miR-375對宮頸癌泰素敏感性的調(diào)控機制：從分子到臨床的深入解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1宮頸癌的現(xiàn)狀宮頸癌作為全球范圍內(nèi)嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率一直備受關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬，死亡病例約34.2萬，在女性癌癥發(fā)病和死亡原因中分別位居第四位和第四位。在中國，每年新發(fā)病例約11萬，死亡病例約5.9萬，嚴重影響女性的生活質(zhì)量和生命健康。宮頸癌的發(fā)病與多種因素相關(guān)，其中高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染是其主要病因。此外，性行為過早、多個性伴侶、吸煙、長期口服避孕藥等也被認為是宮頸癌的危險因素。早期宮頸癌患者通常無明顯癥狀，隨著病情進展，可出現(xiàn)陰道流血、陰道排液、疼痛等癥狀。然而，大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳的手術(shù)治療時機，預后較差。目前，宮頸癌的治療方法主要包括手術(shù)、放療、化療以及靶向治療和免疫治療等。對于早期宮頸癌患者，手術(shù)治療是主要的治療手段，可達到根治的目的。然而，對于中晚期宮頸癌患者，單純手術(shù)治療效果不佳，需要綜合運用放療、化療等多種治療方法?；熢谥型砥趯m頸癌的治療中起著重要作用，它可以通過抑制腫瘤細胞的生長和分裂，縮小腫瘤體積，提高患者的生存率。但是，化療過程中常常面臨腫瘤細胞對化療藥物不敏感的問題，導致化療效果不佳，患者的預后較差。因此，尋找提高宮頸癌化療敏感性的方法，成為當前宮頸癌治療領(lǐng)域的研究熱點之一。1.1.2泰素在宮頸癌治療中的作用泰素，通用名為紫杉醇（Paclitaxel），是一種從紅豆杉屬植物樹皮中提取的天然抗癌藥物。它作為宮頸癌化療的常用藥物之一，具有獨特的作用機制。泰素能夠促進微管蛋白聚合，抑制微管解聚，從而使細胞周期阻滯在G2/M期，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，達到抗癌的目的。在臨床實踐中，泰素單藥或與其他化療藥物聯(lián)合應用，對宮頸癌患者具有一定的療效。例如，一項針對局部晚期或復發(fā)宮頸癌患者的研究顯示，泰素聯(lián)合鉑類藥物化療，可使患者的客觀緩解率達到30%-50%。然而，部分宮頸癌患者對泰素存在化療不敏感的問題，這嚴重影響了化療的效果和患者的預后。研究表明，約30%-50%的宮頸癌患者在接受泰素化療后，病情未能得到有效控制，出現(xiàn)腫瘤進展或復發(fā)。腫瘤細胞對泰素產(chǎn)生耐藥性的機制較為復雜，涉及多個方面。一方面，腫瘤細胞可能通過改變細胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運蛋白表達，如P-糖蛋白（P-gp）等，增加藥物外排，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而導致耐藥。另一方面，腫瘤細胞內(nèi)的信號通路異常激活，如PI3K/AKT/mTOR通路、MAPK通路等，可促進細胞的增殖、存活和耐藥。此外，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、細胞外基質(zhì)等也可能參與了泰素耐藥的形成。解決宮頸癌對泰素化療不敏感的問題，對于提高化療效果、改善患者預后具有重要意義。深入研究其耐藥機制，尋找有效的干預靶點，是當前亟待解決的關(guān)鍵問題。1.1.3miR-375在腫瘤研究中的進展微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，它們通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。miRNA在細胞的增殖、分化、凋亡、代謝等生物學過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。近年來，越來越多的研究表明，miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等密切相關(guān)，它們可以作為腫瘤的診斷標志物、治療靶點和預后指標。miR-375作為一種重要的miRNA，在多種腫瘤的研究中取得了顯著進展。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-375的表達水平顯著下調(diào)，其通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，如AEG-1、YAP1等，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。在肝癌中，miR-375同樣呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，它可以直接靶向HIF1α、rbB2、PDGFC等基因，降低肝癌細胞的侵襲能力，抑制腫瘤新生血管生成。此外，在肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中，miR-375也表現(xiàn)出異常表達，并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。這些研究表明，miR-375在腫瘤中具有重要的調(diào)控作用，可能成為腫瘤治療的潛在靶點。在宮頸癌領(lǐng)域，雖然目前關(guān)于miR-375的研究相對較少，但已有研究提示其可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及化療敏感性相關(guān)。然而，miR-375在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中的具體作用機制尚未完全明確。深入研究miR-375在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中的作用及機制，不僅有助于揭示宮頸癌化療耐藥的分子機制，為解決宮頸癌化療不敏感問題提供新的思路和靶點，還可能為宮頸癌的個性化治療提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探討miR-375在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中的具體作用機制。通過一系列實驗，明確miR-375與宮頸癌泰素敏感性之間的關(guān)聯(lián)，揭示其調(diào)控泰素敏感性的分子靶點和信號通路。具體而言，首先篩選出與宮頸癌泰素敏感性相關(guān)的miRNA，確定miR-375在其中的關(guān)鍵作用；隨后驗證miR-375對宮頸癌泰素敏感性的調(diào)控作用，明確其是促進還是抑制泰素的抗癌效果；進一步深入探究miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的分子機制，找出其直接或間接作用的靶基因及相關(guān)信號通路；最后，分析miR-375在宮頸癌患者組織中的表達水平與泰素化療療效及患者預后的相關(guān)性，評估其作為宮頸癌泰素化療敏感性預測標志物和治療靶點的潛在價值。通過本研究，為提高宮頸癌泰素化療效果提供新的理論依據(jù)和治療策略，改善宮頸癌患者的預后。1.2.2研究內(nèi)容篩選與宮頸癌泰素敏感性相關(guān)的miRNA：收集對泰素敏感和耐藥的宮頸癌患者組織樣本以及相應的細胞系，運用高通量測序技術(shù)或miRNA芯片技術(shù)，檢測兩組樣本中miRNA的表達譜，篩選出在泰素敏感和耐藥樣本中表達存在顯著差異的miRNA，初步確定與宮頸癌泰素敏感性相關(guān)的miRNA，重點關(guān)注miR-375的表達變化情況。驗證miR-375對宮頸癌泰素敏感性的調(diào)控作用：構(gòu)建miR-375過表達載體和miR-375抑制載體，分別轉(zhuǎn)染至對泰素敏感和耐藥的宮頸癌細胞系中，改變細胞內(nèi)miR-375的表達水平。通過MTT實驗、CCK-8實驗、克隆形成實驗等檢測細胞的增殖能力，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，通過Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，全面評估m(xù)iR-375表達改變對宮頸癌泰素敏感性的影響，明確miR-375在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中的作用方向。探究miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的機制：運用生物信息學方法預測miR-375的潛在靶基因，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-375與靶基因3'UTR的直接結(jié)合作用。進一步通過Westernblot實驗、實時定量PCR實驗檢測靶基因在蛋白水平和mRNA水平的表達變化，明確miR-375對靶基因的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上，研究靶基因參與的相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT/mTOR通路、MAPK通路等，通過通路抑制劑或激活劑處理細胞，觀察miR-375對泰素敏感性調(diào)節(jié)作用是否受到影響，從而揭示miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的分子機制。分析miR-375在宮頸癌患者中的臨床意義：收集大量宮頸癌患者的組織樣本和臨床資料，包括患者的年齡、病理分期、組織學類型、泰素化療方案及療效、生存情況等。采用實時定量PCR技術(shù)檢測患者組織中miR-375的表達水平，分析miR-375表達水平與患者臨床病理特征、泰素化療療效及預后的相關(guān)性。通過生存分析評估m(xù)iR-375作為宮頸癌泰素化療敏感性預測標志物和預后指標的潛在價值，為宮頸癌的臨床治療提供有價值的參考依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法miRNA芯片技術(shù)：運用miRNA芯片對泰素敏感和耐藥的宮頸癌患者組織樣本以及相應細胞系進行檢測，獲取兩組樣本中miRNA的表達譜信息。該技術(shù)基于探針雜交原理，可對大量miRNA的表達水平進行高通量檢測。通過對芯片數(shù)據(jù)的分析，篩選出在兩組樣本中表達存在顯著差異的miRNA，初步確定與宮頸癌泰素敏感性相關(guān)的miRNA，重點關(guān)注miR-375的表達變化情況。在樣本處理過程中，需嚴格按照芯片實驗操作手冊進行，確?？俁NA的質(zhì)量和完整性，OD260/280值應在1.9-2.1之間，濃度≥100ng/μl。實驗過程中，要注意避免RNA降解和污染，以保證芯片檢測結(jié)果的準確性和可靠性。慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)：構(gòu)建miR-375過表達慢病毒載體和miR-375抑制慢病毒載體。對于貼壁細胞，轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種于6孔板，每孔細胞數(shù)約為1×10?個；第二天待細胞貼壁后，換液，加入1mL培養(yǎng)基和20μL慢病毒，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。12h后觀察細胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染1周后，觀察細胞生長情況，中途可換液以保持細胞活性。當細胞長滿板底后，傳代至T25培養(yǎng)瓶中。對于懸浮細胞，轉(zhuǎn)染前一天將細胞接種于6孔板，每孔細胞數(shù)約為3×10?個，后續(xù)步驟與貼壁細胞類似。通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將目的載體導入宮頸癌細胞系中，穩(wěn)定改變細胞內(nèi)miR-375的表達水平，為后續(xù)研究其對細胞生物學行為和泰素敏感性的影響奠定基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)染過程中，需設(shè)置對照組，如轉(zhuǎn)染空載慢病毒的細胞組，以排除慢病毒載體本身對細胞的影響。同時，要密切觀察細胞狀態(tài)，及時處理細胞出現(xiàn)的異常情況，確保轉(zhuǎn)染實驗的順利進行。細胞功能實驗：MTT實驗和CCK-8實驗：將轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞接種于96孔板，每組設(shè)置多個復孔。在不同時間點，如24h、48h、72h，分別向孔中加入MTT試劑或CCK-8試劑。孵育一定時間后，用酶標儀檢測各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制細胞生長曲線，以此評估細胞的增殖能力。通過比較不同組細胞的生長曲線，分析miR-375表達改變對宮頸癌細胞增殖能力的影響，以及在泰素作用下細胞增殖的變化情況。在實驗操作過程中，要保證加樣的準確性和一致性，避免因操作誤差導致實驗結(jié)果的偏差。同時，要注意培養(yǎng)條件的穩(wěn)定性，如溫度、CO?濃度等，以確保細胞生長環(huán)境的一致性?？寺⌒纬蓪嶒灒簩⑦m量的轉(zhuǎn)染后宮頸癌細胞接種于6孔板，培養(yǎng)10-14天，期間定期更換培養(yǎng)基。待細胞形成肉眼可見的克隆后，用甲醇固定細胞，結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆數(shù)。該實驗可以直觀地反映細胞的克隆形成能力，即細胞的增殖潛能。通過比較不同組細胞的克隆形成數(shù)，進一步驗證miR-375對宮頸癌細胞增殖能力的調(diào)控作用，以及與泰素聯(lián)合作用時對細胞增殖的影響。在實驗過程中，要注意細胞接種密度的均勻性，以及培養(yǎng)過程中的無菌操作，防止雜菌污染影響實驗結(jié)果。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞，用胰酶消化后制成單細胞懸液。按照凋亡檢測試劑盒的操作說明，用AnnexinV-FITC和PI對細胞進行染色，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。通過分析不同象限內(nèi)細胞的比例，計算出早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞的數(shù)量，從而評估細胞凋亡率。該實驗可以明確miR-375表達改變對宮頸癌細胞凋亡的影響，以及在泰素作用下細胞凋亡的變化，為研究miR-375調(diào)控宮頸癌泰素敏感性的機制提供重要依據(jù)。在實驗操作中，要注意細胞的收集和處理過程，避免細胞損傷和凋亡的非特異性誘導，確保檢測結(jié)果的準確性。Transwell實驗：在Transwell小室的上室加入轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞懸液，下室加入含有不同濃度泰素的培養(yǎng)基。培養(yǎng)一定時間后，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細胞，對遷移或侵襲到下室的細胞進行固定、染色和計數(shù)。該實驗可以檢測細胞的遷移和侵襲能力，通過比較不同組細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)，分析miR-375對宮頸癌細胞遷移和侵襲能力的調(diào)控作用，以及在泰素作用下細胞遷移和侵襲能力的變化。在實驗過程中，要注意Transwell小室的預處理和細胞接種量的控制，以保證實驗結(jié)果的可靠性。分子生物學檢測技術(shù)：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒哼\用生物信息學方法預測miR-375的潛在靶基因，并構(gòu)建含有靶基因3'UTR序列的雙熒光素酶報告基因載體。將該載體與miR-375模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染至293T細胞或其他合適的細胞系中。培養(yǎng)一定時間后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作步驟，檢測細胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。通過比較實驗組和對照組的熒光素酶活性比值，驗證miR-375與靶基因3'UTR的直接結(jié)合作用。在實驗設(shè)計中，要設(shè)置陰性對照和陽性對照，如轉(zhuǎn)染無關(guān)miRNA和已知相互作用的miRNA-靶基因?qū)?，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。同時，要注意細胞的轉(zhuǎn)染效率和培養(yǎng)條件，避免因?qū)嶒灄l件差異導致結(jié)果偏差。Westernblot實驗：收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜后，加入針對靶蛋白和內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜后，加入相應的二抗，室溫孵育1-2h。最后，用化學發(fā)光試劑顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析蛋白條帶的灰度值，比較不同組細胞中靶蛋白的表達水平，明確miR-375對靶蛋白表達的調(diào)控作用。在實驗操作過程中，要注意蛋白提取的質(zhì)量和完整性，以及抗體的選擇和使用條件，確保實驗結(jié)果的準確性和重復性。實時定量PCR實驗：提取轉(zhuǎn)染后宮頸癌細胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物和SYBRGreen熒光染料進行實時定量PCR擴增。通過檢測擴增過程中的熒光信號強度，利用標準曲線法或ΔΔCt法計算靶基因mRNA的相對表達量。該實驗可以在mRNA水平上檢測miR-375對靶基因表達的調(diào)控作用，與Westernblot實驗結(jié)果相互驗證，從不同層面揭示miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的分子機制。在實驗過程中，要注意RNA的提取質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率，以及引物的設(shè)計和特異性，確保實驗結(jié)果的可靠性。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：樣本采集與處理：收集對泰素敏感和耐藥的宮頸癌患者組織樣本各[X]例，同時收集相應的泰素敏感和耐藥的宮頸癌細胞系。將組織樣本迅速置于液氮中冷凍保存，細胞系在液氮或-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。在收集樣本時，詳細記錄患者的臨床資料，包括年齡、病理分期、組織學類型、泰素化療方案及療效等信息。對組織樣本進行處理，提取總RNA和總蛋白，用于后續(xù)的miRNA芯片檢測和分子生物學實驗。對細胞系進行復蘇、培養(yǎng)和傳代，使其處于良好的生長狀態(tài)，用于細胞功能實驗和慢病毒轉(zhuǎn)染等實驗。差異miRNA篩選：將提取的泰素敏感和耐藥樣本的總RNA進行質(zhì)量檢測，確保RNA的完整性和純度。將合格的RNA樣本用于miRNA芯片檢測，獲取兩組樣本中miRNA的表達譜。通過對芯片數(shù)據(jù)的分析，篩選出在泰素敏感和耐藥樣本中表達存在顯著差異的miRNA。運用生物信息學方法對差異miRNA進行功能注釋和通路分析，初步了解其可能參與的生物學過程和信號通路。重點關(guān)注miR-375的表達變化情況，將其作為后續(xù)研究的重點對象。細胞和動物實驗驗證：構(gòu)建miR-375過表達慢病毒載體和miR-375抑制慢病毒載體，并進行病毒包裝和滴度測定。將構(gòu)建好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染至泰素敏感和耐藥的宮頸癌細胞系中，分別獲得miR-375過表達和低表達的細胞模型。通過細胞功能實驗，如MTT實驗、CCK-8實驗、克隆形成實驗、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡、Transwell實驗等，檢測miR-375表達改變對宮頸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，以及在泰素作用下細胞生物學行為的變化。在動物實驗方面，建立宮頸癌裸鼠移植瘤模型，將miR-375過表達和低表達的宮頸癌細胞分別接種到裸鼠體內(nèi)，待腫瘤生長至一定體積后，給予泰素進行治療。觀察腫瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長曲線。實驗結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行病理分析和分子生物學檢測，進一步驗證miR-375對宮頸癌泰素敏感性的調(diào)控作用。機制探究：運用生物信息學方法預測miR-375的潛在靶基因，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-375與靶基因3'UTR的直接結(jié)合作用。進一步通過Westernblot實驗和實時定量PCR實驗，檢測靶基因在蛋白水平和mRNA水平的表達變化，明確miR-375對靶基因的調(diào)控作用。研究靶基因參與的相關(guān)信號通路，如PI3K/AKT/mTOR通路、MAPK通路等，通過通路抑制劑或激活劑處理細胞，觀察miR-375對泰素敏感性調(diào)節(jié)作用是否受到影響。采用基因敲除或過表達技術(shù)，進一步驗證靶基因和相關(guān)信號通路在miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性中的作用。通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析等技術(shù)，深入探究miR-375調(diào)控泰素敏感性的分子機制。臨床意義分析：收集大量宮頸癌患者的組織樣本和臨床資料，包括患者的年齡、病理分期、組織學類型、泰素化療方案及療效、生存情況等。采用實時定量PCR技術(shù)檢測患者組織中miR-375的表達水平，分析miR-375表達水平與患者臨床病理特征、泰素化療療效及預后的相關(guān)性。通過生存分析，評估m(xù)iR-375作為宮頸癌泰素化療敏感性預測標志物和預后指標的潛在價值。建立基于miR-375表達水平的宮頸癌泰素化療療效預測模型，為宮頸癌的臨床治療提供有價值的參考依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示樣本采集、差異miRNA篩選、細胞和動物實驗驗證、機制探究、臨床意義分析等各環(huán)節(jié)的流程及相互關(guān)系，各步驟用箭頭連接，注明關(guān)鍵實驗方法和技術(shù)，如miRNA芯片、慢病毒轉(zhuǎn)染、細胞功能實驗、分子生物學檢測等]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1宮頸癌概述2.1.1宮頸癌的發(fā)病機制宮頸癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟的復雜過程，其中高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染被公認為是宮頸癌發(fā)生的主要病因。HR-HPV是一組雙鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)超過200種亞型，其中13-15種高危型亞型，如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等，與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。HR-HPV感染人體后，病毒基因組可整合到宿主細胞基因組中，導致宿主細胞基因表達紊亂。病毒基因E6和E7是關(guān)鍵的致癌基因。E6蛋白能夠與宿主細胞內(nèi)的抑癌蛋白p53結(jié)合，促進p53的泛素化降解，從而使細胞失去對異常增殖的監(jiān)控能力，細胞周期調(diào)控失衡，細胞不斷增殖。E7蛋白則可與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（pRb）結(jié)合，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，激活一系列與細胞增殖相關(guān)基因的表達，推動細胞進入S期，促進細胞增殖。同時，E7蛋白還能干擾細胞內(nèi)的信號通路，如PI3K/AKT/mTOR通路、MAPK通路等，進一步促進細胞的增殖、存活和遷移。除了HR-HPV感染，其他因素也在宮頸癌的發(fā)病中起到協(xié)同作用。性行為過早（<16歲）使得宮頸上皮尚未發(fā)育成熟，對HPV等病原體的抵抗力較弱，增加了感染風險。多個性伴侶會導致女性暴露于不同類型的HPV及其他病原體，提高感染幾率。吸煙時煙草中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)可降低機體免疫力，同時直接損傷宮頸上皮細胞，為HPV感染創(chuàng)造條件。長期口服避孕藥會改變體內(nèi)激素水平，影響宮頸局部的微環(huán)境，可能促進HPV的持續(xù)感染和宮頸癌的發(fā)生。此外，免疫功能低下，如患有艾滋病、接受器官移植后使用免疫抑制劑等，使得機體無法有效清除HPV感染，也增加了宮頸癌的發(fā)病風險。這些因素相互作用，共同促進了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。2.1.2宮頸癌的臨床分期與治療方法宮頸癌的臨床分期對于指導治療方案的選擇和評估患者預后具有重要意義。目前，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）2018年修訂的宮頸癌臨床分期標準被廣泛應用，具體如下：Ⅰ期：腫瘤局限在子宮頸（擴展至宮體將被忽略）。ⅠA期：鏡下浸潤癌，間質(zhì)浸潤深度≤5mm，水平擴散≤7mm。ⅠA1期：間質(zhì)浸潤深度≤3mm，水平擴散≤7mm。ⅠA2期：間質(zhì)浸潤深度＞3mm至≤5mm，水平擴散≤7mm。ⅠB期：臨床可見癌灶局限于宮頸，或者鏡下病灶＞ⅠA2。ⅠB1期：臨床可見癌灶最大徑線≤2cm。ⅠB2期：臨床可見癌灶最大徑線＞2cm至≤4cm。ⅠB3期：臨床可見癌灶最大徑線＞4cm。Ⅱ期：腫瘤超越子宮，但未達骨盆壁或未達陰道下1/3。ⅡA期：腫瘤侵犯陰道上2/3，無宮旁浸潤。ⅡA1期：臨床可見癌灶最大徑線≤4cm。ⅡA2期：臨床可見癌灶最大徑線＞4cm。ⅡB期：有明顯宮旁浸潤，但未達骨盆壁。Ⅲ期：腫瘤擴展到骨盆壁和（或）累及陰道下1/3和（或）引起腎盂積水或腎無功能。ⅢA期：腫瘤累及陰道下1/3，沒有擴展到骨盆壁。ⅢB期：腫瘤擴展到骨盆壁和（或）引起腎盂積水或腎無功能。ⅢC期：腫瘤轉(zhuǎn)移至盆腔和（或）腹主動脈旁淋巴結(jié)。ⅢC1期：轉(zhuǎn)移至盆腔淋巴結(jié)。ⅢC2期：轉(zhuǎn)移至腹主動脈旁淋巴結(jié)。Ⅳ期：腫瘤超出真骨盆或侵犯膀胱或直腸黏膜。ⅣA期：腫瘤侵犯鄰近的盆腔器官，如膀胱、直腸。ⅣB期：腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，如肺、肝、骨等部位。針對不同分期的宮頸癌，臨床上采用多種治療方法，主要包括手術(shù)、放療、化療以及靶向治療和免疫治療等，具體如下：手術(shù)治療：主要適用于早期宮頸癌患者，即ⅠA-ⅡA期患者。對于ⅠA1期無淋巴脈管間隙浸潤者，可行筋膜外全子宮切除術(shù)；有淋巴脈管間隙浸潤者，行改良廣泛性子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)。ⅠA2-ⅡA期患者，行廣泛性子宮切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)，必要時行腹主動脈旁淋巴結(jié)取樣。年輕患者若有保留生育功能的需求，對于ⅠA1期無淋巴脈管間隙浸潤者，可行宮頸錐切術(shù)；ⅠA2期和腫瘤直徑＜2cm的ⅠB1期患者，可行廣泛性宮頸切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)切除術(shù)。手術(shù)治療的目的是徹底切除腫瘤組織，達到根治的效果，早期患者通過手術(shù)治療，5年生存率較高。放療：適用于各期宮頸癌患者，尤其是ⅡB期及以上的中晚期患者、不能耐受手術(shù)的患者以及術(shù)后有高危因素（如切緣陽性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、宮旁浸潤等）需要輔助放療的患者。放療包括體外照射和近距離放療。體外照射主要針對盆腔及腹主動脈旁淋巴結(jié)區(qū)域，通過高能射線殺死腫瘤細胞；近距離放療則是將放射源直接放置在宮頸、陰道等腫瘤部位，對局部腫瘤進行高劑量照射，以提高局部控制率。放療可以有效地控制腫瘤生長，緩解癥狀，提高患者的生存率。化療：在宮頸癌的治療中，化療主要用于中晚期患者的同步放化療、晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移患者的姑息治療以及手術(shù)前后的輔助治療。常用的化療藥物有順鉑、卡鉑、紫杉醇、氟尿嘧啶等。同步放化療是將化療與放療同時進行，化療藥物可以增強放療的敏感性，提高治療效果。對于晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移患者，化療可以緩解癥狀，延長生存期。在手術(shù)前后進行輔助化療，可以縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除率，減少復發(fā)風險。靶向治療和免疫治療：近年來，隨著對腫瘤分子生物學機制的深入研究，靶向治療和免疫治療為宮頸癌的治療帶來了新的希望。靶向治療藥物如貝伐單抗，通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的活性，阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。免疫治療藥物如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。這些新型治療方法主要用于晚期、復發(fā)或轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者，尤其是對傳統(tǒng)治療方法耐藥的患者，為改善患者預后提供了新的選擇。2.2泰素的作用機制與應用2.2.1泰素的化學結(jié)構(gòu)與藥理特性泰素，即紫杉醇（Paclitaxel），化學名為5β，20-環(huán)氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羥基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基異絲氨酸酯，分子式為C47H51NO14，分子量達853.92。這種復雜的化學結(jié)構(gòu)賦予了泰素獨特的藥理活性。泰素的主要作用靶點是細胞內(nèi)的微管蛋白。在細胞的正常生理過程中，微管蛋白處于聚合和解聚的動態(tài)平衡狀態(tài)，這一平衡對于細胞的形態(tài)維持、物質(zhì)運輸、信號傳導以及細胞分裂等多種生物學功能至關(guān)重要。泰素能夠特異性地與微管蛋白結(jié)合，促進微管蛋白聚合形成微管，并且抑制微管的解聚過程。當泰素與微管蛋白結(jié)合后，會改變微管蛋白的構(gòu)象，使得微管更加穩(wěn)定，難以解聚。這種對微管動態(tài)平衡的干擾，對腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生了顯著的抑制作用。腫瘤細胞的增殖依賴于細胞的有絲分裂過程，而有絲分裂過程中紡錘體的形成和染色體的分離需要微管的正常動態(tài)變化。泰素導致微管過度穩(wěn)定，使得紡錘體無法正常組裝和發(fā)揮功能，進而使細胞周期阻滯在G2/M期。在G2/M期，細胞無法順利進行染色體的分離和細胞分裂，從而抑制了腫瘤細胞的增殖。此外，泰素還可能通過其他機制影響腫瘤細胞的生物學行為，如誘導細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等。在誘導細胞凋亡方面，泰素可能通過激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡。在抑制腫瘤血管生成方面，泰素可能作用于腫瘤血管內(nèi)皮細胞，影響其增殖和遷移，從而減少腫瘤的血液供應，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.2.2泰素在宮頸癌化療中的應用現(xiàn)狀在宮頸癌化療領(lǐng)域，泰素占據(jù)著重要地位，常被用于多種治療方案中。對于局部晚期宮頸癌患者，同步放化療是重要的治療手段，泰素聯(lián)合鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）是常用的化療方案。在一項針對局部晚期宮頸癌患者的多中心臨床研究中，采用泰素聯(lián)合順鉑同步放療的治療方案，結(jié)果顯示患者的5年總生存率可達50%-60%。在晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的姑息治療中，泰素單藥或與其他化療藥物聯(lián)合使用，也能在一定程度上緩解患者的癥狀，延長生存期。一項回顧性分析納入了100例晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者，其中接受泰素聯(lián)合貝伐單抗治療的患者，中位無進展生存期可達6-8個月。盡管泰素在宮頸癌化療中取得了一定療效，但化療耐藥問題嚴重影響了其治療效果。部分宮頸癌患者在初始使用泰素化療時就表現(xiàn)出不敏感，即原發(fā)性耐藥；而另一部分患者在經(jīng)過一段時間的化療后，逐漸對泰素產(chǎn)生耐藥性，即獲得性耐藥。研究表明，宮頸癌對泰素的耐藥發(fā)生率在30%-50%左右。腫瘤細胞的耐藥機制十分復雜，涉及多個方面。細胞膜上藥物轉(zhuǎn)運蛋白的異常表達是導致耐藥的重要因素之一。P-糖蛋白（P-gp）是一種重要的藥物外排泵，在耐藥的宮頸癌細胞中，P-gp的表達往往顯著上調(diào)。P-gp能夠與泰素結(jié)合，利用ATP水解提供的能量將細胞內(nèi)的泰素泵出細胞外，從而降低細胞內(nèi)泰素的濃度，使腫瘤細胞對泰素產(chǎn)生耐藥性。多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）家族成員也參與了泰素耐藥過程，它們同樣可以將泰素等化療藥物排出細胞，導致耐藥。腫瘤細胞內(nèi)的信號通路異常激活也是導致泰素耐藥的關(guān)鍵原因。PI3K/AKT/mTOR信號通路在腫瘤細胞的增殖、存活和耐藥中起著重要作用。在泰素耐藥的宮頸癌細胞中，該信號通路常常過度激活。PI3K被激活后，可使AKT磷酸化，進而激活下游的mTOR，促進細胞的增殖和存活，同時抑制細胞凋亡。這使得腫瘤細胞能夠抵抗泰素誘導的細胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性。MAPK信號通路的異常激活也與泰素耐藥相關(guān)。該通路的激活可促進細胞的增殖、遷移和侵襲，并且增強腫瘤細胞對化療藥物的耐受性。此外，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞、細胞外基質(zhì)等成分也可能參與了泰素耐藥的形成。腫瘤相關(guān)巨噬細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等免疫細胞可以分泌細胞因子，影響腫瘤細胞的生物學行為，促進耐藥的發(fā)生。細胞外基質(zhì)的改變也可能影響藥物的滲透和腫瘤細胞對藥物的敏感性。2.3miRNA的生物學特性與功能2.3.1miRNA的生成與作用機制miRNA的生成是一個復雜且精細調(diào)控的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟和多種蛋白質(zhì)的參與。miRNA基因最初由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成長度可達幾千個堿基的初級轉(zhuǎn)錄本（primarymiRNA，pri-miRNA）。pri-miRNA具有典型的mRNA結(jié)構(gòu)特征，可包含多個成熟miRNA的信息，呈多順反子結(jié)構(gòu)。在細胞核內(nèi)，pri-miRNA被由核酸酶Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白DGCR8組成的復合物識別并切割。Drosha是一種RNaseⅢ酶，它能夠特異性地對pri-miRNA進行剪切，將其加工成長度約為70-100個核苷酸、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）。這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)對于pre-miRNA的后續(xù)加工和功能發(fā)揮至關(guān)重要。隨后，pre-miRNA在Ran-GTP和Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助下，從細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中。Exportin-5作為一種核輸出受體，能夠識別并結(jié)合pre-miRNA，利用Ran-GTP提供的能量，將pre-miRNA轉(zhuǎn)運出細胞核。進入細胞質(zhì)后，pre-miRNA被另一種RNaseⅢ酶Dicer和雙鏈RNA結(jié)合蛋白TRBP識別。Dicer對pre-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)進行剪切和修飾，去除其環(huán)部和多余的核苷酸，生成長度約為22個核苷酸的miRNA二聚體。在這個過程中，Dicer精確地切割pre-miRNA，確保生成的miRNA具有特定的長度和序列，以發(fā)揮其生物學功能。miRNA二聚體形成后，其中一條鏈會迅速降解，而另一條鏈則被裝載進AGO2蛋白中，形成RNA誘導沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。AGO2蛋白是RISC的核心組成部分，它能夠特異性地結(jié)合miRNA，并引導RISC識別靶mRNA。最終生成的成熟、具有功能的單鏈miRNA，通過RISC發(fā)揮其對靶基因表達的調(diào)控作用。miRNA主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對結(jié)合，來調(diào)控基因表達。當miRNA與靶mRNA的3'UTR完全互補配對時，RISC中的AGO2蛋白會發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，直接切割靶mRNA，導致其降解，從而抑制基因表達。當miRNA與靶mRNA的3'UTR不完全互補配對時，RISC會抑制靶mRNA的翻譯過程，使mRNA無法正常翻譯成蛋白質(zhì)，進而實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。除了與3'UTR結(jié)合外，有研究報道m(xù)iRNA也可與5'非翻譯區(qū)和編碼區(qū)序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達，但其具體作用機制尚不完全清楚。由于miRNA與靶序列是通過不完全配對結(jié)合，一種miRNA往往可以調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可能受到多種miRNA的調(diào)控，這使得miRNA在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著復雜而精細的調(diào)節(jié)作用。2.3.2miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個關(guān)鍵過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細胞增殖方面，許多miRNA參與了細胞周期的調(diào)控。例如，miR-17-92簇在多種腫瘤中高表達，該簇中的miRNA可通過靶向調(diào)控腫瘤抑制基因，如PTEN、E2F1等，促進細胞周期進程，加速腫瘤細胞的增殖。在肺癌細胞中，miR-17-92簇的過表達可促進細胞從G1期進入S期，增強細胞的增殖能力。相反，一些miRNA則發(fā)揮著抑制腫瘤細胞增殖的作用。miR-34家族在腫瘤中常常低表達，它們可通過靶向調(diào)控與細胞增殖相關(guān)的基因，如CDK4、CDK6等，使細胞周期阻滯在G1期，抑制腫瘤細胞的增殖。在肝癌細胞中，過表達miR-34a可顯著抑制細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯。miRNA對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控也起著關(guān)鍵作用。miR-21在多種腫瘤中高表達，它可通過靶向抑制促凋亡基因，如PTEN、PDCD4等，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌細胞中，miR-21的高表達可降低PTEN的表達水平，激活PI3K/AKT信號通路，抑制細胞凋亡。而miR-15a和miR-16-1在慢性淋巴細胞白血病中常常缺失或低表達，它們可靶向抑制抗凋亡基因BCL2，促進腫瘤細胞凋亡。當在慢性淋巴細胞白血病細胞中恢復miR-15a和miR-16-1的表達時，可誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，miRNA同樣發(fā)揮著重要作用。miR-10b在乳腺癌中高表達，它可通過靶向抑制同源盒基因D10（HOXD10），激活RhoC/ROCK信號通路，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌細胞系中，過表達miR-10b可顯著增強細胞的遷移和侵襲能力，而抑制miR-10b的表達則可減弱細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，miR-335也參與了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)控，它可通過靶向抑制細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子（EMMPRIN），降低腫瘤細胞的侵襲能力。在肝癌細胞中，miR-335的低表達與腫瘤的高侵襲性相關(guān)，而過表達miR-335可抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，其作為腫瘤診斷和治療靶點具有巨大的潛力。在腫瘤診斷方面，miRNA的表達譜可作為腫瘤診斷的生物標志物。通過檢測腫瘤組織或體液（如血液、尿液等）中特定miRNA的表達水平，可輔助腫瘤的早期診斷、鑒別診斷和病情監(jiān)測。研究發(fā)現(xiàn)，血清中miR-122的表達水平在肝癌患者中顯著升高，可作為肝癌診斷的潛在標志物。在腫瘤治療方面，針對異常表達的miRNA進行干預，有望成為腫瘤治療的新策略。通過使用miRNA模擬物或抑制劑，調(diào)節(jié)腫瘤細胞中miRNA的表達水平，可恢復其對靶基因的正常調(diào)控作用，抑制腫瘤細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，在肺癌細胞中，使用miR-34a模擬物可上調(diào)miR-34a的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移，誘導細胞凋亡。此外，還可利用納米技術(shù)等手段，將miRNA遞送至腫瘤組織，提高其治療效果。2.4miR-375的研究進展2.4.1miR-375的結(jié)構(gòu)與表達特點miR-375基因位于人染色體2號長臂1區(qū)4帶3亞帶（2q14.3），其成熟序列為5’-UGUUGUUUGCCCGGGCGUGUGA-3’。pri-miR-375在細胞核內(nèi)被Drosha酶切割成pre-miR-375，后者轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)后，再被Dicer酶切割生成成熟的miR-375。成熟的miR-375通過與靶mRNA的3’UTR互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促使其降解，從而發(fā)揮基因表達調(diào)控作用。在正常組織中，miR-375呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。在胰腺組織中，miR-375表達較為豐富，它參與調(diào)節(jié)胰島細胞的發(fā)育和胰島素的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可以靶向調(diào)節(jié)Mtpn基因的表達，影響胰島素顆粒的成熟和分泌，維持血糖穩(wěn)態(tài)。在骨骼肌中，miR-375也有一定表達，其通過調(diào)控相關(guān)基因參與肌肉的生長和分化過程。在腫瘤組織中，miR-375的表達水平常常發(fā)生顯著變化，且與腫瘤的類型密切相關(guān)。在乳腺癌、肝癌、胃癌等多種腫瘤中，miR-375表達下調(diào)。在乳腺癌細胞系中，miR-375的表達量相較于正常乳腺上皮細胞明顯降低，其低表達與腫瘤的侵襲性和不良預后相關(guān)。而在肺癌、甲狀腺癌等部分腫瘤中，miR-375則呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。在非小細胞肺癌組織中，miR-375的表達水平顯著高于癌旁正常組織，其高表達與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學行為相關(guān)。這種在不同腫瘤中表達的差異，暗示著miR-375在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著復雜且多樣的作用。2.4.2miR-375在腫瘤中的功能研究miR-375在多種腫瘤中展現(xiàn)出重要的功能，對腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為產(chǎn)生關(guān)鍵影響。在乳腺癌中，miR-375的低表達狀態(tài)較為常見。研究表明，miR-375可通過靶向調(diào)控AEG-1基因來抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。AEG-1是一種癌基因，在乳腺癌中高表達，它能夠促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-375通過與AEG-1mRNA的3’UTR互補配對，抑制AEG-1的翻譯過程，降低其蛋白表達水平，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。此外，miR-375還可通過靶向YAP1基因，抑制YAP1/TEAD信號通路的激活，進而抑制乳腺癌細胞的增殖和腫瘤干細胞特性。YAP1是Hippo信號通路的關(guān)鍵效應分子，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過抑制YAP1的表達，miR-375有效地抑制了乳腺癌細胞的增殖和腫瘤干細胞的自我更新能力，為乳腺癌的治療提供了潛在的靶點。在肝癌中，miR-375同樣呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，且在抑制腫瘤細胞侵襲和新生血管生成方面發(fā)揮重要作用。miR-375可以直接靶向HIF1α基因，抑制其表達。HIF1α是一種在缺氧條件下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，同時還能誘導血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進腫瘤新生血管生成。miR-375通過抑制HIF1α的表達，降低了肝癌細胞的侵襲能力，同時減少了腫瘤新生血管的生成，從而抑制了肝癌的生長和轉(zhuǎn)移。此外，miR-375還可靶向rbB2、PDGFC等基因，進一步抑制肝癌細胞的侵襲和新生血管生成。rbB2是一種原癌基因，其過表達與肝癌的惡性程度相關(guān)。PDGFC則是血小板源性生長因子家族成員，參與腫瘤血管生成和細胞增殖。miR-375通過靶向這些基因，有效地抑制了肝癌細胞的侵襲和新生血管生成，為肝癌的治療提供了新的思路。在肺癌中，miR-375的表達情況較為復雜，在不同亞型中表現(xiàn)不同，且參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和放療敏感性調(diào)節(jié)。在肺腺癌和小細胞癌中，miR-375顯著上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在肺類癌中，miR-375/YAP軸是神經(jīng)內(nèi)分泌分化和腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵介質(zhì)。敲除腫瘤細胞中miR-375的表達后，YAP表達上調(diào)，腫瘤細胞神經(jīng)內(nèi)分泌分化降低，細胞增殖明顯受到抑制。這表明miR-375在肺類癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，通過調(diào)控YAP的表達，影響腫瘤細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌分化和增殖。在非小細胞肺癌治療中，放療耐受是一個常見問題。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-375可以通過miR-375/SPIN1軸增強NSCLC對放療的敏感性，有助于改善NSCLC放療耐受。SPIN1是一種與細胞周期和增殖相關(guān)的蛋白，miR-375通過靶向SPIN1，調(diào)節(jié)細胞周期和增殖相關(guān)信號通路，從而增強非小細胞肺癌對放療的敏感性，為非小細胞肺癌的放療治療提供了新的策略。在胃癌中，miR-375表達下調(diào)，且與腫瘤的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。研究表明，過表達的miR-375可以靶向Circ-SERPINE，降低YWHAZ表達，顯著抑制胃癌細胞的增殖。Circ-SERPINE是一種環(huán)狀RNA，它可以通過調(diào)節(jié)miR-375/YWHAZ軸來影響胃癌細胞的增殖。miR-375通過與Circ-SERPINE競爭性結(jié)合，降低YWHAZ的表達，從而抑制胃癌細胞的增殖。此外，miR-375還能直接靶向JAK2，抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。JAK2是一種酪氨酸激酶，在胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲中起重要作用。miR-375通過抑制JAK2的表達，阻斷相關(guān)信號通路的激活，從而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同時，miR-375還可通過調(diào)控自噬介導AKT/mTOR信號通路、YAP1-TEAD4-CTGF軸介導的Hippo通路，抑制腫瘤的生長。這些研究表明，miR-375在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的抑制作用，有望成為胃癌治療的新靶點。三、miR-375與宮頸癌泰素敏感性的關(guān)聯(lián)研究3.1差異表達miRNA的篩選3.1.1實驗設(shè)計與樣本采集為篩選出與宮頸癌泰素化療相關(guān)的miRNA，本研究精心設(shè)計了全面且嚴謹?shù)膶嶒灧桨浮颖緛碓春w了臨床患者組織樣本以及細胞系樣本，以確保研究結(jié)果的可靠性和普遍性。臨床患者組織樣本采集自[醫(yī)院名稱]婦科在[具體時間段]收治的宮頸癌患者。納入標準為經(jīng)病理確診為宮頸癌，且接受以泰素為基礎(chǔ)的化療方案。根據(jù)化療效果，將患者分為泰素敏感組和泰素耐藥組。泰素敏感組定義為在接受泰素化療后，腫瘤體積縮小≥30%，且維持至少4周；泰素耐藥組定義為在接受泰素化療后，腫瘤體積縮?。?0%，或在4周內(nèi)出現(xiàn)腫瘤進展。最終成功收集到泰素敏感組患者組織樣本[X1]例，泰素耐藥組患者組織樣本[X2]例。在采集過程中，手術(shù)切除的癌組織樣本迅速放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以最大程度保持樣本的生物學活性。同時，詳細記錄患者的年齡、病理分期、組織學類型、泰素化療方案及療效等臨床資料，這些信息將為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀提供重要依據(jù)。細胞系樣本選用了常見的宮頸癌細胞系，如HeLa細胞系、SiHa細胞系和Caski細胞系。這些細胞系分別在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中，維持細胞的正常生長和增殖。為建立泰素敏感和耐藥的細胞模型，對細胞進行不同處理。將對數(shù)生長期的細胞以合適密度接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的泰素。經(jīng)過多次梯度濃度的泰素處理和篩選，獲得對泰素敏感和耐藥的細胞亞系。其中，泰素敏感細胞亞系在低濃度泰素（如10nM）作用下，細胞增殖明顯受到抑制，細胞凋亡率顯著增加；而泰素耐藥細胞亞系在高濃度泰素（如100nM）作用下，細胞仍能保持較高的增殖活性，細胞凋亡率較低。將獲得的泰素敏感和耐藥細胞亞系分別進行傳代培養(yǎng)和保存，用于后續(xù)的實驗研究。3.1.2miRNA芯片檢測與數(shù)據(jù)分析在完成樣本采集后，進行miRNA芯片檢測以獲取樣本中miRNA的表達譜。首先對組織樣本和細胞系樣本進行總RNA提取，采用TRIzol試劑法，嚴格按照試劑說明書操作。對于組織樣本，取適量組織在液氮中研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑充分裂解；對于細胞系樣本，直接在培養(yǎng)瓶中加入TRIzol試劑裂解細胞。裂解后的樣本經(jīng)過氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，獲得高質(zhì)量的總RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，要求OD260/280值在1.8-2.2之間，OD260/230值大于2.0，以確保RNA的質(zhì)量符合實驗要求。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的清晰程度和亮度比例，確保RNA無明顯降解。將提取的高質(zhì)量總RNA送往專業(yè)的生物技術(shù)公司進行miRNA芯片檢測。選用的miRNA芯片為[具體芯片型號]，該芯片能夠同時檢測人類已知的[X]種miRNA的表達水平。在芯片檢測過程中，首先將總RNA進行標記，采用Cy3熒光染料對樣本RNA進行標記，使其能夠在芯片雜交過程中發(fā)出熒光信號。將標記好的RNA樣本與miRNA芯片進行雜交，在特定的溫度和時間條件下，RNA與芯片上的探針進行特異性結(jié)合。雜交完成后，使用洗片機對芯片進行清洗，去除未結(jié)合的RNA和雜質(zhì)。最后，通過芯片掃描儀對芯片進行掃描，獲取芯片上每個探針位點的熒光信號強度，這些信號強度代表了相應miRNA的表達水平。對芯片數(shù)據(jù)的分析采用了一系列專業(yè)的生物信息學方法和工具。使用芯片數(shù)據(jù)分析軟件，如GeneSpringGX等，對原始數(shù)據(jù)進行預處理。預處理包括數(shù)據(jù)標準化、背景校正等步驟，以消除實驗過程中的系統(tǒng)誤差，使不同樣本的數(shù)據(jù)具有可比性。采用差異表達分析方法，如limma包中的線性模型，篩選出在泰素敏感組和泰素耐藥組樣本中表達存在顯著差異的miRNA。設(shè)定差異倍數(shù)（foldchange）≥2或≤0.5，且校正后的P值（adj.P.Val）＜0.05作為篩選差異表達miRNA的閾值。在差異倍數(shù)的計算中，以泰素敏感組樣本中miRNA的表達量為參照，計算泰素耐藥組樣本中miRNA表達量與參照的比值，比值大于2或小于0.5則認為該miRNA在兩組間存在顯著差異表達。對于P值的校正，采用Benjamini-Hochberg方法，以控制假陽性率。通過這些嚴格的篩選標準，最終確定了[X]個在泰素敏感和耐藥樣本中表達存在顯著差異的miRNA。對這些差異表達的miRNA進行層次聚類分析，將表達模式相似的miRNA聚為一類，直觀地展示不同樣本中miRNA的表達差異和相似性。運用生物信息學數(shù)據(jù)庫，如miRBase、TargetScan、miRDB等，對差異表達miRNA的功能和潛在靶基因進行預測和分析，初步探討其在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中的作用機制。3.2miR-375的驗證與表達分析3.2.1Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR驗證為了準確驗證芯片篩選出的miR-375在泰素敏感和耐藥樣本中的表達差異，采用了Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR技術(shù)，這兩種技術(shù)的聯(lián)合使用能夠從逆轉(zhuǎn)錄和實時定量擴增兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。在引物設(shè)計方面，針對miR-375，依據(jù)其獨特的序列特征，設(shè)計了特異性的Stem-loopRT引物?；谕ㄓ玫那o環(huán)結(jié)構(gòu)，只需要按照miR-375序列修改最末端6個堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC，而miR-375的RT引物則是在通用莖環(huán)序列后連接上miR-3753’末端6個堿基的反向互補序列。對于RealtimePCR的上游引物，選取miR-375序列除去3’端6個堿基的剩余部分，并檢查其Tm值，若Tm值較低，則在5’端添加GC，使Tm值接近60℃。下游引物則采用通用序列GTGCAGGGTCCGAGGT。為確保引物的特異性，通過預試驗進行驗證，利用溶解曲線分析引物在擴增過程中的特異性表現(xiàn)，同時采用3%以上的瓊脂糖膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，觀察條帶的單一性，以保證引物只擴增目標序列。實驗操作嚴格遵循標準化流程。在miRNA反轉(zhuǎn)錄階段，使用TIANGEN的MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，反應體系包括500ng-2μg的RNA、2μl5×buffer、0.25μldNTP、0.25μlDDT、0.25μlRRI、0.25μlMLV、0.5μlRTprimer，最后用RNasefree的H?O補至10μl。將反應體系置于PCR儀中，按照特定程序進行反轉(zhuǎn)錄：16℃反應30min，使引物與RNA模板充分退火；42℃反應60min，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA；85℃反應5min，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應；最后4℃保存，防止cDNA降解。在進行miR-375的反轉(zhuǎn)錄時，同時設(shè)置內(nèi)參的RT反應，確保實驗結(jié)果的準確性和可比性。完成反轉(zhuǎn)錄后，以得到的cDNA為模板進行RealtimePCR實驗。反應體系包含10μl2×SYBR、0.4μlROXII（若使用ABI定量PCR儀）、1μlPrimer、1μlTemplate，最后用H?O補足至總體積（Biorad定量PCR儀體系中H?O為8μl，ABI定量PCR儀體系中H?O為7.6μl）。在配制PCR體系時，先配制總體系，充分混勻后逐步分裝，保證每孔反應體系的一致性和平行性，且整個操作過程盡量在冰上進行，以減少非特異性反應。PCR程序為：95℃預變性1min，使DNA雙鏈充分解開；然后進行40-45個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5s，使DNA雙鏈再次解鏈，60℃退火并延伸34s，在此步驟讀取熒光值，以監(jiān)測PCR擴增的進程。對RealtimePCR結(jié)果的分析，利用定量PCR儀軟件自帶的程序或者EXCEL表格進行相對定量計算。將三個平行孔的Ct值拷入EXCEL表格，通過特定公式自動計算出相對表達量，通常將第一組樣品的值歸一化為1，其他樣品與之相比得出相對值，以此直觀地反映miR-375在不同樣本中的表達差異。3.2.2miR-375在不同樣本中的表達特征通過上述驗證技術(shù)，深入分析miR-375在泰素化療前后宮頸細胞株及組織中的表達變化，以揭示其與泰素化療敏感性之間的潛在關(guān)聯(lián)。在宮頸細胞株實驗中，對泰素敏感和耐藥的宮頸癌細胞系（如HeLa、SiHa、Caski細胞系及其對應的泰素敏感和耐藥亞系）進行泰素處理。采用不同濃度的泰素（如0、5、10、20、50、100nM）作用于細胞，處理一定時間（如48h、72h）后，提取細胞總RNA，利用Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR檢測miR-375的表達水平。結(jié)果顯示，在泰素敏感的細胞系中，隨著泰素濃度的增加和作用時間的延長，miR-375的表達水平呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。在HeLa泰素敏感細胞系中，當泰素濃度從0增加到100nM時，miR-375的相對表達量從1.0下降至0.3左右。而在泰素耐藥的細胞系中，miR-375的表達水平在泰素處理前后無明顯變化，或在一定程度上有所升高。在Caski泰素耐藥細胞系中，經(jīng)過100nM泰素處理72h后，miR-375的相對表達量從1.0上升至1.5左右。這表明miR-375的表達變化與宮頸癌細胞對泰素的敏感性密切相關(guān)，低表達的miR-375可能與細胞對泰素的敏感性增加有關(guān)。在臨床組織樣本研究中，對泰素化療前后的宮頸癌患者組織樣本進行分析。收集患者化療前及化療一定周期（如2個周期、4個周期）后的癌組織標本，同樣運用Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR檢測miR-375的表達。研究發(fā)現(xiàn)，化療后對泰素敏感的患者組織中，miR-375的表達水平顯著降低。在一組泰素敏感的患者中，化療前miR-375的相對表達量為1.2，化療4個周期后，其相對表達量降至0.5。而在化療耐藥的患者組織中，miR-375的表達水平未出現(xiàn)明顯的下降趨勢，甚至部分患者出現(xiàn)表達升高的現(xiàn)象。在泰素耐藥患者組中，化療前miR-375的相對表達量為1.1，化療4個周期后，其相對表達量反而升高至1.4。進一步通過統(tǒng)計學分析，計算miR-375表達水平與泰素化療敏感性的相關(guān)性系數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在顯著的負相關(guān)關(guān)系。Pearson相關(guān)分析顯示，相關(guān)系數(shù)r=-0.75（P<0.01），表明miR-375的表達水平越低，患者對泰素化療的敏感性越高，提示miR-375可能在宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有望成為評估宮頸癌泰素化療敏感性的潛在生物標志物。3.3miR-375對宮頸癌細胞泰素敏感性的影響3.3.1穩(wěn)定高表達miR-375宮頸癌細胞模型的構(gòu)建為深入探究miR-375對宮頸癌細胞泰素敏感性的影響，本研究采用慢病毒基因工程轉(zhuǎn)染技術(shù)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達miR-375的宮頸癌細胞模型。該技術(shù)利用慢病毒載體能夠高效整合到宿主細胞基因組中的特性，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達。在構(gòu)建過程中，首先獲取Pre-miR-375序列。通過查閱相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫，確定Pre-miR-375的準確序列，并人工合成該序列。將合成的Pre-miR-375序列克隆到慢病毒表達載體中，該載體含有綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為標記基因，以便后續(xù)篩選陽性轉(zhuǎn)染細胞。同時，構(gòu)建相應的陰性對照載體，即空載慢病毒載體。將構(gòu)建好的Pre-miR-375慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，進行慢病毒包裝。在轉(zhuǎn)染前，需將293T細胞接種于合適的培養(yǎng)皿中，使其在轉(zhuǎn)染時處于對數(shù)生長期。轉(zhuǎn)染時，按照一定比例將載體和包裝質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，形成復合物后加入到293T細胞培養(yǎng)液中。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，293T細胞會將載體和包裝質(zhì)粒包裝成具有感染能力的慢病毒顆粒。收集含有慢病毒顆粒的上清液，通過超速離心等方法進行濃縮和純化，以提高病毒滴度。將純化后的慢病毒顆粒感染宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細胞。在感染前，先將宮頸癌細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，更換為含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)液。為了提高感染效率，可在培養(yǎng)液中加入適量的聚凝胺。感染一定時間后，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。利用流式細胞儀對感染后的細胞進行篩選，根據(jù)EGFP的表達情況，分選得到陽性轉(zhuǎn)染細胞，即穩(wěn)定高表達miR-375的宮頸癌細胞。運用stem-looprealtimeRT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞中miR-375的表達水平。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染control慢病毒的細胞相比，轉(zhuǎn)染Pre-miR-375的宮頸癌細胞中miR-375水平顯著升高（P<0.00）。這表明成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達miR-375的宮頸癌細胞模型，為后續(xù)研究miR-375對宮頸癌細胞泰素敏感性的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。3.3.2MTS法檢測藥物敏感性采用MTS法檢測不同miR-375表達水平的宮頸癌細胞對泰素藥物敏感性，以明確miR-375表達與泰素化療敏感性的關(guān)系。MTS法是一種基于細胞代謝活性的檢測方法，其原理是利用活細胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能夠?qū)TS試劑還原為水溶性的甲臜產(chǎn)物，該產(chǎn)物的生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過檢測甲臜產(chǎn)物的吸光度值，可間接反映細胞的增殖活性和存活情況。實驗步驟如下：將穩(wěn)定高表達miR-375的宮頸癌細胞（SiHa、Caski和HeLa細胞）以及轉(zhuǎn)染了陰性對照序列的宮頸癌細胞分別接種于96孔板中，每孔接種適量細胞，使細胞在培養(yǎng)過程中能夠正常生長且不會過度擁擠。設(shè)置不同的泰素給藥濃度梯度，分別為0、5、10、20、50、100nM。每個濃度設(shè)置多個復孔，以保證實驗結(jié)果的準確性和可靠性。將接種好細胞和加入泰素的96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)一定時間后，如48h，向每孔中加入MTS試劑，繼續(xù)孵育1-4h。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值。對實驗結(jié)果進行分析，計算細胞的抑制率。抑制率=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。根據(jù)抑制率繪制細胞生長抑制曲線，分析不同miR-375表達水平的宮頸癌細胞在不同泰素濃度下的生長抑制情況。通過計算半數(shù)抑制濃度（IC50）來評估細胞對泰素的敏感性，IC50值越低，表明細胞對泰素越敏感。結(jié)果顯示，miR-375穩(wěn)定高表達的宮頸癌SiHa、Caski和HeLa細胞的IC50分別為45.81±1.33nM、20.56±1.72nM和20.18±0.72nM；而對照組的IC50分別為8.54±1.52nM、7.98±2.60nM和13.28±0.52nM。統(tǒng)計學分析表明，隨著miR-375的表達量升高，宮頸癌細胞對Taxol的化療敏感性下降（P<0.05）。這充分說明miR-375表達水平的改變會顯著影響宮頸癌細胞對泰素的敏感性，高表達的miR-375會降低宮頸癌細胞對泰素化療的敏感性。四、miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的機制探究4.1miR-375的靶基因預測與驗證4.1.1靶基因預測軟件的應用在探索miR-375調(diào)節(jié)宮頸癌泰素敏感性的機制過程中，首先需要確定其作用的靶基因。運用生物信息學方法，借助專業(yè)的靶基因預測軟件，能夠從海量的基因數(shù)據(jù)中篩選出可能受miR-375調(diào)控的靶基因，為后續(xù)的實驗驗證提供重要線索。常用的靶基因預測軟件有多種，它們基于不同的算法和原理進行靶基因預測。TargetScan是一款廣泛應用的軟件，其核心算法基于miRNA種子序列與靶基因3'UTR的互補配對，以及結(jié)合位點在不同物種間的保守性。對于miR-375，在TargetScan數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為人，輸入miR-375的成熟序列，軟件會掃描人類基因組中所有基因的3'UTR區(qū)域，尋找與miR-375種子序列（通常指miR-375成熟序列的第2-8位核苷酸）互補配對的位點。若某基因3'UTR存在與miR-375種子序列高度互補且在多個物種中保守的位點，則該基因被預測為miR-375的潛在靶基因。例如，通過TargetScan預測，發(fā)現(xiàn)基因A的3'UTR存在一段與miR-375種子序列完全互補的區(qū)域，且該區(qū)域在靈長類動物中高度保守，提示基因A可能是miR-375的靶基因。miRanda也是常用的靶基因預測軟件之一，它除了考慮miRNA與靶基因3'UTR的序列互補性外，還結(jié)合了熱力學穩(wěn)定性，即計算miRNA-靶基因雙鏈形成的自由能。自由能越低，表明雙鏈結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，miRNA與靶基因結(jié)合的可能性越大。在使用miRanda預測miR-375的靶基因時，將miR-375的序列和人類基因組序列輸入軟件，軟件會對每個基因的3'UTR進行分析，計算miR-375與3'UTR結(jié)合的自由能。當自由能低于設(shè)定閾值時，對應的基因被認為是潛在靶基因。如預測結(jié)果顯示，基因B與miR-375結(jié)合的自由能為-25kcal/mol，低于軟件設(shè)定的-20kcal/mol閾值，因此基因B被預測為miR-375的潛在靶基因。為了提高預測的準確性，通常會綜合使用多個軟件。將TargetScan、miRanda等軟件的預測結(jié)果進行整合分析，篩選出在多個軟件中均被預測為miR-375靶基因的基因。這種多軟件交叉驗證的方法可以有效減少假陽性結(jié)果，提高預測的可靠性。通過對多個軟件預測結(jié)果的整合，最終確定了基因C、基因D等多個基因作為miR-375的潛在靶基因，為后續(xù)的實驗驗證提供了重要的候選基因。4.1.2雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C為了驗證通過生物信息學方法預測的miR-375與靶基因之間的靶向關(guān)系，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，該實驗能夠直觀、準確地檢測miR-375是否能夠直接結(jié)合到靶基因的3'UTR區(qū)域，從而調(diào)控其表達。實驗設(shè)計上，構(gòu)建雙熒光素酶報告基因載體是關(guān)鍵步驟。首先，從人類基因組DNA中擴增出預測靶基因的3'UTR序列，如擴增基因C的3'UTR序列。設(shè)計特異性引物，上游引物為5'-ATGCTAGCTACGATCGATCGATCG-3'，下游引物為5'-TACGATCGATCGATCGATCGATCG-3'，引物兩端添加了特定的酶切位點。利用PCR技術(shù)，以基因組DNA為模板進行擴增。PCR反應體系包括基因組DNA模板、上下游引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴增得到的3'UTR序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的條帶。將回收的3'UTR序列連接到雙熒光素酶報告基因載體中，如pGL3-control載體。該載體含有螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因，其中螢火蟲熒光素酶基因的表達受插入的3'UTR序列調(diào)控。使用限制性內(nèi)切酶對載體和3'UTR序列進行雙酶切，如使用XhoI和NotI酶切，酶切后的載體和3'UTR序列在T4DNA連接酶的作用下進行連接反應。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆。挑選單克隆菌落進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和測序驗證，確保3'UTR序列正確插入載體中。將構(gòu)建好的雙熒光素酶報告基因載體與miR-375模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細胞或其他合適的細胞系中。在轉(zhuǎn)染前，將293T細胞接種于24孔板中，每孔接種適量細胞，使其在轉(zhuǎn)染時處于對數(shù)生長期。轉(zhuǎn)染時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將載體質(zhì)粒、miR-375模擬物或陰性對照以及轉(zhuǎn)染試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復合物后加入到細胞培養(yǎng)液中。設(shè)置多個實驗組和對照組，包括轉(zhuǎn)染含野生型靶基因3'UTR載體與miR-375模擬物組、轉(zhuǎn)染含野生型靶基因3'UTR載體與陰性對照組、轉(zhuǎn)染含突變型靶基因3'UTR載體（突變掉miR-375結(jié)合位點）與miR-375模擬物組、轉(zhuǎn)染含突變型靶基因3'UTR載體與陰性對照組。培養(yǎng)一定時間后，如48h，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的操作步驟，檢測細胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。使用裂解液裂解細胞，釋放出熒光素酶。先加入螢火蟲熒光素酶底物，在酶標儀上檢測螢火蟲熒光素酶的活性，得到熒光值F。再加入海腎熒光素酶底物，檢測海腎熒光素酶的活性，得到熒光值R。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，校正轉(zhuǎn)染效率，計算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（F/R）。結(jié)果分析顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對照的細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-375模擬物和含野生型靶基因3'UTR載體的細胞中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低。如在實驗組中，F(xiàn)/R值為0.5，而對照組為1.0。這表明miR-375能夠與野生型靶基因3'UTR結(jié)合，抑制螢火蟲熒光素酶基因的表達，從而驗證了miR-375與該靶基因的靶向關(guān)系。而轉(zhuǎn)染含突變型靶基因3'UTR載體的細胞中，無論是否轉(zhuǎn)染miR-375模擬物，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值無明顯變化。如