1/65生工生物宏基因組全基因組測序項(xiàng)目報(bào)告合同編號合同編號客戶單位東北師范大學(xué)報(bào)告時(shí)間2025-05-112/65?一.術(shù)語解釋?二.本項(xiàng)目使用軟件與數(shù)據(jù)庫?2.1軟件?2.2數(shù)據(jù)庫?三.項(xiàng)目分析流程?3.1分析流程圖?3.2詳細(xì)分析內(nèi)容列表?3.3分析步驟及方法簡介?四.分析結(jié)果展示?4.1數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控?4.2拼接組裝?4.3基因預(yù)測?4.4非冗余基因集構(gòu)建?4.5基因豐度表?4.6基因多樣性分析?4.7物種分類學(xué)注釋?4.8KEGG功能注釋?4.9COG功能注釋?4.10抗生素抗性基因注釋?4.11碳水化合物活性酶注釋?4.12GO功能注釋?4.13SEED功能注釋?4.14BacMet功能注釋?4.15VFDB功能注釋?4.16TCDB功能注釋?4.17PHI功能注釋?4.18ARGS功能注釋?4.19豐度柱狀圖?4.20共線性關(guān)系圖?4.21樣本聚類樹與柱狀圖組合分析?4.22豐度Heatmap熱圖?4.23Network網(wǎng)絡(luò)分析?4.24多級物種組成圖?4.25分類學(xué)系統(tǒng)組成樹?4.26層級注釋GraPhlAn可視化分析?4.27多樣本比較Venn圖?4.28Hcluster層次聚類樹?4.29樣本間距離Heatmap熱圖?4.30PCA主成分分析?4.31PCoA主坐標(biāo)分析?4.32NMDS非度量多維尺度分析?六.參考文獻(xiàn)3/65一.術(shù)語解釋Bp:base-pair，堿基對，讀長的單位，每一個(gè)bp指一對互補(bǔ)的堿基。Read:讀長，測序數(shù)據(jù)中每一條序列就是一個(gè)read。Raw_reads:原始數(shù)據(jù)。Clean_reads:QC之后的數(shù)據(jù)。Fastq:序列數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)格式之一，每4行為一條read的信息。包含測序read名，序列，正反鏈標(biāo)示，序列質(zhì)量值。Pair-end測序:雙端測序，兩端均測序。質(zhì)量評分:指的是一個(gè)堿基的錯(cuò)誤概率的對數(shù)值，即質(zhì)量評分越高，錯(cuò)誤概率越小。QC:Qualitycontrol，即質(zhì)量控制。宏基因組(Metagenomics):是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法。Contig序列:由來源于同一基因組，具有overlapping關(guān)系的reads拼接而成的片段。N50/N90:將組裝所得片段（Scaffold/Contig）按照從長到短排序并累加求和，累加值達(dá)到基因組總長度一半時(shí)的片段長度即是該組裝結(jié)果的N50值，通常用來衡量組裝情況；N90與之類似，即累加長度為基因組總長90%時(shí)，該片段的長度?；斐仄唇?假設(shè)有5個(gè)樣品被測序，經(jīng)過質(zhì)量控制后，各樣品分別單獨(dú)進(jìn)行拼接，如每個(gè)樣品中均存在一種低豐度的物種A，其測序深度只有2X，那么屬于該物種的序列很難被組裝，將所有樣品中未被組裝的序列合并在一起，此時(shí)物種A的測序深度將達(dá)到10X，就有可能拼接得到該物種的序列，此種方法極大的提高了發(fā)現(xiàn)低豐度物種的可能性。AbInitioApproach:基因識別的一種方法，大概的含義是從頭開始識別一個(gè)基因所具有的完整結(jié)構(gòu)特征。在原核生物中，基因往往具有特定且容易識別的啟動(dòng)子序列，并且其不含內(nèi)含子，基因的編碼區(qū)是一個(gè)連續(xù)的開放閱讀框。除此之外，原核生物的蛋白質(zhì)編碼區(qū)還具有其它一些容易判別的統(tǒng)計(jì)學(xué)特征，這些特性使得原核生物的基因識別特別適合采用AbInitio方法，該方法的平均準(zhǔn)確度能達(dá)到90%以上。非冗余基因集基因集:這一概念類似于細(xì)菌群落組成譜研究中的OTU，由于宏基因組測序所得到的數(shù)據(jù)量通常很大，為了降低后續(xù)分析成本，在序列拼接和基因識別之后，將所得到的基因按照相似性進(jìn)行聚類，每個(gè)聚類的基因挑選一個(gè)代表序列構(gòu)成非冗余基因集，以降低后續(xù)功能注釋所需的計(jì)算成本。Binning:將reads或者contigs根據(jù)它們的性質(zhì)分配到不同的OTU中，進(jìn)而拼接得到單一菌種的基因組序列，宏基因組中獲得一個(gè)完整合適的單微生物序列，大概需要測序結(jié)果中有該微生物全基因組6-8倍的覆蓋率。共豐度基因(Co-abundancegenes,CAG)聚類分析:通過基因豐度變化趨勢對不同的基因進(jìn)行聚類的一種方法，來自同一物種的基因，在不同樣品中其豐度變化會(huì)保持一致的趨勢，可以根據(jù)這個(gè)變化趨勢判定基因的物種來源。宏基因組尺度關(guān)聯(lián)分析(MWAS):MWAS類似于GWAS，是通過宏基因組尺度的分析，識別與性狀相關(guān)的宏基因組marker單元，主要的應(yīng)用方向?yàn)橥ㄟ^腸道菌群的挖掘，發(fā)現(xiàn)與疾病或者其它宿主表型性狀相關(guān)的微生物或基因marker，用于診斷宿主的疾病，進(jìn)一步分析其分子機(jī)制，為疾病治療提供可行性方案。寡核苷酸多態(tài)性:在不同微生物的DNA中，短的寡核苷酸并不是均一的分布的，其具有物種特異性。相近物種的DNA序列一般都會(huì)擁有相似寡核苷酸概率，而不相似的物種則不一樣，根據(jù)拼接得到序列的寡核苷酸分布模式，即可評估其物種來源。4/65Binning過程中的coverage:測序得到的屬于同一個(gè)細(xì)菌基因組的Reads的數(shù)量，相當(dāng)于宏基因組中的測序深度。PCA分析:在多元統(tǒng)計(jì)分析中，主成分分析PCA(PrincipalComponentAnalysis)是一種簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)。主成分分析經(jīng)常用于減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集中對方差貢獻(xiàn)最大的特征，從而有效地找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)。PCoA分析:PCoA分析(PrincipalCo-ordinatesAnalysis)是一種研究數(shù)據(jù)相似性和差異性的可視化方法。進(jìn)過一系列的計(jì)算之后，選擇主要的，排在前幾位的特征值，對樣本之間的關(guān)系進(jìn)行描述。NMDS分析:非度量多維尺度分析，是一種將多維空間的研究對象簡化到低維空間進(jìn)行定位，分析和歸類，同時(shí)又保留對象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。其特點(diǎn)是根據(jù)樣品中包含的物種信息，以點(diǎn)的形式反映在多維空間上，而對不同樣品間的差異程度，則是通過點(diǎn)與點(diǎn)的距離體現(xiàn)的，最終獲得樣品的空間定位點(diǎn)圖。Node:網(wǎng)絡(luò)圖概念，每一個(gè)點(diǎn)就是一個(gè)node，在本項(xiàng)目network中，node有三種形式:樣本、功能分類和物種分類。Edge:節(jié)點(diǎn)之間具有某種相互作用，可以沒有方向，也可以應(yīng)用箭頭表示相互作用的施加者和承受者，沒有箭頭的網(wǎng)絡(luò)稱為undirected，有箭頭的網(wǎng)絡(luò)成為directed，在微生物群落研究中，通常邊是沒有方向的，因?yàn)橥ǔ碚f我們無法分辨微生物之間相互作用的因果關(guān)系，可以使用邊的寬度表示相互作用的強(qiáng)弱，通常為不同微生物或功能基因間的相關(guān)系數(shù)。相關(guān)點(diǎn)（Neighbors）:通過邊與一個(gè)節(jié)點(diǎn)相連的其它節(jié)點(diǎn)，稱為這個(gè)節(jié)點(diǎn)的neighbors。度/連通性(Degree/Connectivity):一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其它節(jié)點(diǎn)相連接的邊的數(shù)目，在directed網(wǎng)絡(luò)中degree分為in-degree和out-degree。hub:在網(wǎng)絡(luò)中degree最高的節(jié)點(diǎn)稱為hub，其可以代表與其相連的其它節(jié)點(diǎn)。Density:網(wǎng)絡(luò)中真實(shí)存在的邊與理論上可能存在邊(所有節(jié)點(diǎn)兩兩相連)的比例。Centralization:評估網(wǎng)絡(luò)中只有一個(gè)hub的趨勢。Heterogeneity:評估網(wǎng)絡(luò)中含有多個(gè)hub的趨勢。DegreeDistribution:網(wǎng)絡(luò)圖中所有節(jié)點(diǎn)degree的頻數(shù)分布，網(wǎng)絡(luò)圖中所有節(jié)點(diǎn)的相互作用是隨機(jī)連接節(jié)點(diǎn)產(chǎn)生時(shí)，degreedistribution符合柏松分布，如果一個(gè)網(wǎng)絡(luò)的Degreedistribution與柏松分布有明顯的差異，則此網(wǎng)絡(luò)不是隨機(jī)產(chǎn)生的。Scale-free:如果一個(gè)網(wǎng)絡(luò)的degreedistribution接近一個(gè)power-lawk-α分布，稱這個(gè)網(wǎng)絡(luò)為scale-free，α為degree常數(shù)。當(dāng)α>3時(shí)，不同的hub之間不具有相關(guān)性；當(dāng)2<α<3時(shí)，hub之間具有等級層次；當(dāng)α=2時(shí)，最大的hub與幾乎所有的節(jié)點(diǎn)相連。Neighborhoodconnectivities:一個(gè)節(jié)點(diǎn)的所有neighbors的connectivity的平均數(shù)。Modularity:用于表示網(wǎng)絡(luò)是否可以分為若干個(gè)模塊的參數(shù)，參數(shù)在0-1之間，Averageclusteringcoefficientdistribution是對從具有2-n個(gè)neighbor的節(jié)點(diǎn)的平均clusteringcoefficient的分布排列，用于鑒定網(wǎng)絡(luò)中的modularity。Topologicalcoefficients:與一個(gè)節(jié)點(diǎn)至少具有一個(gè)共有neighbor的其它節(jié)點(diǎn)與該節(jié)點(diǎn)共有neighbor的平均數(shù)，與該節(jié)點(diǎn)neighbor數(shù)目的比值，用于評估該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中具有共有neighbor的趨勢。Closeness:評估信息從該節(jié)點(diǎn)傳播到網(wǎng)絡(luò)中其它節(jié)點(diǎn)的速度。Betweenness:反應(yīng)一個(gè)節(jié)點(diǎn)對網(wǎng)絡(luò)中其它節(jié)點(diǎn)的控制力的大小。Robustness:外界環(huán)境條件的改變或干擾對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響，如一些節(jié)點(diǎn)degree的改變或完全丟失，對整體的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響的大小。5/65Smallworld:局部小世界，表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的平均距離很短，意味著網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)總是與其它節(jié)點(diǎn)緊密相關(guān)。6/65二.本項(xiàng)目使用軟件與數(shù)據(jù)庫SoftWareNameVersionRPackageVersionfastp[1]0.36vegan2.0-10Bowtie2[2]2.1.0VennDiagram1.6.16DIAMOND[3]0.8.20ggtern2.1.1IDBA-UD[4]1.1.2igraph1.0.1megahit[5]1.2.9circlize0.4.8SPAdes[6]3.13ggraph2.0.0Prodigal[7]2.60ape5.3CD-HIT[8]2.60ade41.7-13NCBIBlast+[9]2.28randomForest4.6-14HMMER3[10]3.1b1corrplot0.84SAMtools[11]0.1.18Krona[12]2.6.1GraPhlAn[13]1.1.3ETE3[14]3.0.0b35canopy[15]1.1.3STAMP[16]2.1.3LEfSe[17]1.1.0kraken2[18]2.0.8metaWRAP[19]1.3.2salmon[20]1.5.0checkm[21]1.1.3R3.6.3KEGG[22]數(shù)據(jù)庫：http://www.kegg.jp7/65NCBINR數(shù)據(jù)庫：/eggNOG[23]數(shù)據(jù)庫：http://eggnogdb.embl.de/Uniprot[24]數(shù)據(jù)庫：/ARDB[25]數(shù)據(jù)庫：/CAZy[26]數(shù)據(jù)庫：/SEED[27]數(shù)據(jù)庫：/wiki/Main_PageTCDB[28]數(shù)據(jù)庫：PHI-base[29]數(shù)據(jù)庫：/index.jspCARD[30]數(shù)據(jù)庫：https://card.mcmaster.ca/SARG[31]數(shù)據(jù)庫：https://smile.hku.hk/SARGsBactMet[32]數(shù)據(jù)庫：https://smile.hku.hk/SARGsVFDB[33]數(shù)據(jù)庫：https://smile.hku.hk/SARGsGO[34]數(shù)據(jù)庫：/8/65三.項(xiàng)目分析流程3.2詳細(xì)分析內(nèi)容列表詳細(xì)分析內(nèi)容詳細(xì)分析內(nèi)容1)原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估2)數(shù)據(jù)質(zhì)控1.數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控分析項(xiàng)目說明9/65分析項(xiàng)目詳細(xì)分析內(nèi)容說明2.拼接組裝1)基因功能注釋3.基因預(yù)測1)基因預(yù)測4.基因集分析1)非冗余基因集構(gòu)建MGS分析樣本數(shù)目需大于5；多樣性差異分析要求分組大于2，且重復(fù)不少于32)構(gòu)建基因豐度表3)基因多樣性以及差異分析4)MGS基于基因豐度進(jìn)行序列聚類分析5.Binning分箱1)binning分箱要求樣本數(shù)目大于202)MAGs物種鑒定3)MAGs完整度與污染度評估6.物種與功能注釋1)物種分類學(xué)注釋SARG抗性數(shù)據(jù)庫基于reads比對注釋，無法關(guān)聯(lián)基因2)KEGG功能注釋3)COG功能注釋4)CARD抗生素抗性基因注釋5)CAzy碳水化合物活性酶注釋6)GO功能注釋7)SEED功能注釋8)BacMet重金屬抗性功能注釋9)VFDB毒力因子功能注釋10)TCDB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能注釋11)PHI功能注釋12)SARG環(huán)境抗生素抗性注釋7.物種與功能組成分析1)豐度柱狀圖部分分析僅限于物種可做2)沖擊柱狀圖3)共線性關(guān)系圖4)豐度箱型圖5)樣本聚類樹與柱狀圖組合分析6)豐度Heatmap熱圖7)多級物種組成圖，僅限于物種8)分類學(xué)系統(tǒng)組成樹，僅限于物種10/65分析項(xiàng)目分析項(xiàng)目詳細(xì)分析內(nèi)容說明9)層級注釋GraPhlAn可視化分析，僅限于物種10)層級注釋iTOL可視化分析，僅限于物種8.物種與功能beta多樣性分析1)樣本間距離箱型圖要求樣本大于4，分析4,5要求分組大于2，組中樣本重復(fù)不小于32)PCA/PCoA/NMDS排序圖3)層級聚類分析4)ANOSIM樣本間相似度檢驗(yàn)5)PREMANOVA置換多元方差分析8.物種與功能差異分析1)Metastats差異分析要求分組分析大于2，組中樣本重復(fù)不小于32)Lefse判別分析3)Randomforest組間隨機(jī)森林分析9.物種與功能環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析1)VIF與變量篩選要求環(huán)境因子，且環(huán)境因子數(shù)目必須小于樣本數(shù)目2)RDA/CCA/dbRDA約束性排序分析3)環(huán)境因子相關(guān)性分析4)mantel檢驗(yàn)5)環(huán)境因子貢獻(xiàn)度分析10.物種與功能共線性分析1)Network共線性網(wǎng)絡(luò)分析要求樣本大于4，如有分組，單一分組中樣本重復(fù)不小于3 3.3分析步驟及方法簡介1.數(shù)據(jù)評估及質(zhì)控:對測序的原始數(shù)據(jù)通過Fastp進(jìn)行質(zhì)量評估，數(shù)據(jù)過濾，有效reads統(tǒng)計(jì)等，去除來源于人體和提供的宿主基因組的污染序列，得到相對準(zhǔn)確的有效數(shù)據(jù)。2.拼接組裝:首先使用megahit進(jìn)行多樣本混合拼接，得到初步拼接contig序列。隨后使用bowite2將cleanreadsmap回拼接結(jié)果，提取unmappedreads，并使用SPAdes再次拼接，得到低豐度contigs。結(jié)合初步拼接結(jié)果，最終得到較為完整的contigs組裝結(jié)果。3.Binning分箱:宏基因組Binning是將混合序列組裝得到的contigs或scaffold按物種分開并重新歸類的過程。這些重新歸類后的contigs序列稱之為宏基因組組裝基因組（MAGs）。根據(jù)四核苷酸頻率（TNF）和豐度變化模式（ABD）分別區(qū)分不同物種來源的序列和親緣關(guān)系較為接近的序列。使用軟件為Metawrap組合套件，依次完成Bin分選，Bin提純，Bin定量，BIn重組裝和Bin鑒定等過程。最終經(jīng)過濾后得到完整度較高且低污染度的單菌基因組草圖。11/654.基因預(yù)測:采用Prodigal對拼接結(jié)果進(jìn)行ORF預(yù)測，選擇長度大于等于100bp的基因，并將其翻譯成氨基酸序列。5.基因集構(gòu)建:對于各樣本的基因預(yù)測結(jié)果，采用CD-HIT軟件進(jìn)行去冗余，以獲得非冗余的基因集。6.基因集豐度:關(guān)于基因集的豐度計(jì)算有兩種策略可供選擇：1）基于非比對的方式，Salmon采用雙向并行推理(dual-phase)算法以及構(gòu)建偏差模型的方法準(zhǔn)確定量各個(gè)樣本中基因的豐度，結(jié)合基因長度，可以計(jì)算基因豐度信息。2）基于比對方式，采用Bowtie2將各樣本Cleanreads比對到非冗余基因集序列上，利用SAMtools獲得比對上的reads，再考慮到基因長度，計(jì)算基因在各樣本的豐度信息；我們采用基于bowtie2短序列比對的方法進(jìn)行分析，也可以指定非比對的方法[35]。7.基因集功能注釋:將基因集與NR、KEGG、eggNOG、ARDB、CAZy、SEED等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得基因的物種注釋信息和功能注釋信息。并根據(jù)基因集豐度得到功能豐度和物種豐度。8.豐度分析:基于基因集豐度信息和注釋信息，得到物種豐度和功能豐度，進(jìn)行物種與功能組成分析、物種與功能差異分析、樣本比較分析等多方向的統(tǒng)計(jì)分析和探索，并對結(jié)果做可視化展示，挖掘數(shù)據(jù)中的有效信息，揭露隱含的規(guī)律，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)假設(shè)和發(fā)現(xiàn)新的問題。分析備注:(1)當(dāng)沒有提供環(huán)境因子或理化指標(biāo)等外源數(shù)據(jù)，無法提供環(huán)境因子相關(guān)性以及模型預(yù)測分析等；(2)當(dāng)沒有提供分組信息，我們默認(rèn)按照單個(gè)樣本作為分組，此時(shí)不再提供差異統(tǒng)計(jì)分析；(3)當(dāng)樣品數(shù)目小于3個(gè)時(shí)，無法進(jìn)行排序分析和聚類分析，例如PCA，NMDS，dbRDA，CCA/RDA，聚類分析，豐度聚類熱圖分析；(4)當(dāng)分組內(nèi)的生物學(xué)重復(fù)數(shù)目小于3個(gè)時(shí)，諸如Adonis，Anosim，Metastat，LEfSe等統(tǒng)計(jì)分析皆沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將不進(jìn)行此類分析；(5)如果組裝效果過差，則基于Contig的binning分析將無法進(jìn)行，建議樣本數(shù)目大于5個(gè)；(6)當(dāng)樣本數(shù)目小于6個(gè)或組裝效果過差時(shí)，則基于基因的binning分析將無法進(jìn)行；如果分組數(shù)目超過兩組時(shí)，基于基因的binning分析將無意義；12/65四.分析結(jié)果展示二代測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別(BaseCalling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(SequencedReads) ,我們稱之為RawData或RawReads，結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式存儲(chǔ)，其中包含測序序列(reads)的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。FASTQ格式文件中每個(gè)read由四行描述，如下所示:@ST-E00159:113:000000000-AFJGE:1:1101:12409:12861:N:0:TCTACA+其中第一行以“@”開頭，隨后為測序標(biāo)識符(SequenceIdentifiers)和描述文字(選擇性部分)；第二行是堿基序列；第三行以“+”開頭，隨后為測序標(biāo)識符(選擇性部分)；第四行是對應(yīng)堿基的測序質(zhì)量，該行中每個(gè)字符對應(yīng)的ASCII值減去33，即為對應(yīng)第二行堿基的測序質(zhì)量值。Reads的堿基測序質(zhì)量值(Phredqualityscore,Qphred)是測序錯(cuò)誤率(base-callingerrorprobabilities,P)的整數(shù)映射，映射關(guān)系為：Qphred=-10log10(P)。PhredqualityscoresarePhredqualityscoresarelogarithmicallylinkedtoerrorprobabilitiesPhredQualityScoreProbabilityofIncorrectBaseCallBaseCallAccuracy90%2099%3099.9%401in10,00099.99%13/65我們使用fastp對原始數(shù)據(jù)質(zhì)量值等信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。并繪制堿基的質(zhì)量分布圖結(jié)果目錄:1_QC/1_raw_data_infor/All_raw_data_infor.xls:原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總表。表1.1各樣本原始數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)60R1Sluge60R4TotalReadsCount(#)411790764037076661203534TotalBasesCount(bp)617686140060556149009180530100AverageReadLength(bp)150150150Q20BasesCount(bp)599420900559360695238936315225Q20BasesRatio(%)97.04%98.03%97.34%Q30BasesCount(bp)574660361257098079478551925292Q30BasesRatio(%)93.03%94.29%93.15%GCcontent(%)50.94%61.87%47.90%注：若樣本數(shù)目較多，此處只會(huì)截取部分樣本數(shù)據(jù)，完整數(shù)據(jù)請見結(jié)果文件夾中的對應(yīng)文件TotalReadsCount：樣本所有reads數(shù)目，為reads1與reads2數(shù)目之和TotalBaseCount：所有堿基數(shù)目，即數(shù)據(jù)量AverageReadLength：平均序列長度Q20BaseCount：堿基質(zhì)量在Q20以上的數(shù)目Q20BaseRatio：堿基質(zhì)量在Q20以上的比例GCBaseRatio：GC含量1_Raw_data_infor/*.raw_data_infor.xls:單樣本測序原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。解釋同上1_Raw_data_infor/*.raw_data_mean_qual.pdf:單樣本測序堿基質(zhì)量分布圖。14/65圖1.2堿基質(zhì)量分布圖橫坐標(biāo)為reads的堿基位置，縱坐標(biāo)為所有reads該位置堿基的平均測序質(zhì)量，虛線左側(cè)0150bp為read-1測序質(zhì)量分布，右側(cè)150300bp為read-2測序質(zhì)量分布。堿基質(zhì)量分布檢查用于檢測在測序長度范圍內(nèi)，有無某些堿基位置存在異常的高錯(cuò)誤率，例如如果中間位置的堿基測序錯(cuò)誤率顯著高于其他位置，則可能存在異常堿基。1_Raw_data_infor/*.raw_data_base_percent.pdf:單樣本測序堿基含量分布圖。15/65圖1.3單樣本測序堿基含量分布圖橫坐標(biāo)為reads的堿基位置，縱坐標(biāo)為所有reads該位置四堿基（ATGC）含量，虛線左側(cè)堿基質(zhì)量分布檢查用于檢測在測序長度范圍內(nèi)，有無某些堿基位置存在異常的堿基分布，一般情況下四堿基含量均一。測序得到的原始數(shù)據(jù)，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列。為了保證信息分析質(zhì)量，必須對原始數(shù)據(jù)過濾，得到CIean數(shù)據(jù)。使用Fastp主要包括以下幾個(gè)步驟：1)去除reads中的接頭序列；Fastp可以自動(dòng)化地查找接頭序列并進(jìn)行剪裁。尤其是PEreads，根據(jù)readsoverIap可以更準(zhǔn)確的查找接頭，對于接頭堿基不匹配的情況表現(xiàn)尤為突出。2)全局裁剪和劃窗質(zhì)量裁剪；Fastp對所有reads的頭部和尾部進(jìn)行統(tǒng)一裁剪，去除一些測序質(zhì)量不好的cycIe。從reads的39到59方向或59到39方向計(jì)算固定劃窗內(nèi)的堿基平均質(zhì)量，低于平均質(zhì)量值Q20的劃窗進(jìn)行裁剪，劃窗默認(rèn)為4；3)校正堿基；查找每一對reads的overIap，對區(qū)間內(nèi)不一致堿基進(jìn)行適當(dāng)矯正；4)質(zhì)量過濾；對低質(zhì)量序列進(jìn)行剔除，包括含大量模糊堿基序列（一條reads中有40%的堿基質(zhì)量低于Q15）以及長度低于35nt的雙端reads；經(jīng)過reads的質(zhì)控步驟，為了得到更為有效的微生物數(shù)據(jù)，我們需要進(jìn)行去宿主污染。16/65去宿主污染：我們使用bowtie2將reads比對到人類或其他宿主基因組上(需提供參考基因組)，去除比對相似性高的來源于宿主基因組或污染的reads。結(jié)果目錄:1_QC/2_QC_data_infor/All_clean_data_infor.xls:質(zhì)控后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總表。表1.2質(zhì)控后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表60R1Sluge60R4TotalReadsCount(#)400475044006779859852486TotalBasesCount(bp)599658060859606101678964513275AverageReadLength(bp)150149150Q20BasesCount(bp)586768695958476327628767800834Q20BasesRatio(%)97.85%98.10%97.81%Q30BasesCount(bp)564349314856271480198412518936Q30BasesRatio(%)94.11%94.41%93.84%GCcontent(%)50.99%61.96%47.86%注：若樣本數(shù)目較多，此處只會(huì)截取部分樣本數(shù)據(jù)，完整數(shù)據(jù)請見結(jié)果文件夾中的對應(yīng)文件TotalReadsCount：樣本所有reads數(shù)目，為reads1與reads2數(shù)目之和TotalBaseCount：所有堿基數(shù)目，即數(shù)據(jù)量AverageReadLength：平均序列長度Q20BaseCount：堿基質(zhì)量在Q20以上的數(shù)目Q20BaseRatio：堿基質(zhì)量在Q20以上的比例GCBaseRatio：GC含量1_QC/2_QC_data_infor/All_QC_stat.xls:質(zhì)控后reads組成占比統(tǒng)計(jì)表。表1.3各樣本質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)60R160R1Sluge60R4CleanReads97.8999.7798.47LowQuality2.080.231.480.025.0e-030.04Tooshort7.0e-033.0e-030.02注：若樣本數(shù)目較多，此處只會(huì)截取部分樣本數(shù)據(jù)，完整數(shù)據(jù)請見結(jié)果文件夾中的對應(yīng)文件CleanReads(%)：質(zhì)控后的cleanreads組成占比LowQuality(%)：低質(zhì)量reads組成占比（Q20以下）TooMayN(%)：模糊堿基以及含N堿基組成占比17/65Tooshort(%)：質(zhì)控后短reads組成占比（15bp以下）4.2拼接組裝使用基于DeBruijngraph原理的拼接軟件megahit對cleanreads進(jìn)行多樣本混合拼接；之后將各樣本的cleanreads使用bowtie2比對至組裝后的contigs上，獲取unmappedPEreads；繼續(xù)使用SPAdes對未比對reads進(jìn)行混合拼接；對于兩次拼接組裝生成的contig，過濾小于500bp的序列，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和后續(xù)基因預(yù)測等下游分析。結(jié)果目錄:2_assemblyassembly_filter.fasta:各樣本混合組裝得到的contig序列。all_assembly_evalute.xls:所有樣本混合組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表。表2.1組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)ValuesValues1716698N502371N701093N90623TraitsNo.：拼裝得到的contig數(shù)目N50：N50長度，將所有reads按照大小排列，位于contig數(shù)目的50%處的contig對應(yīng)的長度，N70等與之概念一致。N70：N70長度N90：N90長度MaxLen：長度最長的contig長度TotalLen：所有contig總長度AverageLen：contig平均長度GCcontent：contig的GC含量Ncontent：contig的未知堿基含量Contig_Number(>nbp)：長度超過(n)bp的contigs數(shù)目all_assembly_length_density.pdf:混合組裝結(jié)果密度曲線分布圖。18/65圖2.2混合組裝結(jié)果密度曲線分布圖橫軸為長度區(qū)間，縱軸為密度，表示長度的密度曲線分布。all_assembly_length_distrubtion.xls:混合組裝結(jié)果長度分布統(tǒng)計(jì)表。使用Prodigal對拼接的contigs進(jìn)行ORF預(yù)測，選擇長度大于等于100bp的基因，作為候選基因集。結(jié)果目錄:4_Gene_Catalog/Gene_Predictassembly_prodigal.ffn:基因預(yù)測得到的核酸序列。all_gene_predict_evalute.xls:基因預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表。表3.1基因預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)19/65ValuesValues2967790N50786N70573N90354TraitsNo.：預(yù)測得到的基因數(shù)目N50：N50長度N90：N90長度MaxLen：長度最長的基因長度TotalLen：所有基因總長度AverageLen：基因平均長度GCcontent：基因的GC含量all_gene_predict_length_density.pdf:預(yù)測基因長度密度曲線分布圖。圖3.2預(yù)測基因長度密度曲線分布圖橫軸為長度區(qū)間，縱軸為密度，表示預(yù)測基因長度的密度曲線分布all_gene_predict_length_distrubtion.xls:預(yù)測基因長度分布統(tǒng)計(jì)表。20/65all_gene_predict_length_distrubtion_barplot.pdf:預(yù)測基因長度分布圖。來自相同環(huán)境的樣品之間有很多微生物（或基因）是共有的，不同基因的豐度在樣本之間的變化可以反映樣本之間的共性和不同。因此可以通過構(gòu)建一個(gè)非冗余基因集（non-redundantgenecatalog來描述該類環(huán)境所有基因的整體信息。將所有樣品預(yù)測出來的基因序列，用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類（參數(shù)為：95%identity、90%coverage每個(gè)類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集。結(jié)果目錄:4_Gene_Catalog/Gene_Clustergene_catalog.ffn：基因集核酸序列。gene_catalog.faa:基因集蛋白序列。all_gene_catalog_evalute.xls:基因集結(jié)果統(tǒng)計(jì)表。表4.1基因集結(jié)果統(tǒng)計(jì)ValuesValues1438314N50840N70603N90387Traits文件描述同基因預(yù)測部分all_gene_catalog_length_density.pdf:Unique基因長度密度曲線分布圖。21/65圖3.2Unique基因長度密度曲線分布圖橫軸為長度區(qū)間，縱軸為密度，表示聚類基因長度的密度曲線分布all_gene_catalog_length_distrubtion.xls:基因集長度分布統(tǒng)計(jì)表。4.5基因豐度表使用Bowtie2將各樣本CleanReads與非冗余基因集進(jìn)行比對，利用Samtools統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因被比對上的reads條數(shù)，考慮到基因的長度，計(jì)算得到每個(gè)基因在樣品中的豐度，并匯總成所有樣本的基因豐度表。計(jì)算公式如下：其中，r表示比對上基因的reads數(shù)目，L為基因的長度。結(jié)果目錄：5_gene_profile/Gene_Abundance/22/65gene_profile_abundance.txt：基因集豐度統(tǒng)計(jì)表。gene_profile_reads.xls：基因集reads數(shù)統(tǒng)計(jì)表。表5.1基因reads數(shù)統(tǒng)計(jì)NameNameSluge20R460R1MGE132126MGE2019MGE3300MGE403第一列表示基因名字，后面每列均為各樣本在該基因的reads數(shù)?；蛟诓煌瑯颖鹃g會(huì)出現(xiàn)基因個(gè)數(shù)及豐富度有差異的現(xiàn)象，香農(nóng)維納(Shannon–Wiener)指數(shù)與辛普森(Simposon)等指數(shù)被用來表征微生物基因多樣性。通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。同時(shí)可以根據(jù)分組信息，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)T檢驗(yàn)的方法，檢測每兩組之間的指數(shù)值是否具有顯著性差異。計(jì)算群落分布豐度(Communityrichness)的指數(shù)有:Sobs-theobservedrichness(/wiki/Sobs)Chao-theChao1estimator(/wiki/Chao)ACE-theACEestimator(/wiki/Ace)計(jì)算群落分布多樣性(Communitydiversity)的指數(shù)有：:Shannon-theShannonindex(/wiki/Shannon)Simpson-theSimpsonindex(/wiki/Simpson)Coverage-theGood'scoverage(/wiki/Coverage)計(jì)算群落分布均勻度(Communityevenness)的指數(shù)有：:Shannoneven-theShannonindex-basedmeasureofevenness(Pielou'sevennessindex，J)各指數(shù)算法如下:23/65Chao:用chao1算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，chao1在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，由Chao(1984)最早提出。計(jì)算公式如下：其中，Schao1=估計(jì)的OTU數(shù)Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)n1=只含有一條序列的OTU數(shù)目(如"singletons")n2=只含有兩條序列的OTU數(shù)目(如"doubletons")Ace:用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，由Chao提出，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao1的算法不同。計(jì)算公式如下：其中，abundrfr人ACE<0.80frACE≥0.80ni=含有i條序列的OTU數(shù)目Srare=含有"abund"條序列或者少于"abund"的OTU數(shù)目Sabund=多于"abund"條序列的OTU數(shù)目abund=“優(yōu)勢”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10Shannon:用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一。它與Simpson多樣性指數(shù)常用于反映alpha多樣性指數(shù)。Shannon值越大，說明群落多樣性越高。計(jì)算公式如下：其中，24/65Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)ni=第i個(gè)OTU包含的序列數(shù)N=所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)Simpson:用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，由EdwardHughSimpson(1949)提出，在生態(tài)學(xué)中常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。計(jì)算公式如下：其中，Sobs=實(shí)際觀測到的OTU數(shù)ni=第i個(gè)OTU包含的序列數(shù)N=所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)Coverage:各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。該指數(shù)實(shí)際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。計(jì)算公式如下：其中，n1=只含有一條序列的OTU數(shù)目(如"singletons")N=所有個(gè)體數(shù)目，此處為序列總數(shù)Shannoneven:是一個(gè)用于反映物種個(gè)體數(shù)目在群落中分配的均勻程度的指數(shù)。均勻度(evenness)，是指一個(gè)群落或生境中全部物種個(gè)體數(shù)目的分配狀況。計(jì)算公式如下：其中，H,=實(shí)際觀察的Shannon多樣性指數(shù)H,max=ln(S)，為最大的物種多樣性指數(shù)，其中S為群落中的總物種數(shù)軟件:R-vegan。結(jié)果目錄：5_gene_profile/Alpha_Diversity/gene_alpha_div.xls：基因多樣性統(tǒng)計(jì)結(jié)果表。25/65表6.1基因多樣性統(tǒng)計(jì)SampleIDObservedChao1ACESluge428932438129.81443932.3920R4281383291102.15300811.6660R1243179252417.39260935.6160R2281612293630.01299000.3560R3237098250872.40258012.7560R4272767285552.10296027.08100thR1691899705320.08706395.44100thR2682682694902.58696647.60100thR3373658382061.46387406.17100thR4306023311846.28319345.63SampleID：樣本名稱Observed：觀測到的gene數(shù)目Chao1：基因豐富度Chao1指數(shù)ACE：基因豐富度ACE指數(shù)Shannon：Shannon多樣性指數(shù)Simpson：Simpson多樣性指數(shù)，Simpson’sIndex本身用D表示，此處為了更符合直觀，使用1-D表示Simpson多樣性指數(shù)InvSimpson：經(jīng)典Simpson多樣性指數(shù)的倒數(shù)Coverage：基因覆蓋度指數(shù)4.7物種分類學(xué)注釋Nr(NCBInon-redundantproteinsequences)是NCBI官方收集的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫，它包括了所有非冗余GenBankCDS的翻譯序列，PDB(ProteinDataBank)蛋白數(shù)據(jù)庫、SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫及來自PIR(ProteinInformationResource)和PDF(ProteinResearchFoundation)等數(shù)據(jù)庫的蛋白序列。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。同時(shí)根據(jù)NCBI的微生物分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫，獲得基因的物種分類注釋信息，并在Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)各個(gè)分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種的相對豐度。26/65結(jié)果目錄：6_taxonomy/abundance/*_abundance.xls：物種層級豐度表。annotation/taxonmy_lineage_format.xls：物種分類學(xué)注釋結(jié)果表。表7.1物種分類學(xué)注釋結(jié)果表GeneIDTaxonIDKindomPhylumMGE12026780kBacteriapPlanctomycetotaMGE21948890kBacteriapPseudomonadotaMGE32073117kBacteriapChloroflexotaMGE42099675kBacteriapBacteroidotaGeneID：GeneIDTaxonID：基因?qū)?yīng)的NCBItax編號Kindom：基因注釋到的分類界水平Phylum：基因注釋到的分類門水平Class：基因注釋到的分類綱水平Order：基因注釋到的分類目水平Family：基因注釋到的分類科水平Genus：基因注釋到的分類屬水平Species：基因注釋到的分類種水平annotation/gene_catalog_species_stats.xls：注釋到門屬水平的基因數(shù)目。annotation/NR_Species_count.pdf：注釋到門屬水平的基因數(shù)目柱形圖。圖圖7.2門對應(yīng)種水平的基因數(shù)目分布圖27/65根據(jù)注釋到物種的基因表格，我們對門水平內(nèi)基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并按照基因數(shù)目排序，挑選前8個(gè)門進(jìn)行展示，每個(gè)門至多展示前5個(gè)物種。不同的顏色代表種水平對應(yīng)的門水平分類?？v坐標(biāo)代表種分類學(xué)水平對應(yīng)的基因數(shù)目。4.8KEGG功能注釋KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)是一個(gè)有關(guān)生物系統(tǒng)較完善的數(shù)據(jù)庫，整合了基因組、化學(xué)物質(zhì)和系統(tǒng)功能信息。其中：KEGGGENES搜集了所有已知的完整的基因組的基因蛋白序列，包含每個(gè)基因的最低限度信息。KEGGPathway存儲(chǔ)了各種生物學(xué)通路信息，包括代謝通路、合成通路、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號傳遞、細(xì)胞周期以及疾病相關(guān)通路等。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到序列對應(yīng)的KO號，根據(jù)KO與Pathway和Module的聯(lián)系得到序列的Pathway、Module注釋信息。并統(tǒng)計(jì)KEGG各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：7_KEGG/abundance/*_abundance.xls：KEGG功能層級豐度表。annotation/gene_catalog_KO_pathway.xls：KEGGPathway功能注釋結(jié)果。表8.1KEGGPathway功能注釋結(jié)果GeneIDGeneIDKOFunctionPathwayLevel3MGE8K09882cobS;cobaltochelataseCobS[EC:]ko00860:PorphyrinandchlorophyllmetabolismMGE8K09882cobS;cobaltochelataseCobS[EC:]ko01100:MetabolicpathwaysMGE8K09882cobS;cobaltochelataseCobS[EC:]ko01240:BiosynthesisofcofactorssucC;succinyl-CoAsynthetasebetasubunit[EC:]ko01110:BiosynthesisofsecondarymetabolitesMGE10K01903GeneID：GeneIDKO：基因?qū)?yīng)的KO編號Function：KO對應(yīng)的基因名稱，功能，酶。Pathway_Level3：KO對應(yīng)的pathwaylevels3代謝注釋Pathway_Level2：KO對應(yīng)的pathwaylevels2代謝注釋Pathway_Level1：KO對應(yīng)的pathwaylevels1代謝注釋28/65annotation/gene_catalog_KO_module.xls：KEGGModule功能注釋結(jié)果。表8.2KEGGModule功能注釋結(jié)果GeneIDKOFunctionModuleLevel4MGE10K01903sucC;succinyl-CoAsynthetasebetasubunit[EC:]M00009:Citratecycle(TCAcycle,Krebscycle)MGE10K01903sucC;succinyl-CoAsynthetasebetasubunit[EC:]M00374:Dicarboxylate-hydroxybutyratecycleMGE10K01903sucC;succinyl-CoAsynthetasebetasubunit[EC:]M00620:Incompletereductivecitratecycle,acetyl-CoA=>oxoglutarateMGE10K01903sucC;succinyl-CoAsynthetasebetasubunit[EC:]M00011:Citratecycle,secondcarbonoxidation,2-oxoglutarate=>oxaloacetateGeneID：GeneIDKO：基因?qū)?yīng)的KO編號Function：KO對應(yīng)的基因名稱，功能，酶。Module_Level4：KO對應(yīng)的Modulelevels4代謝注釋Module_Level3：KO對應(yīng)的Modulelevels3代謝注釋Module_Level2：KO對應(yīng)的Modulelevels2代謝注釋Module_Level1：KO對應(yīng)的Modulelevels1代謝注釋annotation/pathway_category.xls：Pathway分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_pathway_categorie.pdf：Pathway分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。29/65圖8.3KEGGPathway分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸是參與的代謝通路名稱，縱軸是注釋到該通路下的基因數(shù)目。4.9COG功能注釋COG(ClustersofOrthologousGroupsofproteins，直系同源序列聚類)是在對已完成的基因組的蛋白質(zhì)序列的相互比較的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，COG數(shù)據(jù)庫選擇的物種包括各主要系統(tǒng)進(jìn)化譜系。每個(gè)COG家族至少有來自3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化譜系的物種的蛋白所組成。所以一個(gè)COG對應(yīng)于一個(gè)古老的保守型結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成每個(gè)COG的蛋白被假定來自于同一個(gè)祖先蛋白。進(jìn)行COG數(shù)據(jù)庫比對可以對預(yù)測蛋白進(jìn)行功能注釋，歸類以及蛋白精華分析。eggNOG(evolutionarygenealogyofgenes:Non-supervisedOrthologousGroups)數(shù)據(jù)庫是利用Smith-Waterman比對算法對構(gòu)建的基因直系同源簇進(jìn)行功能注釋。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與eggNOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得基因?qū)?yīng)的COG，篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。在此基礎(chǔ)上對基因集進(jìn)行功能注釋、歸類，并統(tǒng)計(jì)COG各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：8_eggNOG/abundance/*_abundance.xls：COG功能層級豐度表。annotation/gene_catalog_eggnog_annotation.xls：COG功能注釋結(jié)果。30/65表9.1COG功能注釋結(jié)果GeneIDeggNOGOGFunctionMGE11644107.SL11570639COG05672-oxoglutaratedehydrogenase,E1MGE30335283.Neut1896COG0860n-acetylmuramoyl-l-alanineamidaseMGE50335283.Neut2388COG0277FADlinkedoxidasedomainproteinMGE66335283.Neut2459COG0178TheUvrABCrepairsystemcatalyzestherecognitionandprocessingofDNAlesions.UvrAisanATPaseandaDNA-bindingprotein.Adamagerecognitioncomplexcomposedof2UvrAand2UvrBsubunitsscansDNAforabnormalities.WhenthepresenceofalesionhasbeenverifiedbyUvrB,theUvrAmoleculesdissociate(Bysimilarity)GeneID：基因ID編號eggNOG：COG編號OG：直系同源基因本體論編號Function：COG對應(yīng)功能Category：COG對應(yīng)分類目錄annotation/eggnog_category.xls：COG功能分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_eggnog_categorie.pdf：COG功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。圖9.2COG功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖31/65橫軸為橫軸為COG的25個(gè)功能大類簡寫，右側(cè)名稱為這些功能分類的全稱，縱軸為相應(yīng)功能大類包含的基因數(shù)目。4.10抗生素抗性基因注釋抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD(AntibioticResistanceGenesDatabase)收集了來自不同環(huán)境來源的(如腸道、生活廢水、河流等)細(xì)菌抗藥性基因及其抗性譜、作用機(jī)制、本體論、COG和CDD注釋信息，為研究藥物作用、環(huán)境治理提供研究依據(jù)。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與ARDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到其對應(yīng)的抗生素抗性基因的種類和數(shù)目。篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。并統(tǒng)計(jì)抗性基因、抗生素在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：9_CARD/abundance/ARO_Name_abundance.xls：抗生素抗性豐度表。abundance/Drug_Class_abundance.xls：抗生素類豐度表。abundance/Gene_Family_abundance.xls：AMR抗生素抗性基因家族豐度表。abundance/Resistance_Mechanism_abundance.xls：抗生素抗性機(jī)制豐度表。annotation/gene_catalog_ardb_annotation.xls：抗生素抗性注釋結(jié)果。表10.1抗生素抗性注釋結(jié)果GeneIDCARDARONameGeneFamilyMGE9652ARO:3000804MexFresistance-nodulation-celldivision(RND)antibioticeffluxpumpMGE9652ARO:3000804MexFresistance-nodulation-celldivision(RND)antibioticeffluxpumpMGE9652ARO:3000804MexFresistance-nodulation-celldivision(RND)antibioticeffluxpumpMGE14949ARO:3004600LnuHlincosamidenucleotidyltransferase(LNU)GeneID：基因ID編號CARD：抗性基因數(shù)據(jù)庫ARO編號ARO_Name：ARO編號對應(yīng)的抗性基因32/65Gene_Family：抗性基因家族Drug_Class：抗生素種類Resistance_Mechanism：抗性機(jī)制annotation/gene_catalog_CARD_categorie.pdf：抗性基因注釋統(tǒng)計(jì)柱狀圖。圖10.2抗性基因注釋統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸為不同類型的抗生素抗性基因名稱，縱軸為抗生素抗性的數(shù)目。4.11碳水化合物活性酶注釋CAZy(Carbohydrate-ActiveenZYmesDatabase)是碳水化合物活性酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包括能催化碳水化合物降解、修飾、以及生物合成的相關(guān)酶系家族。其包含五個(gè)主要分類：糖苷水解酶(GlycosideHydrolases,GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GlycosylTransferases,GTs)、多糖裂解酶(PolysaccharideLyases,PLs)和糖類酯解酶(CarbohydrateEsterases,CEs)、氧化還原酶(AuxiliaryActivities,AAs)。此外，還包含與碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Carbohydrate-BindingModules,CBMs)。使用HMMER3將基因集蛋白序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到其對應(yīng)的碳水化合物活性酶注釋信息。篩選條件為E-value<1e-5。并統(tǒng)計(jì)CAZy各功能層級的豐度。結(jié)果目錄：10_CAZy/33/65abundance/*_abundance.xls：CAZy功能層級豐度表。annotation/gene_catalog_cazy_annotation.xls：CAZy注釋結(jié)果。表11.1CAZy注釋結(jié)果GeneIDCAzyCAZyClassCAZyActivitiesMGE8536GT41GTUDP-GlcNAc:peptidebeta-N-acetylglucosaminyltransferase(EC55)MGE8536GT41GTUDP-Glc:peptideN-beta-glucosyltransferase(EC2.4.1.-)MGE12728GT2GTcellulosesynthase(EC2)MGE12728GT2GTchitinsynthase(EC6)GeneID：基因ID編號CAzy：注釋到的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫編號CAZy_Class：碳水化合物活性酶所屬分類CAZy_Activities：碳水化合物活性酶對應(yīng)活性注釋annotation/cazy_categoris.xls：CAZy功能分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_CAZy_categorie.pdf：CAZy功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。圖11.2CAZy功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸為CAZy的6大功能分類簡寫，右側(cè)為這些功能分類的全稱，縱軸為相應(yīng)功能大類包含的基因數(shù)目。34/654.12GO功能注釋GO(GeneOntology)是一個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表(controlledvocabulary)來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性。GO總共有三個(gè)ontology，分別描述基因的分子功能(molecularfunction)、所處的細(xì)胞位置(cellularcomponent)、參與的生物過程(biologicalprocess)。GO的基本單位是term，每個(gè)term有一個(gè)唯一的標(biāo)示符(由"GO"加上7個(gè)數(shù)字組成，例如GO:0072669)；每類ontology的term通過它們之間的聯(lián)系(is_a，part_of，regulate)構(gòu)成一個(gè)有向無環(huán)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。更詳細(xì)信息見。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對得到的UniprotID得到基因集對應(yīng)的GOterm。篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。并統(tǒng)計(jì)GO各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：11_GO/abundance/*_abundance.xls：GO功能層級豐度表。annotation/gene_catalog_go_annotation.xls：GO功能注釋結(jié)果。表12.1GO功能注釋結(jié)果GeneIDGOTermGOLevel2MGE8GO:0016887ATPaseactivitycatalyticactivityMGE8GO:0051116cobaltochelataseactivitycatalyticactivityMGE8GO:0005524ATPbindingbindingMGE11GO:0030976thiaminepyrophosphatebindingbindingGeneID：基因ID編號GO：GO編號Term：GO3級分類GO_Level2：GO2級分類Ontology：GO1級分類annotation/go_category.xls：GO功能分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_go_categorie.pdf：GO功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。35/65圖12.2GO功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸為GOterm，縱軸為該term內(nèi)基因個(gè)數(shù)及其占被注釋上基因總數(shù)的百分比。4.13SEED功能注釋SEEDSubsystem是國際上知名的功能分類數(shù)據(jù)庫，為RAST(RapidAnnotationusingSubsystemTechnology)的默認(rèn)數(shù)據(jù)庫。使用DIAMOND將基因集蛋白序列與SEED數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。同時(shí)根據(jù)SEEDSubsystem的功能分類層級，獲得基因的SEED分類注釋信息，并統(tǒng)計(jì)SEED各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：12_SEED/abundance/*_abundance.xls：SEED層級豐度表。annotation/gene_catalog_seed_annotation.xls：SEED注釋結(jié)果表。表13.1SEED注釋結(jié)果表36/65GeneIDseedFunctionLevel3MGE8fig|316055.14.peg.135AerobiccobaltochelataseCobSsubunit(EC)CoenzymeB12biosynthesisMGE11fig|644107.3.peg.3852-oxoglutaratedehydrogenaseE1component(EC)TCACycleMGE11fig|644107.3.peg.3852-oxoglutaratedehydrogenaseE1component(EC)DehydrogenasecomplexesMGE30fig|335283.5.peg.N-acetylmuramoyl-L-alanineRecyclingofPeptidoglycan2227amidase(EC8)AminoAcidsGeneID：基因ID編號seed：seed編號Function：seedID對應(yīng)功能Level3：seedID3級水平分類Level2：seedID2級水平分類Level1：seedID1級水平分類annotation/seed_category.xls：SEED功能分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_SEED_categorie.pdf：SEED功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。圖13.2SEED功能分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸為SEED功能大類，縱軸為相應(yīng)功能大類包含的基因數(shù)目。37/654.14BacMet重金屬抗性功能注釋BacMet是一種關(guān)于殺菌劑和重金屬抗性數(shù)據(jù)庫，其手動(dòng)整理了抗菌生物殺蟲劑和金屬抗性基因數(shù)據(jù)庫。BacMet數(shù)據(jù)庫包含470個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗性基因。此外，該數(shù)據(jù)庫還包含從公共序列庫中收集的25477個(gè)潛在抗性基因。BacMet數(shù)據(jù)庫中的所有抗性基因均根據(jù)其分子功能和誘導(dǎo)的抗性表型進(jìn)行了整理。主要包含兩個(gè)子庫：1）具有實(shí)驗(yàn)確定的抗藥性功能的基因的手動(dòng)管理數(shù)據(jù)庫；2）基于與具有實(shí)驗(yàn)確認(rèn)功能的基因的序列相似性來預(yù)測抗性基因的數(shù)據(jù)庫；使用DIAMOND將基因集蛋白序列與BacMet的兩個(gè)子庫數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，篩選條件：E-value<1e-5，Score>60。獲得基因的BacMet分類注釋信息，并統(tǒng)計(jì)BacMet各功能層級在各個(gè)樣本中的豐度。結(jié)果目錄：13_BacMet/abundance/*_abundance.xls：BacMet各個(gè)層級豐度表。annotation/gene_catalog_BactMet_exp_annotation.xls：BacMet已實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的注釋結(jié)果表。表14.1BacMet已實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的注釋結(jié)果表GeneIDBacMetIDGenenameAccessionMGE9652BAC0239mexFQ4KBN7MGE9652BAC0239mexFQ4KBN7MGE9652BAC0239mexFQ4KBN7MGE35881BAC0006acrBP31224GeneID：基因ID編號BacMet_ID：重金屬抗性IDGene_name：抗性ID對應(yīng)基因Accession：抗性基因登錄號Organism：抗性基因來源物種Location：抗性基因在基因組上的定位Compound：抗性名稱annotation/gene_catalog_BactMet_pre_annotation.xls：BacMet預(yù)測得到的注釋結(jié)果表。annotation/BactMet_exp_Gene_category.xls：BacMet功能分類統(tǒng)計(jì)表。annotation/gene_catalog_BactMetExp_categorie.pdf：BacMet抗性基因分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖。38/65圖14.2BacMet抗性基因分類統(tǒng)計(jì)柱狀圖橫軸為重金屬抗性基因，縱軸為對應(yīng)的基因數(shù)目。4.15VFDB毒力因子功能注釋VFDB，毒力因子（Virulencefactor，VFs）指由細(xì)菌，病毒，真菌等代謝產(chǎn)生的帶有侵襲力和毒素等毒力性質(zhì)的分子，主要用于微生物感染宿主時(shí)，通過抑制或逃避宿主的免疫反應(yīng)等出入宿主組織細(xì)胞，并從宿主獲得營養(yǎng)及自身增殖生長的目的。毒力因子可編碼在可移動(dòng)遺傳元件（比如質(zhì)粒、基因島、噬菌體等）上并進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移（傳播使無害細(xì)菌變成危險(xiǎn)的病原菌，所以在鑒定毒力因子時(shí)一般會(huì)考慮基因島、分泌蛋白等。病原菌毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研發(fā)，收集整理了24個(gè)屬100多種重要醫(yī)學(xué)病原菌已知毒力因子的組成、結(jié)構(gòu)、功能、致病機(jī)理、毒力島、序列和基因組信息等內(nèi)容，被廣泛應(yīng)用于毒力因子基因鑒定。其主要包括兩個(gè)子庫：1）帶有setA的庫為VFDB數(shù)據(jù)庫核心庫(setA)，僅包含經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過的毒力基因，setB為全庫(setB),在setA的基礎(chǔ)上增加了預(yù)測的毒力基因使用DIAMOND將基因集蛋白序列與VFDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastp同源性比對，得到功能注釋和同源物種信息，