【辰輝創(chuàng)聚生物】HumanTau441重組蛋白：結(jié)構(gòu)特性與科研應(yīng)用前沿引言Tau蛋白（微管相關(guān)蛋白Tau，MAPT）是維持神經(jīng)元胞內(nèi)微管穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵蛋白。它在阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease,AD）、額顳葉癡呆（FTD）等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)生病理性異常聚集，形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs），是tauopathy類疾病的主要標(biāo)志之一。在人腦中，Tau存在六種剪接變體，Tau441（2N4RTau）是其中最長(zhǎng)的亞型，包含441個(gè)氨基酸，具有兩個(gè)N端插入片段和四個(gè)微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Tau441廣泛用于神經(jīng)病理機(jī)制研究、蛋白聚集模型構(gòu)建、藥物篩選平臺(tái)建立等方向。通過(guò)重組表達(dá)獲得結(jié)構(gòu)完整、功能穩(wěn)定的Tau441蛋白，是科研工作者在神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域進(jìn)行基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究的重要技術(shù)手段。Tau441蛋白的結(jié)構(gòu)與功能特性Tau441全長(zhǎng)441個(gè)氨基酸，分子量約為45–46kDa。其結(jié)構(gòu)分為以下幾個(gè)關(guān)鍵區(qū)域：N端投射區(qū)（1–150aa）：包含N1和N2插入片段，參與調(diào)節(jié)Tau與其他蛋白或細(xì)胞骨架成分的互作。中段親微管區(qū)（~200–370aa）：包含四個(gè)微管結(jié)合重復(fù)序列（R1–R4），是Tau穩(wěn)定微管的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。C端區(qū)域（370–441aa）：在病理聚集過(guò)程中可能形成β折疊結(jié)構(gòu)，參與神經(jīng)原纖維的形成。Tau屬于天然無(wú)序蛋白（IntrinsicallyDisorderedProtein,IDP），其柔性結(jié)構(gòu)使其易受環(huán)境因素（如磷酸化、氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)劑等）影響發(fā)生構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致寡聚體或纖維狀聚集體的形成。重組表達(dá)系統(tǒng)介紹Tau441的表達(dá)系統(tǒng)選擇依據(jù)實(shí)驗(yàn)需求、產(chǎn)量目標(biāo)及翻譯后修飾需求，主要包括以下幾種：1.原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌）最常用的表達(dá)平臺(tái)，代表菌株如E.coliBL21(DE3)。其優(yōu)勢(shì)在于：表達(dá)效率高，適合大規(guī)模制備成本低，操作簡(jiǎn)便可用于構(gòu)建聚集體、PFFs等聚集模型但該系統(tǒng)不具備翻譯后修飾功能，如Tau蛋白在疾病狀態(tài)下常見的磷酸化或乙?；?.哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)（HEK293、CHO）適用于需要天然構(gòu)象及磷酸化修飾的研究：支持原位表達(dá)和組分間互作研究可用于開發(fā)抗體、篩選激酶調(diào)控通路哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的Tau441重組蛋白適合高級(jí)別功能研究或臨床前驗(yàn)證。3.酵母/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)（如Sf9）提供較好的翻譯后修飾支持，表達(dá)量高于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)，常作為折中選擇。適用于特定修飾狀態(tài)的Tau蛋白制備。純化流程介紹根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)不同，Tau441的純化流程略有差異，但核心步驟包括以下幾個(gè)方面：1.標(biāo)簽選擇與初步純化常用6×His、GST、MBP等融合標(biāo)簽，以提高可溶性并簡(jiǎn)化純化流程通過(guò)Ni-NTA親和層析（His-tag）或GlutathioneSepharose（GST-tag）進(jìn)行初步純化2.脫標(biāo)簽及高級(jí)純化使用TEV或Thrombin酶切去除標(biāo)簽離子交換層析（如Q-Sepharose）進(jìn)一步去除雜蛋白凝膠過(guò)濾（SEC）分離聚集體與單體形式，獲得構(gòu)象均一的樣品鑒定與質(zhì)檢分析Tau441純化后需要通過(guò)多維度手段確認(rèn)其純度、構(gòu)象狀態(tài)與功能活性：1.純度與分子量確認(rèn)SDS：快速評(píng)估純度和蛋白大小Westernblot：使用抗Tau抗體（如Tau-5、HT7）確認(rèn)特異性質(zhì)譜（MALDI-TOF/LC-MS）：確認(rèn)氨基酸序列、翻譯后修飾（如磷酸化位點(diǎn)）2.構(gòu)象與聚集性分析圓二色譜（CD）：分析構(gòu)象是否為隨機(jī)卷曲（IDP特征）透射電鏡（TEM）/AFM：觀察聚集狀態(tài)（如PHFs形成）ThioflavinT結(jié)合實(shí)驗(yàn)（ThTassay）：檢測(cè)β-折疊聚集體熒光強(qiáng)度3.功能驗(yàn)證微管共沉淀實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)Tau與微管結(jié)合能力細(xì)胞模型誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：驗(yàn)證TauPFFs引起的Tau轉(zhuǎn)導(dǎo)與聚集能力科研應(yīng)用與發(fā)展展望Tau441重組蛋白在神經(jīng)變性研究中具有廣泛應(yīng)用：1.構(gòu)建體外聚集模型可誘導(dǎo)Tau形成PHFs、SFs等病理構(gòu)象，用于機(jī)制研究和抑制劑篩選：添加肝素、RNA、脂質(zhì)體等誘導(dǎo)劑促進(jìn)Tau聚集用于測(cè)試藥物、抗體對(duì)聚集過(guò)程的影響2.細(xì)胞/動(dòng)物模型構(gòu)建TauPFFs已成為研究Tau跨細(xì)胞傳播的重要工具：在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)Tau內(nèi)源性聚集在小鼠腦注射構(gòu)建tauopathy病理模型3.磷酸化或突變體研究構(gòu)建疾病相關(guān)變體如P301L、V337M、S262E等，探索Tau的調(diào)控通路及其與GSK-3β、CDK5等激酶的作用關(guān)系。4.藥物篩選平臺(tái)用于開發(fā)Tau聚集抑制劑、小分子調(diào)控劑及抗體療法的體外高通量篩選模型。參考文獻(xiàn)1.WangY,MandelkowE.Tauinphysiologyandpathology.NatRevNeurosci.2016;17(1):5–21.2.GoedertM,SpillantiniMG.OrderedassemblyofTauproteinandneurodegeneration.AdvExpMedBiol.2019;1184:3–21.3.BarghornSetal.Structure,microtubuleinteractions,andpairedhelicalfilamentaggregationbyTaumutants.JBiolChem.2000;275(24):17308–17314.4.FitzpatrickAWPetal.Cryo-EMstructuresoftaufilamentsfromAlzheimer’sdisease.Nature.2017;547(7662):185–190.5.AvilaJ,etal.TauphosphorylationandaggregationinAlzheimer'sdiseaseandothertauopathies.BiochimBiophysActa.2004;1739(2-3):331–339.6.LiWetal.Heparin-inducedtaufilamentsarepolymorphicanddifferfromthoseinAlzheimer'sandPick'sdiseases.Elife.2018;7:e43584.7.IqbalKetal.TaupathologyinAlzheimerdiseaseandothertauopathies.BiochimBiophysActa.2009;1792(7):641–648.8.HangerDPetal.Tauphosphorylation:thetherapeuticchallengeforneurodegenerativedisease.TrendsMolMed.2009;15(3):112–119.9.SaharaNetal.Assemblyoftauintransgenicanimals.FEBSJ.2008;275(23