造血干細胞的發(fā)育調(diào)控4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

造血（hematopoiesis）

造血干細胞(hematopoieticstemcell)分化為早期祖細胞(primitiveprogenitorcell)，經(jīng)增殖分化成為晚期祖細胞(lateprogenitorcell)，再分化為具有特異形態(tài)的、骨髓中不同系別前體細胞(precursorcell)，最后分化成為各類具有生理功能的血細胞的整個過程稱為“造血”。造血不包括成熟血細胞在體內(nèi)儲存、釋放、分配和凋亡的過程。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控第一節(jié)造血器官人體的造血器官是生成血液的器官。起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、肝臟和脾等。造血過程分為胚胎期造血和出生后造血。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控一、胚胎期造血器官

人類的血液細胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過程中造血中心的轉(zhuǎn)移，胚胎期造血分為三個時期：

卵黃囊造血期

、肝造血期

、骨髓造血期4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控胚胎期造血的三個時期不能截然分開，此消彼長，互為交錯。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控二、出生后造血出生后造血主要靠骨髓。在正常情況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細胞、粒細胞和血小板的場所，也生成淋巴細胞和單核細胞。脾和淋巴結(jié)為終生制造淋巴細胞的器官。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控一、造血細胞的生長發(fā)育是一個連續(xù)不斷的復(fù)雜過程，造血器官內(nèi)的各種造血細胞在造血微環(huán)境中通過細胞與細胞之間相互作用，在各種細胞因子的誘導(dǎo)下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細胞，然后釋放入血循環(huán)中。第二節(jié)造血干/祖細胞的生長發(fā)育特性4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

（一）基本過程造血細胞的生長發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個方面。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控造血細胞的增殖（proliferation）是指血細胞通過分裂而使其數(shù)量增加的過程。有絲分裂是造血細胞的主要增殖方式。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

造血細胞的分化（differentiation）細胞發(fā)育過程中失去某些潛能而獲得新功能的過程，即由多潛能轉(zhuǎn)變?yōu)閱螡撃艿倪^程。分裂后的細胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生新的特征，分化過程是不可逆的。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

造血細胞的成熟（maturation）造血干細胞定向分化，從原始經(jīng)幼稚到成熟細胞的發(fā)育過程。血細胞越成熟其形態(tài)越易辨認，功能也日趨完善。成熟的血細胞在骨髓內(nèi)通過“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（二）造血細胞生長發(fā)育階段根據(jù)造血細胞的功能和形態(tài)特征，造血細胞生長發(fā)育階段可分為：造血干細胞造血祖細胞原始及幼稚細胞4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控造血干細胞階段造血祖細胞階段原始及幼稚細胞階段成熟細胞4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控二、造血干細胞特性干細胞（stemcell）是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細胞。早期胚胎中的原始生殖細胞即胚胎干細胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細胞（totipotenthematopoieticstemcell，THSC）。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控造血干細胞又稱多能干細胞，由中胚層細胞分化而來，是各種血細胞的始祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細胞而難以辨認。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控1.造血干細胞的基本特征

（1）自我更新（self-renewal）與自我維持（self-maintenance）干細胞在不斷產(chǎn)生祖細胞的同時又保持自己數(shù)量和自身特性不變。高度的自我更新能力是造血干細胞最基本的生物學(xué)特征之一。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（2）

造血干細胞靜止?fàn)顟B(tài)干細胞95%以上細胞處于G0期靜止?fàn)顟B(tài)，不進行DNA合成和有絲分裂，當(dāng)機體發(fā)生缺氧、感染、失血和創(chuàng)傷等應(yīng)激狀態(tài)時，干細胞從靜止進入增殖的數(shù)量增加，以滿足機體對造血的需求。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

（3）

造血干細胞全能性（多向分化）

分化是不可逆的，一旦定向分化為某種祖細胞，就不可能再變成其它的祖細胞。造血干細胞在特定的條件下可以分化成紅細胞、粒細胞、單核細胞、血小板、組織嗜堿細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞等的祖細胞。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（4）

造血干細胞不均一性（heterogeneity）造血干細胞有增殖態(tài)與靜止態(tài)之分，并且不斷地在靜止和增殖態(tài)之間轉(zhuǎn)換。造血干細胞代齡（有絲分裂的次數(shù)）不同構(gòu)成了干細胞群體的代齡結(jié)構(gòu)，形成干細胞不均一性。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控2．造血干細胞檢測

單個細胞在生物體內(nèi)有能力長期重建造血是判斷該細胞為造血干細胞的“金標準”。造血干細胞的數(shù)量極少，形態(tài)上不能區(qū)別，干細胞抗原性弱，僅有很少表面抗原。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

（1）脾集落測試法

1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗小鼠脾集落形成間接證明了造血干細胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細胞，再輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系、巨核系細胞結(jié)節(jié)，這些都是由單個細胞增殖分化而來，即脾集落形成單位（CFU-S）。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（2）單克隆抗體法

CD34+CD38—單個細胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等細胞分化。CD34+CD38—細胞的性能接近于造血干細胞，同時也證明了造血干細胞具有多向分化的能力。利用FACS自動細胞分選系統(tǒng)分選出CD34+CD38+及CD34+CD38—亞群細胞。CD34+細胞具有長期重建造血的能力。CD34+CD38—細胞比CD34+細胞具有更強的長期造血能力。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（三）造血干／祖細胞的臨床應(yīng)用造血干／祖細胞移植主要應(yīng)用于：1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

第三節(jié)造血調(diào)控造血細胞的增殖、分化受控于不同的調(diào)控系統(tǒng)。

其中細胞因子的調(diào)控占重要地位。細胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質(zhì)細胞外信號分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在細胞間傳遞信息，從而影響造血活動。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控一、集落刺激因子類(colony-stimulatingfactors,CSFs)

2.粒細胞集落刺激因子(G-CSF)除促進粒系祖細胞形成集落外，還可誘導(dǎo)某些白血病細胞株分化成熟。3.粒－巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)

促進中性粒細胞、單核細胞祖細胞增殖、分化

成熟，對成熟細胞也產(chǎn)生作用。

1.紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）刺激紅系祖細胞的增殖和分化。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控4.巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）促進單核系祖細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（multi-CSF）促進多系集落生長。6.血小板生成素（thrombopoietin,TPO）促進巨核細胞集落形成。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

二、白細胞介素（interleukin,IL)白細胞介素主要是白細胞產(chǎn)生的信號分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時也參與造血系統(tǒng)的造血調(diào)控。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控三、其它細胞因子1.干細胞因子（stemcellfactor,SCF）/肥大細胞生長因子

促進肥大細胞生長；協(xié)同促進造血干／祖細胞增殖、分化。2.FLT-3配基(FLT-3ligand,FL)誘導(dǎo)處于靜止期的造血干／祖細胞進人細胞周期，促進其擴增。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控1．原癌基因

如：c-myc基因、ras相關(guān)基因、c-abl基因、bcl-2基因、c-kit基因等。四、造血基因調(diào)控原癌基因的編碼產(chǎn)物可為：細胞因子、細胞因子受體、細胞內(nèi)蛋白激酶、細胞內(nèi)信號傳遞分子及轉(zhuǎn)錄因子等。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控2.抑癌基因

如：p53基因、WT1基因、NF1基因、DCC、Rb基因等。抑癌基因編碼產(chǎn)物通常為細胞增殖負調(diào)節(jié)因子，抑制細胞增殖、誘導(dǎo)終末分化、維持基因穩(wěn)定、誘導(dǎo)細胞凋亡等。

3.轉(zhuǎn)錄因子參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控對造血中基本的基因調(diào)控機制仍存在若干懸念有待研究：（1）如何在細胞周期G1與G0之間來回轉(zhuǎn)換，并保持絕大多數(shù)細胞處于G0靜止?fàn)顟B(tài)?（2）干細胞不對稱有絲分裂在基因水平上是怎樣實現(xiàn)的?（3）干/祖細胞基因怎樣調(diào)控各類受體表達，以接受造血微環(huán)境中各種信號的影響?（4）干細胞在基因水平如何調(diào)控決定分化方向?怎樣保持各系之間正常恒定比例?4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控

第四節(jié)造血干／祖細胞體外培養(yǎng)技術(shù)

體內(nèi)造血干／祖細胞在一個極復(fù)雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細胞。體外造血祖細胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，將從機體中分離出的造血祖細胞進行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控一、造血干／祖細胞體外培養(yǎng)的基本條件（一）細胞培養(yǎng)室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營養(yǎng)液（四）細胞因子（五）血清4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控二、造血干／祖細胞體外培養(yǎng)方法（一）造血祖細胞集落培養(yǎng)：（1）分離培養(yǎng)細胞，制成單個核細胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體系：按比例將培養(yǎng)液、細胞、血清、細

胞因子加入到培養(yǎng)體系，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37℃水浴中保溫10min。（4）將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（5）待支持物降至40℃左右，加入培養(yǎng)體系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)，一般平行做3份。（7）于5%CO2、飽和濕度及37℃溫箱內(nèi)孵育。BFU-E需14天，CFU-E需7天。（8）觀察結(jié)果。4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控紅細胞爆式集落形成單位

（BFU-E）紅細胞的祖細胞體外培養(yǎng)紅細胞集落形成單位

(CFU-E)4造血干細胞的發(fā)育調(diào)控（二）紅系祖細胞誘導(dǎo)分化的液體