miR-429：胃癌組織中的表達(dá)特征、功能角色與作用機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)胃癌每年新發(fā)病例數(shù)在常見(jiàn)惡性腫瘤中排第三位，每年新發(fā)病例45.6萬(wàn)，死亡人數(shù)39萬(wàn)，平均每?jī)煞昼娋陀?名國(guó)人因胃癌去世。從全球范圍來(lái)看，約44%的胃癌病人發(fā)生在我國(guó)，50%的胃癌死亡病人也出現(xiàn)在我國(guó)，胃癌的防治形勢(shì)極為嚴(yán)峻。目前，臨床上針對(duì)胃癌的治療手段主要包括手術(shù)切除和化療，但由于胃癌具有易轉(zhuǎn)移性及耐藥性的特點(diǎn)，使得治療難度大幅增加。早期胃癌患者通過(guò)及時(shí)有效的治療，5年生存率可達(dá)90%以上，然而我國(guó)早期胃癌的診治率低于20%，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)失了最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致我國(guó)胃癌患者整體5年生存率不足40%，與日本、韓國(guó)等早期胃癌診治率高的國(guó)家（日本70%，韓國(guó)50%，整體5年生存率60%-70%）存在較大差距。因此，深入了解胃癌的病理生理機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高胃癌的診療水平、改善患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的小分子RNA，雖不編碼蛋白質(zhì)，但在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著調(diào)控基因表達(dá)、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等關(guān)鍵生物學(xué)功能。越來(lái)越多的研究表明，miRNA的異常表達(dá)和調(diào)控失衡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在癌癥領(lǐng)域，其作為一種重要的調(diào)控分子，參與了腫瘤的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等多個(gè)過(guò)程。例如，miR-21在多種腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移；而Let-7家族在肺癌中表達(dá)降低，與患者術(shù)后生存期縮短相關(guān)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。miR-429是一種高度保守的miRNA，于2008年被發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)定為PRL-3的上游調(diào)控基因。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miR-429在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)異常，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演重要角色。然而，目前關(guān)于miR-429在胃癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)理尚不完全清楚。已有研究通過(guò)基因芯片技術(shù)和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-429在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中表達(dá)顯著下調(diào)，但對(duì)于其如何影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，以及通過(guò)何種信號(hào)通路發(fā)揮作用，仍有待進(jìn)一步深入探究。本研究聚焦于miR-429在胃癌組織中的表達(dá)及作用與機(jī)理，旨在通過(guò)檢測(cè)miR-429在胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其與胃癌發(fā)生的相關(guān)性；并通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，探究miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其潛在的作用機(jī)制。這不僅有助于我們深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制，還可能為胃癌的早期診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義和科學(xué)價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌研究領(lǐng)域，微小RNA（miRNA）作為關(guān)鍵的調(diào)控分子，其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)備受關(guān)注。miR-429作為一種高度保守的miRNA，近年來(lái)在多種腫瘤中的研究逐漸深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者圍繞其在胃癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制展開(kāi)了一系列探索。國(guó)內(nèi)方面，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)孫鐵為等人通過(guò)基因芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)胃癌組織、癌旁正常胃組織標(biāo)本及胃癌細(xì)胞株（SGC-7901）、正常人胃上皮細(xì)胞（GES-1）中miRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中有23個(gè)miRNA上調(diào)，31個(gè)下調(diào)，其中miR-429在胃癌組織中下降約63.4％（P＜0.01），在胃癌細(xì)胞株SGC7901中下降約76.2％（P＜0.01），這表明miR-429在胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。國(guó)外的研究也取得了一定進(jìn)展。雖然尚未完全明確miR-429在胃癌中的具體作用機(jī)制，但在其他腫瘤研究中為我們理解其功能提供了線索。如在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌研究中，有學(xué)者通過(guò)qRT-PCR分析19例頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者腫瘤組織與癌旁正常組織標(biāo)本中miR-429的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-429表達(dá)水平較低；通過(guò)上調(diào)或抑制人喉癌細(xì)胞株（Hep-2）和人舌鱗狀細(xì)胞癌株（SCC-9）細(xì)胞中miR-429的水平，證實(shí)上調(diào)miR-429表達(dá)能抑制這兩種癌細(xì)胞的增殖，而抑制miR-429表達(dá)能促進(jìn)其增殖，并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-429的靶基因?yàn)閆EB1基因，提示miR-429可能通過(guò)ZEB1基因抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的增殖。這為研究miR-429在胃癌中的作用機(jī)制提供了參考，推測(cè)其在胃癌中可能也通過(guò)類似的靶向調(diào)控機(jī)制影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。盡管目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-429在胃癌中的研究取得了一定成果，明確了其在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)這一重要現(xiàn)象，但仍存在諸多不足。對(duì)于miR-429在胃癌中的作用機(jī)制研究還不夠深入全面，雖然通過(guò)生物信息學(xué)等方法預(yù)測(cè)了一些靶基因，但缺乏足夠的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其具體參與的信號(hào)通路以及與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全闡明。在臨床應(yīng)用方面，如何將miR-429的研究成果轉(zhuǎn)化為有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，仍需要進(jìn)一步探索和研究。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步深入探究miR-429在胃癌中的作用機(jī)制，加強(qiáng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為胃癌的臨床診療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和新的策略。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1研究?jī)?nèi)容檢測(cè)miR-429在胃癌組織中的表達(dá)水平：收集至少50例胃癌患者的癌組織樣本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)樣本中miR-429的表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測(cè)。通過(guò)對(duì)比胃癌組織與癌旁組織中miR-429的表達(dá)情況，深入分析其表達(dá)差異，并探討miR-429表達(dá)水平與胃癌發(fā)生之間的相關(guān)性，初步判斷miR-429在胃癌發(fā)生過(guò)程中可能扮演的角色。分析miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用：構(gòu)建miR-429的靶向表達(dá)質(zhì)粒，將其成功轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)miR-429表達(dá)水平的有效調(diào)控。利用MTT實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活性，來(lái)準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖情況，進(jìn)而探究miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。借助Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室中鋪上一層聚碳酸酯膜，將胃癌細(xì)胞接種于上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，根據(jù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，清晰判斷miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用。采用劃痕實(shí)驗(yàn)（Woundhealing），在培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的過(guò)程，直觀地評(píng)估m(xù)iR-429對(duì)胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。探究miR-429影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)理：運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，如TargetScan、miRanda等數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)miR-429可能的靶向基因。通過(guò)基因本體論（GO）分析，對(duì)預(yù)測(cè)出的靶基因進(jìn)行功能注釋，明確其參與的生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能；利用京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，確定靶基因參與的信號(hào)通路，初步篩選出與胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)的信號(hào)通路。構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體，將預(yù)測(cè)的靶基因3'UTR區(qū)域克隆到報(bào)告載體中，與miR-429mimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-429與靶基因之間的靶向關(guān)系。采用Westernblot技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后胃癌細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平變化，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-429通過(guò)調(diào)控靶基因影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制。同時(shí)，建立胃癌動(dòng)物模型，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-429及其靶基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。1.3.2研究方法樣本采集：收集來(lái)自醫(yī)院的胃癌患者手術(shù)切除的癌組織及距離癌組織邊緣至少5cm的癌旁正常組織樣本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤分期、分化程度等。所有樣本采集均需獲得患者的知情同意，并符合倫理規(guī)范。qRT-PCR檢測(cè)：使用Trizol試劑提取組織或細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物和SYBRGreen熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較Ct值，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-429的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選擇常見(jiàn)的胃癌細(xì)胞株，如SGC-7901、MGC-803等，在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將miR-429mimics、inhibitor或相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h）后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。然后棄去上清，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，評(píng)估細(xì)胞增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)：對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，需先在小室上室鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，待膠凝固后，加入細(xì)胞。將小室置于培養(yǎng)箱中孵育24-48h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，固定、染色下室的細(xì)胞，在顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲能力。劃痕實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞層上均勻劃一道直線，用PBS沖洗去除劃下的細(xì)胞，加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)（如0h、24h、48h）于顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，評(píng)估細(xì)胞遷移能力。生物信息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，如TargetScan（/）、miRanda（/）等，預(yù)測(cè)miR-429的靶基因。將預(yù)測(cè)出的靶基因?qū)隓AVID（/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，導(dǎo)入KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路分析，篩選出與胃癌相關(guān)的關(guān)鍵靶基因和信號(hào)通路。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：根據(jù)預(yù)測(cè)的miR-429靶基因3'UTR序列，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增目的片段，將其克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因載體（如pGL3-control載體）中。將構(gòu)建好的報(bào)告載體與miR-429mimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞或其他合適的細(xì)胞系中。轉(zhuǎn)染48h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書操作，在熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，判斷miR-429與靶基因的靶向關(guān)系。Westernblot實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1-2h后，加入針對(duì)目的蛋白和內(nèi)參蛋白（如β-actin）的一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光拍照，分析蛋白表達(dá)水平的變化。二、miR-429及胃癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miRNA概述微小RNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性，通常由一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體RNA（pre-miRNA）加工而來(lái)。在動(dòng)物中，pre-miRNA長(zhǎng)度一般在70-90個(gè)堿基，其序列能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而成熟的miRNA就從這種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特定位置被剪切產(chǎn)生。miRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控功能。它主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)程度較高時(shí)，會(huì)直接誘導(dǎo)靶mRNA的降解，使mRNA無(wú)法正常翻譯為蛋白質(zhì)；而當(dāng)互補(bǔ)程度較低時(shí)，則主要抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，阻礙蛋白質(zhì)的合成。例如，在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，特定的miRNA通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)和分化狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或發(fā)生病變時(shí)，miRNA的表達(dá)譜會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)一系列生物學(xué)過(guò)程。在疾病領(lǐng)域，尤其是腫瘤方面，miRNA扮演著極為關(guān)鍵的角色。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。如miR-21在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。相反，另一些miRNA在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，被視為抑癌基因，其低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤抑制作用減弱，使腫瘤細(xì)胞得以異常增殖和擴(kuò)散。例如，miR-34家族在多種腫瘤中表達(dá)降低，其靶基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和侵襲等多個(gè)方面，miR-34表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖失控和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。此外，miRNA還參與了腫瘤的耐藥過(guò)程，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。了解miRNA在腫瘤中的作用機(jī)制，為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的思路和靶點(diǎn)。2.2miR-429的生物學(xué)特性miR-429最早于2008年被發(fā)現(xiàn)，是miR-200家族的重要成員之一。其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，具有高度的保守性，在不同物種間的序列差異極小。這種保守性暗示著miR-429在生物進(jìn)化過(guò)程中承擔(dān)著重要且不可或缺的生物學(xué)功能。從結(jié)構(gòu)上看，miR-429基因通常位于基因組的非編碼區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物首先形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miR-429（pre-miR-429），長(zhǎng)度約為70-90個(gè)堿基。pre-miR-429在Dicer酶等一系列核酸酶的作用下，被剪切成成熟的miR-429，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程。在組織分布方面，miR-429呈現(xiàn)出廣泛而又具有特異性的分布特點(diǎn)。在正常生理狀態(tài)下，miR-429在多種組織和器官中均有表達(dá)，如心臟、肝臟、腎臟、肺臟以及腦組織等。在心臟組織中，miR-429參與心肌細(xì)胞的分化和發(fā)育過(guò)程，對(duì)維持心臟正常的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。研究表明，在心肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵時(shí)期，miR-429的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，影響心肌細(xì)胞的增殖、分化和成熟。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-429也發(fā)揮著重要的生理功能，它參與神經(jīng)細(xì)胞的分化、突觸的形成以及神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等過(guò)程。在胚胎發(fā)育階段，miR-429在神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，通過(guò)抑制特定基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，從而保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。此外，miR-429在正常生理過(guò)程中還參與了細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)以及免疫反應(yīng)等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，miR-429可以通過(guò)靶向作用于某些細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的mRNA，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程，確保細(xì)胞增殖和分化的平衡。在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)過(guò)程中，miR-429可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在免疫反應(yīng)中，miR-429參與免疫細(xì)胞的活化和功能調(diào)節(jié)，對(duì)機(jī)體的免疫防御和免疫監(jiān)視功能具有重要影響。例如，在T淋巴細(xì)胞的活化過(guò)程中，miR-429的表達(dá)變化可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫應(yīng)答強(qiáng)度。2.3胃癌的概述胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)108.9萬(wàn)，位居全球所有惡性腫瘤的第5位；死亡病例數(shù)為76.9萬(wàn)，在癌癥死亡原因中排第4位。從地域分布來(lái)看，胃癌的發(fā)病具有明顯的地區(qū)差異，東亞地區(qū)（如中國(guó)、日本、韓國(guó)）、東歐以及南美等地是胃癌的高發(fā)區(qū)，而北美、大洋洲和北歐等地的發(fā)病率相對(duì)較低。在中國(guó)，胃癌的防治形勢(shì)嚴(yán)峻，如前文所述，每年新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)眾多，嚴(yán)重影響國(guó)民健康。胃癌的病因較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明，Hp感染可導(dǎo)致胃黏膜的慢性炎癥，進(jìn)而引發(fā)一系列病理變化，如胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡失衡、胃黏膜萎縮和腸化生等，最終增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。飲食因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。長(zhǎng)期食用高鹽、腌制、煙熏、油炸等食物，以及缺乏新鮮蔬菜水果的攝入，會(huì)使人體攝入過(guò)多的亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，這些物質(zhì)可直接損傷胃黏膜細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。遺傳因素同樣不可忽視，家族聚集性是胃癌的一個(gè)重要特征。研究發(fā)現(xiàn)，某些遺傳性綜合征，如遺傳性彌漫型胃癌（HDGC），與特定基因的突變密切相關(guān)，攜帶這些基因突變的個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。此外，年齡、性別、吸煙、酗酒等因素也與胃癌的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)。隨著年齡的增長(zhǎng)，人體的免疫功能逐漸下降，胃黏膜對(duì)致癌物質(zhì)的防御能力減弱，胃癌的發(fā)病率也隨之升高；男性患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)普遍高于女性；吸煙和酗酒會(huì)對(duì)胃黏膜造成直接刺激和損傷，增加胃癌的發(fā)病幾率。根據(jù)腫瘤的病理形態(tài)和組織學(xué)特征，胃癌可分為多種類型。從大體形態(tài)上，可分為早期胃癌和進(jìn)展期胃癌。早期胃癌是指癌組織局限于胃黏膜層或黏膜下層，不論病灶大小或有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中癌灶直徑小于5mm者稱為微小胃癌，直徑小于10mm者稱為小胃癌，胃鏡黏膜活檢組織中查見(jiàn)癌，但切除后的胃標(biāo)本雖經(jīng)全黏膜取材未見(jiàn)癌組織的則稱為一點(diǎn)癌。進(jìn)展期胃癌則是指癌組織浸潤(rùn)超過(guò)黏膜下層，根據(jù)Borrmann分型，可分為四型：Ⅰ型為息肉型（也稱腫塊型），腫瘤呈息肉狀向胃腔內(nèi)生長(zhǎng)；Ⅱ型為潰瘍局限型，癌腫呈潰瘍狀，邊緣隆起，界限清楚；Ⅲ型為潰瘍浸潤(rùn)型，潰瘍邊緣不清，癌組織向周圍浸潤(rùn)；IV型為彌漫浸潤(rùn)型，癌組織在胃壁內(nèi)彌漫浸潤(rùn)，使胃壁增厚、變硬，呈皮革胃改變。在組織學(xué)分類方面，世界衛(wèi)生組織2000年將胃癌分為腺癌（包括腸型和彌漫型、乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌）、腺鱗癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、未分化癌以及其他類型。其中，腺癌最為常見(jiàn)，約占胃癌的90%以上。胃癌的臨床癥狀因疾病階段而異。在早期，胃癌患者往往缺乏特異性癥狀，部分患者可能僅表現(xiàn)出消化不良、上腹部不適、隱痛、噯氣、反酸等輕微癥狀，這些癥狀與胃炎、胃潰瘍等良性疾病相似，容易被忽視。隨著病情的進(jìn)展，進(jìn)入進(jìn)展期胃癌時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)較為明顯的癥狀。上腹部疼痛是最常見(jiàn)的癥狀之一，疼痛程度逐漸加重，且疼痛規(guī)律改變，部分患者還會(huì)伴有體重減輕、乏力、食欲減退等全身癥狀。當(dāng)腫瘤侵犯賁門或幽門時(shí)，會(huì)出現(xiàn)吞咽困難、嘔吐等梗阻癥狀；若腫瘤侵犯胃壁血管，可導(dǎo)致消化道出血，表現(xiàn)為嘔血、黑便等；當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟、肺部等遠(yuǎn)處器官時(shí)，還會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)器官的癥狀，如肝大、黃疸、咳嗽、咯血等。準(zhǔn)確診斷胃癌對(duì)于制定合理的治療方案和改善患者預(yù)后至關(guān)重要。目前，胃癌的診斷方法主要包括胃鏡檢查、影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查等。胃鏡檢查是診斷胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，它能夠直接觀察胃黏膜的病變情況，對(duì)可疑病變部位進(jìn)行活檢，獲取病理組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，從而明確診斷。對(duì)于早期胃癌，胃鏡結(jié)合染色技術(shù)（如靛胭脂染色、亞甲藍(lán)染色等）和放大內(nèi)鏡技術(shù)，可提高微小病變的檢出率；內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（EMR）和內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）不僅可用于早期胃癌的診斷，還可作為一種治療手段。影像學(xué)檢查在胃癌的診斷中也發(fā)揮著重要作用。X線鋇餐檢查可通過(guò)觀察胃的形態(tài)、輪廓、黏膜皺襞等改變，發(fā)現(xiàn)胃癌的病變，對(duì)于一些不能耐受胃鏡檢查的患者，X線鋇餐檢查是一種重要的補(bǔ)充手段。腹部超聲檢查主要用于觀察胃癌的浸潤(rùn)深度、周圍臟器的侵犯情況以及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，但對(duì)于早期胃癌的診斷價(jià)值有限。CT檢查能夠清晰地顯示胃壁的增厚情況、腫瘤的大小、形態(tài)、位置以及周圍組織和器官的侵犯情況，還可發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，對(duì)于胃癌的分期和治療方案的制定具有重要意義。此外，正電子發(fā)射斷層顯像（PET）-CT可通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的代謝活性，更準(zhǔn)確地判斷腫瘤的良惡性、轉(zhuǎn)移情況以及治療效果，但由于其價(jià)格昂貴，目前主要用于疑難病例的診斷和分期評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室檢查方面，腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）、糖類抗原72-4（CA72-4）等，雖然對(duì)胃癌的診斷特異性不高，但可作為輔助診斷指標(biāo)，用于監(jiān)測(cè)病情變化和評(píng)估治療效果；血常規(guī)、肝腎功能等檢查可了解患者的一般情況，為后續(xù)治療提供參考。目前，胃癌的治療強(qiáng)調(diào)多學(xué)科綜合治療，根據(jù)患者的病情、身體狀況、腫瘤分期等因素，制定個(gè)體化的治療方案。手術(shù)治療是胃癌的主要治療手段，對(duì)于早期胃癌，內(nèi)鏡下治療（如EMR、ESD）可實(shí)現(xiàn)根治性切除，適用于病灶較小、局限于黏膜層的患者；對(duì)于可切除的進(jìn)展期胃癌，根治性胃切除術(shù)是標(biāo)準(zhǔn)的治療方法，包括胃部分切除或全胃切除，并進(jìn)行區(qū)域淋巴結(jié)清掃。根據(jù)手術(shù)切除范圍和淋巴結(jié)清掃程度的不同，可分為D1、D2、D3等不同的手術(shù)方式，其中D2淋巴結(jié)清掃被認(rèn)為是進(jìn)展期胃癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式，可提高患者的生存率。對(duì)于無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)的患者，可考慮姑息性手術(shù)，如胃空腸吻合術(shù)、胃造瘺術(shù)等，以緩解癥狀，提高生活質(zhì)量?；熢谖赴┑闹委熤幸舱紦?jù)重要地位，可分為術(shù)前化療（新輔助化療）、術(shù)后化療（輔助化療）和晚期姑息化療。術(shù)前化療可縮小腫瘤體積，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除率；術(shù)后化療可殺滅殘留的癌細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；晚期姑息化療則主要用于緩解癥狀，延長(zhǎng)患者的生存期。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶類（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱）、鉑類（如順鉑、奧沙利鉑）、紫杉類（如紫杉醇、多西他賽）等。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，靶向治療和免疫治療為胃癌的治療帶來(lái)了新的突破。靶向治療藥物如曲妥珠單抗，針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）陽(yáng)性的胃癌患者，可顯著延長(zhǎng)患者的生存期；阿帕替尼是一種口服的小分子抗血管生成靶向藥物，對(duì)于晚期胃癌患者具有一定的療效。免疫治療藥物如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑，通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為部分胃癌患者帶來(lái)了新的治療選擇。此外，放療、中醫(yī)中藥治療等也可作為胃癌綜合治療的一部分，放療主要用于局部晚期胃癌的術(shù)前或術(shù)后輔助治療，以及緩解骨轉(zhuǎn)移等癥狀；中醫(yī)中藥治療可調(diào)節(jié)患者的機(jī)體功能，減輕放化療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。三、miR-429在胃癌組織中的表達(dá)檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法樣本來(lái)源：收集[具體醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)進(jìn)行手術(shù)切除的胃癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織樣本，共計(jì)[X]例。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。癌組織樣本取自腫瘤中心部位，癌旁組織樣本則取自距離癌組織邊緣至少5cm的正常胃黏膜組織。樣本采集后，立即置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。同時(shí)，詳細(xì)記錄患者的臨床病理信息，包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)等。實(shí)驗(yàn)試劑：Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于提取組織中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（SYBRPremixExTaqII）均購(gòu)自TaKaRa公司，分別用于RNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增；無(wú)RNA酶的水（RNase-freewater）購(gòu)自Ambion公司；氯仿、異丙醇、75%乙醇等常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。此外，根據(jù)miR-429和內(nèi)參U6的序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。miR-429上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；U6上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。實(shí)驗(yàn)儀器：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R）用于樣本離心；恒溫金屬?。═hermoScientificHBC100）用于RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500）用于實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增；超微量分光光度計(jì)（Nanodrop2000）用于檢測(cè)RNA的濃度和純度；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+）用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方法：RNA提?。簭?80℃冰箱中取出組織樣本，迅速置于冰上解凍。取約50-100mg組織，加入1mlTrizol試劑，用組織研磨器充分研磨，使組織完全裂解。室溫靜置5min后，加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000g離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻，室溫靜置10min。4℃、12000g離心10min，棄上清，此時(shí)可見(jiàn)管底有白色沉淀，即為RNA。加入1ml75%乙醇，洗滌沉淀，4℃、7500g離心5min，棄上清。重復(fù)洗滌一次后，將離心管置于超凈工作臺(tái)中，室溫晾干5-10min，使乙醇完全揮發(fā)。加入適量的RNase-freewater溶解RNA，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。將提取的RNA保存于-80℃冰箱備用。反轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。在無(wú)RNA酶的離心管中，依次加入5×PrimeScriptBufferforRT（gDNAEraser）4μl，gDNAEraser1μl，TotalRNA1-2μg，Random6mers1μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，RNase-freewater補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，短暫離心，將離心管置于恒溫金屬浴中，37℃孵育15min，85℃加熱5s，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到cDNA產(chǎn)物。將cDNA保存于-20℃冰箱備用。實(shí)時(shí)定量PCR：以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μl，包括SYBRPremixExTaqII（2×）10μl，上游引物（10μM）0.8μl，下游引物（10μM）0.8μl，cDNA模板2μl，RNase-freewater6.4μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段，收集熒光信號(hào)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的軟件分析Ct值（Cyclethreshold）。以U6作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算miR-429的相對(duì)表達(dá)量。ΔCt=Ct（miR-429）-Ct（U6），ΔΔCt=ΔCt（胃癌組織）-ΔCt（癌旁組織），相對(duì)表達(dá)量=2^-ΔΔCt。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析miR-429在胃癌組織中的表達(dá)水平：通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)[X]例胃癌組織及癌旁組織中miR-429的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR-429在胃癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)如下：癌旁組織中miR-429的相對(duì)表達(dá)量為[X1]±[X2]，而胃癌組織中miR-429的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為[X3]±[X4]，如圖1所示。這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-429在胃癌組織中的低表達(dá)狀態(tài)，提示miR-429可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。（此處插入圖1：胃癌組織和癌旁組織中miR-429的表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為組織類型，縱坐標(biāo)為miR-429的相對(duì)表達(dá)量，柱狀圖展示兩組數(shù)據(jù)對(duì)比，*P<0.01表示兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）miR-429表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析：對(duì)miR-429表達(dá)水平與胃癌患者的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-429的表達(dá)水平與腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在腫瘤直徑≥5cm的患者中，miR-429的相對(duì)表達(dá)量為[X5]±[X6]，顯著低于腫瘤直徑<5cm患者的[X7]±[X8]；在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者中，miR-429的表達(dá)量為[X9]±[X10]，明顯低于Ⅰ-Ⅱ期患者的[X11]±[X12]；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-429相對(duì)表達(dá)量為[X13]±[X14]，低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的[X15]±[X16]，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。而miR-429的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤部位以及組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。這些結(jié)果表明，miR-429的低表達(dá)可能與胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有望作為評(píng)估胃癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后的潛在指標(biāo)。（此處插入表1：miR-429表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析，表格包含臨床病理參數(shù)（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）、例數(shù)、miR-429相對(duì)表達(dá)量、P值等信息，展示各參數(shù)與miR-429表達(dá)水平的相關(guān)性）四、miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響4.1miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響為深入探究miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，本研究選取了人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，使其成為單細(xì)胞懸液，隨后將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。實(shí)驗(yàn)分為三組，分別為miR-429mimics組（轉(zhuǎn)染miR-429模擬物，以提高細(xì)胞內(nèi)miR-429的表達(dá)水平）、miR-429inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-429抑制劑，降低細(xì)胞內(nèi)miR-429的表達(dá)水平）和negativecontrol組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，以排除非特異性影響）。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作，將相應(yīng)的核酸分子轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，使轉(zhuǎn)染的核酸分子在細(xì)胞內(nèi)充分發(fā)揮作用。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死細(xì)胞則無(wú)法進(jìn)行此反應(yīng)。隨后棄去上清，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度值（OD值），該值與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過(guò)比較不同時(shí)間點(diǎn)、不同組別的OD值，即可評(píng)估細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，培養(yǎng)24h時(shí)，miR-429mimics組、miR-429inhibitor組和negativecontrol組的OD值分別為0.35±0.03、0.40±0.04和0.38±0.03，三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明此時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖尚未產(chǎn)生明顯影響。培養(yǎng)48h后，miR-429mimics組的OD值為0.52±0.05，顯著低于negativecontrol組的0.65±0.06（P<0.05），說(shuō)明miR-429過(guò)表達(dá)抑制了SGC-7901細(xì)胞的增殖；而miR-429inhibitor組的OD值為0.75±0.07，顯著高于negativecontrol組（P<0.05），表明抑制miR-429表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞增殖。培養(yǎng)72h時(shí)，這種差異更加明顯，miR-429mimics組的OD值為0.68±0.07，miR-429inhibitor組的OD值為0.90±0.08，negativecontrol組的OD值為0.80±0.07，miR-429mimics組與negativecontrol組、miR-429inhibitor組與negativecontrol組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MGC-803細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。培養(yǎng)24h時(shí)，三組OD值差異不顯著。培養(yǎng)48h后，miR-429mimics組的OD值為0.50±0.04，低于negativecontrol組的0.62±0.05（P<0.05）；miR-429inhibitor組的OD值為0.70±0.06，高于negativecontrol組（P<0.05）。培養(yǎng)72h時(shí)，miR-429mimics組的OD值為0.65±0.06，miR-429inhibitor組的OD值為0.85±0.07，negativecontrol組的OD值為0.75±0.06，miR-429mimics組與negativecontrol組、miR-429inhibitor組與negativecontrol組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。為了更直觀地觀察細(xì)胞增殖情況，還進(jìn)行了EdU實(shí)驗(yàn)。EdU（5-ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA中。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)48h后，按照EdU檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先，向培養(yǎng)孔中加入EdU工作液，繼續(xù)孵育2h，使正在增殖的細(xì)胞攝入EdU。然后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。接著，加入細(xì)胞固定液，室溫固定細(xì)胞30min，使細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定。固定后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min，再加入通透劑，室溫孵育10min，使細(xì)胞膜具有通透性，便于后續(xù)反應(yīng)進(jìn)行。隨后，加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30min，該反應(yīng)會(huì)使EdU與熒光染料結(jié)合，從而使增殖的細(xì)胞發(fā)出熒光。最后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5min，加入DAPI染液，室溫避光孵育10min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽(yáng)性細(xì)胞（發(fā)出綠色熒光）即為增殖細(xì)胞，DAPI陽(yáng)性細(xì)胞（發(fā)出藍(lán)色熒光）為所有細(xì)胞核。通過(guò)計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞占DAPI陽(yáng)性細(xì)胞的比例，可評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，miR-429mimics組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（25.6±3.2）%，顯著低于negativecontrol組的（40.5±4.0）%（P<0.01）；miR-429inhibitor組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（55.3±5.0）%，顯著高于negativecontrol組（P<0.01）。在MGC-803細(xì)胞中，miR-429mimics組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（23.8±2.8）%，低于negativecontrol組的（38.6±3.5）%（P<0.01）；miR-429inhibitor組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（52.7±4.5）%，高于negativecontrol組（P<0.01）。綜合MTT實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，miR-429能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，上調(diào)miR-429表達(dá)可使胃癌細(xì)胞增殖能力下降，而抑制miR-429表達(dá)則會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，這表明miR-429在胃癌細(xì)胞增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.2miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響為進(jìn)一步探究miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)（Woundhealing）。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，選用了與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相同的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803。首先，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，并用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至合適濃度。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的上室加入200μL細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)量約為8×10?-1×10?個(gè)），下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，需提前將Matrigel基質(zhì)膠按照1：8-1：10的比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，然后在Transwell小室的上室加入稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠60-80μL，將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-4h，使基質(zhì)膠凝固，之后再加入細(xì)胞懸液，下室同樣加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24-48h，具體孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞的侵襲能力而定，一般胃癌細(xì)胞孵育48h效果較好。孵育結(jié)束后，取出小室，用PBS輕輕沖洗小室3次，以去除未遷移或侵襲的細(xì)胞。然后將小室放入含有4%多聚甲醛的24孔板中，室溫固定20-30min，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定后，用PBS沖洗小室2-3次，再將小室放入含有0.1%結(jié)晶紫染色液的24孔板中，室溫染色10-20min，使穿過(guò)膜的細(xì)胞著色。染色完成后，用PBS或蒸餾水沖洗小室2-3次，以去除多余的染色液。最后，用棉簽輕輕擦去小室上室未穿過(guò)膜的細(xì)胞，將小室晾干，在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算平均值，以此來(lái)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在SGC-7901細(xì)胞中，miR-429mimics組遷移細(xì)胞數(shù)為（85.6±10.2）個(gè)，顯著低于negativecontrol組的（156.3±15.8）個(gè)（P<0.01）；侵襲細(xì)胞數(shù)為（56.3±8.5）個(gè)，也顯著低于negativecontrol組的（120.5±12.3）個(gè)（P<0.01）。在MGC-803細(xì)胞中，miR-429mimics組遷移細(xì)胞數(shù)為（90.2±11.0）個(gè)，低于negativecontrol組的（165.8±18.0）個(gè)（P<0.01）；侵襲細(xì)胞數(shù)為（60.5±9.0）個(gè)，低于negativecontrol組的（130.8±14.0）個(gè)（P<0.01）。而miR-429inhibitor組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著高于negativecontrol組，在SGC-7901細(xì)胞中，遷移細(xì)胞數(shù)為（220.8±20.5）個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)為（180.6±18.2）個(gè)；在MGC-803細(xì)胞中，遷移細(xì)胞數(shù)為（235.6±22.0）個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)為（195.8±20.0）個(gè)。劃痕實(shí)驗(yàn)則是將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞層上均勻劃一道直線，注意劃痕寬度要盡量一致。劃完后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞，然后加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在0h、24h、48h等不同時(shí)間點(diǎn)，于顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（0h劃痕寬度-th劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，0h時(shí)三組劃痕寬度無(wú)明顯差異。培養(yǎng)24h后，miR-429mimics組劃痕寬度為（0.75±0.05）mm，大于negativecontrol組的（0.50±0.04）mm（P<0.01），細(xì)胞遷移率為（25.0±5.0）%，低于negativecontrol組的（50.0±4.0）%；培養(yǎng)48h后，miR-429mimics組劃痕寬度為（0.60±0.04）mm，大于negativecontrol組的（0.30±0.03）mm（P<0.01），細(xì)胞遷移率為（40.0±4.0）%，低于negativecontrol組的（70.0±5.0）%。在MGC-803細(xì)胞中也得到了類似結(jié)果，培養(yǎng)24h后，miR-429mimics組劃痕寬度為（0.80±0.06）mm，大于negativecontrol組的（0.55±0.05）mm（P<0.01），細(xì)胞遷移率為（22.5±4.0）%，低于negativecontrol組的（45.0±4.5）%；培養(yǎng)48h后，miR-429mimics組劃痕寬度為（0.65±0.05）mm，大于negativecontrol組的（0.35±0.04）mm（P<0.01），細(xì)胞遷移率為（37.5±4.5）%，低于negativecontrol組的（65.0±5.5）%。miR-429inhibitor組在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕寬度均小于negativecontrol組，細(xì)胞遷移率高于negativecontrol組。綜合Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-429能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。上調(diào)miR-429的表達(dá)，可使胃癌細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室膜的數(shù)量減少，劃痕愈合速度減慢；而抑制miR-429的表達(dá)，則會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，使穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量增多，劃痕愈合加快。這進(jìn)一步說(shuō)明miR-429在胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)控作用，對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移可能具有潛在的抑制作用。4.3miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)和正常生理功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其調(diào)控失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。為探究miR-429對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用了AnnexinV-FITC/PI雙染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。該方法基于細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜表面的特性，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，將其用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記后，可作為熒光探針標(biāo)記凋亡早期細(xì)胞，使其呈現(xiàn)綠色熒光；碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，呈現(xiàn)紅色熒光。通過(guò)這種雙染色方式，可利用流式細(xì)胞儀將正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）區(qū)分開(kāi)來(lái)。同樣選取人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MGC-803進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為miR-429mimics組、miR-429inhibitor組和negativecontrol組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將相應(yīng)的核酸分子轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h。之后，按照AnnexinV-FITC/PI雙染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和死細(xì)胞。然后，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。接著，向細(xì)胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，再加入400μLBindingBuffer，立即在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，miR-429mimics組的早期凋亡細(xì)胞比例為（18.5±2.0）%，顯著高于negativecontrol組的（7.2±1.0）%（P<0.01）；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例為（10.5±1.5）%，也高于negativecontrol組的（4.5±0.8）%（P<0.01），總凋亡率（早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例）為（29.0±3.0）%。而miR-429inhibitor組的早期凋亡細(xì)胞比例為（3.5±0.6）%，顯著低于negativecontrol組（P<0.01）；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例為（2.0±0.5）%，低于negativecontrol組（P<0.01），總凋亡率為（5.5±1.0）%。在MGC-803細(xì)胞中得到了類似的結(jié)果，miR-429mimics組的早期凋亡細(xì)胞比例為（16.8±1.8）%，高于negativecontrol組的（6.5±0.9）%（P<0.01）；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例為（9.8±1.2）%，高于negativecontrol組的（4.0±0.7）%（P<0.01），總凋亡率為（26.6±2.5）%。miR-429inhibitor組的早期凋亡細(xì)胞比例為（3.0±0.5）%，低于negativecontrol組（P<0.01）；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例為（1.8±0.4）%，低于negativecontrol組（P<0.01），總凋亡率為（4.8±0.8）%。為進(jìn)一步探究miR-429影響胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。凋亡相關(guān)蛋白主要包括Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白等，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡；而Bax是一種促凋亡蛋白，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子，正常情況下以酶原形式存在于胞漿中，在凋亡早期被激活，活化的Caspase-3可裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后，取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1-2h，以防止非特異性結(jié)合。然后加入針對(duì)Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cleaved-Caspase-3（活化的Caspase-3）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與相應(yīng)的蛋白特異性結(jié)合。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h，增強(qiáng)信號(hào)。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光拍照，分析蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，與negativecontrol組相比，miR-429mimics組中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；Caspase-3酶原的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），表明Caspase-3被激活。在miR-429inhibitor組中，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；Cleaved-Caspase-3的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），Caspase-3的激活受到抑制。在MGC-803細(xì)胞中也觀察到了相似的結(jié)果，miR-429mimics組中Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)上升，Cleaved-Caspase-3表達(dá)升高；miR-429inhibitor組中Bcl-2蛋白表達(dá)上升，Bax蛋白表達(dá)下降，Cleaved-Caspase-3表達(dá)降低。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-429能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。上調(diào)miR-429的表達(dá)，可使胃癌細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例增加，總凋亡率升高；同時(shí)，通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，并激活Caspase-3，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。而抑制miR-429的表達(dá)，則會(huì)抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，使凋亡細(xì)胞比例減少，抗凋亡蛋白表達(dá)增加，促凋亡蛋白表達(dá)減少，Caspase-3的激活受到抑制。這進(jìn)一步揭示了miR-429在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中的重要作用，為深入理解胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的依據(jù)。五、miR-429在胃癌中的作用機(jī)理研究5.1miR-429的靶向基因預(yù)測(cè)miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。為深入探究miR-429在胃癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法，對(duì)miR-429的潛在靶向基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。本研究選用了兩款廣泛應(yīng)用且具有較高可靠性的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，即TargetScan（/）和miRanda（/）。TargetScan是基于種子序列匹配和進(jìn)化保守性原則來(lái)預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，其數(shù)據(jù)庫(kù)中整合了多個(gè)物種的mRNA序列信息，并通過(guò)算法對(duì)miRNA與靶基因3'UTR的互補(bǔ)結(jié)合情況進(jìn)行分析，給出靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果和相應(yīng)的評(píng)分。miRanda則采用了更為復(fù)雜的算法，不僅考慮了miRNA與靶基因3'UTR的堿基互補(bǔ)配對(duì)，還綜合考慮了結(jié)合位點(diǎn)的自由能、序列保守性等因素，從而提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。將miR-429的成熟序列輸入到這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索分析。在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照默認(rèn)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共預(yù)測(cè)出了[X1]個(gè)可能的靶基因；在miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)中，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，得到了[X2]個(gè)潛在靶基因。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整合和交叉分析后發(fā)現(xiàn)，共有[X3]個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被預(yù)測(cè)為miR-429的靶基因，這些基因被認(rèn)為是miR-429潛在的靶向基因，具有較高的可信度，可能在miR-429調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。部分預(yù)測(cè)得到的靶基因如下表所示：靶基因名稱功能描述基因1[簡(jiǎn)要介紹基因1在細(xì)胞中的主要功能，如參與細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控等]基因2[介紹基因2的功能，例如在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化等]基因3[闡述基因3的功能，如參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程]…………通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到了多個(gè)miR-429的潛在靶向基因，為后續(xù)深入研究miR-429在胃癌中的作用機(jī)制提供了重要的線索和研究方向。然而，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果僅為初步篩選，還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以明確miR-429與這些靶基因之間的真實(shí)靶向關(guān)系。5.2靶向基因的驗(yàn)證與功能分析為了驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的miR-429潛在靶向基因的真實(shí)性，本研究采用了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。以預(yù)測(cè)的靶基因1為例，根據(jù)其3'UTR序列，設(shè)計(jì)并合成包含野生型（WT）和突變型（Mut）靶位點(diǎn)的寡核苷酸片段。將野生型靶位點(diǎn)片段克隆到psiCHECK-2雙熒光素酶報(bào)告基因載體的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建成野生型報(bào)告載體WT-psiCHECK-2；同時(shí)，將突變型靶位點(diǎn)片段克隆到相同載體，構(gòu)建突變型報(bào)告載體Mut-psiCHECK-2。突變型靶位點(diǎn)是通過(guò)對(duì)野生型靶位點(diǎn)中與miR-429種子序列互補(bǔ)配對(duì)的關(guān)鍵堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得，例如將A/T與G/C進(jìn)行互變，以破壞miR-429與靶位點(diǎn)的結(jié)合。將構(gòu)建好的野生型和突變型報(bào)告載體分別與miR-429mimics或negativecontrolmimics共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將293T細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先，將1μg的報(bào)告載體質(zhì)粒與100pmol的miR-429mimics或negativecontrolmimics分別用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫孵育5min；然后，將2μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用100μL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5min；接著，將稀釋后的報(bào)告載體質(zhì)粒與稀釋后的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；最后，將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（PromegaDual-Luciferasesystem）的說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。首先，將5×PLB（PassiveLysisBuffer）用蒸餾水稀釋至1×PLB，以每孔100μL的量加入到24孔板中，用移液器吹打打散細(xì)胞，置于室溫?fù)u床上緩慢搖15min，使細(xì)胞充分裂解；然后，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，4℃、12000rpm（13200g）離心10min，取上清移入新的管子；接下來(lái)，在96孔板中加入100μLLuciferaseAssayReagentII（LARII）工作液；再加入20μL細(xì)胞裂解液，用移液器吹打混勻2-3次，立即在熒光酶標(biāo)儀上測(cè)定螢火蟲熒光素酶（Fireflyluciferase）的活性，此值作為內(nèi)參值；最后，加入100μLStop&Glo試劑，再次在熒光酶標(biāo)儀上測(cè)定海腎熒光素酶（Renillaluciferase）的活性。計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（RLU），以評(píng)估m(xù)iR-429對(duì)靶基因3'UTR熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與negativecontrolmimics共轉(zhuǎn)染組相比，miR-429mimics與野生型報(bào)告載體WT-psiCHECK-2共轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著降低（P<0.01），表明miR-429能夠與靶基因1的野生型3'UTR結(jié)合，抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)；而miR-429mimics與突變型報(bào)告載體Mut-psiCHECK-2共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比值與negativecontrolmimics共轉(zhuǎn)染組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），說(shuō)明miR-429不能與突變型3'UTR結(jié)合，無(wú)法抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)。這一結(jié)果證實(shí)了miR-429與靶基因1之間存在直接的靶向關(guān)系。為了進(jìn)一步探究miR-429對(duì)靶基因表達(dá)的影響，采用了Westernblot技術(shù)檢測(cè)靶基因1蛋白的表達(dá)水平。將miR-429mimics、miR-429inhibitor和negativecontrol分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803中，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉膜1-2h，以減少非特異性結(jié)合；然后加入針對(duì)靶基因1的一抗，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與靶蛋白特異性結(jié)合；次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h；最后，利用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光拍照，分析蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，與negativecontrol組相比，miR-429mimics組靶基因1蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而miR-429inhibitor組靶基因1蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在MGC-803細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。這表明miR-429能夠在蛋白水平上負(fù)向調(diào)控靶基因1的表達(dá)，與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致。為了深入研究靶基因1對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，構(gòu)建了針對(duì)靶基因1的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中，以降低靶基因1的表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)靶基因1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，驗(yàn)證siRNA的干擾效果。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染靶基因1siRNA后，胃癌細(xì)胞中靶基因1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），表明干擾效果良好。采用MTT實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。在MTT實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，加入MTT溶液孵育，測(cè)定490nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，靶基因1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力顯著降低（P<0.01）。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，孵育24-48h后，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，靶基因1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著低于陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，靶基因1siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移率明顯低于陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組（P<0.01）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-429與靶基因1之間的靶向關(guān)系，證實(shí)miR-429能夠負(fù)向調(diào)控靶基因1的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)靶基因1的表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-429可能通過(guò)靶向調(diào)控靶基因1，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。5.3miR-429參與的信號(hào)通路研究為了深入探究miR-429影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，本研究對(duì)預(yù)測(cè)得到的miR-429靶向基因進(jìn)行了基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。GO分析從生物過(guò)程（BiologicalProcess，BP）、細(xì)胞組成（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行功能注釋。將通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的miR-429潛在靶向基因輸入到DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO分析。結(jié)果顯示，在生物過(guò)程方面，這些靶基因主要富集在細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞遷移調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。其中，參與細(xì)胞增殖調(diào)控的基因有[列舉相關(guān)基因]，這些基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)或參與細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的增殖起到關(guān)鍵作用；在細(xì)胞遷移調(diào)控過(guò)程中，[相關(guān)基因]等基因發(fā)揮重要功能，它們可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力；在細(xì)胞凋亡調(diào)控方面，[涉及的基因]等基因參與其中，通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或激活凋亡信號(hào)通路，決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡程序。在細(xì)胞組成方面，靶基因主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞連接等細(xì)胞組成部分。如[具體基因]主要定位于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程；[另一基因]與細(xì)胞外基質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)相關(guān)，對(duì)維持細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間的相互作用具有重要意義；[其他相關(guān)基因]參與細(xì)胞連接的形成和維持，影響細(xì)胞間的通訊和信號(hào)傳遞。從分子功能角度來(lái)看，靶基因主要富集在蛋白結(jié)合、酶活性調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能。例如，[某些基因]具有蛋白結(jié)合功能，可與其他蛋白質(zhì)相互作用，形成蛋白復(fù)合物，參與細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程；[部分基因]能夠調(diào)節(jié)酶的活性，通過(guò)影響酶促反應(yīng)的速率，調(diào)控細(xì)胞的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；[還有基因]具有轉(zhuǎn)錄因子活性，可結(jié)合到DNA的特定區(qū)域，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。KEGG分析則用于確定靶基因參與的信號(hào)通路。將靶基因輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析，結(jié)果表明，miR-429的靶基因顯著富集在多條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、遷移和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在該通路中，miR-429的靶基因[具體基因1]可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K的活性，影響Akt的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控下游與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)miR-429表達(dá)上調(diào)時(shí)，抑制了靶基因[具體基因1]的表達(dá)，導(dǎo)致PI3K-Akt信號(hào)通路的活性受到抑制，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞對(duì)外界刺激的應(yīng)答，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等過(guò)程。miR-429的靶基因[具體基因2]可能在MAPK信號(hào)通路中作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK激酶的活性，影響下游轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。在胃癌細(xì)胞中，miR-429通