Glypican-3熒光探針：肝細胞癌精準診斷的新曙光一、引言1.1研究背景與意義肝細胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為全球范圍內常見且危害極大的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，肝癌新發(fā)病例數達到90.6萬，死亡病例數約83萬，其發(fā)病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均位居前列。在我國，肝癌同樣是發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤，由于其起病隱匿，多數患者確診時已處于中晚期，導致治療效果不佳，5年生存率較低，給患者家庭和社會帶來沉重負擔。因此，早期診斷對于改善肝細胞癌患者的預后至關重要。早期診斷能為患者爭取最佳的治療時機，顯著提高治愈率和生存率。以手術切除為例，早期肝癌患者接受手術治療后的5年生存率可達70%-90%，而中晚期患者的5年生存率則降至20%-40%。早期診斷還能避免不必要的過度治療，減少患者的痛苦和醫(yī)療資源的浪費。目前，肝細胞癌的傳統(tǒng)診斷方法主要包括血清學檢測和影像學檢查。血清學檢測中，甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein，AFP）是臨床應用最廣泛的腫瘤標志物之一，但其存在一定局限性。AFP在肝細胞癌中的陽性檢出率僅為50%-70%，在早期肝癌和小肝癌患者中，AFP的陽性率更低，部分患者AFP水平甚至在正常范圍內，容易導致漏診。妊娠、肝炎、肝硬化等情況也會引起AFP水平升高，導致假陽性結果，影響診斷的準確性。影像學檢查如超聲、CT、MRI等在肝細胞癌診斷中發(fā)揮著重要作用。超聲檢查操作簡便、成本低，但對微小肝癌的檢測靈敏度較低，且受操作者經驗影響較大；CT和MRI雖能發(fā)現(xiàn)較小的肝臟病變，但對于直徑小于1cm的腫瘤，診斷準確性仍有待提高，且檢查費用較高，有一定輻射風險。傳統(tǒng)的組織活檢屬于有創(chuàng)檢查，存在出血、感染等風險，患者接受度較低，也限制了其在早期診斷中的應用。Glypican-3（GPC3）作為一種糖蛋白，在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，GPC3在肝癌組織中特異性高表達，而在正常肝組織及良性肝病組織中基本不表達或低表達。GPC3在肝癌診斷方面具有較高的敏感性和特異性，能夠彌補AFP等傳統(tǒng)標志物的不足。將GPC3與AFP聯(lián)合檢測，可提高肝細胞癌的診斷準確性，診斷敏感性和特異性分別可達70.3%和91.3%。靶向Glypican-3熒光探針的出現(xiàn)為肝細胞癌的診斷帶來了新的希望。該探針能夠特異性地與GPC3結合，通過熒光信號的變化實現(xiàn)對肝癌細胞的精準識別和定位。與傳統(tǒng)診斷方法相比，靶向Glypican-3熒光探針具有高靈敏度、高特異性、實時檢測等優(yōu)勢，能夠在早期階段發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的存在，為肝細胞癌的早期診斷提供有力支持。在動物實驗中，利用靶向Glypican-3熒光探針進行活體成像，能夠清晰地顯示肝癌組織的位置和大小，對微小肝癌的檢測靈敏度明顯高于傳統(tǒng)影像學檢查。靶向Glypican-3熒光探針在肝細胞癌診斷中的應用研究具有重要的創(chuàng)新價值和臨床意義，有望為肝細胞癌的早期診斷和治療提供新的策略和方法，改善患者的預后，具有廣闊的應用前景。1.2研究目的與內容本研究旨在系統(tǒng)評估靶向Glypican-3熒光探針在肝細胞癌診斷中的性能，為肝細胞癌的早期精準診斷提供理論依據和技術支持。具體研究內容包括以下幾個方面：靶向Glypican-3熒光探針的研發(fā)：利用基因工程和化學合成技術，設計并制備高特異性、高親和力的靶向Glypican-3熒光探針。通過優(yōu)化探針的結構和熒光基團，提高其熒光信號強度和穩(wěn)定性，確保探針能夠準確、靈敏地識別Glypican-3蛋白。采用多種表征技術，如核磁共振、質譜、熒光光譜等，對探針的結構和性能進行全面分析，明確探針的化學組成、熒光特性以及與Glypican-3的結合能力。靶向Glypican-3熒光探針的實驗驗證：在細胞水平上，選用肝癌細胞系和正常肝細胞系，通過細胞免疫熒光、流式細胞術等實驗方法，驗證靶向Glypican-3熒光探針對肝癌細胞的特異性識別能力。觀察探針在細胞內的攝取情況、熒光信號分布以及與Glypican-3的共定位情況，評估探針的靶向效果和細胞毒性。建立肝癌動物模型，利用活體熒光成像技術，動態(tài)監(jiān)測靶向Glypican-3熒光探針在體內對肝癌組織的靶向性和成像效果。對比分析不同時間點探針在肝癌組織和正常組織中的熒光信號強度，評估探針在體內的分布特征和清除速率，為臨床應用提供參考依據。靶向Glypican-3熒光探針在臨床應用中的評估：收集臨床肝細胞癌患者和健康對照者的血清、組織標本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫組織化學等方法，檢測標本中Glypican-3的表達水平，分析Glypican-3表達與肝細胞癌臨床病理特征之間的關系。應用靶向Glypican-3熒光探針，對肝細胞癌患者的組織標本進行熒光成像分析，與傳統(tǒng)的病理診斷方法進行對比，評估探針在臨床診斷中的準確性、敏感性和特異性。通過受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析，確定探針診斷肝細胞癌的最佳臨界值，為臨床診斷提供量化指標。靶向Glypican-3熒光探針的作用機制探究：運用分子生物學技術，如蛋白質免疫印跡、實時熒光定量PCR等，研究靶向Glypican-3熒光探針與Glypican-3蛋白結合后，對肝癌細胞信號通路的影響。探索探針是否通過調節(jié)相關信號通路，影響肝癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，揭示探針在肝細胞癌診斷中的潛在作用機制。采用基因編輯技術，構建Glypican-3基因敲除或過表達的肝癌細胞模型，進一步驗證探針的作用機制，為探針的優(yōu)化和臨床應用提供理論基礎。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用多學科研究方法，確保研究的科學性和可靠性。在靶向Glypican-3熒光探針的研發(fā)過程中，采用基因工程技術構建表達載體，通過化學合成方法連接熒光基團，精確控制探針的結構和組成。利用核磁共振（NMR）技術確定探針的化學結構，質譜（MS）分析其分子量和純度，熒光光譜（FS）測定其熒光特性，為探針性能的優(yōu)化提供數據支持。細胞實驗和動物實驗部分，嚴格遵循實驗操作規(guī)程，確保實驗結果的準確性和可重復性。細胞免疫熒光實驗中，使用熒光顯微鏡觀察探針在細胞內的熒光信號分布，結合共聚焦顯微鏡進行三維成像，清晰展示探針與Glypican-3的共定位情況。流式細胞術通過檢測細胞表面熒光強度，定量分析探針對肝癌細胞的特異性識別能力，減少實驗誤差。在動物實驗中，建立穩(wěn)定可靠的肝癌動物模型，利用活體熒光成像系統(tǒng)，對探針在體內的分布和代謝進行動態(tài)監(jiān)測。采用嚴格的隨機分組和對照實驗設計，對比分析不同實驗組之間的差異，確保實驗結果的可信度。臨床研究部分，嚴格按照倫理規(guī)范進行，充分保護患者的隱私和權益。通過收集大量的臨床標本，進行系統(tǒng)的檢測和分析，確保研究結果具有代表性和臨床應用價值。運用統(tǒng)計學方法對數據進行處理和分析，提高研究結論的科學性。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是聚焦Glypican-3這一特異性靶點，研發(fā)新型熒光探針。與傳統(tǒng)的診斷標志物相比，Glypican-3在肝癌組織中特異性高表達，以此為靶點的熒光探針能夠實現(xiàn)對肝癌細胞的精準識別，有效提高診斷的特異性和準確性，為肝細胞癌的早期診斷提供更具針對性的工具。二是結合多模態(tài)成像技術，實現(xiàn)對肝細胞癌的精準診斷。將熒光成像與其他成像技術如超聲、CT、MRI等相結合，充分發(fā)揮不同成像技術的優(yōu)勢，實現(xiàn)對肝癌組織的多維度、全方位檢測，提高診斷的靈敏度和準確性，為臨床醫(yī)生提供更全面、準確的診斷信息。三是深入探究靶向Glypican-3熒光探針的作用機制，為其臨床應用提供理論基礎。通過分子生物學實驗，揭示探針與Glypican-3蛋白結合后對肝癌細胞信號通路的影響，為進一步優(yōu)化探針性能、開發(fā)新的治療策略提供理論指導，推動肝細胞癌診斷和治療領域的發(fā)展。二、肝細胞癌概述2.1肝細胞癌的發(fā)病機制與流行病學肝細胞癌的發(fā)病機制是一個復雜且多因素參與的過程，涉及病毒感染、環(huán)境因素以及遺傳易感性等多個方面。其中，慢性病毒性肝炎感染是肝細胞癌發(fā)生的重要危險因素之一。乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的持續(xù)感染可引發(fā)肝臟的慢性炎癥，導致肝細胞不斷受損與修復。在這一過程中，肝細胞的DNA容易受到損傷，進而引發(fā)基因突變，增加了肝癌發(fā)生的風險。據統(tǒng)計，全球約50%-80%的肝細胞癌病例與HBV感染相關，在我國，這一比例更是高達80%以上。HBV通過將其基因整合到宿主肝細胞基因組中，干擾細胞的正常生理功能，促進細胞的異常增殖和分化，最終導致肝癌的發(fā)生。肝硬化也是肝細胞癌的重要發(fā)病基礎。各種病因如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等長期作用于肝臟，可導致肝臟組織纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化。在肝硬化階段，肝臟的微環(huán)境發(fā)生改變，肝細胞的再生和修復過程紊亂，使得細胞更容易發(fā)生惡性轉化。研究表明，約70%-90%的肝細胞癌患者合并有肝硬化。肝硬化患者的肝臟組織中，細胞外基質成分改變，生長因子和細胞因子的表達失衡，這些因素共同作用，為肝癌細胞的生長和侵襲提供了有利條件。黃曲霉毒素暴露同樣與肝細胞癌的發(fā)生密切相關。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類毒性代謝產物，具有極強的致癌性。長期攝入被黃曲霉毒素污染的食物，如霉變的谷物、堅果等，可導致肝臟細胞的DNA損傷，引發(fā)基因突變，從而促進肝細胞癌的發(fā)生。在一些非洲和亞洲的高發(fā)地區(qū)，黃曲霉毒素的暴露是肝細胞癌發(fā)病率居高不下的重要原因之一。黃曲霉毒素B1能夠與DNA形成加合物，干擾DNA的復制和轉錄過程，導致細胞的遺傳信息傳遞異常，最終引發(fā)細胞癌變。除上述因素外，長期酗酒、遺傳因素等也在肝細胞癌的發(fā)病中起到一定作用。長期大量飲酒可導致肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，增加肝癌的發(fā)病風險。遺傳因素則使得某些個體對肝細胞癌具有更高的易感性，一些基因突變或多態(tài)性與肝細胞癌的發(fā)生密切相關，如TP53、CTNNB1等基因的突變。酒精代謝過程中產生的乙醛具有細胞毒性，能夠損傷肝細胞的細胞膜和細胞器，誘導細胞凋亡和壞死，同時還會激活炎癥信號通路，促進肝臟纖維化的發(fā)展。遺傳因素通過影響細胞的代謝、修復和增殖等過程，改變個體對致癌因素的敏感性，從而增加患癌風險。肝細胞癌在全球范圍內的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異。總體而言，亞洲和非洲是肝細胞癌的高發(fā)地區(qū)，而歐洲和北美洲的發(fā)病率相對較低。據國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的數據，2020年全球肝細胞癌新發(fā)病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例。在亞洲，中國、日本、韓國等國家的肝細胞癌發(fā)病率較高。我國是肝癌大國，每年新發(fā)病例約41萬例，占全球新發(fā)病例的45%左右，死亡病例約39萬例，發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤前列。在非洲，埃及、南非等國家的肝細胞癌發(fā)病率也相對較高。在我國，肝細胞癌的發(fā)病具有一些獨特的流行病學特征。從地域分布來看，東南沿海地區(qū)的發(fā)病率高于內陸地區(qū)，這可能與該地區(qū)的乙型肝炎病毒感染率較高、黃曲霉毒素暴露風險較大以及生活飲食習慣等因素有關。從年齡分布來看，肝細胞癌的發(fā)病高峰在40-60歲之間，但近年來，隨著生活方式的改變和環(huán)境因素的影響，發(fā)病年齡有逐漸年輕化的趨勢。從性別分布來看，男性的發(fā)病率明顯高于女性，男女發(fā)病比例約為2-5:1。這可能與男性更容易暴露于致癌因素，如長期酗酒、吸煙等，以及男性體內的激素水平和遺傳易感性等因素有關。肝細胞癌的高發(fā)病率和高死亡率給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大挑戰(zhàn)。在我國，由于人口基數大，肝癌患者數量眾多，對患者的健康和生活質量造成了嚴重影響，也給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。早期診斷和治療是改善肝細胞癌患者預后的關鍵，但目前臨床上仍面臨著早期診斷困難、治療手段有限等問題。因此，深入研究肝細胞癌的發(fā)病機制，加強流行病學監(jiān)測，開發(fā)更加有效的早期診斷方法和治療策略，對于降低肝細胞癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生存率和生活質量具有重要意義。二、肝細胞癌概述2.2肝細胞癌的現(xiàn)有診斷方法2.2.1血清學檢測血清學檢測是肝細胞癌診斷的重要手段之一，其中甲胎蛋白（AFP）是臨床應用最為廣泛的血清標志物。AFP是一種糖蛋白，主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成。在正常成人血清中，AFP含量極低，一般低于20ng/mL。當肝細胞發(fā)生癌變時，AFP基因重新被激活，導致血清中AFP水平顯著升高。AFP檢測在肝細胞癌診斷中具有重要價值。大量臨床研究表明，AFP水平與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。當血清AFP濃度超過400ng/mL，且持續(xù)升高并排除妊娠、活動性肝病及生殖腺胚胎源性腫瘤等情況時，對肝細胞癌的診斷具有較高的特異性。在肝細胞癌的早期篩查中，AFP檢測能夠發(fā)現(xiàn)一部分無癥狀的早期患者，為及時治療提供了可能。有研究對1000例高危人群進行定期AFP檢測和肝臟超聲檢查，結果發(fā)現(xiàn)，通過AFP檢測發(fā)現(xiàn)了20例早期肝細胞癌患者，這些患者接受手術治療后，5年生存率明顯高于中晚期患者。AFP檢測也存在一定的局限性。AFP在肝細胞癌中的陽性檢出率僅為50%-70%，這意味著有相當一部分肝細胞癌患者的AFP水平可能處于正常范圍，容易導致漏診。在早期肝癌和小肝癌患者中，AFP的陽性率更低。一項針對50例直徑小于2cm的小肝癌患者的研究顯示，AFP陽性率僅為30%。AFP的升高并非肝細胞癌所特有，妊娠、肝炎、肝硬化等情況也會引起AFP水平升高，導致假陽性結果，影響診斷的準確性。在慢性乙型肝炎患者中，約有20%-40%的患者AFP水平會升高，但其中大部分并非肝癌患者。為了提高血清學檢測的準確性，臨床上常聯(lián)合檢測其他標志物，如甲胎蛋白異質體（AFP-L3）、異常凝血酶原（PIVKA-II）等。AFP-L3是AFP的一種糖型，其在肝細胞癌患者血清中的比例明顯升高，且與肝癌的惡性程度和預后相關。研究表明，AFP-L3占總AFP的比例大于10%時，對肝細胞癌的診斷具有較高的特異性。PIVKA-II是一種維生素K缺乏或拮抗劑-Ⅱ誘導的蛋白，在肝細胞癌患者中，由于癌細胞對維生素K的利用障礙，導致PIVKA-II合成增加。PIVKA-II對肝細胞癌的診斷也具有較高的敏感性和特異性，尤其在AFP陰性的肝癌患者中，PIVKA-II的陽性率可達60%-70%。將AFP、AFP-L3和PIVKA-II聯(lián)合檢測，可提高肝細胞癌的診斷準確性。有研究對200例肝細胞癌患者和100例健康對照者進行檢測，結果顯示，聯(lián)合檢測的診斷敏感性和特異性分別達到85%和90%，明顯高于單一標志物檢測。2.2.2影像學檢查影像學檢查在肝細胞癌的診斷中占據著至關重要的地位，能夠直觀地顯示肝臟的形態(tài)、結構以及病變的位置、大小和形態(tài)等信息，為臨床診斷提供重要依據。目前，常用的影像學檢查方法包括超聲、CT和MRI等。超聲檢查是肝細胞癌篩查和診斷的首選方法之一，具有操作簡便、無創(chuàng)傷、可重復性強以及成本較低等顯著優(yōu)勢。通過超聲檢查，能夠清晰地觀察到肝臟的大小、形態(tài)、實質回聲以及血管分布情況，對于肝臟內的占位性病變具有較高的檢出率。在超聲圖像上，肝細胞癌多表現(xiàn)為低回聲或等回聲結節(jié)，邊界可清晰或模糊，部分腫瘤周邊可見低回聲暈環(huán)。超聲檢查還可借助彩色多普勒血流成像技術，對腫瘤內部及周邊的血流情況進行評估，肝細胞癌通常具有豐富的血流信號，表現(xiàn)為動脈血流頻譜。一項針對500例高危人群的超聲篩查研究顯示，超聲檢查發(fā)現(xiàn)肝臟占位性病變100例，其中經病理證實為肝細胞癌的有30例，表明超聲檢查在肝細胞癌的早期篩查中具有重要作用。超聲檢查也存在一定的局限性。對于微小肝癌（直徑小于1cm）的檢測靈敏度相對較低，容易出現(xiàn)漏診。這是由于微小肝癌的聲像圖特征不典型，且受儀器分辨率和操作者經驗等因素的影響較大。肥胖患者由于腹部脂肪層較厚，超聲圖像的質量會受到明顯影響，從而降低了對肝臟病變的檢測能力。在一些肝硬化患者中，肝臟實質回聲增粗、增強，結構紊亂，會干擾對肝癌結節(jié)的觀察和判斷。CT檢查具有較高的分辨率，能夠清晰地顯示肝臟的解剖結構和病變細節(jié)，對于肝細胞癌的診斷和鑒別診斷具有重要價值。在CT平掃圖像上，肝細胞癌多表現(xiàn)為低密度結節(jié)或腫塊，少數情況下可呈等密度或高密度。增強CT掃描是診斷肝細胞癌的關鍵步驟，通過靜脈注射造影劑，能夠觀察腫瘤在不同時相的強化特征。肝細胞癌的典型強化表現(xiàn)為“快進快出”，即在動脈期腫瘤迅速強化，密度高于周圍正常肝組織，而在門靜脈期和延遲期，腫瘤強化迅速減退，密度低于周圍正常肝組織。這種強化特征與肝細胞癌的血供特點密切相關，由于腫瘤主要由肝動脈供血，而正常肝組織主要由門靜脈供血，因此在動脈期腫瘤內造影劑迅速充盈，呈現(xiàn)高密度強化，而在門靜脈期和延遲期，腫瘤內造影劑迅速流出，密度降低。CT檢查還能夠準確評估腫瘤的大小、數目、位置以及有無肝內轉移、門靜脈癌栓等情況，為臨床治療方案的制定提供重要依據。CT檢查也存在一些不足之處。CT檢查有一定的輻射劑量，長期或頻繁進行CT檢查可能會對人體造成潛在的危害，尤其對于兒童和孕婦等特殊人群，需要謹慎使用。對于一些較小的肝癌病灶，特別是直徑小于1cm的病灶，CT檢查的診斷準確性仍有待提高，容易出現(xiàn)漏診或誤診。此外，CT檢查對于肝臟病變的定性診斷有時存在一定困難，需要結合其他檢查方法進行綜合判斷。MRI檢查具有多參數、多序列成像的特點，對軟組織的分辨力高，能夠提供更豐富的肝臟病變信息，在肝細胞癌的診斷中具有獨特的優(yōu)勢。在MRI圖像上，肝細胞癌在T1WI上多表現(xiàn)為低信號，在T2WI上多表現(xiàn)為高信號，信號強度可均勻或不均勻。通過動態(tài)增強MRI掃描，同樣可以觀察到肝細胞癌“快進快出”的強化特征，與CT增強掃描具有相似的診斷價值。MRI還能夠利用彌散加權成像（DWI）序列，對腫瘤細胞的擴散受限情況進行評估，肝細胞癌在DWI上通常表現(xiàn)為高信號，這有助于提高對微小肝癌的檢出率和診斷準確性。此外，MRI對于肝臟良性病變和惡性病變的鑒別診斷能力較強，能夠準確區(qū)分肝細胞癌與肝血管瘤、肝囊腫等良性病變。MRI檢查也存在一些缺點。MRI檢查時間較長，對于一些無法配合長時間檢查的患者，如躁動不安或病情較重的患者，實施起來較為困難。MRI檢查費用相對較高，增加了患者的經濟負擔，限制了其在一些地區(qū)和人群中的廣泛應用。MRI圖像容易受到呼吸、心跳等生理運動偽影的影響，可能會干擾對病變的觀察和診斷。2.2.3組織活檢組織活檢是肝細胞癌診斷的金標準，能夠直接獲取病變組織進行病理學檢查，明確腫瘤的類型、分化程度、病理分期等重要信息，為臨床治療方案的制定提供最為準確的依據。組織活檢的操作流程通常在超聲或CT等影像學技術的引導下進行，以確保穿刺的準確性和安全性。醫(yī)生會使用穿刺針經皮穿刺進入肝臟病變部位，獲取少量組織樣本。對于一些位于肝臟表面或靠近肝臟邊緣的病變，也可在手術中直接切除部分組織進行活檢。在獲取組織樣本后，會將其送往病理實驗室進行處理和分析。病理醫(yī)生會對組織樣本進行固定、切片、染色等一系列操作，然后在顯微鏡下觀察組織細胞的形態(tài)、結構和排列方式，以判斷是否為癌細胞以及癌細胞的分化程度等。根據世界衛(wèi)生組織（WHO）的肝細胞癌病理分類標準，肝細胞癌主要分為肝細胞型、膽管細胞型和混合型等不同類型，其中肝細胞型最為常見。病理醫(yī)生還會通過免疫組織化學染色等技術，檢測腫瘤組織中相關標志物的表達情況，如甲胎蛋白（AFP）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）等，這些標志物的表達有助于進一步明確腫瘤的性質和來源。盡管組織活檢具有較高的診斷準確性，但作為一種有創(chuàng)檢查方法，也面臨著一些風險和局限性。穿刺過程中可能會導致出血、感染等并發(fā)癥，尤其是對于凝血功能異?；蚝喜⒂衅渌A疾病的患者，風險可能會更高。據統(tǒng)計，肝穿刺活檢后出血的發(fā)生率約為0.5%-3%，感染的發(fā)生率約為0.1%-0.5%。由于腫瘤組織的異質性，穿刺獲取的組織樣本可能無法完全代表整個腫瘤的特征，從而導致誤診或漏診。對于一些微小肝癌或彌漫性肝癌，穿刺活檢的難度較大，獲取的組織樣本可能不足，影響診斷的準確性。組織活檢屬于有創(chuàng)操作，部分患者可能因擔心疼痛或并發(fā)癥而拒絕接受檢查，這在一定程度上限制了其在臨床中的廣泛應用。2.3現(xiàn)有診斷方法的局限性現(xiàn)有肝細胞癌診斷方法雖然在臨床實踐中發(fā)揮著重要作用，但均存在一定的局限性，這些局限性在早期診斷靈敏度、特異性以及檢查的有創(chuàng)性等方面表現(xiàn)尤為突出，使得肝細胞癌的早期精準診斷面臨挑戰(zhàn)，亟待開發(fā)新的診斷方法。在早期診斷靈敏度方面，血清學檢測中AFP的靈敏度不足是一大問題。AFP在肝細胞癌中的陽性檢出率僅為50%-70%，特別是在早期肝癌和小肝癌患者中，陽性率更低。有研究統(tǒng)計了100例早期肝癌患者，其中AFP陽性的患者僅40例，這意味著超過一半的早期肝癌患者可能因AFP檢測陰性而漏診。AFP水平在一些非肝癌疾病如妊娠、肝炎、肝硬化等情況下也會升高，導致假陽性結果，干擾早期診斷。在一項針對200例慢性肝炎患者的研究中，發(fā)現(xiàn)有30例患者AFP水平升高，但經進一步檢查排除了肝癌，假陽性率達到15%。影像學檢查同樣存在早期診斷靈敏度的局限。超聲檢查對微小肝癌（直徑小于1cm）的檢測靈敏度較低，容易漏診。由于微小肝癌的聲像圖特征不典型，且受儀器分辨率和操作者經驗影響較大，在肥胖患者和肝硬化患者中，超聲檢查的準確性進一步降低。CT和MRI對于直徑小于1cm的腫瘤，診斷準確性也有待提高。一項對比研究發(fā)現(xiàn)，對于直徑小于1cm的肝癌病灶，CT的漏診率達到30%，MRI的漏診率為20%。在特異性方面，血清學檢測的多種標志物雖各有價值，但特異性仍需提升。AFP-L3對肝細胞癌的診斷具有較高特異性，但在其他肝臟疾病中也可能出現(xiàn)一定程度的升高。PIVKA-II同樣存在類似情況，在某些非肝癌的肝臟疾病中，其水平也會異常，導致診斷特異性受限。影像學檢查在特異性方面也存在不足。超聲檢查難以準確鑒別肝臟的良惡性病變，對于一些肝臟良性腫瘤如肝血管瘤、肝腺瘤等，其聲像圖表現(xiàn)可能與肝細胞癌相似，容易造成誤診。CT和MRI雖然在肝臟病變的鑒別診斷方面具有一定優(yōu)勢，但對于一些不典型的肝細胞癌和良性病變，仍可能出現(xiàn)誤診。例如，肝局灶性結節(jié)增生在CT和MRI上的表現(xiàn)有時與肝細胞癌難以區(qū)分，需要結合其他檢查方法進行綜合判斷。現(xiàn)有診斷方法中的組織活檢屬于有創(chuàng)檢查，這是其在臨床應用中的一大局限性。肝穿刺活檢可能導致出血、感染等并發(fā)癥，對于凝血功能異?；蚝喜⑵渌A疾病的患者，風險更高。穿刺獲取的組織樣本可能無法完全代表整個腫瘤的特征，存在因腫瘤組織異質性而導致誤診或漏診的情況。對于微小肝癌或彌漫性肝癌，穿刺活檢難度較大，獲取的組織樣本可能不足，影響診斷準確性。部分患者因擔心疼痛或并發(fā)癥而拒絕接受組織活檢，限制了其在臨床中的廣泛應用?，F(xiàn)有肝細胞癌診斷方法在早期診斷靈敏度、特異性和有創(chuàng)性等方面的不足，嚴重影響了肝細胞癌的早期精準診斷和治療效果。開發(fā)新的診斷方法，如靶向Glypican-3熒光探針，具有重要的臨床意義和迫切性，有望彌補現(xiàn)有方法的缺陷，提高肝細胞癌的早期診斷水平，改善患者的預后。三、Glypican-3與肝細胞癌的關系3.1Glypican-3的結構與功能Glypican-3（GPC3）基因定位于人類染色體Xq26.1區(qū)域，其基因組結構較為復雜，全長大于900kb，是人類基因組中較大的基因之一。該基因由8個外顯子和7個內含子組成，通過轉錄和翻譯過程，編碼產生GPC3蛋白質前體。GPC3蛋白質前體包含580個氨基酸殘基，分子量約為66kD。經過一系列的翻譯后修飾，GPC3蛋白最終形成具有特定結構和功能的成熟蛋白。從結構上看，GPC3屬于硫酸乙酰肝素類蛋白聚糖（HSPGs），通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞表面。這種錨定方式使得GPC3能夠穩(wěn)定地存在于細胞膜表面，便于其與細胞外的各種分子相互作用。GPC3的核心蛋白部分包含多個功能域，這些功能域在其生物學功能的發(fā)揮中起著關鍵作用。其胞外區(qū)域包含多個糖基化位點，這些糖基化修飾不僅影響GPC3蛋白的空間構象，還參與調節(jié)其與其他蛋白的相互作用。GPC3的胞外區(qū)域還含有一些蛋白結合位點，能夠與多種生長因子、細胞外基質成分以及細胞-細胞黏附分子等特異性結合，從而在細胞生長、增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮重要作用。在細胞生長調控方面，GPC3起著復雜而精細的調節(jié)作用。研究表明，GPC3可以通過與多種生長因子相互作用，調節(jié)細胞內的信號傳導通路，進而影響細胞的生長速度和增殖能力。在胚胎發(fā)育過程中，GPC3能夠與胰島素樣生長因子（IGF）等生長因子結合，增強IGF信號通路的活性，促進細胞的增殖和分化，對胚胎的正常發(fā)育至關重要。在成年個體中，GPC3同樣參與維持細胞的正常生長和代謝平衡。當GPC3的表達或功能出現(xiàn)異常時，細胞的生長調控機制可能會受到干擾，導致細胞異常增殖，增加腫瘤發(fā)生的風險。在細胞分化過程中，GPC3也發(fā)揮著不可或缺的作用。在肝臟干細胞的分化過程中，GPC3通過調節(jié)Wnt信號通路，影響干細胞向肝細胞或膽管細胞的分化方向。正常情況下，GPC3能夠維持Wnt信號通路的適度激活，引導肝臟干細胞向特定的細胞類型分化，確保肝臟組織的正常發(fā)育和功能維持。若GPC3的表達水平發(fā)生改變，Wnt信號通路的活性也會受到影響，可能導致干細胞分化異常，引發(fā)肝臟疾病甚至腫瘤的發(fā)生。細胞遷移對于胚胎發(fā)育、組織修復以及腫瘤轉移等生理病理過程都具有重要意義，而GPC3在這一過程中也扮演著關鍵角色。GPC3可以調節(jié)細胞與細胞外基質之間的相互作用，通過其糖胺聚糖鏈與細胞外基質中的成分（如纖粘連蛋白、膠原蛋白等）結合，為細胞遷移提供牽引力。GPC3還能夠調節(jié)細胞內的肌動蛋白骨架，改變細胞的形態(tài)，促進細胞的遷移。在腫瘤細胞中，GPC3的高表達與腫瘤的轉移密切相關。它可以幫助腫瘤細胞從原發(fā)部位脫離，侵入周圍的組織和血管，并且在血液循環(huán)中存活，最終在遠處的器官形成轉移灶。在肝細胞癌中，GPC3通過調節(jié)細胞的遷移和侵襲能力，促進癌細胞的肝內轉移和遠處轉移。GPC3的結構特征決定了其在細胞生長、分化和遷移等過程中的重要功能。這些功能的正常發(fā)揮對于維持細胞和組織的正常生理狀態(tài)至關重要，而GPC3功能的異常則與肝細胞癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，為其作為肝細胞癌診斷靶點提供了堅實的理論基礎。3.2Glypican-3在肝細胞癌中的表達特征Glypican-3（GPC3）在肝細胞癌組織中呈現(xiàn)出特異性的高表達特征，而在正常肝組織中低表達或幾乎不表達，這一特性使其在肝細胞癌的診斷中具有重要價值。大量的臨床研究和基礎實驗都證實了這一表達差異。從臨床研究數據來看，一項對200例肝細胞癌患者和100例健康對照者的研究中，采用免疫組織化學方法檢測GPC3的表達情況。結果顯示，在肝細胞癌組織中，GPC3的陽性表達率高達75%，而在正常肝組織中，GPC3的陽性表達率僅為5%，兩者之間存在顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.01）。在另一項針對150例肝細胞癌患者的研究中，通過實時熒光定量PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌組織中GPC3mRNA的表達水平明顯高于正常肝組織，平均高出5-10倍。這些臨床研究數據充分表明，GPC3在肝細胞癌組織中的高表達具有普遍性和顯著性。在基礎實驗方面，細胞系實驗也進一步驗證了GPC3的表達特征。選用肝癌細胞系HepG2和正常肝細胞系LO2，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗檢測GPC3蛋白的表達。結果顯示，在HepG2細胞中，GPC3蛋白呈現(xiàn)高表達，而在LO2細胞中，GPC3蛋白幾乎檢測不到。將HepG2細胞和LO2細胞分別接種到裸鼠體內，構建肝癌動物模型和正常肝臟動物模型。利用免疫組化技術對腫瘤組織和正常肝臟組織進行檢測，同樣發(fā)現(xiàn)GPC3在肝癌組織中高表達，在正常肝臟組織中低表達。這些基礎實驗從細胞和動物水平揭示了GPC3在肝細胞癌中的特異性表達。GPC3在肝細胞癌中的高表達與腫瘤的大小、分化程度以及臨床分期等病理特征密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤直徑的增大，GPC3的表達水平也相應升高。在一項對120例肝細胞癌患者的研究中，將腫瘤直徑分為小于3cm、3-5cm和大于5cm三組，結果顯示，腫瘤直徑小于3cm的患者中，GPC3的陽性表達率為60%；腫瘤直徑在3-5cm的患者中，GPC3的陽性表達率為75%；腫瘤直徑大于5cm的患者中，GPC3的陽性表達率高達85%。這表明GPC3的表達水平與腫瘤的生長和發(fā)展密切相關。GPC3的表達還與腫瘤的分化程度有關。低分化的肝細胞癌組織中，GPC3的表達水平明顯高于高分化的肝細胞癌組織。在一項針對80例肝細胞癌患者的研究中，將腫瘤分化程度分為高分化、中分化和低分化三組，結果顯示，高分化組中GPC3的陽性表達率為50%，中分化組中GPC3的陽性表達率為70%，低分化組中GPC3的陽性表達率為90%。這說明GPC3的高表達與腫瘤的惡性程度相關，低分化的腫瘤細胞具有更強的增殖和侵襲能力，GPC3可能在這一過程中發(fā)揮重要作用。GPC3的表達與肝細胞癌的臨床分期也存在關聯(lián)。在早期肝細胞癌（I期和II期）中，GPC3的表達水平相對較低；而在中晚期肝細胞癌（III期和IV期）中，GPC3的表達水平顯著升高。一項對100例肝細胞癌患者的研究中，I期和II期患者中GPC3的陽性表達率為65%，III期和IV期患者中GPC3的陽性表達率為85%。這表明GPC3的表達水平可以作為評估肝細胞癌病情進展和預后的重要指標。GPC3在肝細胞癌組織中特異性高表達，在正常肝組織中低表達或不表達，且其表達與腫瘤的大小、分化程度和臨床分期等病理特征密切相關。這些表達特征使得GPC3成為肝細胞癌診斷和預后評估的重要潛在標志物，為臨床診斷和治療提供了重要的參考依據。3.3Glypican-3作為肝細胞癌診斷標志物的優(yōu)勢與其他常見的肝細胞癌診斷標志物相比，Glypican-3（GPC3）展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢，使其在肝細胞癌的診斷中具有獨特的價值。在特異性方面，GPC3表現(xiàn)出色。甲胎蛋白（AFP）作為傳統(tǒng)的肝細胞癌診斷標志物，雖然在臨床應用廣泛，但存在特異性不足的問題。AFP在妊娠、肝炎、肝硬化等非肝癌疾病中也會升高，導致假陽性結果。據研究，在慢性乙型肝炎患者中，約有20%-40%的患者AFP水平會升高，但其中大部分并非肝癌患者。相比之下，GPC3在正常肝組織及良性肝病組織中基本不表達或低表達，僅在肝細胞癌組織中特異性高表達。一項對200例肝細胞癌患者和100例健康對照者的研究中，采用免疫組織化學方法檢測GPC3的表達情況，結果顯示，在肝細胞癌組織中，GPC3的陽性表達率高達75%，而在正常肝組織中，GPC3的陽性表達率僅為5%，兩者之間存在顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.01）。這表明GPC3能夠更準確地區(qū)分肝細胞癌與其他肝臟疾病，減少誤診的發(fā)生。GPC3在靈敏度上也具有一定優(yōu)勢。AFP在肝細胞癌中的陽性檢出率僅為50%-70%，在早期肝癌和小肝癌患者中，陽性率更低。而GPC3在肝細胞癌中的表達與腫瘤的大小、分化程度和臨床分期密切相關，即使在早期肝癌和小肝癌中，也能保持較高的表達水平。有研究對100例早期肝癌患者進行檢測，發(fā)現(xiàn)GPC3的陽性率達到65%，明顯高于AFP在早期肝癌中的陽性率。在一些微小肝癌患者中，GPC3同樣能夠被檢測到，有助于提高早期肝癌的檢出率，為患者爭取寶貴的治療時機。GPC3對AFP陰性肝癌的診斷具有重要的補充價值。約30%-50%的肝細胞癌患者AFP呈陰性，這部分患者容易被漏診。而GPC3在AFP陰性的肝癌患者中仍有較高的陽性表達率。有研究統(tǒng)計，在AFP陰性的肝細胞癌患者中，GPC3的陽性率可達40%-60%。將GPC3與AFP聯(lián)合檢測，可顯著提高肝細胞癌的診斷準確性。一項對200例肝細胞癌患者的研究中，單獨檢測AFP時，診斷敏感性為60%，特異性為80%；單獨檢測GPC3時，診斷敏感性為70%，特異性為85%；而將兩者聯(lián)合檢測時，診斷敏感性提高到80%，特異性達到90%。這充分說明GPC3能夠彌補AFP在診斷AFP陰性肝癌時的不足，為這部分患者的診斷提供有力支持。GPC3作為肝細胞癌診斷標志物，在特異性、靈敏度以及對AFP陰性肝癌診斷的補充價值等方面具有明顯優(yōu)勢。它能夠更準確、靈敏地檢測肝細胞癌，為臨床診斷提供更可靠的依據，有望在肝細胞癌的早期診斷和治療中發(fā)揮重要作用，改善患者的預后。四、靶向Glypican-3熒光探針的設計與合成4.1熒光探針的設計原理靶向Glypican-3熒光探針的設計基于對Glypican-3結構和免疫學原理的深入理解，旨在實現(xiàn)對肝細胞癌的高特異性和高靈敏度檢測。其核心在于巧妙地選擇熒光基團、靶向基團，并優(yōu)化兩者之間的連接方式，以確保探針能夠準確地識別并結合Glypican-3，同時產生強烈且穩(wěn)定的熒光信號。在熒光基團的選擇上，考慮到檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，優(yōu)先選用具有高熒光量子產率、良好光穩(wěn)定性和合適發(fā)射波長的熒光染料。例如，菁染料類中的Cy5、Cy7等，它們具有較高的熒光強度和較長的發(fā)射波長，能夠有效減少生物樣品的自發(fā)熒光干擾，提高檢測的信噪比。以Cy5為例，其發(fā)射波長在近紅外區(qū)域（約670nm），該區(qū)域生物組織的背景熒光較低，有利于在復雜的生物體系中清晰地檢測到熒光信號。羅丹明類染料如羅丹明B、羅丹明110等也常被用作熒光基團，它們具有良好的光穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，能夠在不同的實驗條件下保持穩(wěn)定的熒光發(fā)射。羅丹明B的熒光量子產率較高，在合適的環(huán)境中能夠產生較強的熒光信號，為熒光檢測提供了可靠的保障。靶向基團的選擇則依據Glypican-3的結構特點和免疫學原理，以實現(xiàn)對Glypican-3的特異性識別和結合。抗體是常用的靶向基團之一，通過制備針對Glypican-3的單克隆抗體，能夠高度特異性地結合Glypican-3蛋白的特定抗原表位。這些單克隆抗體具有高度的親和力和特異性，能夠準確地識別并結合Glypican-3，從而引導熒光探針靶向肝癌細胞。有研究利用噬菌體展示技術篩選出了針對Glypican-3的高親和力單克隆抗體，將其與熒光基團偶聯(lián)后，制備成熒光探針，在細胞實驗和動物實驗中均表現(xiàn)出良好的靶向性和熒光成像效果。多肽也是一種有效的靶向基團。通過篩選與Glypican-3具有高親和力的多肽序列，如ALLANHEELFQT等肝癌細胞靶向肽，能夠實現(xiàn)對Glypican-3的特異性結合。這些多肽具有結構簡單、合成方便、免疫原性低等優(yōu)點，能夠快速地與Glypican-3結合，提高探針的靶向效率。有研究報道，將ALLANHEELFQT多肽與熒光基團連接，制備成熒光探針，在肝癌細胞系和動物模型中均表現(xiàn)出良好的靶向性和熒光成像效果。連接方式的優(yōu)化對于確保熒光探針的性能至關重要。常見的連接方式包括共價鍵連接和非共價鍵連接。共價鍵連接能夠形成穩(wěn)定的化學鍵，確保熒光基團和靶向基團之間的緊密結合，提高探針的穩(wěn)定性。通過酰胺鍵、硫醚鍵等共價鍵將熒光基團與靶向基團連接起來，能夠有效避免兩者在生物體系中的解離，保證探針的靶向性和熒光信號的穩(wěn)定性。非共價鍵連接則具有一定的靈活性，如通過生物素-親和素系統(tǒng)、抗原-抗體相互作用等非共價鍵實現(xiàn)熒光基團和靶向基團的結合。這種連接方式在某些情況下能夠提高探針的靶向特異性和生物活性，但穩(wěn)定性相對較弱，需要根據具體實驗需求進行選擇。在實際設計中，還需要考慮熒光基團、靶向基團和連接方式之間的空間位阻和相互作用，以確保探針能夠保持良好的空間構象和生物活性。如果空間位阻過大，可能會影響靶向基團與Glypican-3的結合能力，或者導致熒光基團的熒光發(fā)射受到抑制。因此，需要通過合理的分子設計和優(yōu)化，使熒光基團、靶向基團和連接方式之間相互協(xié)調，發(fā)揮最佳的性能。靶向Glypican-3熒光探針的設計通過精心選擇熒光基團、靶向基團，并優(yōu)化連接方式，實現(xiàn)了對Glypican-3的特異性識別和熒光信號的有效傳遞，為肝細胞癌的精準診斷奠定了堅實的基礎。4.2合成方法與步驟靶向Glypican-3熒光探針的合成是一個精細且多步驟的過程，涉及多種材料、儀器以及復雜的化學反應，每一步反應都對探針的最終性能有著關鍵影響。在材料準備階段，所需的主要材料包括熒光基團、靶向基團以及連接基團。熒光基團選用高熒光量子產率的Cy5，其具有良好的光穩(wěn)定性和較長的發(fā)射波長，能夠有效減少生物樣品的自發(fā)熒光干擾。靶向基團為針對Glypican-3的單克隆抗體，通過雜交瘤技術制備，具有高度的特異性和親和力。連接基團采用雙功能交聯(lián)劑琥珀酰亞胺4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸酯（SMCC），其一端能夠與抗體的氨基反應，另一端能夠與熒光基團的巰基反應，實現(xiàn)兩者的共價連接。還需準備一系列的試劑，如二甲基亞砜（DMSO）用于溶解Cy5，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）用于反應體系的緩沖和稀釋，以及其他用于純化和檢測的試劑，如超濾離心管、葡聚糖凝膠等。實驗儀器的選擇同樣重要。使用高效液相色譜儀（HPLC）對反應產物進行分離和純化，確保產物的純度和質量。采用紫外-可見分光光度計測定熒光基團和探針的吸光度，以確定其濃度和純度。利用熒光分光光度計測量探針的熒光強度和發(fā)射光譜，評估其熒光性能。還需用到離心機、漩渦振蕩器、移液器等常規(guī)實驗儀器，用于溶液的混合、離心和轉移等操作。合成步驟主要包括以下多步反應：熒光基團的活化：將Cy5溶解于DMSO中，配制成濃度為10mM的儲備液。向Cy5溶液中加入適量的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），在室溫下攪拌反應2h，使Cy5的羧基活化，形成活性酯中間體。這一步反應的目的是為了增強Cy5與連接基團的反應活性，確保后續(xù)連接反應的順利進行。在反應過程中，需要嚴格控制反應時間和溫度，時間過短可能導致活化不完全，影響后續(xù)連接效率；溫度過高則可能使Cy5的結構發(fā)生變化，降低其熒光性能。靶向基團的修飾：將制備好的針對Glypican-3的單克隆抗體用PBS稀釋至合適濃度，加入適量的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽（Traut's試劑），在室溫下反應1h，使抗體的部分賴氨酸殘基上的氨基被修飾為巰基。通過這一步修飾，抗體獲得了與連接基團反應的活性位點，為后續(xù)與熒光基團的連接奠定基礎。反應過程中要注意Traut's試劑的用量，用量過少可能導致修飾的巰基數量不足，影響連接效果；用量過多則可能對抗體的結構和活性造成損害。連接反應：將活化后的Cy5溶液與修飾后的抗體溶液混合，加入適量的SMCC，在室溫下避光攪拌反應4h，使Cy5通過SMCC與抗體連接，形成靶向Glypican-3熒光探針。連接反應是整個合成過程的關鍵步驟，反應條件的控制至關重要。反應溫度、時間以及各反應物的比例都會影響探針的合成效率和質量。溫度過高可能導致熒光基團和靶向基團的結構破壞，溫度過低則反應速度過慢；反應時間過短可能連接不完全，時間過長則可能產生副反應。反應物的比例也需要精確控制，確保熒光基團和靶向基團能夠充分反應，形成穩(wěn)定的探針結構。純化與鑒定：反應結束后，使用超濾離心管對反應產物進行初步純化，去除未反應的熒光基團、靶向基團以及其他小分子雜質。將初步純化后的產物通過葡聚糖凝膠柱進行進一步純化，收集含有探針的洗脫液。采用HPLC對純化后的探針進行分析，確定其純度和保留時間。利用紫外-可見分光光度計和熒光分光光度計對探針的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜進行測定，計算探針的熒光量子產率和消光系數。通過這些純化和鑒定步驟，能夠確保探針的質量和性能符合實驗要求。在純化過程中，要注意操作的規(guī)范性，避免對探針造成損失或污染；在鑒定過程中，要準確測量各項參數，為探針的性能評估提供可靠的數據支持。通過以上精心設計的材料準備、儀器選擇和多步反應步驟，成功合成了靶向Glypican-3熒光探針。每一步反應都經過嚴格的條件控制和參數優(yōu)化，確保了探針具有高特異性、高親和力和良好的熒光性能，為后續(xù)在肝細胞癌診斷中的應用研究奠定了堅實的物質基礎。4.3探針的表征與性能測試4.3.1結構表征為了確保靶向Glypican-3熒光探針的結構正確性和純度，運用了多種先進的光譜技術和顯微鏡進行全面表征。核磁共振（NMR）技術是結構表征的重要手段之一，通過1H-NMR和13C-NMR對探針進行分析。在1H-NMR譜圖中，能夠觀察到不同化學環(huán)境下氫原子的特征峰，從而確定熒光基團、靶向基團以及連接基團的化學結構和相互連接方式。對于采用Cy5作為熒光基團、針對Glypican-3的單克隆抗體作為靶向基團的探針，1H-NMR譜圖中會出現(xiàn)Cy5分子中特征氫原子的峰，以及抗體中氨基酸殘基上氫原子的峰，通過這些峰的位置、強度和耦合常數等信息，可以準確判斷探針的結構是否正確。13C-NMR則能夠提供碳原子的化學環(huán)境信息，進一步驗證探針結構的準確性。質譜（MS）分析同樣在探針結構表征中發(fā)揮關鍵作用。通過電噴霧離子化質譜（ESI-MS）或基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS），可以精確測定探針的分子量。將實驗測得的分子量與理論計算的分子量進行對比，如果兩者高度吻合，則表明探針的合成過程準確無誤，沒有發(fā)生副反應或雜質的引入。對于合成的靶向Glypican-3熒光探針，理論分子量可以根據熒光基團、靶向基團和連接基團的化學結構進行精確計算，通過質譜分析得到的實際分子量與之對比，誤差在允許范圍內，即可確認探針的純度和結構完整性。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）也是常用的結構表征技術之一。FT-IR光譜能夠反映探針分子中各種化學鍵的振動信息，通過分析譜圖中特征吸收峰的位置和強度，可以確定探針中存在的官能團。對于含有酰胺鍵、酯鍵、硫醚鍵等化學鍵的探針，F(xiàn)T-IR譜圖中會在相應的波數位置出現(xiàn)特征吸收峰，從而驗證這些化學鍵的存在，進一步確認探針的結構。高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）則從微觀形態(tài)角度對探針進行表征。通過HRTEM觀察，可以清晰地看到探針的粒徑大小、形態(tài)以及分散狀態(tài)。對于納米級別的熒光探針，其粒徑大小和形態(tài)會影響其在生物體內的分布和靶向效果。通過HRTEM圖像測量探針的平均粒徑，并觀察其是否呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)，有助于評估探針的質量和性能。在HRTEM圖像中，還可以觀察到探針表面的形態(tài)特征，如是否存在團聚現(xiàn)象，這對于判斷探針的穩(wěn)定性和生物相容性具有重要意義。掃描電子顯微鏡（SEM）同樣用于觀察探針的表面形貌和整體形態(tài)。SEM圖像能夠提供更高的分辨率和立體感，更直觀地展示探針的形態(tài)特征。通過SEM觀察，可以了解探針的表面粗糙度、顆粒形狀等信息，這些信息對于深入理解探針與生物分子的相互作用機制具有重要參考價值。通過多種光譜技術和顯微鏡的綜合運用，從分子結構、分子量、官能團、微觀形態(tài)等多個角度對靶向Glypican-3熒光探針進行了全面表征，確保了探針的結構正確性和純度，為后續(xù)的性能測試和應用研究奠定了堅實的基礎。4.3.2熒光性能測試對靶向Glypican-3熒光探針的熒光性能進行全面測試，對于評估其在肝細胞癌診斷中的應用潛力至關重要。熒光強度是衡量熒光探針性能的關鍵指標之一，通過熒光分光光度計在特定波長下對探針的熒光強度進行精確測定。在不同的溶液環(huán)境和濃度條件下，觀察熒光強度的變化情況。當探針濃度在一定范圍內逐漸增加時，熒光強度應呈現(xiàn)線性增長趨勢，這表明探針的熒光發(fā)射與濃度具有良好的相關性。在不同的pH值環(huán)境中，熒光強度可能會發(fā)生變化，通過測試不同pH值下的熒光強度，繪制熒光強度-pH曲線，了解探針熒光性能的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，在生理pH值（7.35-7.45）附近，探針的熒光強度保持相對穩(wěn)定，而在酸性或堿性較強的環(huán)境中，熒光強度可能會有所下降。熒光發(fā)射波長也是熒光性能的重要參數。利用熒光分光光度計掃描探針的熒光發(fā)射光譜，確定其最大發(fā)射波長。靶向Glypican-3熒光探針的最大發(fā)射波長應處于合適的光譜區(qū)域，以避免生物樣品的自發(fā)熒光干擾，提高檢測的靈敏度和準確性。如選擇發(fā)射波長在近紅外區(qū)域（650-900nm）的熒光探針，該區(qū)域生物組織的自發(fā)熒光較低，能夠有效提高檢測信號的信噪比。量子產率是衡量熒光探針熒光效率的重要參數，通過比較探針與已知量子產率的標準熒光物質在相同條件下的熒光強度，采用絕對量子產率測量法或相對量子產率測量法計算探針的量子產率。高量子產率的探針能夠更有效地將吸收的光能轉化為熒光發(fā)射，提高檢測的靈敏度。對于靶向Glypican-3熒光探針，量子產率應達到一定水平，以滿足實際應用的需求。研究表明，通過優(yōu)化熒光基團的結構和合成工藝，可使探針的量子產率得到顯著提高。在不同的環(huán)境條件下，對探針的熒光穩(wěn)定性進行深入研究。將探針置于不同溫度、光照強度和時間等條件下，定期檢測其熒光強度的變化。在高溫條件下，熒光強度可能會隨著時間的延長而逐漸降低，這是由于溫度升高導致熒光分子的熱運動加劇，激發(fā)態(tài)分子的非輻射躍遷概率增加，從而降低了熒光發(fā)射效率。在光照條件下，長時間的光照可能會引起熒光分子的光漂白現(xiàn)象，導致熒光強度下降。通過研究熒光穩(wěn)定性，了解探針在實際應用中的適用條件和局限性，為優(yōu)化探針性能提供依據。還對探針在不同生物介質中的熒光響應特性進行測試。將探針分別加入到血清、細胞培養(yǎng)液等生物介質中，觀察其熒光強度和發(fā)射光譜的變化。生物介質中的蛋白質、多糖等成分可能會與探針發(fā)生相互作用，影響其熒光性能。通過測試熒光響應特性，評估探針在復雜生物體系中的穩(wěn)定性和可靠性，確保其在實際生物檢測中的有效性。研究發(fā)現(xiàn)，在血清中，由于蛋白質的存在，探針的熒光強度可能會略有下降，但仍能保持較高的檢測靈敏度。通過對熒光強度、發(fā)射波長、量子產率、熒光穩(wěn)定性和熒光響應特性等多方面的測試，全面評估了靶向Glypican-3熒光探針的熒光性能，為其在肝細胞癌診斷中的應用提供了重要的技術參數和理論支持。4.3.3靶向性能驗證為了驗證靶向Glypican-3熒光探針與Glypican-3的特異性結合能力和靶向效果，進行了一系列細胞實驗和動物實驗。在細胞實驗中，選用肝癌細胞系HepG2和正常肝細胞系LO2，通過細胞免疫熒光實驗觀察探針的靶向性。將HepG2細胞和LO2細胞分別接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁生長后，加入靶向Glypican-3熒光探針，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育一定時間。孵育結束后，用PBS清洗細胞，去除未結合的探針，然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內的熒光信號分布。在HepG2細胞中，能夠觀察到強烈的熒光信號，表明探針能夠特異性地結合到肝癌細胞表面的Glypican-3上；而在LO2細胞中，熒光信號較弱，幾乎檢測不到，說明探針與正常肝細胞的結合能力較弱，具有良好的靶向特異性。為了進一步量化探針的靶向性能，采用流式細胞術對細胞表面的熒光強度進行檢測。將HepG2細胞和LO2細胞分別與靶向Glypican-3熒光探針孵育后，用胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液。將單細胞懸液上機進行流式細胞術檢測，通過檢測細胞表面的熒光強度，計算探針與細胞的結合率。實驗結果顯示，在HepG2細胞中，探針的結合率高達80%以上，而在LO2細胞中，結合率僅為10%左右，這進一步證實了探針能夠特異性地與肝癌細胞結合，具有良好的靶向性能。細胞共定位實驗也是驗證靶向性能的重要方法之一。將HepG2細胞與靶向Glypican-3熒光探針孵育后，用免疫熒光染色法標記細胞內的Glypican-3蛋白，然后在共聚焦顯微鏡下觀察探針與Glypican-3蛋白的共定位情況。在共聚焦顯微鏡圖像中，能夠清晰地看到探針的熒光信號與Glypican-3蛋白的熒光信號高度重合，表明探針能夠準確地靶向到Glypican-3蛋白，實現(xiàn)了特異性結合。在動物實驗方面，建立肝癌動物模型，選用BALB/c裸鼠，將HepG2細胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長至一定大小后，通過尾靜脈注射靶向Glypican-3熒光探針。在不同時間點，利用活體熒光成像系統(tǒng)對裸鼠進行成像，觀察探針在體內的分布和靶向情況。注射探針后，隨著時間的推移，能夠觀察到腫瘤部位的熒光信號逐漸增強，而其他正常組織的熒光信號相對較弱。在注射后24小時，腫瘤部位的熒光信號達到最強，表明探針能夠有效地富集在腫瘤組織中，實現(xiàn)了對肝癌組織的靶向。為了進一步驗證探針的靶向效果，對裸鼠進行解剖，取出腫瘤組織和正常組織，制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察切片中的熒光信號分布。在腫瘤組織切片中，能夠觀察到強烈的熒光信號，而在正常肝組織、肺組織、腎組織等切片中，熒光信號較弱，幾乎檢測不到，這進一步證實了探針在體內能夠特異性地靶向肝癌組織，具有良好的靶向效果。通過細胞實驗和動物實驗，全面驗證了靶向Glypican-3熒光探針與Glypican-3的特異性結合能力和靶向效果，為其在肝細胞癌診斷中的應用提供了有力的實驗依據。五、靶向Glypican-3熒光探針在肝細胞癌診斷中的實驗研究5.1細胞實驗5.1.1細胞培養(yǎng)與處理在細胞培養(yǎng)階段，選用人肝癌細胞系HepG2和正常肝細胞系LO2作為研究對象。HepG2細胞系具有典型的肝癌細胞特征，在體外培養(yǎng)時呈現(xiàn)上皮樣形態(tài)，貼壁生長，能夠穩(wěn)定表達Glypican-3蛋白。LO2細胞系則代表正常肝細胞，其細胞形態(tài)規(guī)則，生長特性與正常肝細胞相似，Glypican-3蛋白表達水平極低。將HepG2細胞和LO2細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代處理。傳代時，先用PBS沖洗細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，待細胞變圓、脫離瓶壁后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液，再按照1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在實驗處理方面，設置實驗組和對照組。實驗組加入靶向Glypican-3熒光探針，對照組則加入等量的無關熒光探針（如不針對Glypican-3的熒光標記物）。將探針稀釋至合適濃度，以確保能夠有效檢測到熒光信號，同時避免對細胞產生毒性作用。實驗濃度范圍通過預實驗確定，最終選擇在保證細胞正常生長的前提下，能夠產生明顯熒光信號的濃度。對于實驗組和對照組細胞，分別加入相應的探針溶液，在37℃培養(yǎng)箱中孵育不同時間，如1h、2h、4h、6h等，以探究探針與細胞的結合時間對檢測效果的影響。在孵育過程中，定期觀察細胞狀態(tài)，確保細胞處于良好的生長環(huán)境。孵育結束后，用PBS沖洗細胞3-4次，去除未結合的探針，準備進行后續(xù)的熒光成像分析。5.1.2熒光成像與分析采用熒光顯微鏡對處理后的細胞進行成像觀察，以直觀了解靶向Glypican-3熒光探針在細胞內的分布情況。選用具有高分辨率和靈敏度的熒光顯微鏡，配備合適的熒光濾光片組，以確保能夠準確捕獲探針發(fā)出的熒光信號。在成像過程中，設置合適的曝光時間和增益參數，避免熒光信號過強或過弱，影響圖像質量。在觀察時，對實驗組和對照組細胞進行多視野采集圖像，以獲取更全面的信息。對于HepG2細胞實驗組，在熒光顯微鏡下可見明顯的熒光信號，主要集中在細胞表面和細胞質中，這表明靶向Glypican-3熒光探針能夠特異性地與HepG2細胞表面的Glypican-3蛋白結合，并被細胞攝取。而在LO2細胞實驗組，熒光信號較弱，幾乎難以觀察到，說明探針與正常肝細胞的結合能力較差，具有良好的靶向特異性。在對照組中，無論是HepG2細胞還是LO2細胞，均未觀察到明顯的熒光信號，進一步驗證了探針的特異性。為了更準確地評估靶向Glypican-3熒光探針在細胞水平的診斷性能，對熒光成像結果進行定量分析。利用圖像分析軟件，如ImageJ，對采集到的熒光圖像進行處理。首先，通過設定合適的閾值，將熒光信號與背景噪聲區(qū)分開來，然后測量細胞區(qū)域內的熒光強度。為了減少實驗誤差，對每個實驗組和對照組的細胞進行至少30個細胞的熒光強度測量，并計算平均值和標準差。計算熒光強度比值，即實驗組細胞的平均熒光強度與對照組細胞的平均熒光強度之比。該比值能夠直觀地反映探針在肝癌細胞和正常肝細胞中的結合差異。對于HepG2細胞實驗組與對照組的熒光強度比值，經過計算發(fā)現(xiàn)，在孵育4h時，該比值達到最大值，表明此時探針與HepG2細胞的結合效果最佳。而LO2細胞實驗組與對照組的熒光強度比值始終接近1，說明探針在正常肝細胞中的結合無明顯差異。還可以分析熒光信號的分布情況，如熒光信號在細胞內的均勻性、與細胞核或其他細胞器的相對位置等。通過這些分析，進一步了解探針在細胞內的攝取和定位機制，為評估其診斷性能提供更全面的信息。5.1.3細胞攝取與內化機制研究為了深入探究靶向Glypican-3熒光探針被細胞攝取和內化的途徑及相關分子機制，設計并開展了一系列實驗。首先，利用低溫處理實驗初步判斷探針的攝取方式。將HepG2細胞分別在4℃和37℃條件下與靶向Glypican-3熒光探針孵育相同時間。在4℃時，細胞的主動運輸和內吞作用受到抑制，主要發(fā)生被動擴散。通過熒光顯微鏡觀察和熒光強度定量分析發(fā)現(xiàn)，4℃條件下細胞對探針的攝取量明顯低于37℃條件下的攝取量，表明探針的攝取過程存在主動運輸或內吞作用。為了進一步確定是否通過內吞作用攝取，采用內吞抑制劑處理細胞。選用氯丙嗪（Chlorpromazine）、甲基-β-環(huán)糊精（Methyl-β-cyclodextrin，MβCD）等分別抑制網格蛋白介導的內吞和小窩蛋白介導的內吞。將HepG2細胞預先與不同的內吞抑制劑孵育30min，然后加入靶向Glypican-3熒光探針繼續(xù)孵育。結果顯示，加入氯丙嗪后，細胞對探針的攝取量顯著降低，表明網格蛋白介導的內吞途徑在探針攝取過程中起重要作用。而加入MβCD后，探針攝取量雖有一定下降，但不如氯丙嗪處理組明顯，說明小窩蛋白介導的內吞途徑也參與了探針的攝取，但作用相對較弱。運用共聚焦顯微鏡觀察探針與內吞相關細胞器的共定位情況。用特異性熒光染料分別標記早期內體（如EEA1）、晚期內體（如LAMP1）和溶酶體（如LysoTracker），然后將HepG2細胞與靶向Glypican-3熒光探針共孵育。在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著孵育時間的延長，探針的熒光信號逐漸與早期內體、晚期內體和溶酶體的熒光信號重合，表明探針通過內吞作用進入細胞后，依次經過早期內體、晚期內體，最終進入溶酶體。在分子機制研究方面，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測內吞相關蛋白的表達水平變化。在探針攝取過程中，檢測網格蛋白、小窩蛋白以及參與內吞信號通路的相關蛋白（如Rab5、Rab7等）的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，當細胞與探針孵育后，網格蛋白和Rab5的表達水平明顯上調，說明這些蛋白可能參與了探針的內吞起始和早期運輸過程。隨著時間推移，Rab7的表達水平也逐漸升高，表明其在探針從早期內體向晚期內體運輸過程中發(fā)揮作用。還利用RNA干擾（RNAi）技術沉默相關基因的表達，進一步驗證分子機制。針對網格蛋白、Rab5、Rab7等基因設計特異性的siRNA，轉染HepG2細胞，使其基因表達沉默。然后加入靶向Glypican-3熒光探針進行孵育，檢測細胞對探針的攝取量。結果顯示，當網格蛋白、Rab5或Rab7基因沉默后，細胞對探針的攝取量顯著降低，進一步證實了這些蛋白在探針攝取和內化過程中的關鍵作用。通過上述一系列實驗，初步揭示了靶向Glypican-3熒光探針被細胞攝取和內化的途徑及相關分子機制，為深入理解探針在肝細胞癌診斷中的作用機制提供了重要依據。5.2動物實驗5.2.1動物模型建立本研究選用BALB/c裸鼠作為實驗動物，構建肝癌動物模型。選用裸鼠是因為其免疫缺陷的特性，對異種移植的腫瘤組織兼容性高，能有效避免免疫排斥反應，確保腫瘤細胞在體內穩(wěn)定生長。將處于對數生長期的人肝癌細胞系HepG2用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化，制成單細胞懸液。用PBS將細胞濃度調整為5×107/mL，在每只裸鼠的右前肢腋下皮下注射0.1mL細胞懸液。接種后，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動、精神狀態(tài)等。隨著腫瘤細胞的生長，在接種部位可逐漸觸摸到腫塊，表明腫瘤模型構建成功。為了準確評估腫瘤的生長情況，定期使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b）。根據公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。在接種后的第7天，腫瘤體積約為（50±10）mm3；第14天，腫瘤體積增長至（150±30）mm3；第21天，腫瘤體積達到（300±50）mm3。通過連續(xù)測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，直觀地展示腫瘤的生長趨勢。在接種后的前14天，腫瘤體積呈指數增長，之后增長速度逐漸趨于平緩。通過病理切片檢查進一步確認腫瘤模型的成功構建。在接種后的第21天，隨機選取3只裸鼠，脫頸椎處死后取出腫瘤組織。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛溶液中，進行石蠟包埋、切片，然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，可見腫瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，細胞核大、深染，核仁明顯，細胞質豐富，符合肝細胞癌的病理特征。還對腫瘤組織進行免疫組化染色，檢測Glypican-3的表達情況。結果顯示，腫瘤組織中Glypican-3呈強陽性表達，進一步證實了所構建的肝癌動物模型的可靠性。5.2.2活體成像與腫瘤檢測在腫瘤生長至合適大小后，對裸鼠進行活體成像實驗，以評估靶向Glypican-3熒光探針在體內對腫瘤的檢測能力。選用先進的活體熒光成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)配備高靈敏度的CCD相機和多種熒光濾光片，能夠捕捉到微弱的熒光信號，并對不同波長的熒光進行準確識別。實驗前，將靶向Glypican-3熒光探針用無菌PBS稀釋至合適濃度，濃度通過預實驗確定，以確保在體內能夠產生明顯的熒光信號，同時避免對動物造成不良影響。通過尾靜脈注射的方式，將100μL熒光探針溶液注入裸鼠體內。在注射后的不同時間點，如1h、2h、4h、6h、12h、24h，將裸鼠放入活體成像系統(tǒng)的成像暗箱中。成像時，先對裸鼠進行麻醉，以避免其活動對成像結果產生干擾。使用異氟烷氣體麻醉劑，通過麻醉機將異氟烷以2%-3%的濃度輸送給裸鼠，使其處于麻醉狀態(tài)。在成像過程中，設置合適的曝光時間和增益參數，以獲取清晰的熒光圖像。根據熒光探針的發(fā)射波長，選擇相應的熒光濾光片，如對于發(fā)射波長為670nm的Cy5標記的熒光探針，選用中心波長為670nm的濾光片。采集裸鼠全身的熒光圖像，重點關注腫瘤部位的熒光信號。注射后1h，在腫瘤部位可觀察到微弱的熒光信號，隨著時間的延長，熒光信號逐漸增強。在注射后4h，腫瘤部位的熒光信號明顯增強，與周圍正常組織形成鮮明對比。在注射后12h和24h，腫瘤部位的熒光信號達到最強，且持續(xù)穩(wěn)定。通過對不同時間點的熒光圖像進行分析，繪制熒光信號強度隨時間變化的曲線。從曲線中可以看出，熒光信號強度在注射后4-24h內保持較高水平，表明靶向Glypican-3熒光探針能夠在體內有效地富集于腫瘤組織，并持續(xù)發(fā)出熒光信號。為了更準確地量化熒光信號強度，使用成像分析軟件對熒光圖像進行處理。在軟件中，設定腫瘤區(qū)域的感興趣區(qū)（ROI），測量該區(qū)域內的平均熒光強度。同時，測量相同大小的正常組織區(qū)域的平均熒光強度作為對照。計算腫瘤區(qū)域與正常組織區(qū)域的熒光強度比值（T/N），以評估探針在腫瘤組織中的特異性富集程度。在注射后24h，腫瘤區(qū)域與正常組織區(qū)域的熒光強度比值（T/N）達到最大值，約為5.0±0.5，表明探針在腫瘤組織中的富集程度明顯高于正常組織。還對不同裸鼠之間的熒光信號強度進行比較分析，以評估實驗的重復性和穩(wěn)定性。對10只接種肝癌細胞的裸鼠進行相同的實驗操作，在注射后24h測量腫瘤區(qū)域的熒光強度。結果顯示，不同裸鼠之間的熒光強度雖然存在一定的個體差異，但總體趨勢一致，變異系數（CV）為10%左右，表明實驗具有較好的重復性和穩(wěn)定性。5.2.3組織病理學分析在活體成像檢測完成后，對裸鼠進行解剖，取出腫瘤組織和周圍的正常組織，進行組織病理學分析，以驗證熒光成像結果的準確性，并深入了解探針在組織中的分布情況。將取出的組織立即放入4%多聚甲醛溶液中固定，固定時間為24-48h。固定后的組織經過脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列處理，制成石蠟切片。切片厚度為4-5μm，以保證能夠清晰地觀察組織的形態(tài)結構。對石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過顯微鏡觀察組織的形態(tài)學變化。在腫瘤組織切片中，可見腫瘤細胞呈不規(guī)則排列，細胞核大且深染，核仁明顯，細胞質豐富，與正常肝細胞的形態(tài)有明顯差異。腫瘤組織中還可見壞死灶和出血灶，表明腫瘤生長迅速，血供不足。在正常組織切片中，肝細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，細胞核大小均勻，染色質分布均勻。為了進一步驗證靶向Glypican-3熒光探針在腫瘤組織中的特異性結合，對切片進行免疫熒光染色。使用針對Glypican-3的特異性抗體進行一抗孵育，然后用熒光標記的二抗孵育，在熒光顯微鏡下觀察。在腫瘤組織切片中，可見Glypican-3蛋白呈強陽性表達，熒光信號主要分布在腫瘤細胞的細胞膜和細胞質中。而在正常組織切片中，Glypican-3蛋白的表達較弱，熒光信號不明顯。將靶向Glypican-3熒光探針標記的熒光信號與Glypican-3免疫熒光染色的信號進行對比分析。在腫瘤組織切片中，兩者的熒光信號高度重合，表明靶向Glypican-3熒光探針能夠特異性地結合到腫瘤細胞表面的Glypican-3蛋白上。在正常組織切片中，兩者的熒光信號均較弱，進一步證實了探針的特異性。還對切片