動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primaryculture)細(xì)胞系(establishedcellline)細(xì)胞培養(yǎng)的定義和分類貼壁培養(yǎng)(adherent)懸浮培養(yǎng)(suspension)含血清培養(yǎng)(serum-containing)無血清培養(yǎng)(serum-free)器官培養(yǎng)(organculture)組織培養(yǎng)(tissueculture)細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)………..通過人工手段，將細(xì)胞從所附著的組織或器官上分離下來，在體外模擬其體內(nèi)的生長環(huán)境，進(jìn)行培養(yǎng)的過程。物理性：設(shè)備、環(huán)境等化學(xué)性：培養(yǎng)液、生長因子、激素、血清等一、細(xì)胞培養(yǎng)的條件無菌操作條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌鍋細(xì)胞培養(yǎng)與檢測條件：純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，正置顯微鏡，電子天平，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件：液氮罐，凍存管實(shí)驗(yàn)室安全細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備條件凈化工作室我國藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn)超凈工作臺(tái)Biosafetyhood超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)箱IncubatorCO2培養(yǎng)箱主要控制模擬活體內(nèi)環(huán)境相關(guān)的3個(gè)基本變量：穩(wěn)定的CO2水平、溫度、相對(duì)濕度。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2h）。主要用于玻璃器皿消毒高壓滅菌鍋：高壓蒸汽滅菌（121℃，20-30min）過濾裝置：過濾除菌。大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等消毒滅菌裝置顯微鏡Microscope熒光倒置顯微鏡相差顯微鏡純水系統(tǒng)WaterpurificationsystemFlaskanddishMultiwellplates培養(yǎng)器皿plasticwareandglassware細(xì)胞凍存設(shè)備-液氮罐微孔板振蕩器酶標(biāo)儀微量移液器離心機(jī)濕度、溫度、酸度、滲透壓、氣體、生長表面等溫度：哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常37

C。細(xì)胞耐受低溫的能力強(qiáng)于高溫濕度：飽和濕度酸度：通常pH7.2-7.4，主要受培養(yǎng)液中NaHCO3和培養(yǎng)箱中CO2影響，細(xì)胞可耐受范圍6.5-7.8滲透壓：通常290-310mOsm。影響因素包括培養(yǎng)液中鹽、糖、氨基酸等細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件氣體：通常5％CO2，

90-95％air（18%O2）培養(yǎng)基/培養(yǎng)液(culturemedium)培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：如血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。來源受限；成分復(fù)雜，影響某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和結(jié)果的分析；易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成。如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它輔助物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定；成本低。缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。各種培養(yǎng)基成分有較大差異，適用細(xì)胞種類不同儲(chǔ)存時(shí)間：1-2monthat2-10

CpH：7.2-7.4緩沖成分：NaHCO3,HepesGlucose：highorlow抗生素添加與否過濾除菌：0.22μm水的質(zhì)量控制（去離子水或三蒸水）酚紅等指示劑的選用培養(yǎng)液配置人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和增殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清（serum）的應(yīng)用含有許多營養(yǎng)物質(zhì)如：蛋白、激素、生長因子、細(xì)胞因子、維生素等是很好的緩沖系統(tǒng)含轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白等，具抗氧化活性含有貼壁因子或粘附蛋白可以幫助細(xì)胞貼壁對(duì)于重金屬有解毒的作用成分復(fù)雜，其中的一些物質(zhì)能干擾受體的檢測和各種因子作用機(jī)制的研究能促使成纖維細(xì)胞過量生長，故對(duì)上皮細(xì)胞培養(yǎng)不利每批血清中所含貼壁因子的濃度不同，可以影響貼壁實(shí)驗(yàn)的結(jié)果血清種類胎牛血清（FCS）、犢牛血清（FBS）、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以FCS質(zhì)量最好。血清的滅活目的：使血清中的補(bǔ)體成分失活方法：56

C，30min血清的批間差異來源：動(dòng)物飼養(yǎng)方式、季節(jié)、血清處理步驟質(zhì)量穩(wěn)定性控制：檢測小樣品質(zhì)量，選擇最佳者，大批購買，分裝后-20

C或-80

C儲(chǔ)存激素和生長因子（growthfactors)外源添加用于特殊細(xì)胞功能的維持、無血清培養(yǎng)體系的營養(yǎng)供給等。包括激素、生長因子、細(xì)胞因子、維生素、促神經(jīng)因子等。名稱使用濃度EGF0.1-10ng/mlaFGF1-10ng/mlbFGF1-10ng/mlPDGF1-50ng/mlTGFb0.1-10ng/mlactivin1-100ng/mlinhibin1-100ng/mlNGF1-10ng/mlTNF0.1-100ng/mlGM-CSF0.01-1

g/mlErythopoietin(EPO)0.01-1

g/mlinterleukins1-100ng/mltransferrin1-5

g/mlBSA1-25

g/ml名稱使用濃度hydrocortison10-8Mtestosterone10-9-10-7Mestrodial10-9-10-8Mprogesterone10-9-10-7MFSH1ng-1

g/mlLH1ng-1

g/mlGnRH1-10ng/mlPGE110-100ng/mlPGE2a10-100ng/mlfibronectin10

g/mllaminin10

g/mlRetinoidacid10-50ng/mlinsulin0.1-10

g/mlVitaminD10-2000ng/ml無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株。無血清培養(yǎng)液（Serum-freemedium）培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，分別作用于G+和G-菌。有時(shí)也用慶大霉素（100IU/ml）：方便、廣譜、穩(wěn)定?；A(chǔ)培養(yǎng)基80-95％血清5-20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100IU／ml完全培養(yǎng)液組成無菌操作要點(diǎn)細(xì)胞原代培養(yǎng)(primaryculture)細(xì)胞傳代培養(yǎng)(passage/subculture)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇(freezeandthaw)細(xì)胞克隆(cloning)二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)培養(yǎng)前準(zhǔn)備在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品。玻璃用品需清洗、泡酸、沖洗，與槍頭、epp管等高壓滅菌后烘干；生理鹽水、PBS等高壓滅菌。少量多次！將各種物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。操作野消毒在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換?；鹧嫦九c無菌操作洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液擦手。Whydoprimaryculture?沒有現(xiàn)成的細(xì)胞系模型有些細(xì)胞不增殖，如神經(jīng)元、肌細(xì)胞、T細(xì)胞等有些細(xì)胞系未能很好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的分化狀態(tài)特殊病理狀態(tài)的標(biāo)本DrawbackoftheprimarycultureTimeconsumingUsingofliveanimalsorfreshtissuesVariationfromonepreparationtoanotherDurationofcellmaintenanceUsuallycontainingmixedcelltypesContaminationThinkbeforeprimaryculture細(xì)胞純度、活力及產(chǎn)量的平衡用什么標(biāo)志分子來鑒定所需的細(xì)胞確定所選用動(dòng)物種類、性別、年齡、處理方式所需細(xì)胞所在的器官或組織，其豐度如何多種細(xì)胞混和培養(yǎng)或純化單一細(xì)胞基本方法獲取無菌組織并漂洗，剔除多余血塊和雜質(zhì)，組織剪碎蛋白酶消化（胰酶37

C消化0.5h左右）或機(jī)械分離（尼龍網(wǎng)或銅網(wǎng)過濾）接種培養(yǎng)（培養(yǎng)瓶蓋擰緊后松半圈）蛋白酶消化分離細(xì)胞消化酶的選擇胰蛋白酶Trypsin:終濃度0.25%，作用強(qiáng)，能有效去除成纖維細(xì)胞，對(duì)上皮細(xì)胞有損害，需要無Ca2+、Mg2+的緩沖液膠原酶Collagenase：去除組織周圍的基質(zhì)成分以分散細(xì)胞，需要Ca2+協(xié)助作用分散酶Dispase：通常與collagenase聯(lián)用，作用較緩和DNase：有效去除消化過程中破裂細(xì)胞釋放的DNA消化溫度的選擇37

C：酶作用的最佳溫度，但對(duì)先消化下來的細(xì)胞活力損傷大，尤其是trypsin；可通過短時(shí)多次消化法來克服4-9

C：消化緩慢，但對(duì)細(xì)胞活力保持較好細(xì)胞的進(jìn)一步純化方法密度梯度沉降法：Percoll、Ficoll、BSA等差異貼壁法：利用不同細(xì)胞貼壁特性的差異進(jìn)行分離免疫標(biāo)記法：利用細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)特異標(biāo)志分子的抗體進(jìn)行分離條件培養(yǎng)法：采用最有利于某種細(xì)胞生長的培養(yǎng)條件進(jìn)行細(xì)胞篩選群體倍增次數(shù)和傳代次數(shù)Populationdoubling(PD)&passage(P)Y=X·2nY最終細(xì)胞數(shù)量X開始接種的細(xì)胞數(shù)量懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新鮮培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長細(xì)胞傳代呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢（如Hela細(xì)胞），可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。貼壁生長細(xì)胞傳代酶消化法傳代：常用含0.25％的胰蛋白酶的消化液。細(xì)胞傳代的方法去除培養(yǎng)液:用移液槍，勿傾倒，注意細(xì)胞貼壁緊密與否無Ca2+、Mg2+PBS洗一遍加入消化液（含0.25%trypsin/0.02%EDTA的無Ca2+、Mg2+PBS），室溫或37C消化約5min，鏡檢細(xì)胞是否圓縮、脫落加入含血清的培養(yǎng)液，中止消化反應(yīng)按照一定的傳代比例接種于培養(yǎng)皿記錄細(xì)胞的傳代時(shí)間、PD、傳代比例等信息貼壁細(xì)胞傳代的基本方法每種細(xì)胞傳代的比例盡可能穩(wěn)定接種細(xì)胞數(shù)目不可太低，以保證細(xì)胞的self-condition能力細(xì)胞的外環(huán)境不可太大培養(yǎng)液更換勿過于頻繁，尤其當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)可大量獲得的原代培養(yǎng)細(xì)胞：如胚胎成纖維細(xì)胞建系過程中，較早代數(shù)的細(xì)胞和隨后每3-5代的細(xì)胞細(xì)胞呈現(xiàn)新的特征和功能時(shí)特殊病理組織來源的細(xì)胞特殊需求或進(jìn)行特殊改造的細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞庫長途運(yùn)輸……需要凍存凍融過程導(dǎo)致混合細(xì)胞中各種細(xì)胞的比例發(fā)生改變對(duì)大鼠或小鼠細(xì)胞，凍融有時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核型發(fā)生改變長時(shí)間凍存導(dǎo)致細(xì)胞活力下降有時(shí)會(huì)發(fā)生細(xì)胞之間的交叉污染或支原體污染劣勢細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞在零度以下，可以導(dǎo)致細(xì)胞器脫水，細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，產(chǎn)生大的冰晶，造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂?？烊趶?fù)蘇的目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。凍存原則：慢凍速融，減輕冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷冷凍保護(hù)劑的使用常用DMSO，滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，并能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存的基本方法細(xì)胞消化洗滌后，用凍存液懸浮，加入凍存管內(nèi)冷凍凍存液現(xiàn)用現(xiàn)配：10-20％血清+10％DMSO或甘油+70-80％培養(yǎng)液凍存體積要?。?.5-1ml凍存細(xì)胞數(shù)目與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化，一般準(zhǔn)備凍存的細(xì)胞不需長滿，1：2凍存“緩凍”：4C，0.5-1h-20C，1-2h-80C或氣態(tài)液氮，0.5-1h-196C液氮，1-2year

完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，PD，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等程序降溫儀凍存細(xì)胞的復(fù)蘇將凍存的細(xì)胞解凍并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞庫內(nèi)的細(xì)胞每1-2年必須復(fù)蘇一次“速融”：快速將凍存細(xì)胞置于37C環(huán)境，迅速解凍培養(yǎng)液等要預(yù)熱至37C解凍后的細(xì)胞要認(rèn)真記錄傳代次數(shù)影響復(fù)蘇效率的因素：復(fù)蘇溫度、凍存條件、細(xì)胞特性保持液氮罐內(nèi)的液氮量，經(jīng)常監(jiān)測溫度細(xì)胞系（CellLine）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（LineageofCells）所組成。細(xì)胞株（CellStrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整個(gè)培養(yǎng)期間始終存在。有限細(xì)胞株（finitecellstrain）：不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限；連續(xù)細(xì)胞株（continuouscellstrain）：可以連續(xù)傳代。細(xì)胞克?。–ellcloning）：分離單個(gè)細(xì)胞并以此細(xì)胞發(fā)展出特性穩(wěn)定的細(xì)胞群體。應(yīng)用：單克隆抗體制備、細(xì)胞基因突變或轉(zhuǎn)染、從各種細(xì)胞世系中篩選特殊特性的細(xì)胞。

有限稀釋法：

適用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞克隆方法將細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋成10-100cells/ml懸液在96孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞，50-100ul/well12-24h后，觀察細(xì)胞生長狀況，標(biāo)記出只有一個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔通過Westernblotting或ELISA等手段篩選所需的單克隆逐漸傳代至24孔培養(yǎng)板、35mm平皿、25cm2培養(yǎng)瓶等，并經(jīng)常凍存一部分細(xì)胞

克隆環(huán)(cloningring)：

適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞克隆方法將細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋成500-1000cells/ml的懸液在100mm培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞，1-2ml/dish3-5天后，觀察細(xì)胞生長狀況，選擇遠(yuǎn)離其它克隆并且含有50-100個(gè)細(xì)胞的克隆將克隆環(huán)粘在選擇克隆上形成隔離，在克隆環(huán)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞消化將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)逐漸傳代至35mm平皿、25cm2培養(yǎng)瓶等，并經(jīng)常凍存一部分細(xì)胞三、培養(yǎng)細(xì)胞的基本特性體外培養(yǎng)細(xì)胞的類型體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線體外培養(yǎng)細(xì)胞的類型懸浮型：某些類型的癌細(xì)胞，容易大量繁殖貼壁型：大多數(shù)細(xì)胞為貼壁依賴性細(xì)胞成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀、漩渦狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖特點(diǎn)潛伏期指數(shù)生長期穩(wěn)定期培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長曲線潛伏期：從懸浮狀態(tài)（胞體呈圓球形）到貼壁。各種細(xì)胞貼附速度不同，與細(xì)胞種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般傳代細(xì)胞24h內(nèi)，原代細(xì)胞更長，連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞短。指數(shù)增生期：細(xì)胞分裂相增多，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長，是細(xì)胞增殖最活躍、活力最旺盛的階段。判定細(xì)胞生長旺盛與否的重要標(biāo)志是分裂指數(shù)。指數(shù)增生期持續(xù)3-5天后產(chǎn)生接觸抑制。穩(wěn)定期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，停止增殖，細(xì)胞數(shù)量不再增加，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需及時(shí)傳代，否則造成細(xì)胞中毒。細(xì)胞增殖活性或活力的檢測有絲分裂指數(shù)(mitoticindex)：培養(yǎng)物中分裂相細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分比。一般細(xì)胞的MI約為0.1-0.5%，原代細(xì)胞MI更低，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞可達(dá)3-5%細(xì)胞群體倍增時(shí)間：標(biāo)記核苷酸(3H-TdR)摻入：根據(jù)DNA含量變化間接反映細(xì)胞增殖活性MTT比色法：通過線粒體內(nèi)特定酶活性間接反映細(xì)胞活力染色法：如臺(tái)盼藍(lán)對(duì)活細(xì)胞拒染肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的觀察四、細(xì)胞污染問題細(xì)胞污染的發(fā)現(xiàn)和解決肉眼觀察（初步印象）培養(yǎng)液顏色玫瑰紅黃環(huán)境偏堿性，pH>7.5檢查CO2培養(yǎng)瓶是否被擰緊環(huán)境偏酸性，pH<6.8檢查CO2未及時(shí)換液，營養(yǎng)缺乏細(xì)胞密度過高細(xì)菌或真菌污染培養(yǎng)液透明度渾濁細(xì)菌或真菌（酵母）污染細(xì)胞大量死亡，碎片增多倒置顯微鏡觀察相差顯微鏡熒光顯微鏡細(xì)胞污染(contamination)問題細(xì)胞污染的種類：細(xì)菌、酵母菌、霉菌、支原體和病毒等，細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞污染的原因：無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清、培養(yǎng)液和細(xì)胞本身等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)和清潔的環(huán)境、有保障的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。如何發(fā)現(xiàn)污染？

肉眼觀察：培養(yǎng)液是否渾濁、異常偏酸、有毛絮狀物質(zhì)培養(yǎng)皿外圍是否有異物培養(yǎng)箱四周壁上、水盤中有無異物顯微鏡觀察：細(xì)菌：非常細(xì)小，400X以上可見，桿狀、球狀或不規(guī)則，在培養(yǎng)液中小范圍游動(dòng)；生長迅速，可將細(xì)胞埋沒酵母：100X以上可見，念珠狀（或長或短）、珍珠項(xiàng)鏈樣，較細(xì)胞碎片透亮且規(guī)則，生長迅速，將培養(yǎng)液變渾濁霉菌：最初為白色、細(xì)絲狀，有分枝；隨后呈現(xiàn)中間密集，類似線團(tuán)；最后肉眼可見，呈墨綠色或黑色。有時(shí)在最初污染時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞生長支原體：Hoechst熒光染色可見為黏附在細(xì)胞膜上的小顆粒。細(xì)胞生長異常減慢，但排除培養(yǎng)條件的原因病毒：電鏡下可見，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面，影響細(xì)胞功能污染細(xì)胞的拯救拯救：ALMOSTIMPOSSIBLE!!對(duì)珍貴的細(xì)胞，污染較輕時(shí)，可嘗試的手段：通過Percoll梯度沉降，使霉菌和酵母處于最下層小心挑出霉菌，用燙的針處理污染部位和周圍大量的培養(yǎng)液反復(fù)洗滌細(xì)胞，將污染稀釋殺菌劑：對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)的毒害作用，污染物被消除后，需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重新克隆篩選污染細(xì)胞及用具的處理原則：QUICKLY&THOROUGHLY迅速將污染細(xì)胞請(qǐng)出培養(yǎng)間，勿開蓋！10NNaOH液處理污染細(xì)胞被污染物接觸過的用具進(jìn)行高壓