哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)高效生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)的優(yōu)選平臺課程目標(biāo)了解哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)基礎(chǔ)原理掌握系統(tǒng)組成與工作機(jī)制熟悉關(guān)鍵細(xì)胞系特點(diǎn)比較不同細(xì)胞系優(yōu)缺點(diǎn)掌握優(yōu)化策略提高蛋白表達(dá)量和質(zhì)量了解應(yīng)用前景目錄1第一至三部分系統(tǒng)概述、優(yōu)勢和常用細(xì)胞系2第四至六部分基本原理、表達(dá)策略和細(xì)胞培養(yǎng)3第七至九部分優(yōu)化策略、純化技術(shù)和質(zhì)量控制4第十至十一部分挑戰(zhàn)、解決方案和未來發(fā)展第一部分：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述定義與特點(diǎn)利用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)發(fā)展歷史從實(shí)驗(yàn)室技術(shù)到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域生物制藥、疫苗、基礎(chǔ)研究系統(tǒng)組成細(xì)胞、載體、培養(yǎng)條件和表達(dá)策略什么是哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)？基本定義利用哺乳動物細(xì)胞作為宿主表達(dá)外源基因編碼的蛋白質(zhì)獲得具有天然結(jié)構(gòu)和功能的產(chǎn)物系統(tǒng)組成細(xì)胞宿主表達(dá)載體培養(yǎng)基系統(tǒng)轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)方法關(guān)鍵特點(diǎn)復(fù)雜糖基化修飾能力正確蛋白質(zhì)折疊完整翻譯后加工高生物活性產(chǎn)物哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的發(fā)展歷史11950年代首次建立連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系21970-80年代雜交瘤技術(shù)和首批單抗藥物31990年代無血清培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)成熟42000年至今基因工程、高效表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的重要性產(chǎn)業(yè)價值全球生物制藥市場核心技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量生產(chǎn)功能完整的人源化蛋白3技術(shù)基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域3單克隆抗體癌癥和自身免疫疾病治療疫苗開發(fā)病毒樣顆粒和亞單位疫苗基因治療病毒載體生產(chǎn)基礎(chǔ)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究第二部分：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢復(fù)雜翻譯后修飾實(shí)現(xiàn)人源化糖基化模式正確蛋白質(zhì)折疊復(fù)雜結(jié)構(gòu)域的精確構(gòu)象高效分泌能力分泌型蛋白的天然加工高質(zhì)量終產(chǎn)品生物活性和安全性保障優(yōu)勢1：翻譯后修飾復(fù)雜糖基化N-連接和O-連接糖基化蛋白質(zhì)剪切正確信號肽切除二硫鍵形成復(fù)雜三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定磷酸化等修飾功能調(diào)控的關(guān)鍵優(yōu)勢2：蛋白質(zhì)折疊分子伴侶輔助熱休克蛋白和折疊酶協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境專業(yè)化折疊環(huán)境二硫鍵形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化優(yōu)勢3：分泌能力信號肽識別靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工糖基化和初步折疊高爾基體修飾糖鏈加工和蛋白質(zhì)分選分泌囊泡運(yùn)輸向細(xì)胞外釋放成熟蛋白優(yōu)勢4：產(chǎn)品質(zhì)量高生物活性保持天然構(gòu)象和功能低免疫原性人源化修飾降低排斥風(fēng)險結(jié)構(gòu)完整性完整多聚體裝配能力批次一致性穩(wěn)定細(xì)胞系確保產(chǎn)品一致第三部分：常用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主流哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括CHO、HEK293、BHK、NS0/SP2/0等CHO細(xì)胞系來源中國倉鼠卵巢細(xì)胞優(yōu)勢高產(chǎn)量、易培養(yǎng)、安全記錄良好應(yīng)用抗體生產(chǎn)、凝血因子、生長因子特點(diǎn)懸浮培養(yǎng)能力、適應(yīng)無血清培養(yǎng)產(chǎn)量水平可達(dá)5-10g/LHEK293細(xì)胞系人源背景人胚腎細(xì)胞，人源糖基化模式高轉(zhuǎn)染效率適合瞬時表達(dá)和病毒包裝易于培養(yǎng)貼壁和懸浮培養(yǎng)均可應(yīng)用范圍復(fù)雜蛋白、病毒、基因治療載體BHK細(xì)胞系來源嬰倉鼠腎細(xì)胞特點(diǎn)高表達(dá)某些復(fù)雜蛋白，如凝血因子應(yīng)用第Ⅷ、Ⅸ凝血因子和疫苗生產(chǎn)局限性對某些病毒易感，安全性考量NS0和SP2/0細(xì)胞系NS0細(xì)胞系小鼠骨髓瘤細(xì)胞無內(nèi)源性抗體表達(dá)適合單抗生產(chǎn)膽固醇依賴性SP2/0細(xì)胞系小鼠雜交瘤細(xì)胞歷史悠久的抗體表達(dá)平臺生長速度快糖基化模式與人源差異較大共同特點(diǎn)無血清適應(yīng)性懸浮培養(yǎng)能力FDA批準(zhǔn)應(yīng)用歷史抗體表達(dá)的經(jīng)典細(xì)胞系其他哺乳動物細(xì)胞系12345PER.C6人視網(wǎng)膜細(xì)胞，高密度培養(yǎng)能力CAP人羊膜細(xì)胞，懸浮生長，高表達(dá)量C127小鼠乳腺上皮細(xì)胞，特定蛋白表達(dá)COS猴腎細(xì)胞，高效瞬時表達(dá)Vero猴腎細(xì)胞，疫苗生產(chǎn)應(yīng)用第四部分：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的基本原理基因設(shè)計目的基因和調(diào)控元件基因遞送轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄、翻譯和修飾篩選擴(kuò)增高表達(dá)克隆選擇基因轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)-DNA復(fù)合物介導(dǎo)簡便高效，適用多種細(xì)胞電穿孔法電脈沖形成瞬時膜孔適用難轉(zhuǎn)染細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒、腺病毒等高效率，可整合聚合物轉(zhuǎn)染PEI、磷酸鈣沉淀經(jīng)濟(jì)實(shí)用表達(dá)載體設(shè)計1目的基因編碼目標(biāo)蛋白啟動子/增強(qiáng)子驅(qū)動高效轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽序列輔助純化和檢測選擇標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞調(diào)控元件多順反子和信號序列啟動子選擇啟動子類型特點(diǎn)應(yīng)用場景CMV強(qiáng)啟動子，組成型表達(dá)高水平表達(dá)，短期表達(dá)EF1α中強(qiáng)度，長期穩(wěn)定穩(wěn)定細(xì)胞系建立CAG組成型，廣譜活性多種哺乳動物細(xì)胞PGK中等強(qiáng)度，穩(wěn)定性好長期表達(dá)應(yīng)用誘導(dǎo)型啟動子可調(diào)控表達(dá)水平毒性蛋白表達(dá)選擇標(biāo)記48h篩選時間轉(zhuǎn)染后開始藥物選擇2-3周克隆形成穩(wěn)定整合細(xì)胞克隆出現(xiàn)4-8周穩(wěn)定細(xì)胞系單克隆擴(kuò)增完成時間常用選擇標(biāo)記包括：G418(新霉素)、嘌呤霉素、潮霉素B、氨甲蝶呤第五部分：表達(dá)策略瞬時表達(dá)快速獲得蛋白無需細(xì)胞篩選表達(dá)時間短(3-14天)產(chǎn)量較低穩(wěn)定表達(dá)長期持續(xù)表達(dá)需克隆篩選建系時間長(1-3個月)產(chǎn)量高，批次一致誘導(dǎo)表達(dá)可控表達(dá)時間調(diào)節(jié)表達(dá)水平適合毒性蛋白系統(tǒng)復(fù)雜度高瞬時表達(dá)1轉(zhuǎn)染優(yōu)化高純度質(zhì)粒，最佳轉(zhuǎn)染條件2表達(dá)窗口通常3-14天內(nèi)收獲產(chǎn)物規(guī)模調(diào)整從小試到中試的放大策略穩(wěn)定表達(dá)1轉(zhuǎn)染與整合外源DNA整合到宿主基因組藥物篩選選擇性標(biāo)記富集陽性細(xì)胞單克隆分離有限稀釋或克隆環(huán)分離高產(chǎn)克隆篩選評估蛋白表達(dá)量和質(zhì)量細(xì)胞庫建立主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫瞬時表達(dá)vs穩(wěn)定表達(dá)開發(fā)時間(天)相對產(chǎn)量成本誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)1四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)Tet-On/Tet-Off，應(yīng)用最廣泛2依克迪酮誘導(dǎo)系統(tǒng)昆蟲激素類似物誘導(dǎo)，背景低3雌激素受體系統(tǒng)他莫昔芬誘導(dǎo)，低泄漏表達(dá)4甲基丙烯酸酯系統(tǒng)臨床級應(yīng)用，精確調(diào)控第六部分：哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)溫度控制通常37°C，精確控制±0.5°CpH維持CO?緩沖系統(tǒng)，pH7.0-7.4溶氧水平30-60%飽和度，避免缺氧培養(yǎng)基配方營養(yǎng)平衡與細(xì)胞需求匹配基本培養(yǎng)條件參數(shù)常用范圍影響溫度37°C±0.5°C代謝速率，蛋白折疊pH7.0-7.4細(xì)胞生長，蛋白質(zhì)量CO?濃度5-10%pH緩沖溶氧30-60%能量代謝，細(xì)胞活力剪切力<100s?1細(xì)胞完整性無血清培養(yǎng)驅(qū)動因素降低污染風(fēng)險，提高一致性挑戰(zhàn)細(xì)胞適應(yīng)性，生長速率減慢關(guān)鍵添加物生長因子，載體蛋白，脂質(zhì)3優(yōu)化策略漸進(jìn)適應(yīng)，成分平衡懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢高密度培養(yǎng)放大簡便生物反應(yīng)器兼容減少貼壁表面需求適應(yīng)策略逐步降低血清添加保護(hù)劑優(yōu)化攪拌速率克服聚集傾向關(guān)鍵參數(shù)攪拌速率微載體使用氣泡保護(hù)劑接種密度優(yōu)化大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1實(shí)驗(yàn)室規(guī)模T瓶，搖瓶(0.1-10L)中試規(guī)模小型生物反應(yīng)器(10-100L)工業(yè)規(guī)模大型生物反應(yīng)器(100-20,000L)第七部分：表達(dá)優(yōu)化策略2-5倍基因優(yōu)化密碼子優(yōu)化提升表達(dá)量3-10倍載體優(yōu)化強(qiáng)啟動子和增強(qiáng)子選擇2-8倍培養(yǎng)優(yōu)化培養(yǎng)條件和補(bǔ)料策略密碼子優(yōu)化原理調(diào)整密碼子使用頻率匹配宿主細(xì)胞1效果提高翻譯效率，增加表達(dá)量工具在線算法和商業(yè)服務(wù)注意事項避免破壞關(guān)鍵調(diào)控元件信號肽優(yōu)化常用高效信號肽包括：IgG信號肽、白蛋白信號肽、tPA信號肽和IL-2信號肽轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)DNA純度和濃度DNA:轉(zhuǎn)染試劑比例細(xì)胞密度和狀態(tài)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間篩選策略DOE實(shí)驗(yàn)設(shè)計高通量優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率監(jiān)測表達(dá)水平評估常見問題細(xì)胞毒性轉(zhuǎn)染效率低表達(dá)時間短批次間差異培養(yǎng)條件優(yōu)化溫度調(diào)控降溫至30-34°C延長產(chǎn)量階段補(bǔ)料策略動態(tài)補(bǔ)料維持關(guān)鍵營養(yǎng)物添加劑應(yīng)用丁酸鈉等小分子增強(qiáng)表達(dá)溶氧優(yōu)化維持適宜溶氧水平避免脅迫第八部分：蛋白質(zhì)純化技術(shù)收獲離心或過濾分離細(xì)胞澄清深層過濾去除細(xì)胞碎片捕獲親和層析初步純化精制多步層析去除雜質(zhì)終純化病毒滅活和無菌過濾親和層析蛋白A層析抗體純化金標(biāo)準(zhǔn)金屬親和層析His標(biāo)簽蛋白高效純化抗體親和層析FLAG、HA等標(biāo)簽特異純化離子交換層析陽離子交換分離堿性蛋白結(jié)合帶正電荷蛋白常用樹脂：SP、CM洗脫：鹽濃度梯度陰離子交換分離酸性蛋白結(jié)合帶負(fù)電荷蛋白常用樹脂：Q、DEAE洗脫：pH梯度或鹽濃度優(yōu)化參數(shù)pH值緩沖液成分梯度斜率柱流速和樣品負(fù)載分子篩層析分離原理基于分子大小差異優(yōu)勢溫和條件，保持蛋白活性應(yīng)用多聚體分析，脫鹽，緩沖液交換局限性分辨率有限，樣品稀釋多步純化策略純度(%)產(chǎn)量(%)第九部分：表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)量控制細(xì)胞表型生長特性，形態(tài)學(xué)檢查1基因組完整性核型分析，序列驗(yàn)證2無菌性微生物和支原體檢測產(chǎn)品質(zhì)量純度，活性和穩(wěn)定性克隆篩選1有限稀釋克隆化每孔0.5-1個細(xì)胞，簡便但效率低2FACS單細(xì)胞分選高通量，可結(jié)合熒光報告基因3ClonePix自動化挑取基于分泌蛋白形成的"光暈"自動識別4微流控單細(xì)胞培養(yǎng)新興技術(shù)，高通量微環(huán)境控制穩(wěn)定性評估傳代次數(shù)相對產(chǎn)量(%)蛋白質(zhì)量得分產(chǎn)量評估ELISA定量特異性高，通量較低Octet生物層干涉實(shí)時監(jiān)測，無需標(biāo)記HPLC分析高精度，可同時評價純度蛋白質(zhì)印跡半定量，可檢測降解產(chǎn)物蛋白質(zhì)特性分析質(zhì)譜分析精確分子量，翻譯后修飾鑒定圓二色譜二級結(jié)構(gòu)評估，折疊狀態(tài)分析活性測定功能評估，結(jié)合力和酶動力學(xué)第十部分：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的挑戰(zhàn)與解決方案主要挑戰(zhàn)低表達(dá)量，產(chǎn)品異質(zhì)性根因分析基因整合位點(diǎn)，細(xì)胞代謝技術(shù)方案基因優(yōu)化，培養(yǎng)改進(jìn)驗(yàn)證效果量化評估改進(jìn)效果挑戰(zhàn)1：低表達(dá)量原因基因沉默，整合位點(diǎn)影響1解決方案使用MAR序列，位點(diǎn)特異整合2基因優(yōu)化密碼子優(yōu)化，增強(qiáng)啟動子3培養(yǎng)策略過表達(dá)伴侶分子，補(bǔ)料優(yōu)化4挑戰(zhàn)2：蛋白質(zhì)異質(zhì)性主要問題糖基化多樣性不完全折疊聚集體形成C端異質(zhì)性影響因素培養(yǎng)條件細(xì)胞代謝狀態(tài)處理過程蛋白自身特性解決策略糖基化工程加熱激活蛋白過表達(dá)溫度降低培養(yǎng)添加分子伴侶挑戰(zhàn)3：細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)性能下降細(xì)胞增殖減慢，活力降低代謝失衡氨和乳酸積累，營養(yǎng)消耗加速3根本原因過度表達(dá)消耗細(xì)胞能量和資源挑戰(zhàn)4：規(guī)模化生產(chǎn)10-100倍放大幅度從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)規(guī)模10-30%效率損失放大過程中的典型產(chǎn)量降低5-10倍成本增加相比微生物表達(dá)系統(tǒng)的成本倍數(shù)第十一部分：哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的未來發(fā)展基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9精確調(diào)控人工智能輔助預(yù)測表達(dá)水平，優(yōu)化設(shè)計新型表達(dá)宿主人源化細(xì)胞系，定制化平臺自動化與高通量全流程機(jī)器人操作，數(shù)據(jù)集成基因編輯技術(shù)的應(yīng)用靶向整合熱點(diǎn)位點(diǎn)定向插入多基因敲除抑制競爭代謝通路基因通路優(yōu)化增強(qiáng)翻譯后修飾能力制備工程化細(xì)胞系定制化表達(dá)平臺人工智能輔助設(shè)計AI應(yīng)用于序列優(yōu)化、表達(dá)預(yù)測、培養(yǎng)參數(shù)控制和克隆篩選新型表達(dá)宿主的開發(fā)基因組簡化細(xì)胞最小化基因組，降低背景干擾人源化細(xì)