DBS13河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布IDBS13/001—2015本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009規(guī)定的格式編寫。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)于2015年4月23日首次發(fā)布。1DBS13/001—2015食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)食品中諾如病毒檢測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類、生食葉類蔬菜和包裝飲用水等食品中諾如病毒普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類、生食葉類蔬菜和包裝飲用水等食品中GⅠ型和GⅡ型諾如病毒的檢測(cè)。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。諾如病毒norovirus諾如病毒屬于人類杯狀病毒科，諾如病毒屬，是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾如病毒直徑約為26nm～35nm，無(wú)包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對(duì)稱。諾如病毒基因組是單股正鏈RNA，組成長(zhǎng)約7kb～7.5kb，電鏡下缺乏顯著的形態(tài)學(xué)特征，負(fù)染色電鏡照片顯示，諾如病毒是具有典型的羽狀邊緣、表面有凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)病毒。諾如病毒共可分為GⅠ~GⅤ5個(gè)基因型，其中感染人的主要是GⅠ型和GⅡ型。3設(shè)備和材料3.1電子天平：感量0.1g。3.2組織勻漿器或其他可以破碎樣品的工具。3.3普通冰箱：2℃~8℃。3.4超低溫冰箱：-80℃±5℃。3.5高速冷凍離心機(jī)：最大離心力大于15000g。3.6恒溫水浴箱或金屬?。?7℃~65℃。3.7PCR擴(kuò)增儀。3.8實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀。3.9電泳儀。3.10凝膠成像系統(tǒng)。3.11震蕩混勻器。3.12電熱干燥箱。DBS13/001—201523.13pH計(jì)。3.14水過(guò)濾系統(tǒng)。3.16洗耳球或電動(dòng)移液器。3.17無(wú)RNA酶的玻璃容器、微量加樣器吸頭、無(wú)菌50mL離心管、無(wú)菌1.5mL離心管和PCR管。3.18無(wú)RNA酶的一次性移液管：10mL、25mL。3.19混合硝酸纖維素膜：孔徑0.22μm。4試劑除有特殊說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。4.1無(wú)RNA酶的超純水：見(jiàn)附錄A.1。4.2甘氨酸緩沖液：見(jiàn)附錄A.2。4.35XPEG8000溶液：見(jiàn)附錄A.3。4.42.5mol/L氯化鎂(MgCl2)溶液：見(jiàn)附錄A.4。4.5牛肉膏-甘氨酸洗脫液:見(jiàn)附錄A.5。4.6氯仿。4.71mol/L鹽酸溶液。4.81mol/L氫氧化鈉溶液。4.9病毒RNA提取試劑盒。4.10TaqDNA聚合酶：-20℃保存，避免反復(fù)凍融。4.11逆轉(zhuǎn)錄酶：-20℃保存，避免反復(fù)凍融。4.12RNA酶抑制劑：-20℃保存，避免反復(fù)凍融。4.13dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。4.14引物和探針：使用濃度為25μmol/L，-20℃保存，引物和探針序列見(jiàn)表1和表2。表1普通RT-PCR檢測(cè)引物正向引物F:5’-ATACCACTATGATGCAGATTA-3’反向引物R:5’-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3’3表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)引物和探針正向引物F:5'-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’反向引物R:5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’探針:5’-FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA-3’正向引物F:5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’反向引物R:5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’探針:5’-FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA-3’4.151×TAE：見(jiàn)附錄A.6。4.16分子量標(biāo)記：100bp～1000bp。4.17諾如病毒陽(yáng)性對(duì)照。4.18諾如病毒陰性對(duì)照。4.19溴化乙錠（EB）溶液（10μg/μL）：見(jiàn)附錄A.7。4.2010×上樣緩沖液：見(jiàn)附錄A.8。4.21含0.5μg/mL溴化乙錠（或5%GoldView）的1.5%瓊脂糖凝膠：見(jiàn)附錄A.9。5檢測(cè)程序諾如病毒檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。4貝類消化腺5g+35mL甘氨酸緩沖液生食葉類蔬菜25g+40mL甘氨酸緩沖液包裝飲用水500mL+10mLMgCl?溶液切碎，孵育或震蕩，4℃離心30min調(diào)pH至3.0,過(guò)濾上清+10mL氯仿萃取，4℃夜，離心5夜，離心5min濾膜+10mL牛肉膏-甘氨酸洗脫20-30min,去除濾膜冰上1h或4℃過(guò)夜，離心5min60℃溶解5min,離心取上清。病毒粗提產(chǎn)物結(jié)果報(bào)告運(yùn)輸過(guò)程中保持樣品溫度在0℃~5℃。實(shí)驗(yàn)室接到樣品后應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)。如果暫時(shí)不能檢測(cè)應(yīng)6.2.1.2按無(wú)菌操作取5g消化腺組織，在組織勻漿器中高速勻漿3min或切碎成2mm3以下的小塊，放入50mL離心管中，加入35mL甘氨酸緩沖液(樣品重量與緩沖液體積之比為1:7),37℃孵育30minDBS13/001—20155或室溫下劇烈振蕩10min。4℃,10000g離心30min。6.2.1.3轉(zhuǎn)移上清液至另一個(gè)50mL離心管中，加入10mL或更多氯仿，充分振蕩，放置10min，4℃,10000g離心30min。如上清較渾濁，可重復(fù)用氯仿再抽提一次。6.2.1.4轉(zhuǎn)移上清至另一個(gè)50mL離心管中，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5，加入0.25倍體積的PEG8000溶液（PEG終濃度為8%），上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.1.5冰上放置至少1h或4℃放置過(guò)夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.1.6加入200μL無(wú)RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產(chǎn)物。6.2.2生食葉類蔬菜6.2.2.1使用無(wú)菌的剪刀和鑷子將25g生食葉類蔬菜剪成約2.5cm×2.5cm×2.5cm的小塊，裝入50mL6.2.2.2轉(zhuǎn)移上清至另一個(gè)50mL離心管中，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5，加入0.25倍體積的PEG8000溶液，上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.2.3冰上放置至少1h或4℃放置過(guò)夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.2.4加入200μL無(wú)RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產(chǎn)物。6.2.3包裝飲用水6.2.3.1500mL水樣中加入10mL的2.5mol/L氯化鎂溶液，使其終濃度達(dá)到0.05mol/L；用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)水樣pH至3.0±0.5。6.2.3.2采用真空抽濾使之通過(guò)孔徑為0.22μm的混合硝酸纖維素膜（混濁度較大的污水,需預(yù)先澄清），然后用10mL牛肉膏-甘氨酸洗脫液（pH9.5）震蕩洗脫濾膜20～30min。6.2.3.3去除濾膜，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)洗脫液pH至7.0±0.5，向洗脫液中加入0.25倍體積的PEG8000溶液，上下顛倒離心管以充分混勻。6.2.3.4將離心管及樣液一起放在冰上放置至少1h或4℃放置過(guò)夜。4℃,10000g離心5min。棄去上清，保留沉淀。6.2.3.5加入200μL無(wú)RNA酶的超純水，60℃加熱5min充分溶解沉淀。4℃,10000g離心3min，取上清，得到病毒粗提產(chǎn)物。6.3病毒RNA的提取和純化使用病毒RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的提取和純化，采用如下方法，或根據(jù)儀器和試劑盒要求調(diào)整操作步驟。6.3.1在核酸提取板每孔中加入20μL磁珠混合物，加入200μL病毒粗提產(chǎn)物，加入500μL含有CarrierRNA的裂解/結(jié)合混合液，混勻后震蕩5min使裂解完全。6.3.2提取板放置磁性抽提架上至少3min以捕獲磁珠（捕獲的時(shí)間取決于磁架的類別和型號(hào)）。當(dāng)捕獲完全，磁珠會(huì)在磁架上形成顆粒。DBS13/001—201566.3.3棄去上清，加入300μL漂洗液1，震蕩1min，在磁架上放置1min，棄去上清。6.3.4重復(fù)上一步驟一次。6.3.5加入450μL漂洗液2，震蕩1min，在磁架上放置1min，棄去上清。6.3.6重復(fù)上一步驟一次。6.3.7離心2min，去除漂洗液和酒精。6.3.8加入60μL室溫或預(yù)熱至60℃~65℃的洗脫液，震蕩3min，放置磁架上1min，轉(zhuǎn)移上清至另一個(gè)1.5mL離心管中，-20℃保存純化的RNA。注意事項(xiàng)：為防止RNA降解，所用實(shí)驗(yàn)用具及溶液應(yīng)無(wú)RNA酶，操作過(guò)程中應(yīng)自始至終佩戴一次性橡膠或乳膠手6.4病毒核酸檢測(cè)兩種方法可任選一種。6.4.1普通RT-PCR法6.4.1.1普通RT-PCR反應(yīng)體系一步法普通RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3。每個(gè)反應(yīng)體系設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。以諾如病毒RNA為陽(yáng)性對(duì)照，以不含有諾如病毒RNA作為陰性對(duì)照，以水代替模板作為空白對(duì)照。表3普通RT-PCR反應(yīng)體系————6.4.1.2普通RT-PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件為：7或根據(jù)試劑要求調(diào)整反應(yīng)條件。6.4.1.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)用電泳緩沖液（1×TAE）、0.5μg/mL溴化乙錠（或GoldView等核酸染料）配制1.5%的瓊脂糖凝膠（見(jiàn)附錄A.9）。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。將9μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加1μL10×上樣緩沖液，點(diǎn)樣，電泳。電壓根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度來(lái)確定，一般控制在3V/cm～5V/cm，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到凝膠邊緣時(shí)關(guān)閉電源。凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，獲取并保存圖像。6.4.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法6.4.2.1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系一步法RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表4。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。以諾如病毒RNA為陽(yáng)性對(duì)照，以不含有諾如病毒RNA作為陰性對(duì)照，以水代替模板作為空白對(duì)照。表4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系————6.4.2.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件為：或根據(jù)試劑要求調(diào)整反應(yīng)條件。45個(gè)循環(huán)7結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)7.1普通RT-PCR法如果陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條326bp大小的條帶，而樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則可判定樣品為諾如病毒陰性。如果陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)一條326bp大小的條帶，樣品也出現(xiàn)預(yù)期大小條帶，則可判定樣品為諾如病毒陽(yáng)性。7.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法DBS13/001—20158待測(cè)樣品的Ct值大于或等于45時(shí)，則判定諾如病毒陰性。待測(cè)樣品的Ct值小于或等于30時(shí)，則判定諾如病毒陽(yáng)性。待測(cè)樣品的Ct值小于45而大于30時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行測(cè)試，如果重測(cè)樣品的Ct值大于或等于45時(shí)，則判定諾如病毒陰性；如果重測(cè)樣品的Ct值小于45時(shí)，則判定諾如病毒陽(yáng)性。8結(jié)果報(bào)告8.1陰性結(jié)果報(bào)告方式若貝類檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為5g貝類消化腺未檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為25g生食葉類蔬菜未檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測(cè)結(jié)果為陰性，則結(jié)果報(bào)告為500mL包裝飲用水未檢出諾如病毒。8.2陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告方式若貝類檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為5g貝類消化腺檢出諾如病毒。若生食葉類蔬菜檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為25g生食葉類蔬菜檢出諾如病毒。若包裝飲用水檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果報(bào)告為500mL包裝飲用水檢出諾如病毒。DBS13/001—20159（規(guī)范性附錄）試劑的配制除有特殊說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。RNA酶的去除和無(wú)RNA酶溶液的配制：配制溶液用的液體和固體應(yīng)采用未開(kāi)封的新品。配制溶液所用的超純水、玻璃容器、移液器吸頭、藥匙等用具應(yīng)無(wú)RNA酶。操作過(guò)程中應(yīng)始終佩戴乳膠手套，并經(jīng)常更換，以避免皮膚上的細(xì)菌和真菌及人體自身分泌的RNA酶污染用具或帶入溶液。玻璃容器應(yīng)在240℃烘烤4h以去除RNA酶。離心管、移液器吸頭、藥匙等用具可購(gòu)買無(wú)RNA酶級(jí)別的，或用0.1%的焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液室溫浸泡過(guò)夜，然后高壓滅菌并烘干。A.1無(wú)RNA酶的超純水A.1.1成分超純水1000.0mL焦炭酸二乙酯（DEPC）1.0mLA.1.2制法避光，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，121℃高壓滅菌15min，備用。A.2甘氨酸緩沖液（含0.1mol/L甘氨酸，0.3mol/L氯化鈉，pH9.5）A.2.1成分甘氨酸7.50g氯化鈉17.55gA.2.2制法將上述各成分?jǐn)嚢枞芙庥诔兯?，調(diào)節(jié)pH至9.5，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.35XPEG8000溶液[含40%（w/v）PEG8000，1.5mol/L氯化鈉]A.3.1成分PEG8000400.0g氯化鈉87.0gA.3.2制法將上述各成分?jǐn)嚢枞芙庥诔兯?，用超純水定容?000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備A.42.5mol/L氯化鎂(MgCl2)溶液A.4.1成分氯化鎂（MgCl2）238.0gA.4.2制法將上述各成分?jǐn)嚢枞芙庥诔兯?，用超純水定容?000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.5牛肉膏-甘氨酸洗脫液（含3％牛肉膏,0.05mol/L甘氨酸,pH9.5）A.5.1成分牛肉膏30.0g甘氨酸3.75gA.5.2制法將上述各成分?jǐn)嚢枞芙庥诔兯?，調(diào)節(jié)pH至9.5，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.61×TAE電泳緩沖液A.6.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液，pH8.0A.6.1.1成分乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2·2H2O）186.1gA.6.1.2制法將上述各成分?jǐn)嚢枞芙庥诔兯校{(diào)節(jié)pH至8.0，用超純水定容至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。A.6.250×TA