發(fā)酵工程關(guān)鍵指生物體在一定生物反應器中,以一定發(fā)酵方法,生產(chǎn)目標產(chǎn)物工程技術(shù)體系。菌種選育利用菌種突變（自然或人工）,然后采取方法和理性化方法進行篩選,取得目突變過程。自發(fā)突變及特點是微生物未經(jīng)人工誘變劑處理或雜交等生物技術(shù)手段而自然發(fā)生突變。特點:突變速度慢,時間長,突變頻率低,通常為10-7~10-9誘發(fā)突變及特點是人為用化學、物理誘變劑（紫外線、亞硝酸等）去處理微生物而引發(fā)突變。特點:突變速度快,時間短,突變頻率高,通常＞10-4自然選種是利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變原理,經(jīng)過分離、篩選排除衰退型菌株,從中選出維持或高出原有生產(chǎn)水平菌株過程。又稱自然分離。誘變育種是利用物理或化學誘變劑處理均勻分散微生物細胞群體,促進其突變率大幅度提升,然后采取簡便、高效篩選方法,從中選出少數(shù)含有優(yōu)良性狀突變菌株。培養(yǎng)基人工配制、供微生物生長繁殖和生物合成多種代謝產(chǎn)物所需多個營養(yǎng)物質(zhì)混合物。孢子制備是將休眠狀態(tài)孢子經(jīng)過固體表面進行擴大繁殖再形成成熟孢子過程。種子制備是由保藏菌種開始,經(jīng)過不停擴大培養(yǎng),使菌體數(shù)量達成能滿足發(fā)酵罐接種量需要所包含生產(chǎn)過程。分批發(fā)酵一次性投入料液,發(fā)酵過程中不補充,一直到放罐。連續(xù)發(fā)酵是在特定發(fā)酵設(shè)備中進行,一邊連續(xù)不停地輸入新鮮無菌料液,同時在另一邊連續(xù)不停地放出發(fā)酵液。分為罐式連續(xù)發(fā)酵和管道式連續(xù)發(fā)酵。動物組織培養(yǎng)從體內(nèi)取出組織,模擬體內(nèi)生理環(huán)境,在無菌、合適溫度和一定營養(yǎng)條件下,使之生存和生長,并維持其結(jié)構(gòu)和功效方法。習慣上又泛指全部體外培養(yǎng),即:器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。接觸抑制細胞從接種到長滿底物表面后,因為細胞繁殖數(shù)量增多相互接觸,不再增加。細胞克隆即單細胞分離培養(yǎng),把一個單細胞從一個群體中分離出來單獨培養(yǎng),使之重新繁衍成為一個新細胞群體培養(yǎng)技術(shù)?？寺⌒纬陕始毎褐袉蝹€細胞形成克隆百分數(shù)稱為克隆形成率,用來表示細胞生活力和獨立生長能力?？寺〗臃N率植物組織培養(yǎng)在無菌條件下,利用人工培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng),包含原生質(zhì)體、懸浮細胞和植物器官等培養(yǎng)。細胞全能性任何有完整細胞核植物細胞擁有形成一個完整植株所必需遺傳信息,理論上都能發(fā)育成為一顆植株。外植體從活植物體上切下進行培養(yǎng)那部分組織或器官。愈傷組織在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來一團無序生長薄壁細胞。原生質(zhì)體植物細胞除去細胞壁后剩下球形細胞。單克隆抗體單一類型只針對某一特定抗原決定簇抗原分子。抗體酶又稱催化抗體,結(jié)合了酶與抗體優(yōu)點,既能夠起酶促催化作用,又能夠起抗體選擇性和專一性結(jié)合抗原作用。簡答育種選育目（生產(chǎn)方面）提升發(fā)酵產(chǎn)量改善菌種性能產(chǎn)生新發(fā)酵產(chǎn)物去除多出組分自然選育方法及通常過程出發(fā)菌株——斜面培養(yǎng)——單孢子懸浮液——單菌落分離——初篩——復篩——高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性試驗和菌種特征考察——放大生產(chǎn)——隨時留種保藏,做好菌種保藏工作誘變選育方法及通常過程出發(fā)菌株——斜面培養(yǎng)——單孢子懸浮液——誘變處理——單菌落分離（使用分離培養(yǎng)基及理性化篩選模型等）——初篩——復篩——高產(chǎn)菌株穩(wěn)定性和菌種特征考察——放大生產(chǎn)——隨時留種保藏,做好育種保藏工作突變株三種類型正變株＞110%負變株＜90%穩(wěn)定株90-110%誘變劑分類物理誘變劑化學誘變劑生物誘變劑誘變關(guān)鍵步驟出發(fā)菌株選擇誘變處理突變株篩選篩選方法培養(yǎng)基成份及舉例碳源糖類氮源蛋白質(zhì)磷源和硫源KH2PO4K2HPO4Na2SO4MgSO4無機離子P、S、Fe、Mg、Ca等生長因子維生素、氨基酸前體苯乙酸、苯氧乙酸誘導劑L因子、B因子促進劑和抑制劑促進劑巴比妥抑制劑溴化物水分消沫劑動、植物油培養(yǎng)基種類合成培養(yǎng)基和復合培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基生產(chǎn)種子制備那兩個過程菌種崗位孢子制備生產(chǎn)崗位種子制備菌種保藏原理使微生物代謝于不活躍、生長繁殖受抑制休眠狀態(tài),以降低菌種變異。菌種保藏基礎(chǔ)方法斜面低溫保藏法（短期保藏）甘油保藏法（短、中期保藏）大（?。┟妆２胤ǎㄖ衅诒２兀熎け２胤ǎㄖ衅诒２兀╂咦訛V紙保藏法（中期保藏）砂土管保藏法（中期保藏）液體石蠟保藏法（中期保藏）真空冷凍干燥法（中、長久保藏）液氮超低溫保藏法（中、長久保藏）發(fā)酵類型（3種）分批發(fā)酵補料分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵過程控制參數(shù)分類（舉例）物理參數(shù):溫度、壓力、攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌功率、空氣流量化學參數(shù):pH、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、溶解氧濃度、廢氣中氧含量、廢氣中CO2含量生物參數(shù):菌體濃度、菌絲形態(tài)影響孢子/種子質(zhì)量原因孢子:培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和濕度、培養(yǎng)時間、冷藏時間、接種量、菌種保藏方法、定時純化、選育菌種種子:培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量細胞工程關(guān)鍵領(lǐng)域動物組織培養(yǎng)、植物組織培養(yǎng)、細胞融合與單克隆抗體、細胞拆合與染色體工程、轉(zhuǎn)基因生物、胚胎工程、細胞與基因診療細胞類型（四種貼壁/懸?。┵N壁:上皮細胞型、成纖維細胞型、游走細胞型、多形細胞型懸浮:懸浮在溶液中細胞培養(yǎng)中常見消毒方法高壓蒸汽消毒、干燥高溫消毒、過濾除菌、化學方法、紫外線天然動物細胞培養(yǎng)基（4種）血清、血漿、組織浸出液、水解乳蛋白常見四種細胞培養(yǎng)法單蓋玻片懸滴培養(yǎng)法、培養(yǎng)瓶原代培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、灌注小室培養(yǎng)法提升細胞克隆形成率方法使用適應性培養(yǎng)基、利用飼主細胞、牛胎血清、1-10國際單位/ml營養(yǎng)液胰島素、多用5%濃度CO2、底物特殊處理、適應性底物抗癌藥品細胞敏感性試驗方法美藍法、染料排斥法、集落形成試驗法、噻唑鹽（MTT）比色法、生長曲線測定法、放射性同位素3H-TdR摻入法、抗癌藥品效能比（CFU-F）測定法大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)法氣升式深層培養(yǎng)系統(tǒng)、微載體培養(yǎng)系統(tǒng)、微囊培養(yǎng)系統(tǒng)、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)原生質(zhì)體制備法（酶/機）酶解法、機械法植物細胞原生質(zhì)體融合后雜種細胞篩選法（4）遺傳互補篩選法、抗體互補篩選法、利用物理特征篩選法、利用生長特征篩選法動物細胞原生質(zhì)體融合后雜種細胞篩選法（3）利用抗藥性篩選系統(tǒng)、營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)、溫度敏感突變型雜種細胞篩選單克隆抗體大規(guī)模制備法利用微載體、微囊、旋轉(zhuǎn)瓶、中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)等進行培養(yǎng)?；蚬こ蹋╣eneticengineering）就是把外源基因經(jīng)過體外重組后導入受體細胞內(nèi),使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制,轉(zhuǎn)錄,翻譯表示操作。四大要素:目基因,載體,受體細胞,工具酶六步:分離,酶切,連接,轉(zhuǎn)化,篩選,驗證限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonucleases,RE）:通常能識別和切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列DNA水解酶,簡稱限制性內(nèi)切酶。特征:切割特異性,在特定部位上水解雙鏈DNA中每一條鏈上磷酸二酯鍵,從而造成雙鏈缺口,切斷DNA分子。星號活力（staractivity）,又稱第二活力（secondactivity）,指酶反應條件改變時,酶識別特異性降低,使酶在DNA分子中切點數(shù)增加。造成星號活力原因:a、甘油濃度過高,酶切反應體積最少要比限制性內(nèi)切酶本身體積大十倍;b、酶單位數(shù)/DNA比值過高,超出10U/mgDNA;c、低離子強度,小于25mmol/L;d、高pH值（pH）8.0）;e、有機溶劑存在;f、二價離子改變連接酶（ligase）:催化在2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵酶,最適溫度:15最常見質(zhì)粒提取方法:試驗室常見三法——堿變性法,氯化銫密度梯度離心法,沸水浴法。注意事項:a、新配制,為了確保NaOH沒有吸收到空氣CO2而減弱了堿性,因裂解細胞關(guān)鍵是堿,而非SDS,所以叫堿裂解法。b、操作要快速,因在堿性條件下,基因組DNA片段會慢慢斷裂。C、顛倒時動作要輕柔,不然,基因組DNA也會斷裂。大腸桿菌作為受體細胞優(yōu)點、缺點。大腸桿菌（DNA重組試驗和基因工程關(guān)鍵受體菌）;優(yōu)點:a、遺傳背景清楚,載體受體系統(tǒng)完備;b、培養(yǎng)簡單,生長快速,培養(yǎng)周期短,抗污染能力強;c、重組子穩(wěn)定,目基因表示水平高。不足:a、不能隨重組蛋白質(zhì)進行修飾加工b、蛋白質(zhì)分泌性能不好,形成包涵體c、蛋白質(zhì)產(chǎn)物不能糖基化d、大腸桿菌細胞中含有熱原物質(zhì)用于外源DNA擴增和克隆、基因高效表示、基因文庫構(gòu)建已知序列目基因取得方法:PCR、化學合成法PCR（PolymeraseChainReaction）法,又稱聚合酶鏈反應或擴增技術(shù),是一個高效快速體外擴增技術(shù)。使用PCR法克隆目基因前提條件是:已知待擴增目基因或DNA片段兩側(cè)序列,依據(jù)該序列化學合成擴展反應必需引物。PCR步驟:95℃變形_雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA;60℃退火_系統(tǒng)溫度降低,引物與DNA模板結(jié)合,形成局部雙鏈;72℃延伸_在DNA聚合酶作用下,以dNTP為原料,從引物5’影響PCR原因:熱DNA聚合酶;PCR反應緩沖液;引物（引物長度、G+C含量、堿基分布、引物濃度）;dNTP;溫度循環(huán)參數(shù)。引物作用:引物決定著擴增特異性和擴增效率。生物技術(shù)特點:a、目產(chǎn)物在初始原料中含量較低;b、含目產(chǎn)物初始原料組成復雜,出來目產(chǎn)物外,還有大量細胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽等。尤其是產(chǎn)物類似物對目產(chǎn)物分離純化影響很大;c、目產(chǎn)物穩(wěn)定性差,含有生物活性物質(zhì)對pH、溫度、金屬離子、有機溶劑、剪切刀、表面張力等十分敏感,輕易使其失活、變性;d、種類繁多,包含大、中、小分子,結(jié)構(gòu)簡單或復雜有機化合物以及結(jié)構(gòu)復雜又性質(zhì)各異生物活性物質(zhì);e、應用面廣,對其質(zhì)量、純度要求高,甚至要求無菌、無熱源。分離純化技術(shù)要求:a、技術(shù)條件要求溫和,能保持目產(chǎn)物生物活性;b、選擇性要好,能從復雜混合物中有效地將目產(chǎn)物分離出來,達成較高純化倍數(shù);c、收率要高;d、兩個技術(shù)之間要能直接銜接,不需要對材料加以處理或調(diào)整,這么可降低工藝步驟;e、整個分離純化過程要快,能夠滿足高生產(chǎn)率要求。分離純化過程中固液分離方法:分離細胞碎片比較難,通常見離心和膜過濾。分離純化過程中常見層析方法是依據(jù)物質(zhì)什么性質(zhì)分離:離子交換層析（ion-exchangechromatography,IEC）是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ);凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography,GFC）又稱排阻層析或分子篩方法,關(guān)鍵是依據(jù)蛋白質(zhì)大小和形狀,即蛋白質(zhì)質(zhì)量進行分離和純化;親和層析（affinitychromatography,AC）依據(jù)生物分子間親和力分離。蛋白質(zhì)含量測定常見方法:物理性質(zhì)——UV;化學性質(zhì)——凱氏定氮法,雙縮尿法;染色性質(zhì)——考馬斯亮染色法,銀染法;其她性質(zhì)——熒光法。蛋白質(zhì)純度測定常見方法:電泳法_SDS,IEF;化學法_N端測定,C端測定;儀器法_HPLC,質(zhì)譜,氨基酸組成份析。包涵體（InclusionBodies,IB）:在一些生長條件下,大腸桿菌能積累某種特殊生物大分子,它們致密地集聚在細胞內(nèi),或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu),這種水不溶性結(jié)構(gòu)就是包涵體。以包涵體形式表示重組蛋白喪失了原有生物活性,必需經(jīng)過有效變性復性操作,才能回收得到含有正確空間構(gòu)象（所以含有生物活性）目標蛋白。外源基因在大腸桿菌中高效表示影響原因:轉(zhuǎn)錄——開啟子、終止子;翻譯——核糖體結(jié)合位點、密碼子、質(zhì)粒拷貝數(shù)。核糖體結(jié)合位點（RBS）:mRNA翻譯起始效率關(guān)鍵是由其5’瓊脂糖凝膠電泳原理,移動方向,影響DNA在瓊脂糖中遷移原因？原理:瓊脂糖凝膠電泳是利用瓊脂糖融化再凝固后能形成帶有一定孔隙固體基質(zhì)特征,其密度取決于瓊脂糖濃度。在電場作用下及中性pH緩沖條件下帶負電核酸分子就能夠向（陽極）遷移。它關(guān)鍵用于分離、判定核酸,如DNA判定,DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等,為DNA分子及其片段分子量測定和DNA分子構(gòu)象分析提供了關(guān)鍵手段。影響DNA在瓊脂糖中遷移原因:加DNA分子:分子大小、構(gòu)象、堿基組成凝膠濃度電壓、電場強度、電泳緩沖液組成及pH值電泳溫度感受態(tài)（competence）:就是細菌能夠吸收周圍環(huán)境中DNA分子生理狀態(tài)Ca2+誘導完整細胞轉(zhuǎn)化適適用于革蘭氏陰性菌影響轉(zhuǎn)化原因:宿主細胞限制修飾系統(tǒng)宿主細胞感受態(tài)形成對轉(zhuǎn)化率有較大影響,感受態(tài)細胞形成率低,轉(zhuǎn)化率對應降低。重組DNA構(gòu)型與轉(zhuǎn)化率相關(guān),因為用超螺旋閉合環(huán)狀和開環(huán)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌不會受細菌內(nèi)酶破壞,所以用環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)化率