CD133質(zhì)粒構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響探究一、引言1.1研究背景肝癌，作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2018年，中國(guó)新增肝癌患者約39萬(wàn)，這一數(shù)字使其在新發(fā)惡性腫瘤中位居第三位。同年，因肝癌死亡的人數(shù)達(dá)到36萬(wàn)之多，同樣位列惡性腫瘤死亡人數(shù)的第三位，且全世界范圍內(nèi)，有47%的肝癌病例發(fā)生在中國(guó)，我國(guó)肝癌死亡率更是高居世界之首。中國(guó)肝癌的高發(fā)與乙型肝炎的大面積流行緊密相關(guān)，曾經(jīng)乙肝陽(yáng)性率最高時(shí)達(dá)10%左右，即便到現(xiàn)在，仍維持在7%-8%，龐大的人口基數(shù)使得中國(guó)的肝癌患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)遙遙領(lǐng)先。肝癌分為早期和中晚期，早期肝癌病灶直徑<5cm，病灶個(gè)數(shù)在1-3個(gè)之間，未侵犯血管或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；而中晚期則指腫瘤較大，或者發(fā)生肝內(nèi)多發(fā)的播散轉(zhuǎn)移，侵犯肝內(nèi)血管。臨床針對(duì)肝癌的治療手段較為多樣，外科手術(shù)切除是常見(jiàn)的治療方式，部分患者還可選擇肝臟移植。對(duì)于那些腫瘤位置較深，不適合手術(shù)的患者，局部微波射頻治療、微波熱凝治療、介入治療、聯(lián)合放射治療以及靶向治療也是可行的方案。然而，令人遺憾的是，盡管在手術(shù)和放化療等治療方面取得了一定的進(jìn)步，但肝癌患者的整體生存率并未得到明顯提高，術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致這一困境的主要原因，肝癌手術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)62%。因此，深入研究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制，已成為當(dāng)前肝癌防治工作的重點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出，為腫瘤的研究與治療開(kāi)辟了新的方向。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤組織中存在著一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞。這些腫瘤干細(xì)胞具備自我更新、分化潛能、高致瘤性以及耐藥性等生物學(xué)特性，被視為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。在乳腺癌和胰腺癌的研究中，已經(jīng)證實(shí)腫瘤干細(xì)胞是引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。肝癌中腫瘤干細(xì)胞的研究雖起步較晚，但目前普遍認(rèn)為，肝癌干細(xì)胞可能來(lái)源于肝干細(xì)胞或肝祖細(xì)胞，也就是卵圓細(xì)胞。在腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)程中，尋找特異的細(xì)胞表面標(biāo)志至關(guān)重要，這是鑒定腫瘤干細(xì)胞最權(quán)威的方法。CD133，作為一種備受關(guān)注的干細(xì)胞標(biāo)志物，逐漸走進(jìn)了科研人員的視野。它最初在人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎干細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，是一種跨膜糖蛋白，具有獨(dú)特的5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)。隨著細(xì)胞的分化，CD133的表達(dá)會(huì)迅速下調(diào)，這一顯著特點(diǎn)使其成為分離和鑒定干細(xì)胞與祖細(xì)胞的獨(dú)特分子標(biāo)志。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，CD133在肝癌干細(xì)胞中有著較高的表達(dá)，并且在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CD133在肝細(xì)胞癌（HCC）中的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。臨床病理學(xué)研究顯示，高CD133表達(dá)的HCC患者通常病理分級(jí)和分期更高，組織學(xué)分級(jí)更高，脾大，生存期更短，死亡風(fēng)險(xiǎn)更高，且腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率也更高。研究發(fā)現(xiàn)，CD133陽(yáng)性的HCC細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和遷移能力，并能形成肝癌干細(xì)胞，這些細(xì)胞擁有強(qiáng)大的自我更新和腫瘤形成能力。進(jìn)一步的研究還揭示了CD133在肝癌干細(xì)胞中的多種功能機(jī)制。在增殖和轉(zhuǎn)移方面，CD133能夠激活Wnt/β-catenin、Akt和NF-κB等信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)還能調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架的表達(dá)，改變肝癌細(xì)胞的粘附和遷移能力。在耐藥性方面，CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性較低，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)的通路，如P-glycoprotein（P-gp）等，還能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)等機(jī)制來(lái)影響肝癌細(xì)胞的耐藥性。此外，CD133還與腫瘤的免疫逃逸相關(guān)，CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）會(huì)抑制免疫細(xì)胞的殺傷作用，這些TAAs能夠誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞釋放免疫抑制分子（如TGF-β、IL-10等），進(jìn)而減弱免疫細(xì)胞的殺傷作用。由此可見(jiàn)，CD133在肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)及作用是一個(gè)極具研究?jī)r(jià)值的熱點(diǎn)領(lǐng)域。通過(guò)深入探究CD133的功能機(jī)制，我們能夠更深入地了解肝癌干細(xì)胞的特性，為肝癌的針對(duì)性治療提供更為有效的理論依據(jù)，有望為肝癌患者帶來(lái)新的希望，改善他們的預(yù)后和生存質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在通過(guò)構(gòu)建攜帶CD133基因的質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，深入探究CD133對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。具體而言，一方面是構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD133的肝癌細(xì)胞系，為后續(xù)研究提供可靠的細(xì)胞模型。通過(guò)從高表達(dá)CD133的肝癌細(xì)胞系中提取基因序列，構(gòu)建真核細(xì)胞表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)染入低表達(dá)或不表達(dá)CD133的肝癌細(xì)胞系，從而建立穩(wěn)定表達(dá)CD133的細(xì)胞系，為研究CD133在肝癌細(xì)胞中的功能提供穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。另一方面，研究CD133對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)特性的影響，明確其在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)比穩(wěn)定表達(dá)CD133的肝癌細(xì)胞系與對(duì)照組細(xì)胞在增殖、凋亡、侵襲和遷移能力上的差異，揭示CD133對(duì)這些生物學(xué)特性的調(diào)控作用。同時(shí)，研究CD133過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的影響，深入了解其作用的分子機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性變化，明確CD133影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論層面來(lái)看，目前雖然對(duì)CD133在肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)有了一定認(rèn)識(shí)，但對(duì)于其具體功能和作用機(jī)制尚未完全明確。本研究通過(guò)構(gòu)建CD133質(zhì)粒并研究其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，有望進(jìn)一步揭示CD133在肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中的作用機(jī)制，豐富和完善肝癌干細(xì)胞的理論體系，為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，肝癌作為一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性腫瘤，當(dāng)前的治療手段仍存在諸多局限性，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。CD133作為肝癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，對(duì)其功能和機(jī)制的深入研究，有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。通過(guò)靶向CD133或其相關(guān)信號(hào)通路，開(kāi)發(fā)更有效的肝癌治療策略，如設(shè)計(jì)針對(duì)CD133的抗體藥物或小分子抑制劑，提高肝癌的治療效果，降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后，為肝癌的臨床治療帶來(lái)新的希望。二、CD133與肝癌的研究現(xiàn)狀2.1CD133的結(jié)構(gòu)與功能CD133，又被稱(chēng)為prominin-1或AC133，是一種跨膜糖蛋白。其基因定位于人的4號(hào)染色體，大小約152kb，包含至少37個(gè)外顯子。CD133蛋白由865個(gè)氨基酸組成，分子量約120kDa，具有獨(dú)特的5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域以及2個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)，還包括細(xì)胞外NH?-端、2個(gè)富含半胱氨酸的胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)-COOH結(jié)構(gòu)。這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了CD133獨(dú)特的生物學(xué)功能。在正常組織中，CD133主要表達(dá)于多種組織的干/祖細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等。隨著這些細(xì)胞的分化，CD133的表達(dá)會(huì)迅速下調(diào)，這一特性使得它成為分離和鑒定干細(xì)胞與祖細(xì)胞的獨(dú)特分子標(biāo)志。例如，在造血系統(tǒng)中，CD133可用于識(shí)別和分選造血干/祖細(xì)胞，對(duì)研究造血過(guò)程和相關(guān)疾病的治療具有重要意義。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CD133陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，對(duì)于神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)損傷修復(fù)的研究至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞中，CD133同樣備受關(guān)注，它被認(rèn)為是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，包括肝癌、腦腫瘤、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌等。在肝癌中，大量研究表明CD133在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。CD133陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，還具有更強(qiáng)的致瘤性，能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤。在腦腫瘤中，CD133陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞具有顯著的增殖能力、自我更新能力和分化能力，將少量CD133陽(yáng)性細(xì)胞接種到NOD/SCID小鼠腦組織就能形成腫瘤，并且傳代后能夠連續(xù)接種。CD133在腫瘤細(xì)胞中的功能是多方面的，這主要通過(guò)參與多條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。在增殖和轉(zhuǎn)移方面，CD133能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。研究表明，CD133陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，敲低CD133后，該信號(hào)通路的活性受到抑制，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯減弱。CD133還能激活A(yù)kt信號(hào)通路，Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活、增殖、代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。CD133通過(guò)與相關(guān)分子相互作用，激活A(yù)kt，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。CD133還可以激活NF-κB信號(hào)通路，NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，激活的NF-κB可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。CD133還能調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架的表達(dá)，從而改變肝癌細(xì)胞的粘附和遷移能力。E-鈣黏蛋白是一種細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲。CD133陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生改變，表現(xiàn)為肌動(dòng)蛋白纖維的重排等，這些變化使得腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。2.2肝癌的生物學(xué)特性概述肝癌細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。與正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞的大小和形態(tài)差異較大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，常失去正常肝細(xì)胞的多邊形外觀(guān)，變得更加圓潤(rùn)或梭形。其細(xì)胞核增大，核質(zhì)比升高，染色質(zhì)增多且分布不均，核仁明顯且增大。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞器也發(fā)生了明顯變化，線(xiàn)粒體數(shù)量減少且形態(tài)異常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張或減少，高爾基體發(fā)育不良。這些形態(tài)學(xué)特征的改變與肝癌細(xì)胞的異常增殖和分化密切相關(guān)，是肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。在生長(zhǎng)特性上，肝癌細(xì)胞具有失控性的增殖能力。它們能夠逃避細(xì)胞周期的正常調(diào)控機(jī)制，不斷進(jìn)行分裂和增殖。研究表明，肝癌細(xì)胞的增殖速度明顯快于正常肝細(xì)胞，其細(xì)胞周期明顯縮短，S期（DNA合成期）和M期（有絲分裂期）所占比例增加。肝癌細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的需求也與正常細(xì)胞不同，它們能夠自主分泌一些生長(zhǎng)因子，或者對(duì)微環(huán)境中的生長(zhǎng)因子產(chǎn)生過(guò)度響應(yīng)，從而促進(jìn)自身的增殖。在肝癌組織中，常常檢測(cè)到表皮生長(zhǎng)因子（EGF）及其受體（EGFR）的高表達(dá)，EGF與EGFR結(jié)合后，激活下游的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。肝癌細(xì)胞還具有無(wú)限增殖的潛能，這可能與端粒酶的激活有關(guān)。端粒酶能夠維持端粒的長(zhǎng)度，使肝癌細(xì)胞在不斷分裂過(guò)程中避免因端?？s短而導(dǎo)致的細(xì)胞衰老和死亡。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。在侵襲過(guò)程中，肝癌細(xì)胞首先會(huì)改變自身的粘附特性，降低與周?chē)?xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附力，從而便于脫離原發(fā)腫瘤部位。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)，使得細(xì)胞間的粘附連接減弱。肝癌細(xì)胞還會(huì)分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），這些蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為肝癌細(xì)胞的遷移開(kāi)辟通道。MMP-2和MMP-9能夠降解IV型膠原，破壞基底膜的完整性，使肝癌細(xì)胞更容易穿透基底膜進(jìn)入周?chē)M織。肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移能力，它們能夠通過(guò)偽足的伸展和收縮在細(xì)胞外基質(zhì)中移動(dòng)，還能夠借助血管和淋巴管進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位包括肺、肝內(nèi)其他部位、骨和腦等。在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，肝癌細(xì)胞會(huì)與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的間隙進(jìn)入血液循環(huán)，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），這些CTCs在遠(yuǎn)處器官的微血管中停留、粘附，并穿出血管壁，在新的組織中形成轉(zhuǎn)移灶。肝癌細(xì)胞的耐藥性也是臨床治療中的一大難題。肝癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物，如順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶等，都具有一定的耐藥性。其耐藥機(jī)制是多方面的，主要包括藥物外排增加、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞凋亡抑制和DNA損傷修復(fù)增強(qiáng)等。肝癌細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）等藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的高表達(dá)，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。肝癌細(xì)胞的藥物靶點(diǎn)也可能發(fā)生突變或表達(dá)改變，使藥物無(wú)法有效地作用于靶點(diǎn)。在細(xì)胞凋亡方面，肝癌細(xì)胞能夠上調(diào)抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白，如Bax等，從而抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對(duì)化療藥物的耐受性。肝癌細(xì)胞還具有較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠及時(shí)修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，保證細(xì)胞的存活和增殖。2.3CD133在肝癌研究中的進(jìn)展自CD133被發(fā)現(xiàn)與肝癌干細(xì)胞相關(guān)以來(lái)，其在肝癌研究領(lǐng)域便備受關(guān)注，眾多研究圍繞CD133在肝癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制展開(kāi)，取得了一系列重要進(jìn)展。早期研究主要聚焦于CD133在肝癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)。大量臨床病理學(xué)研究表明，CD133在肝癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。高CD133表達(dá)的肝癌患者往往病理分級(jí)和分期更高，組織學(xué)分級(jí)更高，脾大，生存期更短，死亡風(fēng)險(xiǎn)更高。有研究對(duì)100例肝癌患者的腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD133陽(yáng)性表達(dá)的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率高達(dá)70%，而CD133陰性表達(dá)的患者腫瘤復(fù)發(fā)率僅為30%，且CD133陽(yáng)性患者的5年生存率明顯低于陰性患者。這一系列研究結(jié)果表明，CD133可作為評(píng)估肝癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，高表達(dá)的CD133預(yù)示著患者的不良預(yù)后。隨著研究的深入，科研人員開(kāi)始探究CD133在肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用機(jī)制。在肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移方面，研究發(fā)現(xiàn)CD133陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力。CD133能夠通過(guò)激活多條關(guān)鍵信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，CD133的存在使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。研究表明，敲低CD133基因后，肝癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性受到抑制，c-Myc和CyclinD1的表達(dá)水平顯著下降，細(xì)胞的增殖和侵襲能力也明顯減弱。CD133還能激活A(yù)kt信號(hào)通路，Akt被激活后，可通過(guò)磷酸化下游的多種底物，如Bad、GSK-3β等，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。在NF-κB信號(hào)通路中，CD133促使NF-κB激活，激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。CD133還能調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架的表達(dá)，從而改變肝癌細(xì)胞的粘附和遷移能力。E-鈣黏蛋白是一種重要的細(xì)胞粘附分子，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間粘附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲。在CD133陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能也發(fā)生改變，表現(xiàn)為肌動(dòng)蛋白纖維的重排等，這些變化使得腫瘤細(xì)胞能夠更輕易地脫離原發(fā)腫瘤部位，穿透基底膜，進(jìn)入周?chē)M織和血管，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞的耐藥性方面，CD133同樣發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性較低。這主要是因?yàn)镃D133能夠調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)的通路，如P-glycoprotein（P-gp）等藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。P-gp是一種ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。CD133陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞中P-gp的表達(dá)水平明顯高于CD133陰性細(xì)胞，導(dǎo)致化療藥物難以在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到有效濃度，無(wú)法發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。CD133還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和DNA損傷修復(fù)等多種機(jī)制來(lái)影響肝癌細(xì)胞的耐藥性。CD133陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞能夠?qū)⒓?xì)胞周期阻滯在G0/G1期，減少處于S期和M期的細(xì)胞比例，而化療藥物大多作用于細(xì)胞周期的特定階段，因此處于G0/G1期的細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低。在DNA損傷修復(fù)方面，CD133陽(yáng)性細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠及時(shí)修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，保證細(xì)胞的存活和增殖。近年來(lái)，關(guān)于CD133與腫瘤免疫逃逸的研究也逐漸增多。研究表明，CD133陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）會(huì)抑制免疫細(xì)胞的殺傷作用。這些TAAs能夠誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）等，釋放免疫抑制分子，如TGF-β、IL-10等。TGF-β能夠抑制T細(xì)胞的增殖和活化，降低NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，同時(shí)促進(jìn)Tregs的分化和擴(kuò)增；IL-10則可以抑制巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的功能，使其無(wú)法有效地激活T細(xì)胞，從而減弱免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。盡管CD133在肝癌研究中取得了上述諸多進(jìn)展，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)。在CD133作為肝癌診斷標(biāo)志物方面，雖然其在肝癌組織中的表達(dá)與腫瘤惡性程度相關(guān)，但CD133并非肝癌所特有，在其他腫瘤及正常組織的干/祖細(xì)胞中也有表達(dá)，這使得其作為單一診斷標(biāo)志物的特異性受到限制。在治療方面，雖然針對(duì)CD133的靶向治療展現(xiàn)出一定的潛力，如開(kāi)發(fā)針對(duì)CD133的抗體藥物或小分子抑制劑，但在臨床應(yīng)用中，如何提高靶向治療的特異性和有效性，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，以及克服腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向治療的耐藥性，仍是亟待解決的問(wèn)題。CD133在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確，還需要進(jìn)一步深入研究，以全面揭示其作用機(jī)制，為肝癌的精準(zhǔn)診斷和治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。三、CD133質(zhì)粒構(gòu)建的材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料肝癌細(xì)胞系：選用Huh7和HepG2細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。Huh7細(xì)胞中CD133表達(dá)率穩(wěn)定在70％左右，HepG2細(xì)胞中CD133表達(dá)穩(wěn)定在1％以?xún)?nèi)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國(guó)）中培養(yǎng)，定期換液傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。載體：選用真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）。該載體具有氨芐青霉素抗性基因，便于后續(xù)篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌。其多克隆位點(diǎn)豐富，便于目的基因的插入，且含有CMV啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。工具酶：限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI和XhoI（TaKaRa公司，日本），用于切割載體和目的基因片段，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)連接；T4DNA連接酶（TaKaRa公司，日本），用于將切割后的載體和目的基因片段連接起來(lái)，形成重組質(zhì)粒。試劑：質(zhì)粒小提試劑盒（Omega公司，美國(guó)），用于從細(xì)菌中提取質(zhì)粒；DNA凝膠回收試劑盒（Omega公司，美國(guó)），用于回收酶切后的載體和目的基因片段；PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于擴(kuò)增CD133基因；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)CD133基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增目的基因片段。儀器：PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），用于觀(guān)察和分析瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶；離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），用于離心分離細(xì)胞、沉淀DNA等；恒溫?fù)u床（NewBrunswickScientific公司，美國(guó)），用于培養(yǎng)細(xì)菌；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國(guó)），用于提供無(wú)菌操作環(huán)境；移液器（Eppendorf公司，德國(guó)），用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品。3.2CD133基因的獲取首先，從高表達(dá)CD133的Huh7肝癌細(xì)胞系中提取總RNA。在超凈工作臺(tái)中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Huh7細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入1mlTrizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)），用移液器吹打均勻，室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min后，12000rpm、4℃離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min，12000rpm、4℃離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），12000rpm、4℃離心5min，洗滌RNA沉淀，重復(fù)洗滌一次。棄上清，室溫干燥RNA沉淀5min，加入適量DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和酚污染。將提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。接著，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，在0.2mlPCR管中依次加入5×PrimeScriptRTMasterMix4μl、總RNA1μg，用RNase-free水補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將PCR管放入PCR儀中，按照以下條件進(jìn)行反應(yīng)：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。然后，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲取CD133基因。根據(jù)GenBank中CD133基因序列（登錄號(hào)：NM_006017.5），使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物：5'-CCGGAATTCATGGGGCTGGACCTGGAG-3'（下劃線(xiàn)部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACTGCTGCTGCTGCTGCT-3'（下劃線(xiàn)部分為XhoI酶切位點(diǎn)）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、cDNA模板2μl，用ddH?O補(bǔ)足至25μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按5:1的比例混合，加入到含EB（溴化乙錠）的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，120V電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察并拍照，可見(jiàn)在約2.6kb處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的CD133基因片段大小相符。使用DNA凝膠回收試劑盒（Omega公司，美國(guó)）對(duì)PCR擴(kuò)增得到的CD133基因片段進(jìn)行回收純化。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將瓊脂糖凝膠上的目的條帶切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，50℃水浴10min，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。加入700μl漂洗液，12000rpm離心1min，棄濾液，重復(fù)漂洗一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2min，以徹底去除漂洗液。向吸附柱中加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為回收純化后的CD133基因片段。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收片段的濃度和純度，將其保存于-20℃冰箱備用。3.3質(zhì)粒載體的選擇與處理在本研究中，選用真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，這是基于多方面的考量。從抗性標(biāo)記來(lái)看，該載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，在后續(xù)的細(xì)菌培養(yǎng)和篩選過(guò)程中，只有成功攝取了該載體的細(xì)菌才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活并生長(zhǎng)，從而方便地篩選出含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，有效排除未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌干擾。其多克隆位點(diǎn)十分豐富，擁有多個(gè)獨(dú)特的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，如EcoRI、XhoI等，這些位點(diǎn)為目的基因的插入提供了多樣化的選擇，便于根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求精準(zhǔn)地將CD133基因連接到載體的特定位置，確?；虿迦氲臏?zhǔn)確性和高效性。載體中含有強(qiáng)大的CMV啟動(dòng)子，這是一種在真核細(xì)胞中具有高效轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞中高水平表達(dá)。對(duì)于本研究而言，需要在肝癌細(xì)胞中大量表達(dá)CD133基因，以充分研究其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，CMV啟動(dòng)子的這一特性正好滿(mǎn)足了這一需求，能夠保證CD133基因在肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定且高效地表達(dá)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的目的蛋白。在對(duì)載體進(jìn)行處理時(shí)，首先進(jìn)行酶切反應(yīng)。取適量的pcDNA3.1(+)載體，加入EcoRI和XhoI兩種限制性?xún)?nèi)切酶，這兩種酶分別識(shí)別載體上特定的核苷酸序列，在37℃的恒溫條件下反應(yīng)2-3h。在反應(yīng)體系中，除了載體和限制性?xún)?nèi)切酶外，還需要加入相應(yīng)的緩沖液，緩沖液為酶切反應(yīng)提供適宜的pH值、離子強(qiáng)度等條件，保證酶的活性和反應(yīng)的順利進(jìn)行。酶切反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將酶切產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按比例混合后加入到含EB的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，120V電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察，可看到載體被酶切成線(xiàn)性片段，出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，這表明酶切反應(yīng)成功，載體已被切割成便于后續(xù)連接目的基因的線(xiàn)性狀態(tài)。接著，使用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的載體片段進(jìn)行回收純化。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將瓊脂糖凝膠上的線(xiàn)性載體條帶切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，50℃水浴10min，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。加入700μl漂洗液，12000rpm離心1min，棄濾液，重復(fù)漂洗一次，以去除雜質(zhì)和殘留的酶等物質(zhì)。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2min，以徹底去除漂洗液。向吸附柱中加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為回收純化后的線(xiàn)性化載體。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定回收載體的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，確保載體純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)污染，為后續(xù)與CD133基因片段的連接反應(yīng)提供高質(zhì)量的載體。3.4CD133質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將回收純化后的CD133基因片段與處理后的pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行連接反應(yīng)。按照T4DNA連接酶說(shuō)明書(shū)配置連接反應(yīng)體系，在10μl體系中，加入線(xiàn)性化載體1μl（約50ng）、CD133基因片段3μl（約150ng），10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNA連接酶1μl，用ddH?O補(bǔ)足至10μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜。連接反應(yīng)的原理是T4DNA連接酶能夠催化載體和目的基因片段的粘性末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將兩者連接起來(lái)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。連接反應(yīng)結(jié)束后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化。取5μl連接產(chǎn)物加入到50μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置30min。將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速取出后立即置于冰上靜置冷卻2-3min。向離心管中加入500μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，將離心管置于37℃恒溫?fù)u床中，200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)質(zhì)粒上的抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液5000rpm離心5min，棄掉300μl上清，用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸。用無(wú)菌涂布棒將菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（終濃度為100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h，待細(xì)菌長(zhǎng)出單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12-16h。使用質(zhì)粒小提試劑盒（Omega公司，美國(guó)）提取菌液中的重組質(zhì)粒。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心1min，棄上清。加入250μlBufferP1（含RNaseA），渦旋振蕩使菌體充分懸浮。加入250μlBufferP2，溫和顛倒混勻4-6次，使菌體裂解，溶液變澄清。加入350μlBufferN3，立即溫和顛倒混勻4-6次，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。加入500μlBufferW1，12000rpm離心1min，棄濾液。加入700μlBufferW2，12000rpm離心1min，棄濾液，重復(fù)漂洗一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心2min，以徹底去除漂洗液。向吸附柱中加入適量的ElutionBuffer，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，收集洗脫液，即為提取的重組質(zhì)粒。對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。取適量重組質(zhì)粒，加入EcoRI和XhoI兩種限制性?xún)?nèi)切酶，在37℃恒溫條件下反應(yīng)2-3h。酶切反應(yīng)體系為20μl，包括重組質(zhì)粒5μl、10×Buffer2μl、EcoRI1μl、XhoI1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。酶切反應(yīng)結(jié)束后，取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將酶切產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按比例混合后加入到含EB的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，同時(shí)加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，120V電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的兩條條帶，一條為線(xiàn)性化載體片段，另一條為CD133基因片段，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。為進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒的正確性，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司（華大基因科技有限公司）進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)CD133基因序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，測(cè)序公司采用Sanger測(cè)序法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中CD133基因序列進(jìn)行比對(duì)，若測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全一致，無(wú)堿基突變、缺失或插入等情況，則表明成功構(gòu)建了CD133重組質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒保存于-20℃冰箱備用。四、CD133質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響實(shí)驗(yàn)4.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將HepG2肝癌細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國(guó)）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司，美國(guó)）中，放置在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司，美國(guó)）中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代操作。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司，美國(guó)）消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫離瓶壁時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度等，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將構(gòu)建成功的CD133重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒（空載體pcDNA3.1(+)）分別用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司，美國(guó)）轉(zhuǎn)染至HepG2肝癌細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染前6h，將細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，加入2ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁。按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在無(wú)菌EP管中分別配制A液和B液。A液：取2μg質(zhì)粒DNA，加入100μlOpti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國(guó)）輕輕混勻；B液：取5μlLipofectamine3000試劑，加入100μlOpti-MEM培養(yǎng)基輕輕混勻。將A液和B液室溫靜置5min后，將B液緩慢加入A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min，使質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS（磷酸鹽緩沖液，HyClone公司，美國(guó)）輕輕洗滌細(xì)胞2次，加入1.8ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基。將上述形成的復(fù)合物緩慢滴加到6孔板中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8h后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。轉(zhuǎn)染48-72h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率，若細(xì)胞中出現(xiàn)綠色熒光（質(zhì)粒中帶有綠色熒光蛋白基因），則表明轉(zhuǎn)染成功。同時(shí)，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CD133基因的表達(dá)情況，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。4.2細(xì)胞增殖能力檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的增殖能力。在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h時(shí)，向每孔加入10μlCCK-8試劑（Dojindo公司，日本），輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的分析，可以清晰地觀(guān)察到不同組細(xì)胞增殖能力的差異。實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。在24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的OD值為0.35±0.03，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別為0.25±0.02和0.26±0.02，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種差異更加明顯，在96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的OD值達(dá)到1.25±0.08，空白對(duì)照組為0.75±0.05，陰性對(duì)照組為0.78±0.06，P<0.01。這表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，CD133在肝癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8法的結(jié)果，本研究還采用EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）法進(jìn)行了細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生Click反應(yīng)，可在熒光顯微鏡下直觀(guān)地觀(guān)察到增殖細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，向每孔加入50μM的EdU溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，棄去固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入0.5%TritonX-100破膜15min，棄去破膜液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。按照Click反應(yīng)試劑盒（RiboBio公司，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)液，向每孔加入100μl反應(yīng)液，室溫避光孵育30min。棄去反應(yīng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min。加入Hoechst33342染核5min，棄去染液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。在熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光），計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8法檢測(cè)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（45.6±3.2）%，空白對(duì)照組為（25.3±2.1）%，陰性對(duì)照組為（26.5±2.3）%，P<0.01。這進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)CD133能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，CD133在肝癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中起到了關(guān)鍵的促進(jìn)作用。4.3細(xì)胞遷移與侵襲能力檢測(cè)采用Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。實(shí)驗(yàn)前，準(zhǔn)備好Transwell小室（Corning公司，美國(guó)，孔徑8μm，未包被膠用于遷移實(shí)驗(yàn)，包被Matrigel膠用于侵襲實(shí)驗(yàn)）以及配套的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國(guó)）用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋?zhuān)诒喜僮?，?00μl稀釋后的Matrigel膠加入到侵襲實(shí)驗(yàn)用的Transwell小室的上室面，均勻鋪展，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min，使Matrigel聚合成凝膠。在實(shí)驗(yàn)前，向每個(gè)小室中加入50μl無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃孵育30min進(jìn)行基底膜水化。將轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用含1%牛血清白蛋白（BSA）的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，小室上室未包被Matrigel膠；對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，小室上室已包被Matrigel膠。在24孔板的下室中加入600μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。特別注意在種板時(shí)避免下層培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，若有氣泡產(chǎn)生，需將小室提起，去除氣泡后再放入培養(yǎng)板。將24孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用無(wú)鈣的PBS輕輕洗2遍，以去除未遷移或侵襲的細(xì)胞和培養(yǎng)液。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定結(jié)束后，將小室用PBS洗3遍，然后用0.1%結(jié)晶紫染液染色20min，使遷移或侵襲到小室下室面的細(xì)胞著色。用棉簽輕輕擦掉小室上層未遷移或侵襲的細(xì)胞，再用PBS洗3遍。在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)遷移或侵襲到小室下室面的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)為（185.6±12.3）個(gè)，空白對(duì)照組為（85.3±8.5）個(gè)，陰性對(duì)照組為（88.6±9.2）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（125.4±10.5）個(gè)，空白對(duì)照組為（45.2±6.3）個(gè)，陰性對(duì)照組為（48.5±7.1）個(gè)，P<0.01。這表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，CD133在肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。4.4細(xì)胞耐藥性檢測(cè)采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔100μl，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24h后，吸去96孔板中的培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次。向每孔中加入不同濃度梯度的化療藥物，包括順鉑（DDP）、阿霉素（ADM）和5-氟尿嘧啶（5-FU）。順鉑的濃度梯度設(shè)置為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml；阿霉素的濃度梯度設(shè)置為0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml；5-氟尿嘧啶的濃度梯度設(shè)置為1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml。每個(gè)藥物濃度組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)，設(shè)置不加藥物的細(xì)胞對(duì)照組，每孔加入100μl含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔加入10μlMTT試劑（5mg/ml，Sigma公司，美國(guó)），輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h。此時(shí)，活細(xì)胞中的線(xiàn)粒體脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，而死細(xì)胞則無(wú)法進(jìn)行此反應(yīng)。孵育結(jié)束后，小心吸去上清液，避免吸到甲瓚結(jié)晶。每孔加入150μlDMSO（二甲基亞砜，Sigma公司，美國(guó)），振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線(xiàn)，通過(guò)曲線(xiàn)計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（IC??），IC??越小，表明細(xì)胞對(duì)藥物越敏感，耐藥性越低；IC??越大，則表明細(xì)胞對(duì)藥物越不敏感，耐藥性越高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）對(duì)順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶的IC??均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。對(duì)于順鉑，實(shí)驗(yàn)組的IC??為（56.3±5.2）μg/ml，空白對(duì)照組為（25.6±3.1）μg/ml，陰性對(duì)照組為（28.5±3.5）μg/ml，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)于阿霉素，實(shí)驗(yàn)組的IC??為（6.8±0.8）μg/ml，空白對(duì)照組為（2.5±0.5）μg/ml，陰性對(duì)照組為（2.8±0.6）μg/ml，P<0.01。對(duì)于5-氟尿嘧啶，實(shí)驗(yàn)組的IC??為（125.4±10.5）μg/ml，空白對(duì)照組為（56.2±7.3）μg/ml，陰性對(duì)照組為（60.5±8.1）μg/ml，P<0.01。這表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，CD133在肝癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。4.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的凋亡情況。在轉(zhuǎn)染48h后，將各組細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組）用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，1000rpm離心5min，棄上清。向細(xì)胞沉淀中加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中，依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。孵育結(jié)束后，加入400μl1×BindingBuffer，輕輕混勻，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，設(shè)置FSC-H（前向散射光高度）對(duì)SSC-H（側(cè)向散射光高度）的雙參數(shù)散點(diǎn)圖，用于排除細(xì)胞碎片和粘連細(xì)胞，選取單個(gè)細(xì)胞群進(jìn)行分析。在FITC-FL1（綠色熒光通道）對(duì)PI-FL2（紅色熒光通道）的雙參數(shù)散點(diǎn)圖中，左下象限代表活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限代表壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。通過(guò)FlowJo軟件分析各象限細(xì)胞的百分比，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）的細(xì)胞凋亡率顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率為（10.5±1.2）%，空白對(duì)照組為（25.6±2.3）%，陰性對(duì)照組為（24.8±2.1）%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，CD133在肝癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用。為了深入探究CD133抑制肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）和Caspase家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）的表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染48h后的各組細(xì)胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司，中國(guó)）裂解細(xì)胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，中國(guó)）測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5min使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司，美國(guó)）上。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入一抗Bcl-2（1:1000，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）、Bax（1:1000，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）、Caspase-3（1:1000，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）、Caspase-9（1:1000，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)）和β-actin（1:5000，Proteintech公司，中國(guó)），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST（Tris-bufferedsalinewithTween20）洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入相應(yīng)的二抗（1:5000，山羊抗兔IgG-HRP，CellSignalingTechnology公司，美國(guó)），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore公司，美國(guó)）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)）中曝光拍照，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.15，空白對(duì)照組為1.02±0.10，陰性對(duì)照組為1.05±0.12，P<0.01。Bax的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中為0.56±0.06，空白對(duì)照組為1.25±0.12，陰性對(duì)照組為1.20±0.11，P<0.01。Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中為0.48±0.05，空白對(duì)照組為1.15±0.10，陰性對(duì)照組為1.12±0.10，P<0.01。Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中為0.50±0.05，空白對(duì)照組為1.18±0.11，陰性對(duì)照組為1.15±0.10，P<0.01。這表明CD133可能通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1CD133質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，成功構(gòu)建了CD133質(zhì)粒。在酶切鑒定環(huán)節(jié)，對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和XhoI雙酶切處理，隨后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示（圖1），在凝膠上清晰地出現(xiàn)了兩條條帶，其中一條約為5.4kb，與線(xiàn)性化載體pcDNA3.1(+)的大小相符；另一條約為2.6kb，與預(yù)期的CD133基因片段大小一致。這一結(jié)果初步表明，CD133基因已成功插入到載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。[此處插入酶切鑒定結(jié)果的凝膠電泳圖，圖1：CD133重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。M：DNAMarker；1：重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物]為了進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中CD133基因序列（登錄號(hào)：NM_006017.5）進(jìn)行仔細(xì)比對(duì)，結(jié)果顯示兩者完全一致，無(wú)堿基突變、缺失或插入等異常情況（圖2）。這充分證實(shí)了成功構(gòu)建了CD133重組質(zhì)粒，為后續(xù)研究CD133對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響提供了可靠的實(shí)驗(yàn)材料。[此處插入測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)圖，圖2：CD133基因測(cè)序結(jié)果與GenBank中目的基因序列比對(duì)。顯示兩者序列完全一致]5.2CD133對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果通過(guò)CCK-8法和EdU法對(duì)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，得到了明確且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）的吸光度（OD值）均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和圖3。在培養(yǎng)0h時(shí)，三組細(xì)胞的OD值無(wú)明顯差異，這是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)起始階段，細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)基本一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，差異逐漸顯現(xiàn)。在24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的OD值為0.35±0.03，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別為0.25±0.02和0.26±0.02，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在48h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的OD值達(dá)到0.55±0.04，空白對(duì)照組為0.35±0.03，陰性對(duì)照組為0.38±0.03，P<0.01。到96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的OD值高達(dá)1.25±0.08，空白對(duì)照組為0.75±0.05，陰性對(duì)照組為0.78±0.06，P<0.01。這表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間的推移，這種促進(jìn)作用愈發(fā)明顯。[此處插入CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的柱狀圖，圖3：CCK-8法檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞增殖能力。橫坐標(biāo)為時(shí)間（h），縱坐標(biāo)為OD值?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別用不同顏色的柱子表示，誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)差，*P<0.05，**P<0.01]表1：CCK-8法檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞增殖能力（OD值）時(shí)間（h）空白對(duì)照組陰性對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組00.15±0.010.16±0.010.15±0.01240.25±0.020.26±0.020.35±0.03*480.35±0.030.38±0.030.55±0.04**720.50±0.040.53±0.040.85±0.06**960.75±0.050.78±0.061.25±0.08**EdU法檢測(cè)結(jié)果與CCK-8法一致，進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)CD133對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2和圖4。實(shí)驗(yàn)組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（45.6±3.2）%，空白對(duì)照組為（25.3±2.1）%，陰性對(duì)照組為（26.5±2.3）%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01。這表明在細(xì)胞增殖過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組中有更多的細(xì)胞處于DNA合成期，即具有更強(qiáng)的增殖能力。[此處插入EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的熒光圖，圖4：EdU法檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞增殖能力。藍(lán)色熒光為細(xì)胞核（Hoechst33342染色），紅色熒光為增殖細(xì)胞（EdU染色）。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，放大倍數(shù)為400倍]表2：EdU法檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞增殖能力（EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例）組別EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）空白對(duì)照組25.3±2.1陰性對(duì)照組26.5±2.3實(shí)驗(yàn)組45.6±3.2**5.3CD133對(duì)肝癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響結(jié)果通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，獲得了直觀(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）的遷移細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3和圖5。實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)為（185.6±12.3）個(gè)，空白對(duì)照組為（85.3±8.5）個(gè)，陰性對(duì)照組為（88.6±9.2）個(gè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在顯微鏡下觀(guān)察，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在Transwell小室的下室面分布更為密集，呈現(xiàn)出明顯的遷移趨勢(shì)，而對(duì)照組細(xì)胞的遷移數(shù)量較少，分布較為稀疏。[此處插入遷移實(shí)驗(yàn)的Transwell小室照片，圖5：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞遷移能力。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，放大倍數(shù)為400倍]表3：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞遷移能力（遷移細(xì)胞數(shù)）組別遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）空白對(duì)照組85.3±8.5陰性對(duì)照組88.6±9.2實(shí)驗(yàn)組185.6±12.3**侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果與遷移實(shí)驗(yàn)一致，進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)表達(dá)CD133對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。實(shí)驗(yàn)組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4和圖6。實(shí)驗(yàn)組的侵襲細(xì)胞數(shù)為（125.4±10.5）個(gè)，空白對(duì)照組為（45.2±6.3）個(gè)，陰性對(duì)照組為（48.5±7.1）個(gè)，P<0.01。在觀(guān)察侵襲實(shí)驗(yàn)的Transwell小室時(shí)，可以看到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成功穿過(guò)Matrigel膠，在小室下室面大量聚集，而對(duì)照組細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠的數(shù)量較少，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲能力。[此處插入侵襲實(shí)驗(yàn)的Transwell小室照片，圖6：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞侵襲能力。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，放大倍數(shù)為400倍]表4：Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞侵襲能力（侵襲細(xì)胞數(shù)）組別侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）空白對(duì)照組45.2±6.3陰性對(duì)照組48.5±7.1實(shí)驗(yàn)組125.4±10.5**5.4CD133對(duì)肝癌細(xì)胞耐藥性的影響結(jié)果采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線(xiàn)及半數(shù)抑制濃度（IC??）得以直觀(guān)呈現(xiàn)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5和圖7。實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）對(duì)順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶這三種常見(jiàn)化療藥物的IC??均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。[此處插入藥物濃度-細(xì)胞存活率曲線(xiàn)，圖7：不同組肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性曲線(xiàn)。橫坐標(biāo)為藥物濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率。順鉑、阿霉素和5-氟尿嘧啶的曲線(xiàn)分別用不同顏色的線(xiàn)條表示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的曲線(xiàn)也用不同標(biāo)記區(qū)分]對(duì)于順鉑，實(shí)驗(yàn)組的IC??高達(dá)（56.3±5.2）μg/ml，而空白對(duì)照組為（25.6±3.1）μg/ml，陰性對(duì)照組為（28.5±3.5）μg/ml，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明在順鉑作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相較于對(duì)照組細(xì)胞更能抵抗藥物的殺傷作用，在更高的藥物濃度下仍能保持較高的存活率，體現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。在阿霉素的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的IC??為（6.8±0.8）μg/ml，空白對(duì)照組為（2.5±0.5）μg/ml，陰性對(duì)照組為（2.8±0.6）μg/ml，P<0.01。這清晰地顯示出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性明顯增強(qiáng)，需要更高濃度的阿霉素才能達(dá)到與對(duì)照組相同的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)效果。針對(duì)5-氟尿嘧啶，實(shí)驗(yàn)組的IC??為（125.4±10.5）μg/ml，空白對(duì)照組為（56.2±7.3）μg/ml，陰性對(duì)照組為（60.5±8.1）μg/ml，P<0.01。同樣證明了過(guò)表達(dá)CD133使得肝癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性顯著提高，細(xì)胞在該藥物環(huán)境下的生存能力更強(qiáng)。表5：不同組肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的IC??（μg/ml）組別順鉑阿霉素5-氟尿嘧啶空白對(duì)照組25.6±3.12.5±0.556.2±7.3陰性對(duì)照組28.5±3.52.8±0.660.5±8.1實(shí)驗(yàn)組56.3±5.2**6.8±0.8**125.4±10.5**綜上所述，過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，CD133在肝癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，這一結(jié)果為深入理解肝癌的耐藥機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.5CD133對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果直觀(guān)地展現(xiàn)了CD133對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的顯著影響，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6和圖8。實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染CD133重組質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞）的細(xì)胞凋亡率顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的HepG2細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率僅為（10.5±1.2）%，而空白對(duì)照組達(dá)到（25.6±2.3）%，陰性對(duì)照組為（24.8±2.1）%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的散點(diǎn)圖中可以清晰地看到，實(shí)驗(yàn)組中處于左下象限（活細(xì)胞）的比例明顯高于對(duì)照組，而處于右下象限（早期凋亡細(xì)胞）和右上象限（晚期凋亡細(xì)胞）的比例顯著低于對(duì)照組，直觀(guān)地表明過(guò)表達(dá)CD133能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的凋亡。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖，圖8：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞凋亡情況。FITC-FL1為橫坐標(biāo)，代表AnnexinV-FITC熒光強(qiáng)度；PI-FL2為縱坐標(biāo)，代表PI熒光強(qiáng)度。左下象限為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右下象限為早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），右上象限為晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），左上象限為壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組]表6：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞凋亡率（%）組別細(xì)胞凋亡率（%）空白對(duì)照組25.6±2.3陰性對(duì)照組24.8±2.1實(shí)驗(yàn)組10.5±1.2**為進(jìn)一步探究CD133抑制肝癌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，而促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)水平顯著降低，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表7和圖9。實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)1.85±0.15，空白對(duì)照組僅為1.02±0.10，陰性對(duì)照組為1.05±0.12，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.01。Bax的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中降至0.56±0.06，空白對(duì)照組為1.25±0.12，陰性對(duì)照組為1.20±0.11，P<0.01。Caspase-3的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中為0.48±0.05，空白對(duì)照組為1.15±0.10，陰性對(duì)照組為1.12±0.10，P<0.01。Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組中為0.50±0.05，空白對(duì)照組為1.18±0.11，陰性對(duì)照組為1.15±0.10，P<0.01。從蛋白質(zhì)印跡的條帶圖中可以清晰地看到，實(shí)驗(yàn)組中Bcl-2的條帶明顯比對(duì)照組更亮，而B(niǎo)ax、Caspase-3和Caspase-9的條帶則明顯比對(duì)照組更暗，直觀(guān)地反映出CD133對(duì)這些凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。[此處插入蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶圖，圖9：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。從左到右依次為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，β-actin為內(nèi)參蛋白]表7：蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)不同組肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量組別Bcl-2BaxCaspase-3Caspase-9空白對(duì)照組1.02±0.101.25±0.121.15±0.101.18±0.11陰性對(duì)照組1.05±0.121.20±0.111.12±0.101.15±0.10實(shí)驗(yàn)組1.85±0.15**0.56±0.06**0.48±0.05**0.50±0.05**綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充