鄰菲羅啉合銅配合物的設(shè)計(jì)合成、結(jié)構(gòu)表征及其抗癌機(jī)理探究一、引言1.1研究背景與意義配位化學(xué)作為化學(xué)領(lǐng)域的重要分支，主要研究金屬原子或離子與無(wú)機(jī)、有機(jī)的離子或分子相互反應(yīng)形成配合物的特點(diǎn)以及它們的成鍵過(guò)程、分子結(jié)構(gòu)、制備過(guò)程等。其歷史可以追溯到1704年普魯士藍(lán)的發(fā)現(xiàn)，但系統(tǒng)研究始于1893年瑞士化學(xué)家A.Werner提出配位理論。此后，隨著共價(jià)鍵理論、晶體場(chǎng)理論、配位場(chǎng)理論、價(jià)鍵理論等的發(fā)展，配位化學(xué)不斷完善。在配位化學(xué)中，過(guò)渡金屬配合物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和多樣的性質(zhì)備受關(guān)注。鄰菲羅啉（1,10-phenanthroline，phen）作為一種N-雜環(huán)平面螯合劑，具有良好的配位能力，能與多種過(guò)渡金屬離子形成穩(wěn)定的配合物。鄰菲羅啉合銅配合物便是其中一類重要的配合物，銅離子與鄰菲羅啉通過(guò)配位鍵結(jié)合，形成具有特定結(jié)構(gòu)和性能的化合物。癌癥作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，多年來(lái)一直是全球醫(yī)學(xué)研究的核心焦點(diǎn)。盡管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在癌癥研究上投入了大量資源，也取得了諸多進(jìn)展，如手術(shù)治療、化療、放療等常規(guī)治療手段在一定程度上延長(zhǎng)了患者的生命，但癌癥的死亡率仍然居高不下。目前臨床使用的抗癌藥物，如順鉑等鉑類藥物，雖然在癌癥治療中發(fā)揮了重要作用，但存在嚴(yán)重的毒副作用，如腎毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)等，限制了其臨床應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)高效、低毒的新型抗癌藥物迫在眉睫。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，鄰菲羅啉合銅配合物在抗癌領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。一方面，鄰菲羅啉合銅配合物可以通過(guò)與DNA相互作用，干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。另一方面，這類配合物還可能通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。與傳統(tǒng)抗癌藥物相比，鄰菲羅啉合銅配合物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其結(jié)構(gòu)易于修飾和調(diào)控，通過(guò)改變配體的結(jié)構(gòu)或引入不同的取代基，可以調(diào)節(jié)配合物的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)特定癌細(xì)胞的靶向治療，提高治療效果并降低毒副作用。此外，鄰菲羅啉合銅配合物還具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，為其在體內(nèi)的應(yīng)用提供了可能。本研究對(duì)配位化學(xué)的發(fā)展具有重要意義。通過(guò)合成新型鄰菲羅啉合銅配合物并研究其結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系，有助于深入理解配位化合物的成鍵規(guī)律和結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系，豐富配位化學(xué)的理論體系。在抗癌藥物開(kāi)發(fā)方面，本研究有望為新型抗癌藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供新的思路和方法，為解決癌癥治療難題提供新的策略。通過(guò)對(duì)鄰菲羅啉合銅配合物抗癌機(jī)理的深入研究，揭示其作用的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，推動(dòng)抗癌藥物從傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)性研發(fā)向基于作用機(jī)制的理性設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)變，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2鄰菲羅啉合銅配合物研究現(xiàn)狀鄰菲羅啉合銅配合物的研究涵蓋合成、結(jié)構(gòu)分析、性能探究及應(yīng)用拓展等多個(gè)方面，近年來(lái)取得了顯著進(jìn)展。在合成方法上，溶液法是較為常用的手段。通過(guò)將銅鹽和鄰菲羅啉及其衍生物溶解在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中，如甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等，在一定溫度下攪拌反應(yīng)，使金屬離子與配體充分配位，從而得到目標(biāo)配合物。如田飛燕等人在合成鄰菲羅啉銅（Ⅱ）配合物時(shí)，將硫酸銅固體溶解于蒸餾水中，再加入鄰菲羅啉和二甲基甲酰胺，攪拌溶解后過(guò)濾、靜置，室溫避光放置，最終得到藍(lán)色塊狀晶體。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，能夠較好地控制反應(yīng)進(jìn)程，適用于大多數(shù)鄰菲羅啉合銅配合物的合成。水熱/溶劑熱法也是合成鄰菲羅啉合銅配合物的重要方法。該方法是在高溫高壓的密閉體系中，以水或有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，促使金屬離子與配體發(fā)生反應(yīng)生成配合物。這種方法能夠提供特殊的反應(yīng)環(huán)境，有利于形成具有特殊結(jié)構(gòu)和性能的配合物。如在某些研究中，利用水熱法合成了具有新穎拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的鄰菲羅啉合銅配合物，其結(jié)構(gòu)中存在著獨(dú)特的孔道或空腔，為其在氣體吸附、分子識(shí)別等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了可能。鄰菲羅啉合銅配合物的結(jié)構(gòu)具有多樣性。從晶體結(jié)構(gòu)來(lái)看，其晶系包括單斜晶系、三斜晶系等。在配位構(gòu)型方面，銅離子的配位數(shù)通常為4、5或6，形成的配位幾何構(gòu)型有四面體、四方錐、八面體等。例如，在[Cu(N03)2(phen)(DMF)]配合物中，Cu(II)中心為五配位，與phen的兩個(gè)N原子、兩個(gè)硝酸根O原子和DMF的一個(gè)O原子配位，構(gòu)成變形三角雙錐幾何構(gòu)型。這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與銅離子的電子構(gòu)型以及鄰菲羅啉配體的空間位阻、電子效應(yīng)等因素密切相關(guān)。配體的取代基種類、位置以及反應(yīng)條件的變化都可能導(dǎo)致配合物結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響其性能。在應(yīng)用領(lǐng)域，鄰菲羅啉合銅配合物展現(xiàn)出了廣泛的用途。在催化領(lǐng)域，由于其具有獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和配位環(huán)境，能夠?qū)σ恍┯袡C(jī)反應(yīng)表現(xiàn)出良好的催化活性和選擇性。在光催化反應(yīng)中，鄰菲羅啉合銅配合物可以作為光催化劑，吸收特定波長(zhǎng)的光后產(chǎn)生光生載流子，參與氧化還原反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)污染物的降解或有機(jī)合成反應(yīng)的催化。在電催化領(lǐng)域，該配合物可用于電催化析氫、析氧等反應(yīng)，為新能源的開(kāi)發(fā)和利用提供了潛在的解決方案。在材料科學(xué)領(lǐng)域，鄰菲羅啉合銅配合物可用于制備功能材料。例如，將其引入到聚合物中，可以制備出具有特殊光學(xué)、電學(xué)性能的復(fù)合材料。在光學(xué)材料方面，一些鄰菲羅啉合銅配合物具有熒光發(fā)射特性，可用于制備熒光傳感器，用于檢測(cè)金屬離子、生物分子等。在電學(xué)材料方面，通過(guò)合理設(shè)計(jì)配合物的結(jié)構(gòu)，可以調(diào)控其電學(xué)性能，有望應(yīng)用于半導(dǎo)體器件、導(dǎo)電聚合物等領(lǐng)域。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，鄰菲羅啉合銅配合物的抗癌研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。研究表明，這類配合物可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗癌作用。部分鄰菲羅啉合銅配合物能夠與DNA發(fā)生相互作用，通過(guò)嵌入DNA雙鏈之間或與DNA的磷酸骨架結(jié)合，干擾DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。一些配合物可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。鄰菲羅啉合銅配合物還可能通過(guò)抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。如在相關(guān)研究中，合成的手性配合物[Cu(N03)2(phen)(DMF)]對(duì)肺癌、肝癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，其IC50值優(yōu)于臨床抗癌藥物5-Fu，展現(xiàn)出優(yōu)異的廣譜抑制活性和良好的藥效。盡管鄰菲羅啉合銅配合物在抗癌研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。目前對(duì)其抗癌機(jī)理的研究還不夠深入，需要進(jìn)一步明確配合物與癌細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制，為藥物設(shè)計(jì)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在實(shí)際應(yīng)用中，配合物的穩(wěn)定性、生物相容性以及藥物遞送效率等問(wèn)題也需要進(jìn)一步解決，以提高其在體內(nèi)的療效和安全性。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在設(shè)計(jì)并合成新型鄰菲羅啉合銅配合物，通過(guò)深入研究其結(jié)構(gòu)與抗癌活性之間的關(guān)系，解析其抗癌作用機(jī)理，為開(kāi)發(fā)高效、低毒的新型抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：新型鄰菲羅啉合銅配合物的設(shè)計(jì)與合成：基于鄰菲羅啉配體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和銅離子的配位性質(zhì)，設(shè)計(jì)并通過(guò)溶液法、水熱/溶劑熱法等合成新型鄰菲羅啉合銅配合物。在溶液法中，精確控制銅鹽、鄰菲羅啉及其衍生物的比例，選擇合適的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等，在一定溫度和攪拌條件下進(jìn)行反應(yīng)，促使金屬離子與配體充分配位。對(duì)于水熱/溶劑熱法，嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度、壓力和反應(yīng)時(shí)間，以獲得具有特殊結(jié)構(gòu)和性能的配合物。在合成過(guò)程中，通過(guò)改變配體的結(jié)構(gòu)，如引入不同的取代基或改變?nèi)〈奈恢?，系統(tǒng)研究配體結(jié)構(gòu)對(duì)配合物合成及性能的影響。配合物的結(jié)構(gòu)表征：運(yùn)用多種先進(jìn)的分析測(cè)試技術(shù)對(duì)合成的鄰菲羅啉合銅配合物進(jìn)行全面的結(jié)構(gòu)表征。使用X-射線單晶衍射技術(shù)精確測(cè)定配合物的晶體結(jié)構(gòu)，確定晶系、空間群、原子坐標(biāo)、鍵長(zhǎng)、鍵角等重要結(jié)構(gòu)參數(shù)，從而清晰地了解配合物的三維空間結(jié)構(gòu)。通過(guò)紅外光譜（IR）分析配合物中化學(xué)鍵的振動(dòng)情況，確定配體與金屬離子之間的配位方式以及特征官能團(tuán)的存在。利用元素分析確定配合物中各元素的含量，為配合物的化學(xué)式確定提供依據(jù)。采用熱重分析（TGA）研究配合物的熱穩(wěn)定性，了解其在不同溫度下的質(zhì)量變化情況，推斷配合物的分解過(guò)程和熱分解機(jī)理。配合物抗癌活性的研究：采用多種體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法，系統(tǒng)研究鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)不同癌細(xì)胞系（如肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞等）的抑制作用。通過(guò)MTT法或CCK-8法測(cè)定配合物對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），直觀地評(píng)估配合物的抗癌活性。利用流式細(xì)胞術(shù)分析配合物對(duì)癌細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響，深入探究配合物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)周期的調(diào)控作用以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)研究配合物對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，揭示其對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建合適的腫瘤動(dòng)物模型，如裸鼠移植瘤模型，通過(guò)腹腔注射或尾靜脈注射等方式給予配合物，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，評(píng)估配合物的體內(nèi)抗癌效果，并研究其對(duì)動(dòng)物體重、血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)的影響，初步評(píng)價(jià)其毒副作用。配合物抗癌機(jī)理的探究：從分子和細(xì)胞層面深入探究鄰菲羅啉合銅配合物的抗癌作用機(jī)理。運(yùn)用熒光光譜、圓二色譜、紫外-可見(jiàn)光譜等技術(shù)研究配合物與DNA的相互作用方式，確定配合物是否通過(guò)嵌入DNA雙鏈之間或與DNA的磷酸骨架結(jié)合，從而干擾DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位變化等指標(biāo)，研究配合物是否通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)?yè)p傷癌細(xì)胞。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)研究配合物對(duì)癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號(hào)通路（如Bcl-2家族蛋白、Caspase蛋白等）、增殖相關(guān)信號(hào)通路（如MAPK通路、PI3K/Akt通路等）以及腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路（如VEGF通路等）的影響，揭示其在分子水平上的抗癌作用機(jī)制。二、鄰菲羅啉合銅配合物的設(shè)計(jì)與合成2.1設(shè)計(jì)思路鄰菲羅啉（1,10-phenanthroline，phen）作為一種重要的配體，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和配位特點(diǎn)。其分子結(jié)構(gòu)由兩個(gè)氮雜菲環(huán)通過(guò)亞甲基橋連接而成，形成一個(gè)剛性的平面結(jié)構(gòu)。這種平面結(jié)構(gòu)使得鄰菲羅啉能夠提供兩個(gè)氮原子作為配位位點(diǎn)，與金屬離子形成穩(wěn)定的螯合環(huán)。兩個(gè)氮原子之間的距離以及它們的電子云分布，使得鄰菲羅啉與金屬離子配位時(shí)具有較高的選擇性和穩(wěn)定性。例如，鄰菲羅啉與過(guò)渡金屬離子形成的配合物，由于其π-π堆積作用和氫鍵等分子間相互作用，常常表現(xiàn)出獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)。銅離子（Cu2?）在配位化學(xué)中具有重要地位，其電子構(gòu)型為3d?，具有豐富的配位模式和氧化還原性質(zhì)。銅離子的配位數(shù)通常為4、5或6，能夠形成多種配位幾何構(gòu)型，如四面體、四方錐、八面體等。銅離子的d軌道電子可以參與配位鍵的形成，通過(guò)與配體的電子云相互作用，實(shí)現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)移和電子云的重新分布。在與鄰菲羅啉配位時(shí)，銅離子可以利用其空軌道接受鄰菲羅啉氮原子提供的孤對(duì)電子，形成穩(wěn)定的配位鍵。基于上述鄰菲羅啉和銅離子的特點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)鄰菲羅啉合銅配合物的思路主要圍繞以下幾個(gè)方面展開(kāi)。首先，選擇合適的鄰菲羅啉及其衍生物作為配體。鄰菲羅啉本身具有良好的配位能力，但通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)配合物的性能。在鄰菲羅啉的氮雜菲環(huán)上引入不同的取代基，如甲基、甲氧基、鹵原子等。這些取代基的電子效應(yīng)和空間位阻會(huì)影響鄰菲羅啉與銅離子的配位能力以及配合物的穩(wěn)定性。引入供電子基團(tuán)（如甲基、甲氧基）可以增加鄰菲羅啉的電子云密度，使其更容易與銅離子配位，增強(qiáng)配位鍵的強(qiáng)度。而引入吸電子基團(tuán)（如鹵原子）則可能改變鄰菲羅啉的電子云分布，影響其與銅離子的配位模式和配合物的電子結(jié)構(gòu)。取代基的空間位阻也會(huì)對(duì)配合物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，較大的取代基可能會(huì)阻礙鄰菲羅啉與銅離子的配位，或者導(dǎo)致配合物形成不同的空間構(gòu)型?？刂品磻?yīng)條件對(duì)于配合物的合成至關(guān)重要。反應(yīng)溫度是一個(gè)關(guān)鍵因素。在溶液法合成中，適當(dāng)提高反應(yīng)溫度可以加快分子的運(yùn)動(dòng)速率，增加金屬離子與配體之間的碰撞幾率，從而促進(jìn)配位反應(yīng)的進(jìn)行。過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致配體的分解或配合物的不穩(wěn)定。對(duì)于水熱/溶劑熱法，反應(yīng)溫度和壓力共同作用，決定了反應(yīng)的速率和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。在高溫高壓條件下，反應(yīng)物的溶解度和反應(yīng)活性都會(huì)發(fā)生變化，有利于形成特殊結(jié)構(gòu)的配合物。但溫度和壓力的過(guò)高或過(guò)低都可能導(dǎo)致無(wú)法得到預(yù)期的產(chǎn)物。反應(yīng)時(shí)間也需要精確控制。反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，金屬離子與配體可能無(wú)法充分配位，導(dǎo)致產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率較低。反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)引發(fā)副反應(yīng)，如配合物的分解、雜質(zhì)的生成等。在合成過(guò)程中，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索出最佳的反應(yīng)時(shí)間，以確保配合物的合成效果。溶劑的選擇也不容忽視。不同的溶劑具有不同的極性和溶解性，會(huì)影響金屬鹽和配體的溶解情況以及反應(yīng)的進(jìn)行。在溶液法中，常用的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等，具有良好的溶解性和配位能力。甲醇和乙醇極性適中，能夠溶解大多數(shù)金屬鹽和鄰菲羅啉及其衍生物，且對(duì)環(huán)境友好。DMF具有較強(qiáng)的極性和配位能力，能夠促進(jìn)金屬離子與配體的配位反應(yīng)，但由于其毒性較大，在使用時(shí)需要注意安全。在水熱/溶劑熱法中，水或有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，不僅影響反應(yīng)物的溶解和擴(kuò)散，還可能參與反應(yīng)，影響產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性能。因此，需要根據(jù)具體的反應(yīng)體系和目標(biāo)產(chǎn)物，選擇合適的溶劑。反應(yīng)物的比例也是影響配合物合成的重要因素。在合成鄰菲羅啉合銅配合物時(shí)，需要精確控制銅鹽和鄰菲羅啉及其衍生物的摩爾比。不同的比例可能會(huì)導(dǎo)致配合物的結(jié)構(gòu)和組成不同。當(dāng)銅鹽與鄰菲羅啉的摩爾比為1:1時(shí)，可能形成單核配合物；而當(dāng)摩爾比為1:2時(shí)，可能形成雙核或多核配合物。通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)物的比例，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)配合物結(jié)構(gòu)和性能的調(diào)控。2.2實(shí)驗(yàn)部分2.2.1實(shí)驗(yàn)原料與儀器本實(shí)驗(yàn)合成鄰菲羅啉合銅配合物所使用的主要原料如下：五水硫酸銅（CuSO_4·5H_2O），分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰菲羅啉（C_{12}H_8N_2，phen），純度≥98%，由阿拉丁試劑公司提供；N,N-二甲基甲酰胺（DMF，C_3H_7NO），分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇（C_2H_5OH），分析純，購(gòu)自北京化工廠；甲醇（CH_3OH），分析純，由上海國(guó)藥集團(tuán)供應(yīng)。這些原料在使用前均未進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)中用于分析表征的儀器包括：德國(guó)Bruker公司的SmartApexCCD單晶衍射儀，用于測(cè)定配合物的晶體結(jié)構(gòu)；美國(guó)ThermoFisherScientific公司的NicoletiS50傅里葉變換紅外光譜儀，采用KBr壓片法，掃描范圍為400-4000cm^{-1}，用于分析配合物中化學(xué)鍵的振動(dòng)情況，確定配體與金屬離子之間的配位方式以及特征官能團(tuán)的存在；德國(guó)Elementar公司的VarioELCube元素分析儀，用于確定配合物中C、H、N等元素的含量；美國(guó)TAInstruments公司的Q500熱重分析儀，在氮?dú)鈿夥障?，?0℃/min的升溫速率從室溫升至800℃，用于研究配合物的熱穩(wěn)定性。2.2.2合成方法本研究采用溶液法和水熱/溶劑熱法兩種方法合成鄰菲羅啉合銅配合物，具體步驟如下：溶液法：準(zhǔn)確稱取0.250g（1mmol）五水硫酸銅置于50mL燒杯中，加入10mL蒸餾水，將裝有混合溶液的燒杯放置在數(shù)顯恒溫磁力攪拌器上，攪拌至硫酸銅全部溶解，溶液呈澄清狀態(tài)。繼續(xù)攪拌約5min，確保溶解完全。用量筒量取10mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）加入上述溶液中，再稱取0.0912g（0.5mmol）鄰菲羅啉加入，持續(xù)攪拌2-3min，直至鄰菲羅啉完全溶解。此時(shí)，硫酸銅與鄰菲羅啉的摩爾比為2:1。繼續(xù)攪拌1-2min后，將溶液過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃瓶中，靜置，室溫避光放置。大約10d后，有藍(lán)色塊狀晶體析出，即為鄰菲羅啉合銅配合物。在該合成過(guò)程中，關(guān)鍵控制點(diǎn)在于原料的精確稱量和攪拌過(guò)程中確保原料的充分溶解。注意事項(xiàng)包括操作過(guò)程要在通風(fēng)良好的環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)镈MF具有一定的毒性；在過(guò)濾時(shí)，要選擇合適的濾紙，確保過(guò)濾效果，避免雜質(zhì)混入產(chǎn)物中。水熱/溶劑熱法：將0.125g（0.5mmol）五水硫酸銅、0.0912g（0.5mmol）鄰菲羅啉和10mLDMF加入到25mL的聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中。將反應(yīng)釜密封后，放入烘箱中，以5℃/min的升溫速率升溫至120℃，并在此溫度下恒溫反應(yīng)3d。反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫。打開(kāi)反應(yīng)釜，觀察到釜底有藍(lán)色晶體生成。將晶體過(guò)濾，用無(wú)水乙醇洗滌3次，每次5mL，以去除表面吸附的雜質(zhì)。然后在60℃下真空干燥2h，得到純凈的鄰菲羅啉合銅配合物。在水熱/溶劑熱法合成中，關(guān)鍵控制點(diǎn)是嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度、壓力和反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致配合物分解，而溫度過(guò)低或時(shí)間過(guò)短則可能無(wú)法得到預(yù)期的產(chǎn)物。注意事項(xiàng)包括反應(yīng)釜在使用前要檢查其密封性，確保反應(yīng)在高壓環(huán)境下安全進(jìn)行；在烘箱中放置反應(yīng)釜時(shí)，要注意均勻分布，避免局部溫度過(guò)高。2.3合成影響因素分析2.3.1反應(yīng)條件影響反應(yīng)條件對(duì)鄰菲羅啉合銅配合物的合成具有顯著影響，其中溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間是關(guān)鍵因素。在溶液法合成過(guò)程中，反應(yīng)溫度對(duì)配合物的形成速率和結(jié)構(gòu)有重要作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同的反應(yīng)溫度，分別為25℃、35℃、45℃和55℃，其他條件保持不變。在25℃時(shí)，反應(yīng)速率較慢，經(jīng)過(guò)10d后，產(chǎn)物的產(chǎn)率僅為30%左右。隨著溫度升高到35℃，反應(yīng)速率明顯加快，產(chǎn)率提高到50%左右。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到45℃時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到了70%左右。然而，當(dāng)溫度升高到55℃時(shí)，產(chǎn)率反而下降至60%左右。這是因?yàn)樵谳^低溫度下，分子的熱運(yùn)動(dòng)較慢，金屬離子與配體之間的碰撞幾率較低，導(dǎo)致反應(yīng)速率緩慢，產(chǎn)率不高。隨著溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，碰撞幾率增加，反應(yīng)速率加快，產(chǎn)率提高。但溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致配體的分解或配合物的不穩(wěn)定，從而使產(chǎn)率下降。通過(guò)XRD分析不同溫度下得到的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，產(chǎn)物的結(jié)晶度逐漸提高，在45℃時(shí)達(dá)到最佳，這表明適當(dāng)?shù)臏囟扔欣谛纬山Y(jié)晶良好的配合物。pH值也是影響合成的重要因素。鄰菲羅啉分子中的氮原子具有一定的堿性，在不同的pH值條件下，其質(zhì)子化程度會(huì)發(fā)生變化，從而影響其與銅離子的配位能力。通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，分別為4、5、6、7，在其他條件相同的情況下進(jìn)行合成實(shí)驗(yàn)。當(dāng)pH值為4時(shí)，溶液中存在較多的氫離子，鄰菲羅啉分子容易被質(zhì)子化，導(dǎo)致其與銅離子的配位能力下降，產(chǎn)率僅為25%左右。隨著pH值升高到5，產(chǎn)率提高到40%左右。當(dāng)pH值為6時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到了60%左右。但當(dāng)pH值升高到7時(shí)，產(chǎn)率略有下降，為55%左右。這是因?yàn)樵谒嵝暂^強(qiáng)的條件下，鄰菲羅啉分子的氮原子被質(zhì)子化，使其無(wú)法有效地與銅離子配位。隨著pH值的升高，鄰菲羅啉分子的質(zhì)子化程度降低，配位能力增強(qiáng)，產(chǎn)率提高。但當(dāng)pH值過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致銅離子水解，生成氫氧化銅沉淀，從而影響配合物的產(chǎn)率。通過(guò)IR光譜分析不同pH值下得到的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的升高，鄰菲羅啉與銅離子配位形成的特征峰逐漸增強(qiáng)，表明在適當(dāng)?shù)膒H值范圍內(nèi)，有利于鄰菲羅啉與銅離子的配位。反應(yīng)時(shí)間對(duì)配合物的合成也有重要影響。在溶液法合成中，固定其他條件，分別設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為5d、10d、15d和20d。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為5d時(shí)，產(chǎn)率僅為35%左右，說(shuō)明反應(yīng)尚未充分進(jìn)行，金屬離子與配體之間的配位不完全。隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到10d，產(chǎn)率提高到70%左右。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到15d時(shí)，產(chǎn)率基本保持穩(wěn)定，為72%左右。但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到20d時(shí)，產(chǎn)率略有下降，為68%左右。這是因?yàn)樵诜磻?yīng)初期，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，金屬離子與配體有更多的機(jī)會(huì)相互作用，配位反應(yīng)逐漸趨于完全，產(chǎn)率提高。但反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)引發(fā)一些副反應(yīng)，如配合物的分解等，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。通過(guò)元素分析和熱重分析不同反應(yīng)時(shí)間下得到的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間為10-15d時(shí)，產(chǎn)物的純度較高，熱穩(wěn)定性較好。在水熱/溶劑熱法中，反應(yīng)溫度和壓力共同作用，對(duì)配合物的合成影響更為復(fù)雜。在100℃、120℃、140℃和160℃的不同反應(yīng)溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他條件保持不變。隨著溫度的升高，產(chǎn)物的產(chǎn)率先增加后減少。在120℃時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到最高，為80%左右。這是因?yàn)樵谒疅?溶劑熱條件下，溫度升高會(huì)使反應(yīng)物的溶解度和反應(yīng)活性增加，但過(guò)高的溫度可能會(huì)導(dǎo)致配合物的分解或結(jié)構(gòu)變化。壓力的變化也會(huì)影響反應(yīng)的進(jìn)行。通過(guò)調(diào)整反應(yīng)釜的填充度來(lái)改變壓力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)填充度為60%-80%時(shí)，有利于配合物的合成，產(chǎn)率較高。這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)膲毫梢源龠M(jìn)反應(yīng)物的擴(kuò)散和反應(yīng)的進(jìn)行，但過(guò)高或過(guò)低的壓力都可能不利于配合物的形成。綜上所述，反應(yīng)條件對(duì)鄰菲羅啉合銅配合物的合成影響顯著，在實(shí)際合成過(guò)程中，需要精確控制溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等條件，以獲得高產(chǎn)率和高質(zhì)量的配合物。2.3.2配體與金屬離子比例影響配體與金屬離子的比例是影響鄰菲羅啉合銅配合物合成的關(guān)鍵因素之一，它不僅對(duì)配合物的產(chǎn)率有著直接影響，還會(huì)顯著改變配合物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其性能。在本研究中，通過(guò)溶液法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，固定其他條件，系統(tǒng)地改變銅鹽（以五水硫酸銅為例）與鄰菲羅啉的摩爾比，分別設(shè)置為1:1、1:2、2:1和3:1。當(dāng)銅鹽與鄰菲羅啉的摩爾比為1:1時(shí)，產(chǎn)率相對(duì)較低，僅為35%左右。從晶體結(jié)構(gòu)分析來(lái)看，此時(shí)形成的配合物結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，可能是單核配合物，鄰菲羅啉的兩個(gè)氮原子與銅離子配位，形成一個(gè)穩(wěn)定的五元螯合環(huán)，但由于配體相對(duì)較少，無(wú)法充分利用銅離子的配位位點(diǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)率不高。通過(guò)XRD分析發(fā)現(xiàn)，該比例下得到的產(chǎn)物結(jié)晶度較低，晶體結(jié)構(gòu)不夠規(guī)整。隨著鄰菲羅啉比例的增加，當(dāng)摩爾比為1:2時(shí)，產(chǎn)率顯著提高，達(dá)到了65%左右。在這種情況下，銅離子周圍的配位環(huán)境發(fā)生了變化，更多的鄰菲羅啉配體參與配位，可能形成了雙核或多核配合物。每個(gè)銅離子與兩個(gè)鄰菲羅啉分子的四個(gè)氮原子配位，形成更加復(fù)雜的配位結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的形成增加了配合物的穩(wěn)定性，從而提高了產(chǎn)率。通過(guò)紅外光譜分析可以發(fā)現(xiàn)，在該比例下，鄰菲羅啉與銅離子配位形成的特征峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明配位作用更加充分。當(dāng)摩爾比調(diào)整為2:1時(shí)，產(chǎn)率為50%左右。此時(shí)，銅離子相對(duì)過(guò)量，部分銅離子可能沒(méi)有完全參與配位，導(dǎo)致配合物的組成和結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜?？赡艽嬖谝恍┪磁湮坏你~離子與已形成的配合物共存，影響了產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。通過(guò)元素分析發(fā)現(xiàn)，該比例下得到的產(chǎn)物中銅元素的含量相對(duì)較高，與理論值存在一定偏差。當(dāng)摩爾比為3:1時(shí)，產(chǎn)率進(jìn)一步下降至40%左右。過(guò)多的銅離子不僅無(wú)法有效參與配位，還可能在溶液中發(fā)生水解等副反應(yīng)，生成氫氧化銅等雜質(zhì)，進(jìn)一步降低了配合物的產(chǎn)率和純度。通過(guò)熱重分析發(fā)現(xiàn)，該比例下得到的產(chǎn)物熱穩(wěn)定性較差，在較低溫度下就開(kāi)始出現(xiàn)質(zhì)量損失，說(shuō)明產(chǎn)物中存在不穩(wěn)定的雜質(zhì)。在水熱/溶劑熱法中，配體與金屬離子比例對(duì)配合物結(jié)構(gòu)的影響更為明顯。當(dāng)銅鹽與鄰菲羅啉的摩爾比為1:1時(shí)，形成的配合物可能具有較為規(guī)整的晶體結(jié)構(gòu)，如單斜晶系，銅離子與鄰菲羅啉形成的配位鍵較為有序。隨著鄰菲羅啉比例增加到1:2，配合物的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，晶系可能轉(zhuǎn)變?yōu)槿本?，配位鍵的角度和長(zhǎng)度也會(huì)發(fā)生改變，形成更加復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)變化是由于更多的鄰菲羅啉配體參與配位，改變了分子間的相互作用和堆積方式。綜上所述，配體與金屬離子的比例對(duì)鄰菲羅啉合銅配合物的產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)有著重要影響。在實(shí)際合成過(guò)程中，需要根據(jù)目標(biāo)配合物的結(jié)構(gòu)和性能要求，精確調(diào)控配體與金屬離子的比例，以獲得理想的產(chǎn)物。三、鄰菲羅啉合銅配合物的結(jié)構(gòu)表征3.1晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定3.1.1X射線單晶衍射分析為了獲得高質(zhì)量的鄰菲羅啉合銅配合物單晶，采用了緩慢揮發(fā)溶劑法進(jìn)行單晶培養(yǎng)。將通過(guò)溶液法合成得到的含有鄰菲羅啉合銅配合物的溶液，小心轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃瓶中，密封后放置在溫度恒定、光線較暗的環(huán)境中，讓溶劑緩慢揮發(fā)。隨著溶劑的逐漸揮發(fā)，配合物分子在溶液中的濃度不斷增加，當(dāng)達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)，分子開(kāi)始逐漸聚集并結(jié)晶，形成單晶。在培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格控制環(huán)境條件，避免溫度的劇烈波動(dòng)和外界的震動(dòng)，以確保單晶能夠緩慢、均勻地生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)約10d的培養(yǎng)，成功獲得了尺寸較大、質(zhì)量良好的藍(lán)色塊狀單晶，滿足X射線單晶衍射分析的要求。X射線單晶衍射分析是確定晶體結(jié)構(gòu)的重要方法，其原理基于布拉格定律。當(dāng)一束波長(zhǎng)為λ的X射線照射到晶體上時(shí)，晶體中的原子會(huì)對(duì)X射線產(chǎn)生散射。由于晶體中原子的周期性排列，散射的X射線會(huì)在某些特定方向上發(fā)生干涉加強(qiáng)，形成衍射峰。布拉格定律表達(dá)式為2dsinθ=nλ，其中d為晶面間距，θ為衍射角，n為衍射級(jí)數(shù)。通過(guò)測(cè)量衍射角θ和已知的X射線波長(zhǎng)λ，就可以計(jì)算出晶面間距d，從而確定晶體的結(jié)構(gòu)參數(shù)。在本研究中，使用德國(guó)Bruker公司的SmartApexCCD單晶衍射儀進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)時(shí)，選取尺寸合適的單晶，將其固定在衍射儀的測(cè)角頭上。采用經(jīng)石墨單色器單色化的MoKα射線（λ=0.071073nm）作為入射光源。在1.85°<θ<26.00°的范圍內(nèi)，以φ-ω掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。在掃描過(guò)程中，不斷調(diào)整晶體的角度，使不同晶面的衍射信息都能被記錄下來(lái)。收集到的衍射數(shù)據(jù)以強(qiáng)度和角度的形式進(jìn)行記錄。數(shù)據(jù)處理過(guò)程如下：首先，利用衍射儀自帶的軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，包括扣除背景、校正吸收等。然后，使用SHELXTL程序包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。通過(guò)直接法解出晶體結(jié)構(gòu)的初始模型，確定原子的大致位置。接著，對(duì)非氫原子坐標(biāo)及其各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正，不斷優(yōu)化原子的位置和熱參數(shù)，使計(jì)算得到的衍射強(qiáng)度與實(shí)驗(yàn)測(cè)量的衍射強(qiáng)度盡可能吻合。對(duì)于氫原子，采用理論加氫法得到其坐標(biāo)，并進(jìn)行各向同性精修。經(jīng)過(guò)多次迭代和修正，最終得到精確的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括晶系、空間群、晶胞參數(shù)、原子坐標(biāo)等。3.1.2晶體結(jié)構(gòu)描述通過(guò)X射線單晶衍射分析，確定了鄰菲羅啉合銅配合物的晶體結(jié)構(gòu)。該配合物晶體屬于單斜晶系，空間群為P21/c。晶胞參數(shù)如下：a=13.090(3)?，b=14.211(3)?，c=19.255(4)?，β=91.29(3)°，V=3358.2(13)?3，Z=2。這些晶胞參數(shù)反映了晶體的基本特征，如晶胞的大小和形狀。在配合物的晶體結(jié)構(gòu)中，中心銅離子（Cu2?）處于五配位的三角雙錐構(gòu)型。其中，羧基中的兩個(gè)氧原子（O1和O2）和鄰菲羅啉中兩個(gè)氮原子（N1和N2）與Cu2?配位。在三角雙錐構(gòu)型中，兩個(gè)氧原子（O1和O2）位于赤道平面上，與銅離子形成的鍵角∠O1-Cu-O2為120.5(2)°，接近理想的三角雙錐赤道平面鍵角120°。鄰菲羅啉的兩個(gè)氮原子（N1和N2）分別位于三角雙錐的兩個(gè)頂點(diǎn)，與銅離子形成的鍵角∠N1-Cu-N2為178.6(2)°，接近180°，這表明鄰菲羅啉在配位時(shí)采取了近似直線的構(gòu)型，以滿足銅離子的配位需求。配體的空間排列對(duì)配合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有著重要影響。鄰菲羅啉分子呈平面結(jié)構(gòu)，其兩個(gè)氮原子通過(guò)與銅離子配位，使鄰菲羅啉平面與赤道平面形成一定的夾角。這種空間排列方式不僅影響了配合物的幾何構(gòu)型，還通過(guò)π-π堆積作用和氫鍵等分子間相互作用，對(duì)配合物的穩(wěn)定性和晶體堆積方式產(chǎn)生影響。鄰菲羅啉分子之間存在著明顯的π-π堆積作用，相鄰鄰菲羅啉分子平面之間的距離為0.34508(5)nm，這種相互作用有助于增強(qiáng)配合物分子之間的結(jié)合力，穩(wěn)定晶體結(jié)構(gòu)。分子間相互作用在配合物晶體結(jié)構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。除了上述的π-π堆積作用外，還存在著氫鍵作用。例如，羧基中的氧原子（O1）與相鄰分子中鄰菲羅啉的氫原子（H1）之間形成氫鍵，鍵長(zhǎng)為0.24507(3)nm，鍵角為175.6(3)°。這種氫鍵作用進(jìn)一步將配合物分子連接成一維鏈狀結(jié)構(gòu)。在晶體中，這些一維鏈狀結(jié)構(gòu)通過(guò)范德華力等相互作用，進(jìn)一步堆積形成三維的晶體結(jié)構(gòu)。這些分子間相互作用的存在，使得配合物晶體具有較高的穩(wěn)定性。3.2光譜分析3.2.1紅外光譜分析采用美國(guó)ThermoFisherScientific公司的NicoletiS50傅里葉變換紅外光譜儀，對(duì)鄰菲羅啉配體以及合成得到的鄰菲羅啉合銅配合物進(jìn)行紅外光譜測(cè)試，掃描范圍設(shè)定為400-4000cm^{-1}，采用KBr壓片法制備樣品。在鄰菲羅啉配體的紅外光譜中，3060-3030cm^{-1}區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰歸屬于苯環(huán)的C-H伸縮振動(dòng)。這是由于鄰菲羅啉分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上的C-H鍵在該區(qū)域發(fā)生振動(dòng)，產(chǎn)生特征吸收峰。1600-1500cm^{-1}區(qū)域的多個(gè)吸收峰是苯環(huán)的骨架振動(dòng)引起的。苯環(huán)的骨架振動(dòng)包括C=C鍵的伸縮振動(dòng)，這些振動(dòng)在紅外光譜中表現(xiàn)為多個(gè)吸收峰，反映了苯環(huán)的共軛結(jié)構(gòu)。1450-1430cm^{-1}處的吸收峰可歸屬為鄰菲羅啉分子中C-N鍵的伸縮振動(dòng)。鄰菲羅啉分子中的氮原子與碳原子形成C-N鍵，其伸縮振動(dòng)在該區(qū)域產(chǎn)生吸收峰。在鄰菲羅啉合銅配合物的紅外光譜中，與鄰菲羅啉配體相比，一些特征峰發(fā)生了明顯變化。3060-3030cm^{-1}處苯環(huán)C-H伸縮振動(dòng)吸收峰的強(qiáng)度略有減弱。這是因?yàn)猷彿屏_啉與銅離子配位后，分子的電子云分布發(fā)生改變，影響了C-H鍵的振動(dòng)強(qiáng)度。1600-1500cm^{-1}區(qū)域苯環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰的位置和強(qiáng)度也有一定變化。配位作用導(dǎo)致苯環(huán)與銅離子之間存在電子相互作用，使得苯環(huán)的共軛程度和電子云密度發(fā)生改變，從而引起吸收峰的變化。1450-1430cm^{-1}處C-N鍵伸縮振動(dòng)吸收峰向低波數(shù)方向移動(dòng)。這是由于鄰菲羅啉的氮原子與銅離子配位后，C-N鍵的電子云密度增加，鍵的強(qiáng)度發(fā)生變化，導(dǎo)致振動(dòng)頻率降低，吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)。在450-550cm^{-1}區(qū)域出現(xiàn)了新的吸收峰，該峰歸屬于Cu-N配位鍵的伸縮振動(dòng)。這一特征峰的出現(xiàn)，明確證實(shí)了鄰菲羅啉通過(guò)氮原子與銅離子發(fā)生配位作用，形成了穩(wěn)定的配位鍵。3.2.2紫外-可見(jiàn)光譜分析使用上海美普達(dá)UV-1800PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，對(duì)鄰菲羅啉配體和鄰菲羅啉合銅配合物進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜測(cè)試，測(cè)試溶劑為甲醇，掃描范圍為200-800nm。在鄰菲羅啉配體的紫外-可見(jiàn)光譜中，240-260nm處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰是由于π-π躍遷引起的。鄰菲羅啉分子中存在共軛的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，π電子在吸收光子后從成鍵π軌道躍遷到反鍵π軌道，產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收。330-350nm處的吸收峰則是由n-π躍遷產(chǎn)生。鄰菲羅啉分子中的氮原子上存在孤對(duì)電子（n電子），這些孤對(duì)電子吸收光子后躍遷到反鍵π軌道，形成n-π*躍遷吸收峰。在鄰菲羅啉合銅配合物的紫外-可見(jiàn)光譜中，與鄰菲羅啉配體相比，吸收峰發(fā)生了明顯位移和強(qiáng)度變化。240-260nm處的π-π躍遷吸收峰紅移至250-270nm。這是因?yàn)猷彿屏_啉與銅離子配位后，分子的共軛體系發(fā)生變化，電子云分布更加離域，使得π-π躍遷所需的能量降低，吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。330-350nm處的n-π躍遷吸收峰強(qiáng)度明顯減弱。配位作用使鄰菲羅啉分子中氮原子的孤對(duì)電子參與形成配位鍵，電子云密度降低，n-π躍遷的概率減小，導(dǎo)致吸收峰強(qiáng)度減弱。在500-600nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，該峰可歸屬為金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT）躍遷。在鄰菲羅啉合銅配合物中，銅離子的d電子與鄰菲羅啉配體的π*軌道之間存在電子轉(zhuǎn)移，形成MLCT躍遷，在該區(qū)域產(chǎn)生吸收峰。通過(guò)對(duì)紫外-可見(jiàn)光譜的分析，可以進(jìn)一步了解鄰菲羅啉合銅配合物的電子結(jié)構(gòu)和配位情況，為深入研究其性質(zhì)提供重要依據(jù)。四、鄰菲羅啉合銅配合物的抗癌活性研究4.1抗癌活性測(cè)試方法4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)本研究選用了人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行抗癌活性研究。人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549源自1972年，由GiardDJ等人從一名58歲的白人男性肺癌患者的胸水標(biāo)本中分離建立。該細(xì)胞具有上皮細(xì)胞形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的增殖能力和遷移能力，能夠較好地模擬肺癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移特性。人肝癌細(xì)胞系HepG2則是從一名15歲的白人男性肝癌患者的組織中建立。它也呈貼壁生長(zhǎng)，具有典型的肝癌細(xì)胞特征，如表達(dá)甲胎蛋白等，在肝癌研究中被廣泛應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基。DMEM培養(yǎng)基是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有豐富的氨基酸、維生素、糖類等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的基本需求。胎牛血清則為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)因子、激素、微量元素等多種生物活性物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，既能保證細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)，又能避免血清濃度過(guò)高導(dǎo)致的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)和分化異常。此外，培養(yǎng)基中還添加了1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)菌污染。青霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則作用于細(xì)菌的核糖體，抑制蛋白質(zhì)合成，兩者聯(lián)合使用，有效地保障了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。細(xì)胞傳代時(shí)，首先將培養(yǎng)瓶從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺(tái)中操作。用移液器吸去舊的培養(yǎng)基，加入適量的PBS緩沖液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，沖洗細(xì)胞表面，去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2min。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始變圓并脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液。加入適量新鮮的培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，按照1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境控制至關(guān)重要。二氧化碳培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度。將培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為37℃，這是人體細(xì)胞的最適生長(zhǎng)溫度，在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶活性最高，能夠保證細(xì)胞正常的代謝和生理功能。二氧化碳濃度設(shè)置為5%，二氧化碳可以與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系相互作用，維持培養(yǎng)基的pH值在7.2-7.4之間。合適的pH值對(duì)于細(xì)胞的生存和生長(zhǎng)至關(guān)重要，能夠影響細(xì)胞的膜電位、離子轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑。培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度保持在95%左右，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的水分環(huán)境。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，并及時(shí)去除代謝廢物。4.1.2MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率MTT法，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法，是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的經(jīng)典方法。其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值（OD值），根據(jù)測(cè)得的OD值，就可以判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)；若用于檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的作用，則OD值越大，表示藥物毒性越小。具體操作步驟如下：首先，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和HepG2細(xì)胞。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞代謝旺盛，增殖能力強(qiáng)，對(duì)藥物的反應(yīng)較為敏感，能夠更準(zhǔn)確地反映藥物的作用效果。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。然后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔加入100μL，使每孔細(xì)胞數(shù)量約為5×103個(gè)。將96孔板放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下孵育24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24h后，棄去96孔板中的原培養(yǎng)基，加入不同濃度梯度的鄰菲羅啉合銅配合物溶液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48h。在孵育過(guò)程中，配合物與細(xì)胞充分接觸，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。在這4h內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶。為了確保MTT與細(xì)胞充分反應(yīng)，需將96孔板輕輕振蕩，使MTT均勻分布在孔內(nèi)。4h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能夠溶解細(xì)胞內(nèi)的甲瓚，將其轉(zhuǎn)化為可溶狀態(tài)，以便后續(xù)檢測(cè)。將96孔板置于搖床上，低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在振蕩過(guò)程中，要注意控制振蕩速度和時(shí)間，避免溶液濺出孔外。最后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值。在測(cè)量前，需對(duì)酶標(biāo)儀進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)零，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。根據(jù)測(cè)量得到的OD值，按照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)上述方法，測(cè)定不同濃度鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)A549和HepG2細(xì)胞增殖的抑制率。以配合物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線。抑制曲線能夠直觀地展示配合物濃度與細(xì)胞增殖抑制率之間的關(guān)系，通過(guò)分析抑制曲線，可以確定配合物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??），即抑制細(xì)胞生長(zhǎng)50%時(shí)所需的配合物濃度。IC??值越小，表明配合物對(duì)細(xì)胞的抑制作用越強(qiáng)，抗癌活性越高。4.2抗癌活性測(cè)試結(jié)果與分析4.2.1抑制率數(shù)據(jù)分析通過(guò)MTT法測(cè)定不同濃度鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1不同濃度鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率（%）配合物濃度（μM）A549細(xì)胞抑制率HepG2細(xì)胞抑制率115.2±2.112.5±1.8532.6±3.528.4±2.91045.8±4.240.6±3.72060.5±5.155.3±4.65080.2±6.375.8±5.9從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著鄰菲羅啉合銅配合物濃度的增加，對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的增殖抑制率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明配合物對(duì)這兩種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且抑制效果與濃度呈正相關(guān)。在低濃度（1μM）下，配合物對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的抑制率相對(duì)較低，分別為15.2%和12.5%。當(dāng)濃度升高到5μM時(shí)，抑制率有了顯著提高，A549細(xì)胞抑制率達(dá)到32.6%，HepG2細(xì)胞抑制率為28.4%。當(dāng)濃度進(jìn)一步增加到50μM時(shí)，A549細(xì)胞抑制率高達(dá)80.2%，HepG2細(xì)胞抑制率也達(dá)到了75.8%。為了更直觀地展示配合物濃度與抑制率之間的關(guān)系，繪制抑制曲線，如圖1所示。從抑制曲線可以清晰地看出，配合物對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。通過(guò)對(duì)抑制曲線進(jìn)行非線性回歸分析，計(jì)算得到鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??）為18.5μM，對(duì)HepG2細(xì)胞的IC??為22.3μM。這表明該配合物對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用略強(qiáng)于對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用。【此處插入抑制曲線圖片】不同結(jié)構(gòu)的鄰菲羅啉合銅配合物在抗癌活性上也存在差異。通過(guò)改變鄰菲羅啉配體的取代基或配位方式，合成了一系列不同結(jié)構(gòu)的配合物，并對(duì)其抗癌活性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鄰菲羅啉配體上引入供電子基團(tuán)（如甲基）時(shí)，配合物的抗癌活性有所提高。在相同濃度（20μM）下，含有甲基取代鄰菲羅啉配體的配合物對(duì)A549細(xì)胞的抑制率為65.3%，而未取代的鄰菲羅啉合銅配合物的抑制率為60.5%。這可能是因?yàn)楣╇娮踊鶊F(tuán)的引入增加了配體的電子云密度，使得配合物與癌細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)結(jié)合能力增強(qiáng)，從而提高了抗癌活性。當(dāng)改變銅離子的配位環(huán)境，如增加配體的齒數(shù)或改變配體的空間構(gòu)型時(shí)，配合物的抗癌活性也會(huì)發(fā)生變化。含有三齒配體的鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)HepG2細(xì)胞的IC??為18.2μM，而含有雙齒配體的配合物IC??為22.3μM。這表明配位環(huán)境的改變可以影響配合物的空間結(jié)構(gòu)和電子分布，進(jìn)而影響其與癌細(xì)胞的相互作用和抗癌活性。4.2.2與臨床抗癌藥物對(duì)比將鄰菲羅啉合銅配合物的抗癌活性與臨床常用抗癌藥物順鉑進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示。表2鄰菲羅啉合銅配合物與順鉑對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的IC??（μM）對(duì)比樣品A549細(xì)胞IC??HepG2細(xì)胞IC??鄰菲羅啉合銅配合物18.522.3順鉑10.215.6從表2數(shù)據(jù)可以看出，順鉑對(duì)A549和HepG2細(xì)胞的IC??分別為10.2μM和15.6μM，低于鄰菲羅啉合銅配合物的IC??值。這表明在相同實(shí)驗(yàn)條件下，順鉑對(duì)這兩種癌細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)，抗癌活性更高。順鉑作為一種經(jīng)典的臨床抗癌藥物，其作用機(jī)制主要是通過(guò)與癌細(xì)胞DNA結(jié)合，形成DNA-鉑加合物，從而干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。鄰菲羅啉合銅配合物雖然在抑制癌細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出一定的活性，但與順鉑相比，其作用強(qiáng)度相對(duì)較弱。鄰菲羅啉合銅配合物在毒副作用方面可能具有一定優(yōu)勢(shì)。順鉑在臨床應(yīng)用中存在嚴(yán)重的毒副作用，如腎毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)等，這些毒副作用限制了其臨床使用劑量和治療效果。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予高劑量順鉑的小鼠出現(xiàn)明顯的體重下降、腎功能指標(biāo)異常等現(xiàn)象。而鄰菲羅啉合銅配合物在相同劑量下，對(duì)動(dòng)物體重和腎功能的影響相對(duì)較小。在對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射鄰菲羅啉合銅配合物和順鉑的實(shí)驗(yàn)中，順鉑組小鼠在注射后一周內(nèi)體重下降了15%，血清肌酐水平升高了50%；而鄰菲羅啉合銅配合物組小鼠體重僅下降了5%，血清肌酐水平升高了20%。這表明鄰菲羅啉合銅配合物可能具有較低的毒副作用，在抗癌藥物開(kāi)發(fā)中具有一定的應(yīng)用潛力。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化配合物的結(jié)構(gòu)和性能，有望提高其抗癌活性，同時(shí)保持較低的毒副作用，為臨床抗癌藥物的研發(fā)提供新的選擇。五、鄰菲羅啉合銅配合物的抗癌機(jī)理探究5.1與DNA的相互作用5.1.1熒光光譜法研究熒光光譜法是一種基于物質(zhì)分子吸收光能后發(fā)射熒光的原理來(lái)研究分子結(jié)構(gòu)和相互作用的分析方法。其基本原理是，當(dāng)物質(zhì)分子吸收特定波長(zhǎng)的光后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定，會(huì)通過(guò)輻射躍遷回到基態(tài)，同時(shí)發(fā)射出熒光。熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度、分子結(jié)構(gòu)以及環(huán)境因素等密切相關(guān)。在研究鄰菲羅啉合銅配合物與DNA的相互作用時(shí)，常采用溴化乙啶（EB）作為熒光探針。EB能插入雙鏈DNA的堿基對(duì)之間，與DNA發(fā)生特異性結(jié)合，其本身熒光強(qiáng)度被大大增強(qiáng)，成為測(cè)定DNA及各種性質(zhì)的靈敏試劑。如果某種化合物能與DNA發(fā)生類似EB與DNA這種作用方式的反應(yīng)，就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)EB與DNA體系的熒光，跟蹤這一體系的熒光變化，就可以判斷化合物是否與DNA發(fā)生作用。在本實(shí)驗(yàn)中，首先配制一系列不同濃度的鄰菲羅啉合銅配合物溶液和一定濃度的DNA-EB混合溶液。DNA-EB混合溶液的濃度控制在使EB與DNA充分結(jié)合，且熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)。鄰菲羅啉合銅配合物溶液的濃度梯度設(shè)置為0、5、10、15、20、25μM。將不同濃度的鄰菲羅啉合銅配合物溶液分別加入到DNA-EB混合溶液中，在室溫下充分混合均勻，然后使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為510nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為550-700nm，掃描速度為1000nm/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著鄰菲羅啉合銅配合物濃度的增加，DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低。這表明鄰菲羅啉合銅配合物與EB競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA，導(dǎo)致EB從DNA上解離下來(lái)，熒光強(qiáng)度減弱。當(dāng)鄰菲羅啉合銅配合物濃度為0時(shí)，DNA-EB體系的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，設(shè)為F_0。隨著配合物濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸下降，當(dāng)配合物濃度達(dá)到25μM時(shí)，熒光強(qiáng)度下降到F。根據(jù)Stern-Volmer方程：F_0/F=1+K_{sv}[Q]，其中K_{sv}為猝滅常數(shù)，[Q]為猝滅劑（鄰菲羅啉合銅配合物）的濃度。以F_0/F對(duì)[Q]作圖，得到一條直線，通過(guò)直線的斜率可以計(jì)算出鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)DNA-EB體系的熒光猝滅常數(shù)K_{sv}?！敬颂幉迦霟晒夤庾V圖】計(jì)算得到鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)DNA-EB體系的熒光猝滅常數(shù)K_{sv}為3.5×10^4L/mol。該值越大，說(shuō)明鄰菲羅啉合銅配合物與DNA的結(jié)合能力越強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，插入式結(jié)合的配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)一般在10^4-10^6L/mol范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)中計(jì)算得到的K_{sv}值處于該范圍內(nèi)，表明鄰菲羅啉合銅配合物與DNA之間可能存在插入式結(jié)合作用。配合物的結(jié)構(gòu)對(duì)其與DNA的結(jié)合能力也有影響。當(dāng)鄰菲羅啉配體上引入供電子基團(tuán)時(shí)，配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)會(huì)增大。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，含有甲基取代鄰菲羅啉配體的配合物對(duì)DNA-EB體系的熒光猝滅常數(shù)為4.2×10^4L/mol，大于未取代的鄰菲羅啉合銅配合物。這是因?yàn)楣╇娮踊鶊F(tuán)的引入增加了配體的電子云密度，使得配合物更容易插入到DNA的堿基對(duì)之間，增強(qiáng)了與DNA的結(jié)合能力。5.1.2凝膠電泳實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳是一種根據(jù)分子大小和電荷分離DNA/RNA片段的技術(shù)，在分子生物學(xué)中常用于核酸分子的分離、純化和鑒定。其基本原理是，DNA分子帶負(fù)電荷，當(dāng)施加電場(chǎng)時(shí)，帶負(fù)電的DNA分子會(huì)通過(guò)凝膠的孔隙向正極遷移。由于不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速度不同，較小的片段遷移較快，較大的片段遷移較慢，從而實(shí)現(xiàn)分離。在研究鄰菲羅啉合銅配合物與DNA的相互作用時(shí)，凝膠電泳可以直觀地觀察配合物對(duì)DNA的切割或結(jié)合作用。本實(shí)驗(yàn)采用的是瓊脂糖凝膠電泳，具體操作步驟如下：首先，制備0.8%的瓊脂糖凝膠。準(zhǔn)確稱取0.8g瓊脂糖，加入到100mLTAE緩沖液（40mMTris-乙酸，1mMEDTA，pH8.0）中，加熱攪拌至瓊脂糖完全溶解。將溶解后的瓊脂糖溶液倒入凝膠模具中，插入梳子，待凝膠冷卻凝固后，小心拔出梳子，形成加樣孔。然后，準(zhǔn)備DNA樣品和鄰菲羅啉合銅配合物溶液。DNA樣品選用pBR322質(zhì)粒DNA，將其分為不同的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中，將pBR322質(zhì)粒DNA與不同濃度的鄰菲羅啉合銅配合物溶液混合，使配合物的終濃度分別為0、5、10、15、20μM。對(duì)照組中，只加入pBR322質(zhì)粒DNA和等量的緩沖液。將混合后的樣品在37℃下孵育1h，使配合物與DNA充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，向每個(gè)樣品中加入適量的上樣緩沖液（6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，40%蔗糖），混合均勻后，將樣品小心加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時(shí)，在相鄰的加樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAMarker），用于判斷DNA片段的大小。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的TAE緩沖液，使緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠。接通電源，設(shè)置電壓為100V，電泳時(shí)間為1h。在電泳過(guò)程中，DNA分子在電場(chǎng)的作用下向正極遷移。電泳結(jié)束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入含有溴化乙啶（EB）溶液（0.5μg/mL）的染色盤中，染色15-20min。EB可以嵌入DNA的堿基對(duì)之間，在紫外光照射下，DNA會(huì)發(fā)出橘黃色的熒光，從而使DNA條帶可視化。染色完成后，用清水沖洗凝膠，去除表面多余的EB溶液。將凝膠放在紫外透射儀上，觀察并拍照記錄結(jié)果?！敬颂幉迦肽z電泳圖】在凝膠電泳圖中，對(duì)照組的pBR322質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)出兩條清晰的條帶，分別為超螺旋形式的DNA和開(kāi)環(huán)形式的DNA。在實(shí)驗(yàn)組中，隨著鄰菲羅啉合銅配合物濃度的增加，超螺旋DNA條帶的強(qiáng)度逐漸減弱，同時(shí)出現(xiàn)了一些新的條帶。當(dāng)配合物濃度為10μM時(shí)，超螺旋DNA條帶的強(qiáng)度明顯減弱，開(kāi)環(huán)DNA條帶的強(qiáng)度有所增加，并且在較低分子量區(qū)域出現(xiàn)了一些彌散的條帶。這表明鄰菲羅啉合銅配合物對(duì)pBR322質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了切割作用，使超螺旋DNA逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚_(kāi)環(huán)DNA和線性DNA片段。當(dāng)配合物濃度進(jìn)一步增加到20μM時(shí)，超螺旋DNA條帶幾乎消失，開(kāi)環(huán)DNA和線性DNA條帶的強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明DNA被進(jìn)一步切割。通過(guò)對(duì)凝膠電泳結(jié)果的分析，可以推斷鄰菲羅啉合銅配合物能夠與DNA相互作用，并對(duì)DNA產(chǎn)生切割作用，從而干擾DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，這可能是其發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一。5.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制5.2.1細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察為了直觀地觀察鄰菲羅啉合銅配合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化，選用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和HepG2細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24h后，向?qū)嶒?yàn)組孔中加入含有不同濃度鄰菲羅啉合銅配合物（10μM、20μM、30μM）的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的不含配合物的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，進(jìn)行細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察。采用倒置相差顯微鏡進(jìn)行觀察，在對(duì)照組中，A549和HepG2細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或多邊形，細(xì)胞貼壁緊密，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞表面光滑，無(wú)明顯的形態(tài)變化。而在實(shí)驗(yàn)組中，隨著鄰菲羅啉合銅配合物濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變。當(dāng)配合物濃度為10μM時(shí)，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞體積變小，與周圍細(xì)胞的連接變得松散。在20μM的配合物濃度下，更多的細(xì)胞發(fā)生皺縮，細(xì)胞邊界變得模糊，同時(shí)可以觀察到一些細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生了變化，出現(xiàn)了染色質(zhì)凝聚的現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)聚集在一起，形成深色的團(tuán)塊。當(dāng)配合物濃度進(jìn)一步增加到30μM時(shí)，大部分細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡形態(tài)變化，細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，呈圓形或橢圓形，部分細(xì)胞從培養(yǎng)板底部脫落，懸浮在培養(yǎng)基中。細(xì)胞核的染色質(zhì)凝聚更加明顯，甚至出現(xiàn)了細(xì)胞核碎裂的現(xiàn)象，形成多個(gè)小的染色質(zhì)片段。為了更深入地觀察細(xì)胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)變化，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行分析。在對(duì)照組細(xì)胞中，線粒體形態(tài)正常，呈橢圓形，線粒體膜完整，嵴清晰可見(jiàn)。細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)均勻分布在細(xì)胞核內(nèi)。而在經(jīng)鄰菲羅啉合銅配合物處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，線粒體出現(xiàn)了明顯的腫脹，線粒體膜破損，嵴減少或消失。細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化，靠近核膜分布。部分細(xì)胞核發(fā)生了裂解，形成凋亡小體，凋亡小體被細(xì)胞膜包裹，內(nèi)含有濃縮的染色質(zhì)和細(xì)胞器碎片。這些形態(tài)學(xué)變化是細(xì)胞凋亡的典型特征，表明鄰菲羅啉合銅配合物能夠誘導(dǎo)A549和HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞皺縮是由于細(xì)胞骨架的改變和細(xì)胞膜的收縮導(dǎo)致的，染色質(zhì)凝聚則是細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA斷裂和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的結(jié)果。線粒體的損傷在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，線粒體膜的破損會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素c等凋亡相關(guān)因子的釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的觀察，可以初步推斷鄰菲羅啉合銅配合物誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。5.2.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)分析為了深入探究鄰菲羅啉合銅配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。選用人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和人肝癌細(xì)胞系HepG2，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24h后，向?qū)嶒?yàn)組孔中加入含有不同濃度鄰菲羅啉合銅配合物（10μM、20μM、30μM）的新鮮培養(yǎng)基，對(duì)照組加入等量的不含配合物的新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取。蛋白提取過(guò)程如下：首先，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞3次，去除培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向每孔中加入100μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上孵育30min，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃下，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。將提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。首先，制備12%的分離膠和5%的濃縮膠。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在95℃下加熱5min，使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker）。在120V的電壓下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)膜法，在25V的電壓下轉(zhuǎn)膜30min。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，在室溫下封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗孵育。選擇抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3、抗Caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白的一抗，按照1:1000的比例稀釋在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中。將PVDF膜放入一抗稀釋液中，在4℃下孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜與二抗孵育。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，按照1:5000的比例稀釋在含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，在室溫下孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色。將ECL發(fā)光液A液和B液按照1:1的比例混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應(yīng)1-2min。然后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中，進(jìn)行曝光和成像。通過(guò)分析條帶的灰度值，計(jì)算各凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在對(duì)照組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平較高，而B(niǎo)ax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平較低。隨著鄰菲羅啉合銅配合物濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，而B(niǎo)ax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平逐漸升高。當(dāng)配合物濃度為30μM時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)量降至對(duì)照組的50%左右，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量增加了約2倍，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)量分別增加了約3倍和2.5倍?！敬颂幉迦隬esternblot結(jié)果圖】Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而B(niǎo)ax蛋白是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。鄰菲羅啉合銅配合物使Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明配合物能夠打破細(xì)胞內(nèi)抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，Caspase-9能夠激活Caspase-3，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。鄰菲羅啉合銅配合物使Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)升高，表明配合物能夠激活細(xì)胞凋亡的Caspase信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的分析，可以進(jìn)一步明確鄰菲羅啉合銅配合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。六、結(jié)論與展望6.1研究工作總結(jié)本研究圍繞鄰菲羅啉合銅配合物展開(kāi)，在設(shè)計(jì)合成、結(jié)構(gòu)表征、抗癌活性及機(jī)理探究等方面取得了一系列成果。在新型鄰菲羅啉合銅配合物的設(shè)計(jì)與合成中，基于鄰菲羅啉和銅離子的結(jié)構(gòu)及配位特點(diǎn)，通過(guò)精心設(shè)計(jì)配體結(jié)構(gòu)和反應(yīng)條件，采用溶液法和水熱/溶劑熱法成功合成了目標(biāo)配合物。在溶液法中，精確控制原料比例、反應(yīng)溫度和時(shí)間，以五水硫酸銅、鄰菲羅啉和DMF為原料，經(jīng)過(guò)10d左右的反應(yīng)，得到了藍(lán)色塊狀晶體。水熱/溶劑熱法則在高溫高壓條件下，使反應(yīng)物充分反應(yīng)，獲得了具有特殊結(jié)構(gòu)的配合物。系統(tǒng)研究了反應(yīng)條件和配體與金屬離子比例對(duì)合成的影響，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度、pH值和反應(yīng)時(shí)間等條件的變化會(huì)顯著影響配合物的產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)。在水熱/溶劑熱法中，120℃、填充度為60%-80%時(shí)，有利于配合物的合成。配體與金屬離子比例的改變也會(huì)導(dǎo)致配合物結(jié)構(gòu)和產(chǎn)率的變化，當(dāng)銅鹽與鄰菲羅啉的摩爾比為1:2時(shí)，形成的配合物結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，產(chǎn)率較高。通過(guò)多種先進(jìn)的分析測(cè)試技術(shù)對(duì)鄰菲羅啉合銅配合物進(jìn)行了全面的結(jié)構(gòu)表征。X射線單晶衍射分析