1一、工作簡況（一）任務來源1、基本信息根據(jù)國家標準化管理委員會《關于下達2024年第一批推薦性國家標準計劃及相關外文版計劃的通知》國標委發(fā)〔2024〕16號文的要求，于2025年9月完成《廢水中頭孢菌素類抗生素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》推薦性國家標準的制定工作。計劃編號為：20240497-T-606。本標準由全國廢棄化學品處置標準化技術委員會歸口。主要起草單位為。2、簡要情況（包括概述、現(xiàn)狀、目的意義、當前國際水平）1）頭孢類抗生素理化性質(zhì)頭孢菌素類藥物是7-氨基頭孢烷酸衍生物，是一類具有β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的半合成抗生素。具有抑菌活性強、抗菌譜廣（對革蘭氏陰性菌和陽性菌均顯示廣譜抗菌活性）、藥物半衰期長、藥效持久、對β-內(nèi)酰胺酶比青霉素穩(wěn)定的特點，廣泛用于人用藥和獸用藥領域?？股氐乃幬镌谑褂煤螅俨糠直粰C體吸收外，90%以上是以抗生素原形或代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)由受藥者的糞便和尿液排出體外。頭孢類抗生素與青霉素相似，但其毒性低于青霉素。頭孢類抗生素按照抗菌作用特點進行分類，一般可將常用的頭孢類抗生素分為五代。第一代頭孢菌素開發(fā)較早，抗菌活性較強，抗菌譜較窄，抗革蘭氏陽性菌優(yōu)于革蘭氏陰性菌，以頭孢唑林為代表的第一代頭孢菌素兼顧青霉素、耐酶青霉素和氨芐青霉素三重特點。第一類頭孢菌素在抗革蘭氏陰性菌方面不如第二、三代頭孢菌素但是對革蘭氏陽性菌的活性優(yōu)于第二、三代頭孢菌素。第一代頭孢菌素主要包括頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢羥氨芐、頭孢克羅等。第二代頭孢菌素保留了第一代對革蘭氏陽性菌的作用外，對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的B-內(nèi)酰胺酶較第一代穩(wěn)定，抗菌譜也比第一代廣。第二代頭孢菌素主要包括頭孢美唑、頭孢西丁和頭孢替坦、頭孢呋辛等，第三代頭孢菌素對多種β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有顯著的抗菌活性，與第一代和第二代相比，其抗菌譜更廣，抗菌活性更廣，抗菌活性更強。特別對革蘭氏陰性桿茵的抗菌譜廣、抗菌作用強。第三代頭孢菌素主要有頭孢肟、頭孢他啶、頭孢曲松和頭孢米諾等。第四代頭孢菌素對B-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性很好，與第三代頭孢菌素相比，對革蘭氏陽性菌作用有較大的提高，對革蘭氏陰性菌的作用也不比第三代頭抱菌素差。第四代頭孢菌素抗菌譜極廣，對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很強的抗菌作用。第四代頭孢菌素主要有頭孢匹羅、頭孢唑南等。第五代頭孢菌索在抗菌譜廣，抗菌活性等方面均優(yōu)于前四代，且不易引起耐藥性。但是只有部分藥品上市銷售。第五代頭孢菌素主要包括頭孢洛林和頭孢吡普等。2）頭孢類抗生素的環(huán)境危害頭孢類抗生素具有很強的抑菌和滅菌效果，因此，在日常生活和水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛的應用。頭孢類抗生素在給人們帶來福音的同時，也存在巨大的環(huán)境問題，就是其在環(huán)境中的去除和降解。大量含抗生素的污水、廢水被排放到污水處理廠，但是現(xiàn)如今污水處理廠并沒有很好的辦法有效去除此類污染，從而造成嚴重的環(huán)境污染。目前我國的很多水體中都檢測出了頭孢類抗生素的存在?？股卦谂R床、畜牧養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中起到積極的作用，但是抗生素機體吸收差，水溶性強，常以活性形式通過尿液和糞便以及水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水排入環(huán)境中，最終殘留在土壤和水體中。雖然藥物在環(huán)境會發(fā)生降解，但是大量的使用抗生素仍然會引起持久的污染。近年來，越來越多的水體中檢測到抗生素的存在，2這不僅對環(huán)境造成污染，而且還會破壞生態(tài)系統(tǒng)平衡，對生態(tài)環(huán)境和體健康造成嚴重影響。我國作為抗生素生產(chǎn)和使用大國，水環(huán)境中抗生素污染十分嚴重，但是對應的研究還處于萌芽階段，對抗生素環(huán)境行為的研究也是少之又少，有必要對抗生素的環(huán)境行為進行深入研究，為環(huán)境中抗生素的去除提供更多的理論依據(jù)。頭孢類抗生素是目前最常用的抗生素之一，其對革蘭氏陽性淋球菌和葡萄球菌具有高效性。這些抗生素通過抑制細菌的肽聚糖細胞壁的合成而發(fā)揮抑菌作用。此外，頭孢類抗生素也作為家禽和魚飼料的添加品，導致其在動物體內(nèi)，魚養(yǎng)殖場的廢水中存在。在一般情況下，頭孢類抗生素在水中溶解性高，具有低的生物降解性和高毒性。它們是誘變和致癌化合物，其在水溶液中的持久性增強了他們的生物累積，因此是具有潛在危險的化合物，但是傳統(tǒng)的水處理技術無法有效去除，為控制抗生素污染，有效去除抗生素已經(jīng)受到了國內(nèi)外的廣泛關注。3）研究背景及意義2022年《國務院辦公廳關于印發(fā)新污染物治理行動方案的通知》（國辦發(fā)〔2022〕15號）中提出統(tǒng)籌推進新污染物環(huán)境風險管理，實施調(diào)查評估、分類治理、全過程環(huán)境風險管控，將抗生素確定為新污染物代表之一。隨后，遼寧、山東、浙江、江蘇、四川、上海和重慶等省、直轄市分別出臺了《新污染物治理工作方案（征求意見稿）》要求基本形成新污染物調(diào)查、監(jiān)測、篩查、評估能力，完成一批新污染物環(huán)境調(diào)查監(jiān)測、風險評估和環(huán)境治理試點，開展新污染物環(huán)境調(diào)查監(jiān)測。目前國內(nèi)外對水質(zhì)中頭孢菌素類抗生素分析測定方法主要存在于文獻報道，國家環(huán)境保護標準及行業(yè)標準中也沒有頭孢菌素類抗生素的測定相關標準發(fā)布。由此可見，建立可在常規(guī)實驗室對廢水中頭孢菌素類抗生素定性定量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，不但有利于廢水處理工藝及單元環(huán)節(jié)的設計，還有利于抗生素的使用和排放廢水的管控，從而減少對人體及生態(tài)環(huán)境的危害。目前，在食品檢測領域，基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術的頭孢菌素類抗生素的前處理和定性定量分析方法已相應成熟。本項目首次針對廢水中頭孢菌素類抗生素建立液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的檢測方法，主要基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術的檢測優(yōu)勢和頭孢菌素類抗生素的存在和遷移轉(zhuǎn)化特征，對頭孢菌素類抗生素的前處理方法進行優(yōu)化，有效地提高抗生素的富集含量，建立并優(yōu)化頭孢菌素類抗生素的質(zhì)譜分析儀器的檢測參數(shù)和精度，以期達到準確的定性定量評價效果。（二）主要工作過程1、起草階段（2024.10～2025.1）①起草工作組（一般包括生產(chǎn)、使用、科研、大專院校、檢驗機構(gòu)等利益相關方）本文件起草單位：大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測研究院有限公司等。②分工情況大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測研究院有限公司主要負責提出試驗方案、確定試驗條件、參加工作會議討論、標準征求意見稿及編制說明的編制等工作；中海油天津院主要負責標準制定工作總體協(xié)調(diào)、組織召開標準各階段會議、標準送審階段、報批階段草案、編制說明和相關附件的編制等工作；其他單位負責進行試驗驗證、參加工作會議討論、對標準過程稿件提出修改意見等。③調(diào)查研究過程本標準編制組成員根據(jù)行業(yè)相關規(guī)定，查詢和搜集國內(nèi)外相關標準和文獻資料，確立建立新標準的指導思想，對現(xiàn)有各種方法和監(jiān)測工作需求開展廣泛而深入的調(diào)查研究，對比、篩選后初步提出工作方案和標準研究技術路線，并形成標準草案，制訂初步的實驗方案。④工作組討論稿3根據(jù)前期調(diào)查情況，起草單位于2024年12月18日召開標準工作方案會，，對標準工作組討論稿的相關內(nèi)容進行了細致的討論，確定了試驗方案。⑤驗證過程（驗證單位、驗證（試驗）內(nèi)容、驗證（試驗）數(shù)據(jù)分析、驗證評價）標準編制組開展課題實驗研究工作，對方法各項技術參數(shù)和條件進行優(yōu)化實驗，確定具體的標準方法技術細節(jié)及標準曲線的建立、方法檢出限和測定下限（儀器檢測限的測定、方法檢出限和測定下限的測定）、精密度的測定（空白廢水低中高濃度加標樣精密度、實際樣品低中高加標精密度）、正確度的測定（空白廢水低中高濃度加標樣正確度實際樣品低中高濃度加標正確度）等方法特性指標、質(zhì)控指標，在此基礎上編寫標準征求意見稿、編制說明及方法驗證報告。組織有資質(zhì)的實驗室對該方法的適用性進行了方法驗證，并編寫了方法驗證報告。2、標準征求意見階段（2025.4~5）1廣泛征求意見在起草階段工作基礎上，起草單位對工作組討論稿進行了進一步的討論和修改，其后提出標準草案征求意見稿及編制說明。于2025年5月開始向相關方及委員單位等機構(gòu)發(fā)送征求意見稿及編制說明，并在網(wǎng)上（）公開征求意見。2意見的反饋與處理待定。發(fā)送征求意見稿的單位數(shù)個，收到征求意見稿后回函單位數(shù)個，收到征求意見稿后回函并有建議或意見的單位數(shù)個，沒有回函的單位數(shù)個。對收到的意見全部進行處理，處理意見詳見意見匯總處理表。3、標準預審會階段待定。4、標準審查階段（2025.8）待定。5、報批階段（2025.9）待定。二、國家標準編制原則、標準體系和確定國家標準主要內(nèi)容（一）國家標準編制原則 1貫徹國家的有關方針、政策、法律、法規(guī)；2有利于合理開發(fā)和利用國家資源，推廣科學技術成果；3積極采用國際標準和國外先進標準，促進對外經(jīng)濟技術合作與對外貿(mào)易的發(fā)展；4保障安全和人民的身體健康，保護環(huán)境；5充分考慮使用要求，維護消費者的利益；6技術先進、經(jīng)濟合理、安全可靠、協(xié)調(diào)配套。（二）標準體系在標準體系中的位置：體系類目名稱：03方法-01分析方法；體系編號：01-294-03-01-58。（三）確定國家標準制定主要內(nèi)容（如參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法等）的論據(jù)(包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù))1）主要技術內(nèi)容：本標準適用于生活廢水、養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水中頭孢菌素類抗生素（頭孢匹羅、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢乙腈、頭孢氨芐、頭孢噻肟、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢克肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢噻呋、頭4孢噻吩）的測定。主要框架包括如下章節(jié)：1范圍:規(guī)定標準適用的廢水類別及抗生素檢測種類，確定各個頭孢菌類抗生素的檢出限及測定下限，明確適用范圍。2規(guī)范性引用文件:確定標準引用的水質(zhì)采樣技術規(guī)范及水樣保存和管理技術規(guī)定。3原理:水中抗生素經(jīng)濾膜過濾，經(jīng)固相萃取柱提取凈化后，通過液相色譜分離，用串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測，采用特征離子定性，外標法定量。4試劑與材料5儀器和設備6試樣制備與保存:確定樣品采集與保存方式，空白試樣的制備方式。7測定步驟:選最優(yōu)儀器參考條件，校準方法，試樣測定，確定抗生素的定性分析、計算及抗生素定量方法。8方法準確度和精密度:確定精密度和準確度。9質(zhì)量控制和質(zhì)量保證:確定空白試驗、校準、精密度控制、準確度控制的要求。2）主要技術路線：本標準的制訂工作將嚴格執(zhí)行《國家生態(tài)環(huán)境標準制修訂工作規(guī)則》（國環(huán)規(guī)法規(guī)〔2020〕4號）、《標準化工作導則》（GB/T1.1-2020）、《環(huán)境監(jiān)測分析方法標準制修訂技術導則》（HJ168-2020）及《環(huán)境保護標準編制出版技術指南》（HJ565-2020），在國內(nèi)外相關文獻的基礎上，擬定實驗方案，開展實驗，編制標準文本和標準編制說明，并在全省進行征求意見，完成標準征求意見稿并進行匯總，編制標準文本送審稿和編制說明，完成標準報批稿的編制。本標準制訂的技術路線，見圖1。對頭孢類類抗生素國內(nèi)外現(xiàn)有分析方法和監(jiān)測工作需要開展調(diào)查研究編寫標準草案，確定具體技術路線《廢水中頭孢菌素類抗生素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》研究《廢水中頭孢菌素類抗生素的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》研究儀器分析方法研究樣品的采集、運輸與保存擇極性模式、母離子、儀器分析方法研究樣品的采集、運輸與保存擇極性模式、母離子、孔電壓等樣品前處理方法研究前處理濾膜的選前處理濾膜的選擇，直接進樣法進樣量選擇質(zhì)量保證和質(zhì)量控制措施研究參照文獻、標準及實際試驗情況，確定采樣參照文獻、標準及實際試驗情況，確定采樣與保存技術建立液相色譜分離方法，考察流動相、柱溫、色譜柱類型、梯度洗脫優(yōu)化等條件可量化指標包括：標準曲線線性相關系數(shù)、平行樣品的相對標準誤差、實際樣品的加標回收率、方法檢出限等建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，優(yōu)化電噴霧電壓、碰撞氣流量、錐孔氣流量、離子源溫度、脫溶劑溫度等!孢類類抗響因素建立廢水頭孢類抗生素的測定直接進樣/液相色譜-質(zhì)譜法方法適用性研究：檢出限、精密度、正確度、回收率等實驗↓形成液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用定性、定量分析圖1標準制訂技術路線圖6三、主要試驗驗證數(shù)據(jù)的分析、綜述報告、技術經(jīng)濟論證、預期的經(jīng)濟效果（一）對重要試驗過程的分析試驗條件的優(yōu)化如下：1、固相萃取條件的選擇與優(yōu)化1.1固相萃取柱的選擇抗生素類藥物大多為中等極性或弱極性化合物，從水環(huán)境介質(zhì)中分離富集頭孢類抗生素，可供選擇的固相萃取小柱類型很多。本實驗考察了OasisHLB、OasisMAX和OasisMCX柱對水樣富集凈化，對比其回收率效果，選擇出合適的固相萃取柱。測試3種萃取柱對13種頭孢菌素的回收率(加標量為20.0μg/L，n=3)，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，OasisMAX和OasisMCX萃取柱對頭孢匹羅、頭孢拉定、頭孢氨芐和頭孢喹肟等多種抗生素的回收率偏低，但是相比之下，OasisHLB萃取柱對所選13種目標分析物均表現(xiàn)出良好性能。HLB柱親水親脂平衡填料由特殊的共聚合技術制備而成，含有特定比例的親水基和疏水基，對不同極性化合物均有較好的吸附能力，重現(xiàn)性好，且具有更穩(wěn)定的回收率。所以，本試驗選擇OasisHLB萃取柱對水樣進行SPE萃取。圖2固相萃取柱對13種頭孢類抗生素的回收率的影響(n=3)1.2pH的選擇頭孢菌素在萃取柱上的吸附強度取決于其存在形式。當pH條件不同時，頭孢菌素呈現(xiàn)離子存在形態(tài)也不同。本實驗分別在pH=3、pH=5和pH=7條件下采用空白水樣加標(20.0μg/L，n=3)進行萃取試驗，從而選取合適的pH值。由圖3可以看出，當pH≥5時，頭孢氨芐出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象；當pH=7時，頭孢拉定、頭孢克肟、頭孢喹肟回收率不理想；當pH=3時，13種頭孢類抗生素的回收率在83.0%～108.0%，多種抗生素的回收率較為理想且沒有顯著性差異，其他pH條件下的回收率均不理想。因此，本試驗水樣在過柱前調(diào)至pH=3。圖3pH值對13種頭孢類抗生素的回收率的影響(n=3)2、色譜條件的優(yōu)化頭孢菌素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是β-內(nèi)酰胺類抗生素中的7-氨基頭孢烷酸的衍生物，常用C18色譜柱處理。本實驗比較了AgilentPoroshell120SB-C18色譜柱(2.1×100mm，2.7μm)和WatersAcquityUPLCHSST3色譜柱(2.1×100mm，1.8μm)處理結(jié)果，結(jié)果顯示AgilentPoroshell120SB-C18色譜柱對目標化合物能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，色譜峰的峰形更尖銳。本實驗考察了常用的幾種流動相對13種頭孢菌素色譜分離的影響。結(jié)果顯示：以水-甲醇或水-乙腈為流動相時，多數(shù)頭孢菌素響應低，不能實現(xiàn)較好的分離，特別是在乙腈體系中有拖尾現(xiàn)象。在正離子模式下，通常在流動相中加入適量的甲酸或乙酸銨等物質(zhì)，可以提高目標化合物的離子化效率，同時可以改善峰形。因此本實驗繼續(xù)比較了：0.1%甲酸水-甲醇、5mmol/L乙酸銨溶液-甲醇流動相體系對13種頭孢菌素分離效果的影響。結(jié)果顯示，與5mmol/L乙酸銨溶液-乙腈流動相體系相比，0.1%甲酸水-甲醇流動相體系響應值較高，按表1進行梯度洗脫，目標物化合物的分離效果更好。13種頭孢菌素的標準溶液MRM圖見圖4。表1梯度洗脫程序5555圖413種頭孢菌素的標準溶液MRM圖3、質(zhì)譜條件的優(yōu)化本實驗采用流動注射方式進樣，將20μg/L頭孢菌素標準溶液在正離子模式下進行全掃描，并進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。得到每種化合物的分子離子峰，以分子離子為母離子，對其進行二級質(zhì)譜掃描，選擇干擾小、信噪比大的離子作為定量定性離子對，優(yōu)化碰撞能量、錐空電壓。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。表213種頭孢菌素類抗生素的多離子反應監(jiān)測條件1514.8/1202528.8/133.93458.8/3374356.8/2805347.9/15886455.8/39687349.8/1768441.8/363.9889453.8/285454.8/3238645.8/143523.8/124.8413.8/336.8為定量離子對4、線性關系、檢出限與定量限準確移取適量混合標準中間溶液（10μg/mL），用空白基質(zhì)稀釋定容配成混合標準系列工作溶液，濃度分別為5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L，臨用現(xiàn)配。由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進行測定。以目標化合物的質(zhì)量濃度(μg/L）為橫坐標，以其對應的響應值（峰面積或峰高）為縱坐標，建立標準曲線（見表3）。在該濃度范圍內(nèi)13種目標化合物的相關系數(shù)（R2)均大于0.995。表313種頭孢菌素的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限1y=48.5198x-38.32822y=77.7183x+4.83948345y=456.542x-216.4567y=442.769x-39.169589y=211.945x-8.08213s、回收率和精密度準確量取空白水樣，分別加入100μg/L13種頭孢菌素混合標準工作液50、100和500μL，即加標水平為5.0、10.0和50.0μg/L，每個加標水平進行3次平行測定。結(jié)果表明，13種頭孢菌素的加標回收率在82.6%～