ICS11.220DB22B41吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T3172.3—2020流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)第3部分：H3N8亞型馬流感病毒Real-timeRT-PCRdetectiononHAandNAgenesofinfluenzavirus吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T3172.3—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。DB22/T3172《流感病毒HA和NA基因檢測(cè)熒光RT-PCR法》分為四個(gè)部分。——第1部分：H7N9亞型禽流感病毒；——第2部分：H7N4亞型禽流感病毒；——第3部分：H3N8亞型馬流感病毒；——第4部分：H7N7亞型馬流感病毒。本部分為DB22/T3172的第3部分。本部分由長(zhǎng)春海關(guān)提出并歸口。本部分起草單位：長(zhǎng)春海關(guān)技術(shù)中心。本部分主要起草人：王偉利、王準(zhǔn)、王瑋琳、姚貴哲、劉金華、肖芳、李玥、馬文晨、楊帆、蔡陽、馬玲。IDB22/T3172.3—2020流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)第3部分：H3N8亞型馬流感病毒1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了H3N8亞型馬流感病毒HA和NA基因熒光RT-PCR檢測(cè)方法的原理、試驗(yàn)條件、試劑與材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及試驗(yàn)報(bào)告。本標(biāo)準(zhǔn)適用于H3N8亞型馬流感病毒檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3縮略語NA：神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Taq酶：Taq脫氧核糖核酸聚合酶（ThermusaquaticusDNApolymerase）根據(jù)H3N8亞型馬流感病毒HA基因和NA基因序列設(shè)計(jì)特異引物和探針，探針結(jié)合部位在擴(kuò)增片段內(nèi)部。HA基因和NA基因探針分別在5’端標(biāo)記FAM和CY3熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端分別標(biāo)記MGB和BHQ1作為淬滅熒光基團(tuán)。反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，引物和探針同時(shí)與目的基因片段結(jié)合，此時(shí)探針上熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解，探針上的熒光基團(tuán)游離出來，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所吸收而被檢測(cè)儀所接收。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)形式增長(zhǎng)，熒光信號(hào)也相應(yīng)增長(zhǎng)。據(jù)此熒光PCR儀可實(shí)現(xiàn)對(duì)HA基因和NA基因的同步實(shí)時(shí)檢測(cè)。1DB22/T3172.3—20205.1生物安全措施所有培養(yǎng)物和廢棄物的處置應(yīng)按照GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5.2防污染措施防止污染措施應(yīng)符合GB/T27401的規(guī)定。6試劑與材料6.1試劑6.1.1陰性對(duì)照：可采用經(jīng)滅活的不含馬流感病毒的雞胚尿囊液。6.1.2陽性對(duì)照：非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.1.32×RT-PCRBuffer。6.1.4RTEnzymeMix。6.1.5Taq酶。6.1.6DEPC水：0.1%DEPC處理后的去離子水。6.1.7引物與探針：見表1。表1H3N8亞型馬流感病毒HA基因和NA基因引物和探針引物F1引物R1探針P1引物F2引物R2探針P25’–TGGATTTCATTTGCCATATCAT–3’5’–GCAAATGTTGCATCTAATRTTG–3’FAM–TGGCAGGCCCACAT–MGBHA基因NA基因5’–CTCCAAGAGGGGAAGATGCT–3’5’–CTGACCTGGAGGTTCGACTA–3’CY3–CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGT–BHQ16.2材料7儀器設(shè)備7.2高速冷凍離心機(jī)（13000r/min）。2DB22/T3172.3—20208.1采集將拭子經(jīng)前側(cè)鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有2.0mLPBS液（含有青霉素和鏈霉素）的采樣管中，編號(hào)。8.2運(yùn)輸與儲(chǔ)存鼻拭子樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱中，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。9試驗(yàn)步驟9.1核酸提取采用市售RNA提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀及配套核酸提取試劑進(jìn)行提取。9.2熒光RT-PCR檢測(cè)9.2.1反應(yīng)體系在PCR溶液配制區(qū)，反應(yīng)體系配制見表2與表3，每份檢測(cè)樣品的熒光RT-PCR體系為25μL。用旋渦振蕩器進(jìn)行混勻，瞬間離心后置熒光PCR儀擴(kuò)增。表2H3N8亞型馬流感病毒HA基因熒光RT-PCR反應(yīng)體系3DB22/T3172.3—20209.2.2反應(yīng)參數(shù)9.2.2.1第1階段，反轉(zhuǎn)錄45℃30min。9.2.2.2第2階段，預(yù)變性92℃3min。9.2.2.3第3階段，92℃15s，53℃20s，60℃30s（在此收集熒光），40個(gè)循環(huán)。10試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理10.1結(jié)果分析條件設(shè)定讀取檢測(cè)結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。10.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)10.2.1陰性對(duì)照無Ct值并且無擴(kuò)增曲線。10.2.2陽性對(duì)照的Ct值應(yīng)≤30.0，并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線。10.2.3如陰性對(duì)照和陽性對(duì)照條件不滿足以上條件，此實(shí)驗(yàn)視為無效。10.3結(jié)果判定10.3.1陰性無Ct值且無擴(kuò)增曲線，或只出現(xiàn)單一通道有熒光信號(hào)，均判為陰性。報(bào)告樣品中不存在H3N8