1本文件描述了禽腺病毒I群與Ⅲ群聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechain僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范5.210000×核酸熒光染料(GelRed/GelGreen)。5.3DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)：包括100b×PCR反應(yīng)預(yù)混液(2×TaqPCRMix)。5.5磷酸鹽緩沖液(PBS):0.01mol/L、pH7.4。稱取氯化鈉(NaCl)8.0g、氯化鉀(KC1)0.2g、磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g、磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)2.9g,依次溶于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4,于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min,4℃保存。5.60.5mol/LEDTA溶液：pH8.0。稱取EDTA18.61g,加滅菌水至80mL,用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0,充分溶解，定容至100mL,室溫保2取20mL50×TAE電泳緩沖液，加滅菌水至1000mL,室溫保存。10000×核酸熒光染料(GelRed/GelGreen),均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。稱取EDTA4.4g、溴酚藍(lán)0.25g、二甲苯腈藍(lán)FF0.油，調(diào)pH值至7.0,定容至500mL,分裝室溫保存。5.11無核酸酶離心管(1.5mL)。5.12PCR檢測反應(yīng)管(0.2mL)。5.13禽腺病毒I群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV陽性對照樣品和陰性對照樣品，均-20℃保存。陽性對照：禽腺病毒I群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV基因組DNA5.14引物：引物名稱和序列按照附錄A執(zhí)行。6.2電子天平：精度0.01g。6.4微型低速離心機：轉(zhuǎn)速≤6000r/min。6.5冰箱：-20℃。比例混合，研磨成組織勻漿，裝入1.5mL無核酸酶離心管，置于高速冷凍離心機，4℃、12000r/min3否則應(yīng)-20℃冰箱保存30d。PCR檢測反應(yīng)體系見表1。也可使用等效的商品化2×PCR反應(yīng)預(yù)混1個檢測反應(yīng)體系的使用量10×TaqDNA聚合酶緩沖液禽腺病毒I群上游引物(10μmol/L)禽腺病毒I群下游引物(10μmol/L)禽腺病毒Ⅲ群上游引物(10μmol/L)禽腺病毒Ⅲ群下游引物(10μmol/L)水總體積將制備的陰性對照與待檢樣品DNA、陽性對照基因組DNA樣品溶液產(chǎn)物各2μL依次分別加——第一階段：94℃預(yù)變性5min;——第二階段：94℃40s,55℃40s,72℃30s,共35個循環(huán)；取5μL擴增樣品，與1μL6×核酸電泳加樣緩沖液混勻(若使用含有染料的PCR預(yù)混省略該環(huán)節(jié)),加樣至1.5%X脂糖凝膠樣品孔，置于電泳槽TAE緩沖液中，并設(shè)DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)電4b)陽性對照能夠擴增禽腺病毒I群4型494bp與禽腺病毒Ⅲ群EDSV308bp特異性擴增產(chǎn)物。檢樣品無特異性PCR產(chǎn)物，則判定為禽腺病毒I群5(規(guī)范性)引物引物名稱和序列見表A.1。表A.1引物名稱和序列下游引物下游引物6(資料性)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖B.1。bp--===二~標(biāo)引字母、序號說明：M——DL2000DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1——陰性對照；2——禽腺病毒I群陽性對照；3——禽腺病毒Ⅲ群陽性對照；4——禽腺病毒I群、Ⅲ群陽性混合樣品；5——禽腺病毒I群、Ⅲ群陰性樣品；10——禽腺病毒Ⅲ群臨床樣品；12——禽腺病毒I群