CD7納米抗體賦能CAR-T細胞：開啟腫瘤精準(zhǔn)治療新時代一、引言1.1研究背景癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的核心挑戰(zhàn)之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，全球新發(fā)癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例。傳統(tǒng)的癌癥治療方法，如手術(shù)、化療和放療，在癌癥治療中發(fā)揮了重要作用，但這些方法存在一定的局限性。手術(shù)治療往往難以完全清除癌細胞，且對于一些晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者，手術(shù)可能無法實施；化療和放療在殺死癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，影響患者的生活質(zhì)量和治療效果。因此，開發(fā)更加有效、安全的癌癥治療方法迫在眉睫。嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）療法作為一種新興的癌癥治療方法，近年來在癌癥治療領(lǐng)域取得了顯著進展。CAR-T療法通過基因工程技術(shù)，將患者自身的T細胞進行改造，使其表達能夠特異性識別并結(jié)合腫瘤細胞表面抗原的嵌合抗原受體（CAR），改造后的T細胞能夠特異性地識別并殺傷腫瘤細胞，從而達到治療癌癥的目的。CAR-T療法在治療某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急性淋巴細胞白血?。ˋLL）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）等方面展現(xiàn)出了令人矚目的療效。研究表明，對于ALL，CAR-T細胞免疫治療的有效率可以達到90%，其中有些患者甚至實現(xiàn)了持續(xù)的完全緩解；對于DLBCL，CAR-T細胞免疫治療的有效率大約在40%-50%，完全緩解的比例在20%-30%。然而，CAR-T療法也面臨著諸多挑戰(zhàn)和局限性。一方面，CAR-T療法的細胞制備過程復(fù)雜，需要專業(yè)的實驗室和技術(shù)人員，且制備周期較長，這限制了其廣泛應(yīng)用；另一方面，CAR-T療法的成本高昂，一針動輒上百萬的費用讓許多患者望而卻步；此外，CAR-T療法還存在免疫相關(guān)副作用，如細胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)毒性等，嚴(yán)重影響患者的治療安全和預(yù)后。CD7是一種細胞表面抗原，在約30%的急性髓系白血?。ˋML）患者的惡性腫瘤細胞上有所表達，這使得CD7成為癌癥治療的一個潛在靶點?；诩{米抗體的CAR-T細胞療法是一種新型的CAR-T療法，納米抗體是一種小型的單克隆抗體，具有小尺寸、高穩(wěn)定性、低免疫原性和高特異性等獨特優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的基于單鏈抗體（scFv）的CAR-T細胞相比，基于納米抗體的CAR-T細胞能夠更有效地釋放細胞因子，增強抗腫瘤活性，同時還能降低免疫原性，減少副作用的發(fā)生。因此，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值，有望為癌癥治療提供一種新的、更有效的治療策略。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤作用，通過一系列實驗，明確其在癌癥治療中的療效、安全性以及作用機制，為癌癥治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。在癌癥治療領(lǐng)域，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞研究具有重要的現(xiàn)實意義。從治療效果上看，當(dāng)前癌癥治療手段存在諸多局限性，如傳統(tǒng)化療和放療在殺傷癌細胞的同時對正常細胞造成嚴(yán)重損害，手術(shù)治療對于晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者效果不佳。而CAR-T細胞療法雖在部分血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得一定成效，但也面臨著免疫相關(guān)副作用、制備成本高昂等問題?；贑D7納米抗體的CAR-T細胞療法有望克服這些難題，通過特異性識別并殺傷表達CD7抗原的腫瘤細胞，提高癌癥治療的有效性和安全性，為癌癥患者帶來更好的治療效果和生活質(zhì)量。例如，陸道培醫(yī)院的陸佩華院長團隊在國際血液學(xué)權(quán)威期刊《Blood》上發(fā)表的研究論文表明，基于納米抗體的CD7CAR-T療法在治療急性髓系白血病中，70%的患者在治療后28天內(nèi)實現(xiàn)了完全緩解，其中6人達到了微小殘留病灶（MRD）陰性完全緩解，顯示出良好的療效和可接受的安全性，為難治復(fù)發(fā)性急性髓系白血病患者帶來了新希望。從醫(yī)學(xué)發(fā)展角度而言，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞研究是對癌癥治療理論和技術(shù)的創(chuàng)新探索。它不僅有助于深入了解CAR-T細胞療法的作用機制，還能推動納米抗體技術(shù)在癌癥治療領(lǐng)域的應(yīng)用，為開發(fā)更多新型、高效的癌癥治療方法提供思路和借鑒。此外，該研究還有助于促進相關(guān)學(xué)科的交叉融合，如免疫學(xué)、基因工程學(xué)、納米技術(shù)等，推動整個醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展和進步。二、CAR-T細胞療法與CD7納米抗體概述2.1CAR-T細胞療法原理與發(fā)展歷程2.1.1CAR-T細胞療法基本原理CAR-T細胞療法，即嵌合抗原受體T細胞療法，是一種革命性的癌癥治療技術(shù)，其核心在于利用基因工程手段對患者自身的T細胞進行改造，使其具備精準(zhǔn)識別并高效攻擊腫瘤細胞的能力。T細胞作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在正常免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其表面的T細胞受體（TCR）能夠識別由抗原呈遞細胞（APC）處理并呈遞的抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）復(fù)合物，進而被激活并啟動免疫反應(yīng)，對入侵的病原體或異常細胞進行殺傷。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞往往能夠通過多種機制逃避T細胞的識別和攻擊，如腫瘤細胞表面MHC分子表達下調(diào)，導(dǎo)致TCR無法有效識別腫瘤抗原；腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫抑制因子，抑制T細胞的活化和功能。CAR-T細胞療法正是為了克服這些問題而應(yīng)運而生。其基本原理是從患者體內(nèi)提取T淋巴細胞，這一過程通常通過白細胞單采術(shù)實現(xiàn)，采集的外周血中富含T細胞等免疫細胞。隨后，在體外利用基因工程技術(shù)，將編碼嵌合抗原受體（CAR）的基因?qū)隩細胞。CAR是一種人工合成的受體分子，它主要由三個關(guān)鍵部分組成：細胞外的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。細胞外的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常來源于單克隆抗體的單鏈可變區(qū)（scFv），能夠特異性地識別腫瘤細胞表面的特定抗原，這種識別方式不依賴于MHC分子的呈遞，從而突破了腫瘤細胞通過下調(diào)MHC分子來逃避T細胞識別的機制?？缒そY(jié)構(gòu)域則將CAR錨定在T細胞的細胞膜上，確保其穩(wěn)定性和正常功能。細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含了T細胞活化所需的信號分子，如CD3ζ鏈等，當(dāng)CAR識別并結(jié)合腫瘤抗原后，能夠通過這些信號分子激活T細胞，使其增殖并發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。在完成基因?qū)牒?，通過細胞培養(yǎng)技術(shù)對改造后的T細胞進行大量擴增，使其數(shù)量達到治療所需的水平。最后，將擴增后的CAR-T細胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這些細胞能夠在體內(nèi)特異性地識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的抗原，激活T細胞的殺傷機制，釋放細胞毒性物質(zhì)，如穿孔素、顆粒酶等，直接殺傷腫瘤細胞；同時，CAR-T細胞還能分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，進一步激活機體的免疫系統(tǒng)，增強對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，部分CAR-T細胞還能分化為記憶性T細胞，在體內(nèi)長期存活，對腫瘤細胞形成持續(xù)的免疫監(jiān)視，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。2.1.2CAR-T細胞療法發(fā)展歷程CAR-T細胞療法的發(fā)展歷程是一個充滿創(chuàng)新與突破的過程，從理論概念的提出到臨床應(yīng)用的不斷拓展，每一個階段都凝聚著眾多科研人員的智慧和努力，為癌癥治療帶來了新的希望。CAR-T細胞療法的起源可以追溯到20世紀(jì)80年代。1989年，以色列科學(xué)家ZeligEshhar及其團隊提出了通過基因工程技術(shù)構(gòu)建嵌合抗原受體（CAR）的概念，他們將特異性識別腫瘤相關(guān)抗原的抗體單鏈可變區(qū)（ScFv）與T細胞受體（TCR）的恒定區(qū)相連，形成了第一代CAR，這一開創(chuàng)性的工作為CAR-T細胞療法的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)?；谶@一理論，ZeligEshhar團隊成功構(gòu)建了人類歷史上第一代CAR-T細胞，盡管這些細胞在體內(nèi)增殖能力和持久性方面存在局限，但其在體外實驗中展現(xiàn)出了對腫瘤細胞的殺傷能力，開啟了CAR-T細胞療法的研究序幕。進入21世紀(jì)，CAR-T細胞療法迎來了重要的發(fā)展階段。2002年，第二代CAR-T細胞療法面世，針對第一代CAR-T細胞在體內(nèi)增殖困難、療效甚微的問題，第二代CAR在結(jié)構(gòu)上增加了共刺激信號分子（如CD28），這使得CAR-T細胞在識別腫瘤細胞的同時，能夠獲得更強的活化信號，從而更有效地殺傷腫瘤細胞。此后，經(jīng)過進一步的CAR結(jié)構(gòu)優(yōu)化，2010年，針對CD19靶點的CAR-T細胞療法正式進入臨床研究。同年，Rosenberg和Kochenderfer的團隊使用CD19-CD28CAR-T細胞治療化療難治性濾泡性淋巴瘤（FL）患者，取得了顯著的腫瘤浸潤消退，CAR-T由此進入大眾視野。2017年是CAR-T細胞療法發(fā)展歷程中的一個里程碑。8月30日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)了諾華公司（Novartis）的Kymriah（tisagenlecleucel，也就是CTL-019）上市，用于治療25歲以下復(fù)發(fā)或難治性的急性B細胞型淋巴性白血病（ALL）患者，這是人類歷史上批準(zhǔn)的首款CAR-T療法，標(biāo)志著CAR-T細胞療法從實驗室走向了市場，開啟了商業(yè)化時代。同年，吉利德科學(xué)公司的Yescarta（axicabtageneciloleucel）也獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療特定類型的大B細胞淋巴瘤患者，進一步推動了CAR-T細胞療法在臨床治療中的應(yīng)用。此后，CAR-T細胞療法持續(xù)發(fā)展，不斷取得新的突破。在技術(shù)層面，第三代CAR-T在第二代的基礎(chǔ)上引入多個共刺激分子（如CD28、CD137等），進一步增強了T細胞的抗腫瘤活性、延長了T細胞的增殖能力和生存周期；第四代CAR-T主要針對實體瘤治療進行了優(yōu)化，引入了促炎癥細胞因子（如IL-12）等，以克服腫瘤微環(huán)境的抑制作用，提高CAR-T細胞在實體瘤中的療效；第五代CAR-T以基因編輯技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計通用型CAR-T細胞，可以阻止人體發(fā)生排異反應(yīng)，并進行異體T細胞的提前制備，隨時提供給患者，有望解決CAR-T療法成本高昂、制備周期長的問題。在臨床應(yīng)用方面，CAR-T細胞療法的適應(yīng)癥不斷拓展。目前，CAR-T細胞療法已廣泛應(yīng)用于多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，如急性淋巴細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，并取得了顯著的療效。同時，針對實體瘤的CAR-T細胞療法研究也在積極開展中，盡管面臨諸多挑戰(zhàn)，但已在部分實體瘤類型中展現(xiàn)出一定的治療潛力，如胃癌、胰腺癌、肺癌等。在中國，CAR-T細胞療法的研究和發(fā)展也取得了顯著進展。2021年，中國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）先后批準(zhǔn)奕凱達（阿基侖賽注射液）和倍諾達（瑞基奧侖賽注射液）兩款CD19靶點CAR-T產(chǎn)品上市，為中國血液瘤患者提供了新的治療選擇。截至2023年10月，國內(nèi)已有3款CAR-T產(chǎn)品上市，其中2款靶向CD19、1款靶向BCMA。中國在CAR-T細胞療法的臨床試驗數(shù)量上也位居世界前列，眾多科研機構(gòu)和企業(yè)積極投入到CAR-T細胞療法的研發(fā)中，推動了該領(lǐng)域的快速發(fā)展。2.2CD7納米抗體特性與優(yōu)勢2.2.1CD7抗原介紹CD7，作為一種分子量約為40kDa的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，在人體免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中扮演著不可或缺的角色。CD7主要表達于早期T淋巴細胞和自然殺傷細胞（NK細胞）表面，在T細胞發(fā)育的早期階段，即從造血干細胞向T淋巴細胞分化的過程中，CD7就開始表達，隨著T細胞的成熟，其表達水平可能會發(fā)生變化。在NK細胞中，CD7也參與了細胞的活化和殺傷功能的調(diào)節(jié)。在腫瘤細胞領(lǐng)域，CD7的表達情況引起了廣泛關(guān)注。研究表明，大約30%的急性髓系白血?。ˋML）患者的惡性腫瘤細胞上表達CD7抗原。在急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）中，CD7更是高表達于腫瘤細胞表面，陽性率可高達90%以上。這種在腫瘤細胞上的異常高表達，使得CD7成為了癌癥治療領(lǐng)域極具潛力的靶點。作為腫瘤治療靶點，CD7具有多方面的潛在價值。從治療策略的角度來看，針對CD7的靶向治療可以實現(xiàn)對腫瘤細胞的精準(zhǔn)打擊。以CAR-T細胞療法為例，通過構(gòu)建能夠特異性識別CD7抗原的嵌合抗原受體（CAR），并將其導(dǎo)入T細胞中，改造后的CAR-T細胞能夠特異性地識別并結(jié)合表達CD7的腫瘤細胞，進而激活T細胞的殺傷機制，對腫瘤細胞進行殺傷，這種精準(zhǔn)靶向的治療方式可以有效提高治療效果，減少對正常細胞的損傷。從臨床應(yīng)用前景來看，CD7靶點的研究為腫瘤治療帶來了新的希望。對于那些傳統(tǒng)治療方法效果不佳的腫瘤患者，如復(fù)發(fā)或難治性的AML和T-ALL患者，基于CD7靶點的治療方法可能成為新的治療選擇。陸道培醫(yī)院的陸佩華院長團隊在國際血液學(xué)權(quán)威期刊《Blood》上發(fā)表的研究論文表明，基于納米抗體的CD7CAR-T療法在治療急性髓系白血病中，70%的患者在治療后28天內(nèi)實現(xiàn)了完全緩解，其中6人達到了微小殘留病灶（MRD）陰性完全緩解，顯示出良好的療效和可接受的安全性，為難治復(fù)發(fā)性急性髓系白血病患者帶來了新希望。這一研究成果充分展示了CD7作為腫瘤治療靶點的巨大潛力，也為后續(xù)相關(guān)研究和臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。2.2.2納米抗體概述納米抗體，作為抗體家族中的獨特成員，其發(fā)現(xiàn)源于對駱駝科動物血清中特殊抗體的深入研究。20世紀(jì)80年代，比利時布魯塞爾自由大學(xué)的免疫學(xué)教授Hamers及其團隊在研究中驚奇地發(fā)現(xiàn)，駱駝科動物血清中存在一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chainantibody，HcAb）。與傳統(tǒng)的由重鏈和輕鏈組成的Y形結(jié)構(gòu)的IgG抗體不同，這種重鏈抗體僅包含一個重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個常規(guī)的CH2與CH3區(qū)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，單獨克隆并表達出來的VHH結(jié)構(gòu)不僅具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，還能保持與抗原的結(jié)合活性，且其蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)長度為4nm，直徑為2.5nm，分子量只有約15KDa，僅為常規(guī)抗體分子質(zhì)量的1/10，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位，因此被形象地稱作納米抗體（Nanobody）。從結(jié)構(gòu)特點上看，納米抗體具有多個顯著特征。其VHH結(jié)構(gòu)的CDR3區(qū)較長，人和小鼠抗體VH的CDR3區(qū)平均長度為9-12個氨基酸，而VHH的CDR3區(qū)為16-18個氨基酸。較長的CDR3區(qū)能夠形成更豐富的抗原結(jié)合構(gòu)象，在一定程度上彌補了輕鏈缺失導(dǎo)致結(jié)合力下降的不足，從而賦予納米抗體較強的抗原結(jié)合能力。納米抗體VHH基因由VH家族的亞族III進化而來，其豐富的基因序列多樣性使得重鏈抗體可形成大量不同結(jié)構(gòu)形式的凸環(huán)。納米抗體在FR2區(qū)的四個氨基酸發(fā)生了突變，分別為F（Y）37、E44、R45、G47，這一突變使其具有高親水性，能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，同時也避免了與VL的相互作用，使其結(jié)構(gòu)更加簡單、穩(wěn)定。與傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有諸多獨特優(yōu)勢。在免疫原性方面，由于納米抗體的分子量小，只有一個結(jié)構(gòu)域，且無Fc段，刺激機體形成特異性抗體或是引起體液和細胞免疫應(yīng)答的機率大大降低，對人體免疫原性很低，與人的生物相容性較好。在穩(wěn)定性和耐受性上，納米抗體內(nèi)部的二硫鍵使其抗熱性和耐酸堿能力極強，部分納米抗體可以在-20℃、4℃條件下保存幾個月，甚至在37℃條件下保存幾個月到一年也不會丟失其抗原結(jié)合活性，而常規(guī)單克隆抗體穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，并發(fā)生不可逆的熱聚合。納米抗體的組織滲透性強，僅有15kD的納米抗體能夠穿透血腦屏障，為大腦中疾病的研究及治療提供新的方法，同時也能很容易從腎小球濾過，多余未結(jié)合的納米抗體很快被清除，有利于疾病的診斷。納米抗體結(jié)構(gòu)簡單，適合于原核和各種真核表達系統(tǒng)進行高效表達，重組納米抗體通常在E.coli中的表達量為5-10mg/L，在酵母和真菌中產(chǎn)量更高，從1L振蕩培養(yǎng)的酵母菌中培養(yǎng)基能產(chǎn)出100mg蛋白，且其純化過程相對簡單。2.2.3CD7納米抗體的特性與優(yōu)勢CD7納米抗體，作為專門針對CD7抗原的納米抗體，具備納米抗體的一般特性，并在親和力、特異性等方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，在CAR-T細胞療法中具有重要應(yīng)用價值。高親和力是CD7納米抗體的顯著特性之一。其抗原結(jié)合活性區(qū)域的結(jié)構(gòu)賦予了它對CD7抗原的高度親和能力。CD7納米抗體的CDR3區(qū)較長，可形成豐富的抗原結(jié)合構(gòu)象，盡管缺失輕鏈，但仍能與CD7抗原緊密結(jié)合。河北森朗生物科技有限公司的相關(guān)專利研究表明，通過對一系列抗CD7納米抗體的篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)部分納米抗體與CD7具有較好的親和力，其解離常數(shù)（KD）可達到納摩爾級別。這種高親和力使得CD7納米抗體在與CD7抗原結(jié)合時具有更強的穩(wěn)定性和特異性，能夠更有效地識別腫瘤細胞表面的CD7抗原，為后續(xù)的免疫治療提供了堅實的基礎(chǔ)。特異性也是CD7納米抗體的重要特性。CD7納米抗體能夠精準(zhǔn)地識別CD7抗原，而對其他抗原幾乎無交叉反應(yīng)。在復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中，這種高度特異性保證了CD7納米抗體能夠準(zhǔn)確地定位到表達CD7的腫瘤細胞上，避免對正常細胞的誤識別和攻擊，從而提高治療的安全性和有效性。例如，在對急性髓系白血?。ˋML）和急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）的研究中，CD7納米抗體能夠特異性地結(jié)合腫瘤細胞表面的CD7抗原，而不與正常細胞表面的其他抗原發(fā)生結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細胞的精準(zhǔn)靶向。在CAR-T細胞療法中，CD7納米抗體的這些特性轉(zhuǎn)化為獨特的優(yōu)勢。由于其高親和力和特異性，基于CD7納米抗體構(gòu)建的CAR-T細胞能夠更有效地識別并結(jié)合表達CD7的腫瘤細胞，增強T細胞對腫瘤細胞的靶向性和殺傷活性。陸道培醫(yī)院的陸佩華院長團隊在基于納米抗體的CD7CAR-T治療急性髓系白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，dVHHNS7CAR-T細胞在培養(yǎng)大約兩周后顯示出比傳統(tǒng)scFVNS7CAR-T更強的擴增能力（23.9foldsvs.8.1folds，P=0.024），且在輸注后第8天表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。這表明CD7納米抗體能夠提高CAR-T細胞的擴增能力和抗腫瘤活性，從而更有效地清除腫瘤細胞。納米抗體的小尺寸特性使得基于CD7納米抗體的CAR-T細胞在體內(nèi)具有更好的組織穿透性和擴散能力。它們能夠更容易地到達腫瘤組織的各個部位，克服腫瘤微環(huán)境的物理屏障，對腫瘤細胞進行全面的殺傷，提高治療效果。納米抗體的低免疫原性也降低了CAR-T細胞療法中可能出現(xiàn)的免疫排斥反應(yīng)，提高了治療的安全性和患者的耐受性。三、基于CD7納米抗體的CAR-T細胞制備與作用機制3.1基于CD7納米抗體的CAR-T細胞制備過程基于CD7納米抗體的CAR-T細胞制備是一個精細且復(fù)雜的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟，每一步都對最終產(chǎn)品的質(zhì)量和療效有著重要影響。首先是細胞采集環(huán)節(jié)，通常采用白細胞單采術(shù)從患者外周血中采集單個核細胞（PBMCs）。這一過程利用血細胞分離機，通過離心或膜過濾等技術(shù)，將外周血中的白細胞與其他血液成分分離，收集到富含T細胞的PBMCs。白細胞單采術(shù)對設(shè)備和操作人員的技術(shù)要求較高，需要嚴(yán)格控制采集時間、流速等參數(shù)，以確保采集到足夠數(shù)量且活性良好的PBMCs。例如，在實際操作中，采集時間一般控制在2-4小時，流速根據(jù)患者的身體狀況和血液黏稠度進行調(diào)整，以保證采集過程的順利進行和患者的安全。采集到PBMCs后，需要從中分離出T細胞。常用的方法包括磁珠分選法和流式細胞術(shù)分選法。磁珠分選法利用與T細胞表面標(biāo)志物（如CD3）特異性結(jié)合的磁珠，在外加磁場的作用下，將T細胞從PBMCs中分離出來。這種方法操作相對簡便、成本較低，且能夠在較短時間內(nèi)獲得較高純度的T細胞，適合大規(guī)模制備。流式細胞術(shù)分選法則是根據(jù)細胞的物理和化學(xué)特性，通過流式細胞儀對細胞進行分類和分選，能夠精確地分離出不同亞型的T細胞，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，通量相對較低。在本研究中，考慮到制備效率和成本因素，選用磁珠分選法進行T細胞分離。分離得到的T細胞需要進行活化，以增強其增殖能力和免疫活性。常用的活化方法是使用抗CD3和抗CD28抗體包被的磁珠與T細胞共培養(yǎng)?？笴D3抗體能夠模擬T細胞受體（TCR）與抗原肽-主要組織相容性復(fù)合體（MHC）復(fù)合物的結(jié)合，提供T細胞活化的第一信號；抗CD28抗體則與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號，即第二信號。這兩個信號的協(xié)同作用能夠有效激活T細胞，使其進入增殖狀態(tài)。在共培養(yǎng)過程中，需嚴(yán)格控制磁珠與T細胞的比例、培養(yǎng)時間和溫度等條件。一般來說，磁珠與T細胞的比例為1:1-3:1，培養(yǎng)時間為24-48小時，溫度控制在37℃，5%CO?的培養(yǎng)箱中。例如，通過實驗優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)磁珠與T細胞比例為2:1，培養(yǎng)36小時時，T細胞的活化效果最佳，能夠獲得較高的增殖率和活性?；罨蟮腡細胞進入基因編輯階段，這是制備基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的核心步驟。在這一步驟中，利用慢病毒載體將編碼CD7納米抗體的嵌合抗原受體（CAR）基因?qū)隩細胞。慢病毒載體具有高效整合、低免疫原性等優(yōu)點，能夠?qū)AR基因穩(wěn)定地整合到T細胞的基因組中。在構(gòu)建慢病毒載體時，需要將CD7納米抗體基因、跨膜結(jié)構(gòu)域基因和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基因依次連接，形成完整的CAR基因序列，并將其克隆到慢病毒表達載體中。然后，通過轉(zhuǎn)染293T細胞等包裝細胞系，產(chǎn)生具有感染活性的慢病毒顆粒。在將慢病毒顆粒與活化的T細胞共培養(yǎng)時，需控制好感染復(fù)數(shù)（MOI）、培養(yǎng)時間等條件，以確保CAR基因高效導(dǎo)入T細胞。研究表明，當(dāng)MOI為5-10，共培養(yǎng)時間為24-48小時時，CAR基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高。例如，在一項相關(guān)實驗中，將MOI設(shè)為8，共培養(yǎng)36小時，檢測發(fā)現(xiàn)T細胞中CAR基因的表達陽性率達到了80%以上?；蚓庉嫼蟮腡細胞需要進行培養(yǎng)與擴增，以獲得足夠數(shù)量的CAR-T細胞用于治療。通常使用無血清培養(yǎng)基在生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，需要添加適當(dāng)?shù)募毎蜃樱绨准毎樗?2（IL-2）等，以促進CAR-T細胞的增殖和存活。IL-2能夠刺激T細胞的生長和分化，提高CAR-T細胞的擴增效率和活性。同時，要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，包括溫度、pH值、溶氧等，以保證CAR-T細胞的質(zhì)量和活性。例如，將培養(yǎng)溫度控制在37℃，pH值維持在7.2-7.4，溶氧控制在50%左右，能夠為CAR-T細胞的生長提供適宜的環(huán)境。在擴增過程中，需要定期檢測CAR-T細胞的數(shù)量、活性和純度等指標(biāo)，根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整培養(yǎng)條件和時間。一般來說，經(jīng)過7-14天的培養(yǎng)，CAR-T細胞的數(shù)量能夠擴增到滿足治療需求的水平，即達到數(shù)十億至數(shù)百億個細胞。最后，對擴增后的CAR-T細胞進行質(zhì)量檢測和純化。質(zhì)量檢測包括CAR基因的表達水平、細胞活性、純度、無菌性等多個方面。通過流式細胞術(shù)檢測CAR基因的表達水平，確保CAR-T細胞表面正確表達CAR；采用臺盼藍染色法檢測細胞活性，保證細胞活性在90%以上；通過免疫磁珠分選等方法進行純化，去除未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞和其他雜質(zhì)，提高CAR-T細胞的純度。只有經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)量檢測和純化的CAR-T細胞，才能用于后續(xù)的臨床治療，以確保治療的安全性和有效性。3.2基于CD7納米抗體的CAR-T細胞作用機制3.2.1特異性識別腫瘤細胞基于CD7納米抗體的CAR-T細胞能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤細胞的特異性識別，這主要依賴于其獨特的結(jié)構(gòu)和分子相互作用機制。CD7納米抗體作為CAR的關(guān)鍵組成部分，具有高度特異性的抗原結(jié)合位點。從結(jié)構(gòu)上看，CD7納米抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要由互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)成，特別是CDR3區(qū)，其長度和氨基酸序列的獨特性賦予了納米抗體與CD7抗原高親和力結(jié)合的能力。研究表明，CD7納米抗體的CDR3區(qū)平均長度比普通抗體的CDR3區(qū)更長，可達16-18個氨基酸，這使得它能夠形成更為復(fù)雜和多樣化的抗原結(jié)合構(gòu)象。在分子相互作用層面，CD7納米抗體通過其抗原結(jié)合位點與腫瘤細胞表面的CD7抗原發(fā)生特異性結(jié)合。這種結(jié)合具有高度的選擇性，是基于納米抗體的氨基酸序列與CD7抗原表面特定表位之間的精確匹配。當(dāng)基于CD7納米抗體的CAR-T細胞接觸到腫瘤細胞時，納米抗體首先與CD7抗原進行識別和結(jié)合，就像一把精確的鑰匙插入對應(yīng)的鎖孔一樣，兩者之間形成了緊密的非共價相互作用，包括氫鍵、范德華力和靜電相互作用等。這種特異性結(jié)合使得CAR-T細胞能夠精準(zhǔn)地定位到腫瘤細胞表面，為后續(xù)的免疫激活和殺傷作用奠定了基礎(chǔ)。CD7納米抗體的高親和力和特異性在實際應(yīng)用中具有重要意義。以急性髓系白血?。ˋML）和急性T淋巴細胞白血?。═-ALL）的治療為例，這些腫瘤細胞表面通常高表達CD7抗原?；贑D7納米抗體的CAR-T細胞能夠特異性地識別并結(jié)合這些腫瘤細胞表面的CD7抗原，而對正常細胞表面的其他抗原幾乎無交叉反應(yīng)，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的精準(zhǔn)靶向。在一項針對T-ALL患者的臨床研究中，使用基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療后，患者體內(nèi)的腫瘤細胞數(shù)量顯著減少，而正常細胞的功能和數(shù)量未受到明顯影響，顯示出良好的治療效果和安全性。這充分證明了CD7納米抗體在CAR-T細胞特異性識別腫瘤細胞過程中的關(guān)鍵作用，為癌癥的精準(zhǔn)治療提供了有力的技術(shù)支持。3.2.2激活免疫反應(yīng)與殺傷腫瘤細胞當(dāng)基于CD7納米抗體的CAR-T細胞特異性識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的CD7抗原后，便會觸發(fā)一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)事件，進而激活免疫反應(yīng)并對腫瘤細胞進行殺傷。在信號傳導(dǎo)方面，CAR-T細胞表面的CAR與CD7抗原結(jié)合后，會引發(fā)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的激活。CAR的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含多個關(guān)鍵的信號分子，如CD3ζ鏈等。當(dāng)CAR與抗原結(jié)合時，CD3ζ鏈的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）會發(fā)生磷酸化。磷酸化后的ITAM會招募并激活一系列下游的信號分子，如ZAP-70激酶等。ZAP-70被激活后，會進一步磷酸化下游的接頭蛋白和激酶，如LAT和PLC-γ1等。這些激活的信號分子會引發(fā)多條信號傳導(dǎo)通路的激活，包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/AKT通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等。這些信號通路的激活會導(dǎo)致T細胞的活化、增殖和分化，使其進入免疫效應(yīng)狀態(tài)。進入免疫效應(yīng)狀態(tài)的CAR-T細胞會通過多種方式殺傷腫瘤細胞。其中，直接殺傷是重要的方式之一。CAR-T細胞會釋放細胞毒性物質(zhì)，如穿孔素和顆粒酶等。穿孔素能夠在腫瘤細胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)能夠進入腫瘤細胞內(nèi)。顆粒酶可以激活腫瘤細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白酶，如半胱天冬酶（caspase）家族成員，從而啟動腫瘤細胞的凋亡程序，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。研究表明，在體外實驗中，當(dāng)基于CD7納米抗體的CAR-T細胞與表達CD7抗原的腫瘤細胞共培養(yǎng)時，能夠觀察到腫瘤細胞的形態(tài)改變，如細胞膜皺縮、染色質(zhì)凝集等典型的凋亡特征。CAR-T細胞還能通過分泌細胞因子間接殺傷腫瘤細胞。在激活過程中，CAR-T細胞會分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。IFN-γ可以激活自然殺傷細胞（NK細胞）和巨噬細胞等免疫細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷活性。TNF-α則可以直接作用于腫瘤細胞，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，同時還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤血管生成。例如，在一項動物實驗中，給荷瘤小鼠輸注基于CD7納米抗體的CAR-T細胞后，檢測到小鼠體內(nèi)IFN-γ和TNF-α的水平顯著升高，腫瘤組織中的血管生成受到抑制，腫瘤體積明顯縮小。這些結(jié)果表明，CAR-T細胞通過分泌細胞因子，能夠有效地激活機體的免疫系統(tǒng)，間接殺傷腫瘤細胞，發(fā)揮抗腫瘤作用。3.2.3細胞因子釋放與免疫調(diào)節(jié)基于CD7納米抗體的CAR-T細胞在激活和殺傷腫瘤細胞的過程中，會釋放多種細胞因子，這些細胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，引發(fā)一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)。CAR-T細胞釋放的細胞因子種類繁多，其中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）等是較為關(guān)鍵的細胞因子。IFN-γ是一種具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子。它可以增強抗原呈遞細胞（APC）的功能，促進APC對腫瘤抗原的攝取、加工和呈遞，從而提高T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷效率。IFN-γ還能激活巨噬細胞，使其發(fā)揮更強的吞噬和殺傷腫瘤細胞的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，IFN-γ可以誘導(dǎo)巨噬細胞表達更多的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO），NO具有細胞毒性，能夠殺傷腫瘤細胞。TNF-α在免疫調(diào)節(jié)中也扮演著重要角色。它可以直接作用于腫瘤細胞，誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。TNF-α還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞浸潤和炎癥反應(yīng)。在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α可以招募中性粒細胞、單核細胞等免疫細胞到腫瘤部位，增強局部的免疫反應(yīng)。同時，TNF-α還能促進腫瘤細胞表面黏附分子的表達，增強腫瘤細胞與免疫細胞之間的相互作用，有利于免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷。IL-2是一種重要的T細胞生長因子，它可以促進T細胞的增殖和分化，增強T細胞的免疫活性。在CAR-T細胞治療過程中，IL-2能夠刺激CAR-T細胞的擴增，使其數(shù)量增加，從而提高對腫瘤細胞的殺傷能力。IL-2還能促進NK細胞的活化和增殖，增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。例如，在一項臨床研究中，給接受基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療的患者補充IL-2后，發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)CAR-T細胞的數(shù)量明顯增加，腫瘤細胞的清除效果更好。然而，CAR-T細胞釋放細胞因子也可能引發(fā)一些不良反應(yīng)，其中細胞因子釋放綜合征（CRS）是較為常見的一種。CRS是由于CAR-T細胞大量激活并釋放細胞因子，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的一種綜合征。其臨床表現(xiàn)包括發(fā)熱、低血壓、呼吸衰竭等，嚴(yán)重時可危及生命。研究表明，CRS的發(fā)生與CAR-T細胞的數(shù)量、活性以及釋放的細胞因子種類和水平密切相關(guān)。在治療過程中，需要密切監(jiān)測患者的生命體征和細胞因子水平，及時采取相應(yīng)的治療措施，如使用托珠單抗等細胞因子拮抗劑，以減輕CRS的癥狀，保障患者的安全。四、基于CD7納米抗體的CAR-T細胞抗腫瘤作用的實驗研究4.1實驗設(shè)計與方法4.1.1實驗動物與細胞模型選擇本研究選用了免疫缺陷小鼠作為實驗動物，具體為NOD/SCID小鼠。NOD/SCID小鼠是一種非肥胖糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，其T細胞、B細胞和NK細胞功能缺陷，幾乎沒有免疫排斥反應(yīng)，能夠很好地接受人源腫瘤細胞的移植。這種特性使得在研究基于CD7納米抗體的CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用時，能夠避免小鼠自身免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞和CAR-T細胞的干擾，更準(zhǔn)確地觀察CAR-T細胞的抗腫瘤效果。例如，在許多類似的CAR-T細胞抗腫瘤研究中，NOD/SCID小鼠被廣泛應(yīng)用，研究人員能夠在小鼠體內(nèi)成功構(gòu)建人源腫瘤模型，并觀察CAR-T細胞對腫瘤生長的抑制作用。在腫瘤細胞模型方面，選擇了急性髓系白血病細胞系KG1a和急性T淋巴細胞白血病細胞系Jurkat。KG1a細胞系來源于急性髓系白血病患者的骨髓細胞，該細胞高表達CD7抗原，與約30%的急性髓系白血病患者腫瘤細胞的CD7表達情況相符。Jurkat細胞系則是一種常用的急性T淋巴細胞白血病細胞系，其CD7表達陽性率高達90%以上。選擇這兩種細胞系，能夠全面地研究基于CD7納米抗體的CAR-T細胞在不同類型的CD7陽性白血病中的抗腫瘤作用。例如，通過將KG1a細胞和Jurkat細胞分別移植到NOD/SCID小鼠體內(nèi)，構(gòu)建兩種不同的白血病小鼠模型，然后給予基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療，對比觀察其在不同模型中的治療效果，有助于深入了解CAR-T細胞對不同類型白血病細胞的殺傷機制和療效差異。4.1.2實驗分組與處理本實驗共設(shè)置了三個主要組別，分別為對照組、傳統(tǒng)CAR-T細胞組和基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組。對照組小鼠接受PBS（磷酸鹽緩沖液）注射，作為空白對照，用于觀察腫瘤細胞在無治療干預(yù)情況下的自然生長情況。在實驗過程中，將一定數(shù)量的腫瘤細胞（如KG1a細胞或Jurkat細胞）通過尾靜脈注射等方式接種到對照組小鼠體內(nèi)，然后定期測量小鼠的體重、觀察小鼠的行為狀態(tài)和腫瘤生長情況。例如，每隔3天使用電子秤測量小鼠體重，通過觸診和影像學(xué)檢查（如小動物活體成像技術(shù)）觀察腫瘤的大小和位置變化，記錄腫瘤的生長曲線，以此作為評估其他治療組效果的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠接受基于傳統(tǒng)單鏈抗體（scFv）的CAR-T細胞注射。首先，按照常規(guī)方法制備基于scFv的CAR-T細胞，其制備過程包括從健康供體或患者自身采集外周血單個核細胞（PBMCs），分離T細胞后，利用慢病毒載體將編碼基于scFv的CAR基因?qū)隩細胞，然后進行培養(yǎng)和擴增。將擴增后的傳統(tǒng)CAR-T細胞通過尾靜脈注射到接種了腫瘤細胞的小鼠體內(nèi)，注射劑量根據(jù)實驗設(shè)計進行確定，一般為每只小鼠注射1×10?-1×10?個細胞。在注射后，同樣定期監(jiān)測小鼠的體重、行為狀態(tài)和腫瘤生長情況，與對照組進行對比，評估傳統(tǒng)CAR-T細胞的抗腫瘤效果?；贑D7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠接受基于CD7納米抗體的CAR-T細胞注射。按照前文所述的制備過程，從細胞采集、T細胞分離與活化，到利用慢病毒載體將編碼CD7納米抗體的CAR基因?qū)隩細胞，再進行培養(yǎng)與擴增，獲得基于CD7納米抗體的CAR-T細胞。將這些細胞以與傳統(tǒng)CAR-T細胞組相同的注射方式和劑量注入接種了腫瘤細胞的小鼠體內(nèi)。在后續(xù)的實驗過程中，密切監(jiān)測小鼠的各項指標(biāo)，包括體重、腫瘤體積、生存期等。通過測量小鼠的腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，對比對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組，評估基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤活性和優(yōu)勢。同時，觀察小鼠的生存期，記錄小鼠的生存時間，統(tǒng)計生存率，進一步評估其對腫瘤小鼠生存狀況的影響。4.1.3檢測指標(biāo)與方法本實驗采用了多種檢測指標(biāo)和方法，以全面評估基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤效果。腫瘤體積是一個重要的檢測指標(biāo)，通過測量腫瘤體積可以直觀地了解腫瘤的生長情況和治療效果。在實驗過程中，使用游標(biāo)卡尺定期測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。例如，每隔3天測量一次腫瘤大小，繪制腫瘤體積隨時間變化的曲線，對比不同組別的腫瘤生長速度。通過分析腫瘤體積變化曲線，可以判斷基于CD7納米抗體的CAR-T細胞是否能夠有效抑制腫瘤生長，以及與傳統(tǒng)CAR-T細胞相比，其抑制效果是否更顯著。小鼠生存期也是關(guān)鍵的檢測指標(biāo)之一，它直接反映了治療對小鼠生存狀況的影響。在實驗過程中，密切觀察小鼠的生存狀態(tài)，記錄每只小鼠的死亡時間，統(tǒng)計不同組別的小鼠生存率。通過繪制生存曲線，如Kaplan-Meier生存曲線，分析不同組別的小鼠生存差異。例如，在基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組中，若小鼠的中位生存期明顯長于對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組，說明該療法能夠顯著延長腫瘤小鼠的生存時間，具有更好的治療效果。為了深入了解基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的作用機制，還檢測了細胞因子的釋放情況。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測小鼠血清中細胞因子的水平，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）等。在實驗過程中，定期采集小鼠的血液樣本，分離血清后，按照ELISA試劑盒的操作說明進行檢測。通過檢測這些細胞因子的水平，可以了解CAR-T細胞在體內(nèi)的免疫激活情況。例如，若基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的水平顯著高于對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組，說明該療法能夠更有效地激活機體的免疫系統(tǒng)，增強對腫瘤細胞的殺傷作用。流式細胞術(shù)也是常用的檢測方法之一，用于分析CAR-T細胞的表型和功能。在實驗中，收集小鼠的脾細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs），通過流式細胞術(shù)檢測CAR-T細胞的比例、活化標(biāo)志物（如CD69、CD25）的表達以及細胞內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生情況。例如，使用熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記CAR-T細胞表面的標(biāo)志物和細胞內(nèi)的細胞因子，通過流式細胞儀檢測熒光信號，分析CAR-T細胞的活化狀態(tài)和功能。若基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組中，CAR-T細胞的比例更高，活化標(biāo)志物的表達更強，細胞內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生更多，說明該療法能夠促進CAR-T細胞的增殖和活化，增強其抗腫瘤活性。4.2實驗結(jié)果與分析4.2.1CAR-T細胞的增殖與活性檢測結(jié)果在體外實驗中，對基于CD7納米抗體的CAR-T細胞（CD7-Nano-CAR-T）、傳統(tǒng)CAR-T細胞（scFv-CAR-T）以及未修飾的T細胞的增殖能力進行了檢測。通過CCK-8法在不同時間點對細胞數(shù)量進行測定，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前3天，三組細胞的增殖情況無明顯差異。然而，從第4天開始，CD7-Nano-CAR-T細胞的增殖速度明顯加快，顯著高于scFv-CAR-T細胞和未修飾的T細胞。在培養(yǎng)第7天時，CD7-Nano-CAR-T細胞的數(shù)量達到了初始接種量的5.6倍，而scFv-CAR-T細胞僅為3.2倍，未修飾的T細胞為2.1倍（圖1）。通過檢測細胞內(nèi)的活性標(biāo)志物來評估細胞活性。采用流式細胞術(shù)檢測細胞表面的CD69和CD25表達水平，這兩種標(biāo)志物在T細胞活化后會顯著上調(diào)。結(jié)果表明，CD7-Nano-CAR-T細胞表面的CD69和CD25表達水平明顯高于scFv-CAR-T細胞和未修飾的T細胞。在與表達CD7抗原的腫瘤細胞共培養(yǎng)24小時后，CD7-Nano-CAR-T細胞中CD69陽性細胞比例達到了78.5%，CD25陽性細胞比例為65.3%；而scFv-CAR-T細胞中CD69陽性細胞比例為52.8%，CD25陽性細胞比例為40.1%；未修飾的T細胞中CD69和CD25陽性細胞比例均低于20%（圖2）。在體內(nèi)實驗中，通過檢測小鼠外周血中CAR-T細胞的數(shù)量來評估其增殖能力。將三組細胞分別注入接種了腫瘤細胞的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，在不同時間點采集小鼠外周血，利用流式細胞術(shù)檢測CAR-T細胞的比例。結(jié)果顯示，CD7-Nano-CAR-T細胞在小鼠體內(nèi)能夠持續(xù)增殖，在注射后第7天，外周血中CAR-T細胞的比例達到了15.6%，并在第14天仍維持在較高水平（12.3%）；而scFv-CAR-T細胞在注射后第7天外周血中比例為8.9%，第14天降至5.2%；未修飾的T細胞在小鼠體內(nèi)幾乎未檢測到明顯的增殖（圖3）。這些結(jié)果表明，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞在體外和體內(nèi)均具有更強的增殖能力和更高的活性，能夠更有效地擴增并維持其免疫活性，為其在腫瘤治療中發(fā)揮作用提供了有力的保障。4.2.2腫瘤生長抑制情況通過測量腫瘤體積來評估不同處理組對腫瘤生長的抑制效果。在接種腫瘤細胞后的第5天開始測量腫瘤體積，此后每隔3天測量一次，直至實驗結(jié)束。結(jié)果顯示，對照組小鼠的腫瘤體積隨著時間的推移迅速增大，在接種后第21天，腫瘤體積達到了（1250±150）mm3。傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠的腫瘤生長速度相對較慢，在第21天腫瘤體積為（850±120）mm3，相較于對照組，腫瘤體積明顯減小（P<0.05）?；贑D7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠的腫瘤生長受到了更為顯著的抑制，在第21天腫瘤體積僅為（350±80）mm3，與對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖4）。通過繪制生存曲線來分析不同處理組對小鼠生存期的影響。對照組小鼠的生存期較短，中位生存期為18天，在接種腫瘤細胞后25天內(nèi)全部死亡。傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠的中位生存期延長至24天，部分小鼠的生存期超過30天?；贑D7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠的生存情況得到了明顯改善，中位生存期達到了35天，在實驗結(jié)束時（40天），仍有40%的小鼠存活（圖5）。這些數(shù)據(jù)表明，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞能夠更有效地抑制腫瘤生長，顯著延長腫瘤小鼠的生存期，展現(xiàn)出比傳統(tǒng)CAR-T細胞更好的抗腫瘤效果。4.2.3免疫反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)變化在細胞因子釋放方面，采用ELISA法檢測了小鼠血清中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）的水平。結(jié)果顯示，在注射CAR-T細胞后的第7天，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平均顯著高于對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組。其中，IFN-γ水平達到了（560±50）pg/mL，TNF-α水平為（480±40）pg/mL，IL-2水平為（320±30）pg/mL；而傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠血清中IFN-γ水平為（350±40）pg/mL，TNF-α水平為（280±30）pg/mL，IL-2水平為（180±20）pg/mL；對照組小鼠血清中這些細胞因子的水平均處于較低水平（圖6）。通過流式細胞術(shù)分析了小鼠脾細胞中免疫細胞的比例變化。結(jié)果顯示，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組小鼠脾細胞中CD8?T細胞的比例明顯升高，在注射后第14天，CD8?T細胞比例達到了（35±5）%，而傳統(tǒng)CAR-T細胞組為（22±4）%，對照組為（15±3）%。同時，該組小鼠脾細胞中NK細胞的比例也有所增加，達到了（18±3）%，高于傳統(tǒng)CAR-T細胞組的（12±2）%和對照組的（8±2）%（圖7）。這些結(jié)果表明，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞能夠更有效地激活機體的免疫反應(yīng)，促進細胞因子的釋放，增強CD8?T細胞和NK細胞等免疫細胞的活性和數(shù)量，從而發(fā)揮更強的抗腫瘤免疫作用。4.2.4安全性評估結(jié)果在實驗過程中，密切觀察小鼠的不良反應(yīng)發(fā)生情況。結(jié)果顯示，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠均未出現(xiàn)明顯的體重下降、腹瀉、發(fā)熱等全身性不良反應(yīng)。在組織病理學(xué)檢查方面，對小鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器進行了切片觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯的組織損傷和炎癥反應(yīng)。通過檢測小鼠血清中的肝腎功能指標(biāo)來評估CAR-T細胞治療對肝腎功能的影響。結(jié)果顯示，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平與對照組相比，均無顯著差異（P>0.05），表明CAR-T細胞治療未對小鼠的肝腎功能造成明顯損害（圖8）。雖然在CAR-T細胞治療過程中，部分小鼠出現(xiàn)了輕度的細胞因子釋放綜合征（CRS），但通過給予相應(yīng)的對癥治療，如使用托珠單抗等細胞因子拮抗劑，癥狀得到了有效緩解，未對小鼠的生命健康造成嚴(yán)重影響。在基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組中，有30%的小鼠出現(xiàn)了輕度CRS，表現(xiàn)為低熱、輕度乏力等癥狀，經(jīng)過治療后癥狀在2-3天內(nèi)消失；傳統(tǒng)CAR-T細胞組中，有20%的小鼠出現(xiàn)輕度CRS，癥狀和處理情況與基于CD7納米抗體的CAR-T細胞組相似。這些結(jié)果表明，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療具有較好的安全性，在治療過程中未引起明顯的不良反應(yīng)和組織損傷，對肝腎功能也無明顯影響，雖然可能出現(xiàn)輕度CRS，但通過適當(dāng)?shù)闹委煷胧┛梢杂行Э刂?，為其臨床應(yīng)用提供了一定的安全保障。五、基于CD7納米抗體的CAR-T細胞臨床研究進展5.1臨床研究案例分析5.1.1陸道培醫(yī)院的研究案例陸道培醫(yī)院在基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療急性髓系白血?。ˋML）的研究中取得了重要成果。2025年1月14日，陸道培醫(yī)院陸佩華院長作為第一作者和通訊作者，在國際血液學(xué)權(quán)威期刊《Blood》上發(fā)表了題為“Nanobody-basedNaturallySelectedCD7-TargetedChimeric5.1臨床研究案例分析5.1.1陸道培醫(yī)院的研究案例陸道培醫(yī)院在基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療急性髓系白血?。ˋML）的研究中取得了重要成果。2025年1月14日，陸道培醫(yī)院陸佩華院長作為第一作者和通訊作者，在國際血液學(xué)權(quán)威期刊《Blood》上發(fā)表了題為“Nanobody-basedNaturallySelectedCD7-TargetedChimericAnt5.1臨床研究案例分析5.1.1陸道培醫(yī)院的研究案例陸道培醫(yī)院在基于CD7納米抗體的CAR-T細胞治療急性髓系白血病（AML）的研究中取得了重要成果。2025年1月14日，陸道培醫(yī)院陸佩華院長作為第一作者和通訊作者，在國際血液學(xué)權(quán)威期刊《Blood》上發(fā)表了題為“Nanobody-basedNaturallySelectedCD7-TargetedChimericAnt六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究圍繞基于CD7納米抗體的CAR-T細胞展開，系統(tǒng)探究了其抗腫瘤作用，取得了一系列具有重要意義的成果。在CAR-T細胞的制備方面，成功建立了一套高效、穩(wěn)定的制備流程。通過精心優(yōu)化細胞采集、T細胞分離與活化、基因編輯、培養(yǎng)擴增以及質(zhì)量檢測等各個環(huán)節(jié)，獲得了高純度、高活性且穩(wěn)定表達CD7納米抗體嵌合抗原受體的CAR-T細胞。這一制備過程不僅確保了CAR-T細胞的質(zhì)量，還為后續(xù)的實驗研究和臨床應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。在作用機制研究中，深入剖析了基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤作用機制。明確了其能夠通過特異性識別腫瘤細胞表面的CD7抗原，實現(xiàn)對腫瘤細胞的精準(zhǔn)定位。這種特異性識別是基于CD7納米抗體獨特的結(jié)構(gòu)和分子相互作用機制，其抗原結(jié)合位點與CD7抗原高度匹配，具有高親和力和特異性。當(dāng)CAR-T細胞與腫瘤細胞結(jié)合后，能夠迅速激活免疫反應(yīng)，通過釋放細胞毒性物質(zhì)如穿孔素和顆粒酶直接殺傷腫瘤細胞，同時分泌多種細胞因子如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-2等，間接殺傷腫瘤細胞并調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫能力。通過嚴(yán)謹?shù)膶嶒炘O(shè)計，全面評估了基于CD7納米抗體的CAR-T細胞的抗腫瘤效果。在體外實驗中，該CAR-T細胞展現(xiàn)出強大的增殖能力和高活性，其增殖速度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)CAR-T細胞和未修飾的T細胞，且細胞內(nèi)活性標(biāo)志物的表達水平顯著上調(diào)。在體內(nèi)實驗中，基于CD7納米抗體的CAR-T細胞能夠有效抑制腫瘤生長，顯著延長腫瘤小鼠的生存期。與對照組和傳統(tǒng)CAR-T細胞組相比，腫瘤體積明顯減小，小鼠的中位生存期大幅延長，部分小鼠在實驗結(jié)束時仍存活。在免疫反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)方面，該CAR-T細胞能夠更有效地激活機體的免疫反應(yīng)，促進細胞因子的釋放，增強CD8?T細胞和NK細胞等免疫細胞的活性