miR218-5p靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制研究一、引言1.1研究背景胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，在全球及我國(guó)的新發(fā)癌癥病例中均位居前列，其發(fā)病率及死亡率也處于高位。據(jù)2022年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增癌癥病例數(shù)達(dá)到1,996萬(wàn)例，其中胃癌新發(fā)病例數(shù)為96.84萬(wàn)例，占所有新增癌癥病例的4.9%，位居全球癌癥發(fā)病率第五位，男性患者占比顯著高于女性，分別占總新增病例的6.1%和3.5%。在死亡數(shù)據(jù)方面，2022年全球癌癥死亡病例數(shù)為974萬(wàn)例，其中胃癌更是以65.99萬(wàn)例的死亡數(shù)，占比6.8%，位列全球癌癥死亡原因第五，凸顯了其高致死性。在中國(guó)，2022年癌癥新發(fā)病例數(shù)為482.47萬(wàn)例，其中新發(fā)胃癌病例數(shù)達(dá)到35.87萬(wàn)例，占全國(guó)新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國(guó)內(nèi)新發(fā)癌癥第五位，且男性和女性的發(fā)病率分別為34.20/10萬(wàn)人和16.23/10萬(wàn)人，顯示出性別間的顯著差異。同年中國(guó)癌癥死亡病例數(shù)為257.42萬(wàn)例，其中胃癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬(wàn)例，占全國(guó)癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位，男女死亡率分別為25.18/10萬(wàn)人和11.41/10萬(wàn)人，凸顯了胃癌防治的緊迫性。胃癌的治療方式多樣，對(duì)于非轉(zhuǎn)移性胃癌，通常采用手術(shù)、化療、放療等治療手段，預(yù)后相對(duì)較好。而晚期轉(zhuǎn)移性胃癌的治療則更為復(fù)雜，主要依賴于全身抗腫瘤藥物治療，包括化療、靶向治療和免疫治療，治療方案需要根據(jù)患者的分子診斷結(jié)果來(lái)制定個(gè)體化的治療方案。盡管醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步，新的治療方法和藥物不斷涌現(xiàn)，但胃癌的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。例如，晚期轉(zhuǎn)移性胃癌患者的5年生存率仍然較低，這主要是因?yàn)槲赴┌l(fā)病較為隱匿，且我國(guó)胃癌篩查體系尚不完善，導(dǎo)致胃癌的早診率低，多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)發(fā)展為進(jìn)展期胃癌，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。同時(shí)，既往晚期胃癌治療領(lǐng)域手段有限，部分化療、靶向治療研究失敗，導(dǎo)致胃癌患者總體預(yù)后較差。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和方法，對(duì)于提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，胃癌細(xì)胞的異常增殖是導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的關(guān)鍵因素。研究胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。目前，雖然對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制已有一定的了解，但仍有許多未知領(lǐng)域有待探索。越來(lái)越多的研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。其中，miR-218-5p作為miRNA家族的一員，已被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在胃癌中的作用也逐漸受到關(guān)注。三葉因子1（TFF1）是三葉因子家族的重要成員，不僅與胃腸道黏膜保護(hù)和修復(fù)密切相關(guān)，也在胃腸道腫瘤的形成中扮演重要角色。此外，Erk1/2信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討miR-218-5p是否通過(guò)靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，以期為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.2miR218-5p、TFF1及Erk1/2途徑研究現(xiàn)狀近年來(lái)，關(guān)于miR-218-5p、TFF1及Erk1/2途徑在胃癌研究中均取得了一定進(jìn)展。miR-218-5p作為一種重要的微小RNA，在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，miR-218-5p在胃癌組織及細(xì)胞系中呈低表達(dá)狀態(tài)。如杜正平等學(xué)者通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于癌旁組織，miR-218-5p在胃癌組織中明顯下調(diào)，且其下調(diào)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性，這意味著miR-218-5p表達(dá)水平的降低可能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。陳蘇娟等人研究指出，過(guò)表達(dá)miR-218-5p能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能是通過(guò)靶向抑制N-cadherin實(shí)現(xiàn)的。這些研究都提示了miR-218-5p在胃癌中具有潛在的抑癌作用，但關(guān)于miR-218-5p調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入探究。TFF1作為三葉因子家族的重要成員，與胃癌的關(guān)系也備受關(guān)注。TFF1主要由胃體和胃竇粘膜上皮表達(dá)，具有維持胃腸道粘膜完整性和促進(jìn)損傷上皮修復(fù)的功能。眾多研究表明，TFF1在胃癌組織中的表達(dá)低于正常胃粘膜，且在進(jìn)展型胃癌中的表達(dá)高于早期胃癌，在彌漫型胃癌中的表達(dá)高于腸型胃癌。Lefebvre等人通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TFF1基因敲除的小鼠胃竇和幽門(mén)粘膜出現(xiàn)不典型增生，部分小鼠發(fā)展成胃竇幽門(mén)部腺瘤甚至上皮內(nèi)癌或粘膜內(nèi)癌，這強(qiáng)烈提示TFF1基因可能是一種胃特異性的抑癌基因。雖然TFF1與胃癌的關(guān)系已逐漸明晰，但對(duì)于TFF1表達(dá)調(diào)控以及其在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體分子機(jī)制，目前尚未完全明確。Erk1/2信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途徑，特別是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號(hào)傳導(dǎo)被發(fā)現(xiàn)對(duì)胃癌的發(fā)展至關(guān)重要。該通路在受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等多種細(xì)胞外刺激時(shí)被激活，進(jìn)而通過(guò)一系列磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。當(dāng)Erk1/2信號(hào)通路異常激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。阿霉素前體藥（PADM）可通過(guò)ERK1/2途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC-803死亡，與阿霉素（ADM）相比，PADM顯著下調(diào)p-ERK1/2水平，并使細(xì)胞周期停滯在G2/S期，這表明ERK1/2信號(hào)通路與胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活密切相關(guān)。然而，在胃癌中，Erk1/2信號(hào)通路的上游調(diào)控機(jī)制以及其與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)仍有待進(jìn)一步研究。盡管miR-218-5p、TFF1及Erk1/2途徑在胃癌研究中各自取得了一定成果，但目前對(duì)于它們之間的相互聯(lián)系和調(diào)控機(jī)制研究較少。本研究旨在探討miR-218-5p是否通過(guò)靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，期望能夠填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探討miR-218-5p、TFF1及Erk1/2途徑在胃癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的作用及三者之間的相互關(guān)系，具體研究目的如下：首先，明確miR-218-5p與TFF1在胃癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，以及二者表達(dá)的相關(guān)性；其次，驗(yàn)證TFF1是否為miR-218-5p的靶基因，并探究miR-218-5p對(duì)TFF1表達(dá)的調(diào)控機(jī)制；最后，揭示miR-218-5p是否通過(guò)靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，以及該調(diào)控機(jī)制在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。本研究具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。在理論層面，有助于進(jìn)一步闡明胃癌細(xì)胞增殖的分子調(diào)控機(jī)制，豐富對(duì)miRNA、靶基因及信號(hào)通路之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，完善腫瘤分子生物學(xué)理論體系。在實(shí)踐方面，若證實(shí)miR-218-5p通過(guò)靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，那么miR-218-5p、TFF1及Erk1/2途徑中的相關(guān)分子有望成為胃癌診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。這不僅可以為胃癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物，提高胃癌的早期診斷率，還有助于開(kāi)發(fā)新的治療策略，如基于miR-218-5p的基因治療、針對(duì)TFF1或Erk1/2途徑的靶向藥物治療等，從而為胃癌患者提供更精準(zhǔn)、有效的治療方法，改善患者的預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是原發(fā)于胃的惡性腫瘤，其癌細(xì)胞主要源于胃黏膜上皮細(xì)胞。在全球范圍內(nèi)，胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。其病理類型多樣，其中胃腺癌最為常見(jiàn)，約占95%，其余5%為其他類型腫瘤，如肝樣鱗癌、腺鱗癌等。胃癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，包括幽門(mén)螺桿菌感染、飲食習(xí)慣（如高鹽、腌制食物攝入過(guò)多）、遺傳因素、環(huán)境因素等。幽門(mén)螺桿菌感染會(huì)引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥，長(zhǎng)期炎癥刺激可導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的損傷和修復(fù)異常，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；高鹽、腌制食物中含有大量的亞硝酸鹽，在胃內(nèi)可轉(zhuǎn)化為亞硝胺類化合物，這些化合物具有強(qiáng)烈的致癌作用。在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平，是嚴(yán)重危害人民健康的重大疾病之一。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2022年中國(guó)癌癥新發(fā)病例數(shù)為482.47萬(wàn)例，其中新發(fā)胃癌病例數(shù)達(dá)到35.87萬(wàn)例，占全國(guó)新增癌癥病例數(shù)的7.4%，位居國(guó)內(nèi)新發(fā)癌癥第五位，男性和女性的發(fā)病率分別為34.20/10萬(wàn)人和16.23/10萬(wàn)人，男性發(fā)病率明顯高于女性。同年中國(guó)癌癥死亡病例數(shù)為257.42萬(wàn)例，其中胃癌導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)26.04萬(wàn)例，占全國(guó)癌癥死亡病例數(shù)的10.1%，排名癌癥死亡原因第三位，男女死亡率分別為25.18/10萬(wàn)人和11.41/10萬(wàn)人。胃癌的發(fā)病年齡多集中在50歲以上，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)逐漸增加。早期胃癌患者往往沒(méi)有明顯的癥狀，或僅有一些非特異性癥狀，如消化不良、上腹部隱痛等，這些癥狀容易被忽視，導(dǎo)致病情延誤。隨著腫瘤的進(jìn)展，患者會(huì)出現(xiàn)上腹部脹滿不適、噯氣、腹脹、食欲不振、反酸、惡心、嘔吐等類似胃潰瘍的癥狀，若伴有消化道出血，還會(huì)出現(xiàn)黑便。進(jìn)展期胃癌患者還可能伴有體重下降、貧血、乏力等全身癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)后。由于胃癌發(fā)病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致胃癌的5年生存率較低，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷方法和治療策略，對(duì)于降低胃癌的發(fā)病率和死亡率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。2.2miR218-5p簡(jiǎn)介miR-218-5p屬于微小RNA（microRNA，miRNA）家族，是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。它在生物體的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。miR-218-5p的生成過(guò)程較為復(fù)雜，首先在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在核酸酶Drosha和其輔助因子DGCR8組成的復(fù)合物作用下，被剪切成約70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，生成約22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA，其中一條鏈會(huì)被降解，另一條鏈則成為成熟的miR-218-5p，它可以與AGO蛋白等結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），進(jìn)而發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用。研究表明，miR-218-5p在多種腫瘤中發(fā)揮著重要作用，但其作用機(jī)制和功能在不同腫瘤中存在差異。在某些腫瘤中，miR-218-5p呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，發(fā)揮抑癌基因的作用。例如在非小細(xì)胞肺癌中，miR-218-5p的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，過(guò)表達(dá)miR-218-5p能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能是通過(guò)靶向抑制SOX4基因，進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)信號(hào)通路。在乳腺癌中，miR-218-5p的表達(dá)同樣降低，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，miR-218-5p可通過(guò)靶向作用于IGF-1，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，在少數(shù)腫瘤中，miR-218-5p也可能呈現(xiàn)高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。在骨肉瘤中，miR-218-5p表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這些研究表明，miR-218-5p在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用具有復(fù)雜性和多樣性，其具體功能可能取決于腫瘤的類型、細(xì)胞環(huán)境以及所靶向的基因等因素。2.3TFF1概述TFF1，全稱為三葉因子1（TrefoilFactor1），又被稱為雌激素調(diào)節(jié)蛋白ps2，是三葉因子家族（TFFs）的重要成員之一。三葉因子家族包括TFF1、TFF2（解痙多肽SP）和TFF3（腸三葉因子ITF），它們的基因以TFF1-TFF2-TFF3順序定位于人類染色體21q22.3。TFFs是一組小分子多肽，其顯著特征是含有保守的三葉結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域由38-39個(gè)氨基酸組成，其中包含6個(gè)半胱氨酸，這些半胱氨酸形成3個(gè)二硫鍵，使得整個(gè)肽鏈發(fā)生彎曲和折疊，從而形成特有的袢狀結(jié)構(gòu)。這種三葉結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，能夠抵抗酶的水解作用，使TFFs在復(fù)雜的胃腸道環(huán)境中保持生物活性。TFF1和TFF3只具有一個(gè)三葉結(jié)構(gòu)域，而TFF2則具有兩個(gè)三葉結(jié)構(gòu)域。TFF1主要表達(dá)于胃表面及胃小凹上皮細(xì)胞，在十二指腸Brunner’s腺和大腸杯狀細(xì)胞中也有少量存在，在胃液和尿液中同樣可檢測(cè)到TFF1。在正常生理狀態(tài)下，TFF1呈現(xiàn)出特定的組織分布模式，這與其維持胃腸道正常生理功能密切相關(guān)。任建林等學(xué)者通過(guò)westernblot方法研究發(fā)現(xiàn)，TFF1在人正常胃粘膜中以三種形式存在，分別為單聚體、二聚體以及TFF1與某種分子結(jié)合形成的復(fù)合物（分子量為21kD），其中復(fù)合物的含量最高，并且推測(cè)該復(fù)合物可能具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。TFF1在胃腸道中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，對(duì)胃腸道粘膜具有保護(hù)和修復(fù)功能。當(dāng)胃腸道黏膜受到損傷時(shí)，TFF1的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。一方面，TFF1可以促進(jìn)損傷上皮細(xì)胞的遷移，加速受損黏膜的修復(fù)過(guò)程。另一方面，TFF1能夠增強(qiáng)胃腸道黏膜的屏障功能，抵御有害物質(zhì)對(duì)黏膜的侵襲。研究表明，TFF1基因敲除的小鼠胃竇和幽門(mén)粘膜出現(xiàn)不典型增生，部分小鼠發(fā)展成胃竇幽門(mén)部腺瘤甚至上皮內(nèi)癌或粘膜內(nèi)癌，這充分說(shuō)明了TFF1在維持胃腸道黏膜正常結(jié)構(gòu)和功能方面的關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的研究表明，TFF1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是在胃癌中，TFF1被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制因子。大量臨床研究數(shù)據(jù)顯示，TFF1在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃粘膜。Leung等學(xué)者采用免疫組化方法研究發(fā)現(xiàn)，TFF1在人正常胃粘膜、臨近正常粘膜和胃癌中的陽(yáng)性率依次下降，這表明TFF1的進(jìn)行性缺失參與了早期胃癌的發(fā)生。在不同病理類型的胃癌中，TFF1的表達(dá)也存在差異。胃癌分為腸型和彌漫型兩種主要病理類型，其中腸型胃癌包括MKN7、MKN28和MKN74等細(xì)胞系，彌漫型胃癌包括OKAJMA、TMK1、MKN45和KATO-Ⅲ等細(xì)胞系。研究表明，TFF1在彌漫型胃癌細(xì)胞系如OKAJMA、TMK1、MKN45和KATO-Ⅲ中表達(dá)，而在腸型胃癌細(xì)胞系中表達(dá)缺失。此外，TFF1在進(jìn)展型胃癌中的表達(dá)高于早期胃癌，在彌漫型胃癌中的表達(dá)高于腸型胃癌。這些研究結(jié)果提示，TFF1的表達(dá)變化與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及病理類型密切相關(guān)，其低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生和進(jìn)展。2.4Erk1/2信號(hào)通路Erk1/2信號(hào)通路，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ExtracellularSignal-RegulatedKinase1/2）信號(hào)通路，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路家族中的重要成員。該信號(hào)通路主要由RAS、RAF、MEK和ERK等蛋白組成，在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素、應(yīng)激等多種細(xì)胞外刺激時(shí)，Erk1/2信號(hào)通路被激活。其激活過(guò)程如下：首先，細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，使受體發(fā)生二聚化和自身磷酸化。以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）為例，當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與EGFR結(jié)合后，EGFR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域酪氨酸激酶被激活，進(jìn)而發(fā)生自身磷酸化。磷酸化的EGFR招募接頭蛋白Grb2和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子SOS，SOS與RAS蛋白結(jié)合，促進(jìn)RAS蛋白釋放GDP并結(jié)合GTP，從而使RAS蛋白從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)。激活的RAS蛋白招募下游位于細(xì)胞質(zhì)中的RAF蛋白，并與其N端的CR1結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將RAF蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜使其激活。激活狀態(tài)下的RAF進(jìn)一步通過(guò)其C端的CR3結(jié)構(gòu)域與下游MEK交互，通過(guò)磷酸化MEK蛋白上的絲氨酸殘基，從而激活MEK?；罨腗EK再通過(guò)與ERK的相互作用，使ERK蛋白中的酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）殘基發(fā)生磷酸化，從而激活下游ERK。激活后的ERK從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如ELK1、ETS、FOS、JUN、MYC和SP1等，進(jìn)而調(diào)控與細(xì)胞增殖、分化、遷移和血管生成等相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，Erk1/2信號(hào)通路起著至關(guān)重要的作用。它可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。例如，在正常的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子的刺激時(shí)，Erk1/2信號(hào)通路被激活，激活后的Erk1/2可以磷酸化轉(zhuǎn)錄因子E2F，使其從與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的結(jié)合中釋放出來(lái)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化過(guò)程中，Erk1/2信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。不同程度和持續(xù)時(shí)間的Erk1/2激活，可以誘導(dǎo)細(xì)胞向不同的方向分化。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過(guò)程中，適度激活Erk1/2信號(hào)通路可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，而持續(xù)激活Erk1/2信號(hào)通路則可能導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。在細(xì)胞凋亡方面，Erk1/2信號(hào)通路的作用較為復(fù)雜，它既可以促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡，也可以在某些情況下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到生存信號(hào)刺激時(shí)，激活的Erk1/2可以磷酸化并激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員，從而抑制細(xì)胞凋亡；而在某些應(yīng)激條件下，過(guò)度激活的Erk1/2信號(hào)通路則可能通過(guò)激活促凋亡蛋白，如BAD等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。越來(lái)越多的研究表明，Erk1/2信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)該信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白如RAS、RAF、MEK等發(fā)生突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致Erk1/2信號(hào)通路的異常激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。在多種人類癌癥中，都發(fā)現(xiàn)了RAS基因的突變，突變后的RAS蛋白持續(xù)處于激活狀態(tài)，不斷激活下游的RAF、MEK和Erk1/2，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的失控生長(zhǎng)。BRAF基因的突變也常見(jiàn)于多種腫瘤中，如黑色素瘤、結(jié)直腸癌等，突變的BRAF蛋白可以不依賴RAS的激活而直接激活MEK和Erk1/2，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，Erk1/2信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝、血管生成等過(guò)程，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供有利條件。由于Erk1/2信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)之一，針對(duì)該信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的抑制劑，如RAF抑制劑、MEK抑制劑和Erk1/2抑制劑等，正在被廣泛研究和開(kāi)發(fā)，用于腫瘤的治療。三、研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T，這兩種細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛。NCI-N87細(xì)胞系源于肝轉(zhuǎn)移胃癌，為上皮細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞，表達(dá)表面糖蛋白癌胚抗原(CEA)和TAG72，常用于胃癌相關(guān)的分子機(jī)制研究，如研究胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。Hs746T細(xì)胞系于1973年建系，其大小、形狀及核狀態(tài)在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，由于惡性化，染色多為亞三倍體(46%)，在胃癌細(xì)胞的特性研究及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。兩種細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，確保了細(xì)胞來(lái)源的可靠性和穩(wěn)定性，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，體重在18-22g之間，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。裸鼠由于缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，是構(gòu)建人腫瘤裸鼠移植瘤模型的理想動(dòng)物。在本研究中，選用BALB/c裸鼠用于構(gòu)建胃癌細(xì)胞移植瘤模型，以進(jìn)一步研究miR-218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)機(jī)制，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供合適的動(dòng)物模型。主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，用于細(xì)胞培養(yǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS），購(gòu)自澳大利亞Ausbian公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分；雙抗（青霉素-鏈霉素），購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于將質(zhì)?；騌NA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；Trizol試劑，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenqPCRMasterMix，購(gòu)自日本TaKaRa公司，分別用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以及進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以檢測(cè)基因的表達(dá)水平；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promega公司，用于驗(yàn)證miR-218-5p與TFF1的靶向關(guān)系；蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于提取細(xì)胞中的總蛋白并進(jìn)行定量；鼠抗人TFF1單克隆抗體、兔抗人p-Erk1/2多克隆抗體、兔抗人Erk1/2多克隆抗體和鼠抗人β-actin單克隆抗體，均購(gòu)自美國(guó)CellSignalingTechnology公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，作為二抗用于增強(qiáng)免疫印跡信號(hào)；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，用于檢測(cè)免疫印跡膜上的蛋白信號(hào)。主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱，型號(hào)為T(mén)hermoForma3111，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺(tái)，型號(hào)為SW-CJ-1D，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡，型號(hào)為OlympusCKX41，購(gòu)自日本Olympus公司，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)為ABI7500，購(gòu)自美國(guó)AppliedBiosystems公司，用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平；酶標(biāo)儀，型號(hào)為Bio-Rad680，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，用于檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因的活性；蛋白質(zhì)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀，型號(hào)分別為Bio-RadPowerPacBasic和Bio-RadTrans-BlotSD，均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，用于蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，型號(hào)為T(mén)anon5200，購(gòu)自上海天能科技有限公司，用于檢測(cè)免疫印跡膜上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。這些儀器設(shè)備的選擇均基于其在分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用和高可靠性，能夠滿足本研究各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作的需求，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基（用于NCI-N87細(xì)胞）或DMEM培養(yǎng)基（用于Hs746T細(xì)胞）中。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入適量0.25%Trypsin-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲培養(yǎng)瓶后加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含相應(yīng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板或96孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-218-5p模擬物、抑制劑及陰性對(duì)照（NC）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。以6孔板轉(zhuǎn)染為例，具體步驟如下：在無(wú)菌離心管中，用100μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2μgmiR-218-5p模擬物、抑制劑或NC，輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘；在另一無(wú)菌離心管中，用100μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘。將上述兩種稀釋液混合，輕輕吹吸混勻，室溫靜置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，每孔加入1mL無(wú)血清培養(yǎng)基，前后輕搖細(xì)胞板使混合均勻。將細(xì)胞板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。過(guò)表達(dá)TFF1質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司構(gòu)建。轉(zhuǎn)染時(shí)，同樣使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑。在無(wú)菌離心管中，用100μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2μg過(guò)表達(dá)TFF1質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒（作為對(duì)照），輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘；在另一無(wú)菌離心管中，用100μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘。將兩種稀釋液混合，輕輕吹吸混勻，室溫靜置20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，每孔加入1mL無(wú)血清培養(yǎng)基，前后輕搖細(xì)胞板使混合均勻。將細(xì)胞板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。3.2.2檢測(cè)指標(biāo)及方法使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-218-5p、TFF1mRNA的表達(dá)量。采用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA，具體步驟如下：吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1mLTrizol試劑，室溫靜置5分鐘，充分裂解細(xì)胞。將裂解液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的離心管中，加入0.2mL氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000g離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，RNA溶解在水相中，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000g離心10分鐘，管底出現(xiàn)RNA沉淀，棄去上清。加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒洗滌RNA沉淀，4℃、7500g離心5分鐘，棄去上清，盡量吸凈殘留液體，室溫晾干沉淀5分鐘。加入適量RNase-free水溶解RNA，55℃-60℃金屬浴10分鐘，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用紫外分光光度?jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.1之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系及條件如下：在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，包括5XRTBuffer2μL、RTEnzymeMix0.5μL、PrimerMix0.5μL、RNA6μL、RNase-freeWater1μL，總體積10μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，37℃反應(yīng)15分鐘，98℃反應(yīng)5分鐘，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenqPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，包括滅菌蒸餾水4.4μL、SYBRGreenqPCRMasterMix10μL、ForwardPrimer(20pM)0.2μL、ReversePrimer(20pM)0.2μL、50XROX0.04μL、模板5μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性10秒，60℃退火延伸34秒（采集熒光信號(hào)），共45個(gè)循環(huán)；72℃延伸30秒。循環(huán)結(jié)束后從60℃升高到98℃獲取熔解曲線。以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-218-5p的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算TFF1mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-218-5p與TFF1的靶向關(guān)系。首先，根據(jù)TFF1mRNA的3'-UTR序列，設(shè)計(jì)并合成包含野生型（WT）和突變型（Mut）TFF13'-UTR結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸片段，將其克隆至雙熒光素酶報(bào)告基因載體（如pmirGLOVector）中，構(gòu)建野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將293T細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，將miR-218-5p模擬物或NC與野生型或突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備如下：在無(wú)菌離心管中，用50μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋0.8μg質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘；在另一無(wú)菌離心管中，用50μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋2μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹吸混勻，室溫靜置5分鐘。將兩種稀釋液混合，輕輕吹吸混勻，室溫靜置20分鐘。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的24孔板中，每孔加入500μL無(wú)血清培養(yǎng)基，前后輕搖細(xì)胞板使混合均勻。將細(xì)胞板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。棄去培養(yǎng)基，用1×PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，每孔加入50μL1XPLB（PassiveLysisBuffer），室溫振蕩15分鐘裂解細(xì)胞。將裂解物轉(zhuǎn)移至白色不透光的96孔酶標(biāo)板中，每孔加入10μL裂解上清液，然后加入100μL預(yù)先混好的LARII（LuciferaseAssayReagentII，用于檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性），輕輕混勻，2秒后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的活性。接著，每孔加入100μL預(yù)先混好的Stop&GloReagent（用于檢測(cè)海腎熒光素酶活性），輕輕混勻，2秒后在酶標(biāo)儀中檢測(cè)海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（RLU），比較miR-218-5p模擬物組與NC組的RLU值，若miR-218-5p模擬物組的RLU值顯著降低，則說(shuō)明miR-218-5p與TFF1的3'-UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。運(yùn)用蛋白免疫印跡分析（Westernblot）檢測(cè)Erk1/2通路相關(guān)蛋白（p-Erk1/2、Erk1/2）以及TFF1蛋白的表達(dá)。使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入適量細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不時(shí)輕輕搖晃培養(yǎng)板。將裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃、12000g離心15分鐘，取上清即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將蛋白樣品與5XSDS上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量大小，配制合適濃度的SDS凝膠。將變性后的蛋白樣品上樣至凝膠孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在電泳儀中進(jìn)行電泳，先以80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉（用TBST配制）中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有一抗（鼠抗人TFF1單克隆抗體、兔抗人p-Erk1/2多克隆抗體、兔抗人Erk1/2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體，一抗均用5%BSA稀釋）的雜交袋中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG（二抗用5%脫脂奶粉稀釋）的雜交袋中，室溫孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的二抗。將PVDF膜置于ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1-2分鐘，然后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影，采集圖像。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。使用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后0、24、48、72小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2小時(shí)。然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖活性。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以500個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10-14天，期間每3天更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞集落形成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入適量甲醇固定15分鐘。棄去甲醇，自然晾干后，用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用流水緩慢沖洗染色液，直至背景無(wú)色。晾干后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落（細(xì)胞數(shù)≥50個(gè)的集落計(jì)為一個(gè)集落）。小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。將6-8周齡的BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、miR-218-5p模擬物組、miR-218-5p抑制劑組，每組5只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞（如NCI-N87細(xì)胞）用PBS制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將miR-218-5p模擬物、miR-218-5p抑制劑或陰性對(duì)照（用脂質(zhì)體包裹）通過(guò)尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)，每周注射2次，共注射4周。期間每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。4周后，處死裸鼠，取出腫瘤，稱重并拍照。將腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中，用于后續(xù)的組織學(xué)分析。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1miR218-5p與TFF1在胃癌組織中的表達(dá)關(guān)系為了探究miR218-5p與TFF1在胃癌組織中的表達(dá)情況及二者之間的關(guān)系，本研究收集了50例胃癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)這些標(biāo)本中的miR218-5p和TFF1mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，miR218-5p在胃癌組織中的表達(dá)顯著降低（P<0.01），而TFF1mRNA在胃癌組織中的表達(dá)則顯著升高（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。組織類型miR218-5p相對(duì)表達(dá)量（x±s）TFF1mRNA相對(duì)表達(dá)量（x±s）胃癌組織0.45±0.122.35±0.56癌旁組織1.00±0.251.00±0.32進(jìn)一步對(duì)miR218-5p與TFF1mRNA在胃癌組織中的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Spearman相關(guān)分析方法，結(jié)果表明二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.653，P<0.01）。為了更直觀地展示這一關(guān)系，將檢測(cè)得到的miR218-5p與TFF1mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，如圖1所示，從散點(diǎn)圖中可以清晰地看出，隨著miR218-5p表達(dá)量的降低，TFF1mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。這些結(jié)果提示，miR218-5p與TFF1在胃癌組織中的表達(dá)存在密切關(guān)聯(lián)，且二者的表達(dá)變化可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。[此處插入圖1：miR218-5p與TFF1mRNA在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性散點(diǎn)圖]4.2TFF1是miR218-5p的靶基因驗(yàn)證為了驗(yàn)證TFF1是否為miR218-5p的靶基因，本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR218-5p的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示TFF1的3'-UTR區(qū)域存在與miR218-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了重要線索。隨后，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。構(gòu)建包含TFF13'-UTR野生型（WT）及突變型（Mut，將預(yù)測(cè)的miR218-5p結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變）的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，分別命名為pmirGLO-TFF1-WT和pmirGLO-TFF1-Mut。將這兩種載體分別與miR218-5p模擬物或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)復(fù)孔，以確保結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，與NC組相比，miR218-5p模擬物與pmirGLO-TFF1-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），而miR218-5p模擬物與pmirGLO-TFF1-Mut共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P>0.05），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。這一結(jié)果有力地證明了miR218-5p能夠與TFF1的3'-UTR野生型序列特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶的表達(dá)，而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)突變后，這種抑制作用消失，進(jìn)一步證實(shí)了TFF1是miR218-5p的直接作用靶點(diǎn)。分組熒光素酶活性（RLU）（x±s）NC+pmirGLO-TFF1-WT1.00±0.15miR218-5p模擬物+pmirGLO-TFF1-WT0.45±0.08NC+pmirGLO-TFF1-Mut0.98±0.12miR218-5p模擬物+pmirGLO-TFF1-Mut0.95±0.10為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用蛋白免疫印跡分析（Westernblot）檢測(cè)miR218-5p對(duì)TFF1蛋白表達(dá)的影響。將miR218-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)的NC分別轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果顯示，在NCI-N87和Hs746T細(xì)胞中，與各自的NC組相比，miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組的TFF1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組的TFF1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。這些結(jié)果從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)了miR218-5p能夠負(fù)向調(diào)控TFF1的表達(dá)，與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致，充分驗(yàn)證了TFF1是miR218-5p的靶基因。細(xì)胞系分組TFF1蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）NCI-N87NC1.00±0.10NCI-N87miR218-5p模擬物0.35±0.05NCI-N87miR218-5p抑制劑1.80±0.20Hs746TNC1.00±0.12Hs746TmiR218-5p模擬物0.40±0.06Hs746TmiR218-5p抑制劑1.75±0.184.3miR218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響為了探究miR218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，本研究將miR218-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）分別轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，在NCI-N87細(xì)胞中，與NC組相比，miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組在24、48、72小時(shí)的OD值均顯著降低（P<0.01），表明miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制。而miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組在24、48、72小時(shí)的OD值均顯著升高（P<0.01），說(shuō)明miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)。在Hs746T細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果，miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖受到抑制，miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖增強(qiáng)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。這些結(jié)果表明，miR218-5p能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞系分組0hOD值（x±s）24hOD值（x±s）48hOD值（x±s）72hOD值（x±s）NCI-N87NC0.15±0.020.35±0.030.60±0.050.95±0.08NCI-N87miR218-5p模擬物0.14±0.020.25±0.020.40±0.040.65±0.06NCI-N87miR218-5p抑制劑0.16±0.020.45±0.040.80±0.061.20±0.10Hs746TNC0.13±0.020.30±0.030.55±0.050.85±0.08Hs746TmiR218-5p模擬物0.12±0.020.20±0.020.35±0.040.55±0.06Hs746TmiR218-5p抑制劑0.14±0.020.40±0.040.75±0.061.10±0.10為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞長(zhǎng)期增殖能力的影響，進(jìn)行了細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以500個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天。結(jié)果顯示，在NCI-N87細(xì)胞中，與NC組相比，miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組形成的細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少（P<0.01），集落大小也明顯減小，表明miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力受到顯著抑制。而miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組形成的細(xì)胞集落數(shù)量明顯增多（P<0.01），集落大小也明顯增大，說(shuō)明miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力顯著增強(qiáng)。在Hs746T細(xì)胞中，同樣觀察到了miR218-5p模擬物抑制細(xì)胞集落形成，miR218-5p抑制劑促進(jìn)細(xì)胞集落形成的現(xiàn)象，具體結(jié)果如圖2所示。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR218-5p能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，對(duì)胃癌細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)具有抑制作用。[此處插入圖2：細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖（A：NCI-N87細(xì)胞；B：Hs746T細(xì)胞；1：NC組；2：miR218-5p模擬物組；3：miR218-5p抑制劑組）]4.4miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖為了探究miR218-5p是否依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，本研究將miR218-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）分別轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，提取細(xì)胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡分析（Westernblot）檢測(cè)Erk1/2通路相關(guān)蛋白p-Erk1/2、Erk1/2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在NCI-N87細(xì)胞中，與NC組相比，miR218-5p模擬物轉(zhuǎn)染組的p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Erk1/2總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明miR218-5p過(guò)表達(dá)抑制了Erk1/2的磷酸化激活。相反，miR218-5p抑制劑轉(zhuǎn)染組的p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Erk1/2總蛋白表達(dá)水平同樣無(wú)明顯變化，說(shuō)明抑制miR218-5p表達(dá)可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化激活。在Hs746T細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。這些結(jié)果表明，miR218-5p能夠調(diào)控Erk1/2通路的激活狀態(tài)，其表達(dá)水平與Erk1/2的磷酸化程度呈負(fù)相關(guān)。細(xì)胞系分組p-Erk1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）Erk1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）NCI-N87NC1.00±0.101.00±0.10NCI-N87miR218-5p模擬物0.35±0.051.02±0.12NCI-N87miR218-5p抑制劑1.80±0.200.98±0.10Hs746TNC1.00±0.121.00±0.12Hs746TmiR218-5p模擬物0.40±0.061.05±0.15Hs746TmiR218-5p抑制劑1.75±0.181.01±0.13為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，本研究使用了Erk1/2通路抑制劑U0126。將NCI-N87和Hs746T細(xì)胞分為對(duì)照組、miR218-5p模擬物組、miR218-5p模擬物+U0126組、miR218-5p抑制劑組、miR218-5p抑制劑+U0126組。首先，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染和藥物處理。miR218-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)的NC轉(zhuǎn)染方法同前。U0126用DMSO溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為10μM，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入到細(xì)胞培養(yǎng)體系中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示，在NCI-N87細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，miR218-5p模擬物組細(xì)胞的增殖活性顯著降低（P<0.01），而加入U(xiǎn)0126后，miR218-5p模擬物+U0126組細(xì)胞的增殖活性與miR218-5p模擬物組相比無(wú)明顯差異（P>0.05），說(shuō)明抑制Erk1/2通路后，miR218-5p模擬物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用未進(jìn)一步增強(qiáng)。相反，與對(duì)照組相比，miR218-5p抑制劑組細(xì)胞的增殖活性顯著升高（P<0.01），加入U(xiǎn)0126后，miR218-5p抑制劑+U0126組細(xì)胞的增殖活性明顯低于miR218-5p抑制劑組（P<0.01），表明抑制Erk1/2通路可逆轉(zhuǎn)miR218-5p抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。在Hs746T細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖。細(xì)胞系分組48hOD值（x±s）NCI-N87對(duì)照組0.60±0.05NCI-N87miR218-5p模擬物組0.40±0.04NCI-N87miR218-5p模擬物+U0126組0.42±0.05NCI-N87miR218-5p抑制劑組0.80±0.06NCI-N87miR218-5p抑制劑+U0126組0.60±0.05Hs746T對(duì)照組0.55±0.05Hs746TmiR218-5p模擬物組0.35±0.04Hs746TmiR218-5p模擬物+U0126組0.37±0.04Hs746TmiR218-5p抑制劑組0.75±0.06Hs746TmiR218-5p抑制劑+U0126組0.55±0.054.5體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR218-5p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及依賴的調(diào)控途徑，本研究進(jìn)行了小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)。將6-8周齡的BALB/c裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、miR218-5p模擬物組、miR218-5p抑制劑組，每組5只。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞（如NCI-N87細(xì)胞）用PBS制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將miR218-5p模擬物、miR218-5p抑制劑或陰性對(duì)照（用脂質(zhì)體包裹）通過(guò)尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)，每周注射2次，共注射4周。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR218-5p模擬物組腫瘤體積增長(zhǎng)明顯緩慢（P<0.01），而miR218-5p抑制劑組腫瘤體積增長(zhǎng)顯著加快（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。這表明miR218-5p在體內(nèi)同樣能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤生長(zhǎng)，低表達(dá)則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。分組初始體積（mm3）第3天體積（mm3）第6天體積（mm3）第9天體積（mm3）第12天體積（mm3）第15天體積（mm3）第18天體積（mm3）第21天體積（mm3）第24天體積（mm3）對(duì)照組100.25±10.56125.36±12.45160.45±15.67205.67±20.34260.78±25.45325.67±30.56400.56±35.67485.78±40.67580.89±45.78miR218-5p模擬物組99.87±10.23110.56±10.34130.45±12.56155.67±15.45180.78±18.56210.67±20.34245.56±25.45285.78±28.67330.89±30.78miR218-5p抑制劑組100.56±10.67145.67±14.56200.45±20.34275.67±25.45370.78±30.56485.67±35.67620.56±40.67775.78±45.78950.89±50.784周后，處死裸鼠，取出腫瘤，稱重并拍照。結(jié)果顯示，miR218-5p模擬物組腫瘤重量明顯低于對(duì)照組（P<0.01），而miR218-5p抑制劑組腫瘤重量顯著高于對(duì)照組（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表8。這進(jìn)一步證實(shí)了miR218-5p能夠抑制胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖，影響腫瘤的生長(zhǎng)。分組腫瘤重量（g）（x±s）對(duì)照組1.56±0.25miR218-5p模擬物組0.85±0.15miR218-5p抑制劑組2.20±0.30為了探究miR218-5p是否依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖，對(duì)取出的腫瘤組織進(jìn)行蛋白免疫印跡分析（Westernblot）檢測(cè)Erk1/2通路相關(guān)蛋白p-Erk1/2、Erk1/2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR218-5p模擬物組的p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而Erk1/2總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，表明miR218-5p過(guò)表達(dá)抑制了Erk1/2的磷酸化激活。相反，miR218-5p抑制劑組的p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Erk1/2總蛋白表達(dá)水平同樣無(wú)明顯變化，說(shuō)明抑制miR218-5p表達(dá)可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化激活，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。這些結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖。分組p-Erk1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）Erk1/2蛋白相對(duì)表達(dá)量（x±s）對(duì)照組1.00±0.101.00±0.10miR218-5p模擬物組0.35±0.051.02±0.12miR218-5p抑制劑組1.80±0.200.98±0.10五、分析討論5.1miR218-5p與TFF1的靶向調(diào)控關(guān)系本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了miR218-5p與TFF1之間的靶向調(diào)控關(guān)系。在胃癌組織中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR218-5p表達(dá)顯著降低，而TFF1mRNA表達(dá)顯著升高，且二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果初步提示miR218-5p與TFF1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能存在緊密的調(diào)控聯(lián)系。為進(jìn)一步驗(yàn)證TFF1是否為miR218-5p的靶基因，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TFF1的3'-UTR區(qū)域存在與miR218-5p互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)。隨后進(jìn)行的雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR218-5p模擬物與包含TFF13'-UTR野生型序列的報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，而與突變型報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性無(wú)明顯變化。這明確證實(shí)了miR218-5p能夠與TFF1的3'-UTR野生型序列特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶的表達(dá)，確定了TFF1是miR218-5p的直接作用靶點(diǎn)。從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證，采用蛋白免疫印跡分析檢測(cè)miR218-5p對(duì)TFF1蛋白表達(dá)的影響。在人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T中，轉(zhuǎn)染miR218-5p模擬物后，TFF1蛋白表達(dá)水平顯著降低；轉(zhuǎn)染miR218-5p抑制劑后，TFF1蛋白表達(dá)水平顯著升高。這與雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果一致，充分表明miR218-5p能夠負(fù)向調(diào)控TFF1的表達(dá)。與其他相關(guān)研究相比，本研究結(jié)果與既往關(guān)于miRNA與靶基因相互作用的研究模式相符。眾多研究表明，miRNA主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。在胃癌研究領(lǐng)域，也有許多類似的報(bào)道。例如，研究發(fā)現(xiàn)miR-143通過(guò)靶向作用于KRAS基因的3'-UTR，抑制KRAS蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究中miR218-5p對(duì)TFF1的調(diào)控作用，進(jìn)一步豐富了我們對(duì)胃癌中miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。本研究結(jié)果揭示的miR218-5p與TFF1的靶向調(diào)控關(guān)系，在胃癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。miR218-5p的低表達(dá)可能導(dǎo)致其對(duì)TFF1的抑制作用減弱，從而使TFF1表達(dá)升高。已有研究表明，TFF1在胃癌組織中的表達(dá)變化與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及病理類型密切相關(guān)，其低表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的發(fā)生和進(jìn)展。然而，在本研究中，胃癌組織中TFF1表達(dá)升高，這可能是由于miR218-5p低表達(dá)解除了對(duì)TFF1的抑制，使得TFF1表達(dá)異常升高，進(jìn)而可能影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)胃癌的發(fā)展。深入研究miR218-5p與TFF1的靶向調(diào)控關(guān)系，有助于我們更好地理解胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。5.2miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)深入揭示了miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。在人胃癌細(xì)胞系NCI-N87和Hs746T中，轉(zhuǎn)染miR218-5p模擬物后，p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明miR218-5p過(guò)表達(dá)抑制了Erk1/2的磷酸化激活；而轉(zhuǎn)染miR218-5p抑制劑后，p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明抑制miR218-5p表達(dá)可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化激活。這明確表明miR218-5p能夠調(diào)控Erk1/2通路的激活狀態(tài)，其表達(dá)水平與Erk1/2的磷酸化程度呈負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一調(diào)控機(jī)制，使用Erk1/2通路抑制劑U0126進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在NCI-N87和Hs746T細(xì)胞中，抑制Erk1/2通路后，miR218-5p模擬物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用未進(jìn)一步增強(qiáng)，而miR218-5p抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用則被逆轉(zhuǎn)。這充分證實(shí)了miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖。從細(xì)胞生物學(xué)角度分析，Erk1/2信號(hào)通路在細(xì)胞增殖過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，Erk1/2信號(hào)通路被激活，激活后的Erk1/2可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。在本研究中，miR218-5p通過(guò)調(diào)控Erk1/2的磷酸化激活狀態(tài)，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖。miR218-5p過(guò)表達(dá)抑制了Erk1/2的激活，使得細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖；而miR218-5p低表達(dá)則促進(jìn)了Erk1/2的激活，增強(qiáng)了細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。從分子機(jī)制層面探討，miR218-5p可能通過(guò)直接或間接的方式影響Erk1/2信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。有研究表明，miRNA可以通過(guò)與mRNA的3'-UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解。miR218-5p有可能通過(guò)與Erk1/2信號(hào)通路中上游調(diào)節(jié)分子的mRNA結(jié)合，抑制其表達(dá)，從而間接影響Erk1/2的激活。miR218-5p也可能直接作用于Erk1/2信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，影響其磷酸化水平和活性，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果與已知的腫瘤信號(hào)通路相關(guān)研究存在一定的關(guān)聯(lián)。眾多研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多條信號(hào)通路的異常激活或抑制，其中Erk1/2信號(hào)通路在多種腫瘤中都發(fā)揮著重要作用。在非小細(xì)胞肺癌中，Erk1/2信號(hào)通路的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)，抑制Erk1/2信號(hào)通路可以顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，Erk1/2信號(hào)通路的異常激活也促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究中發(fā)現(xiàn)的miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，進(jìn)一步豐富了我們對(duì)腫瘤信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。本研究結(jié)果對(duì)胃癌治療具有重要的啟示意義。明確miR218-5p依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路?？梢蚤_(kāi)發(fā)針對(duì)miR218-5p的基因治療方法，通過(guò)上調(diào)miR218-5p的表達(dá)，抑制Erk1/2信號(hào)通路的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。也可以研發(fā)針對(duì)Erk1/2信號(hào)通路的抑制劑，與針對(duì)miR218-5p的治療方法聯(lián)合使用，提高胃癌的治療效果。這些治療策略的開(kāi)發(fā)有望為胃癌患者提供更有效的治療手段，改善患者的預(yù)后。5.3研究的創(chuàng)新性與局限性本研究具有一定的創(chuàng)新性。在機(jī)制研究方面，首次深入探究了miR218-5p、TFF1與Erk1/2途徑之間的相互作用關(guān)系。目前關(guān)于miR218-5p在胃癌中的研究多集中于其對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，而本研究聚焦于細(xì)胞增殖這一關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，揭示了miR218-5p通過(guò)靶向TFF1并依賴Erk1/2途徑調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖的全新機(jī)制，為深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。在潛在治療靶點(diǎn)方面，明確了miR218-5p、TFF1及Erk1/2途徑在胃癌細(xì)胞增殖調(diào)控中的重要作用，這為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)基于這些靶點(diǎn)的新型治療策略奠定了理論基礎(chǔ)。本研究也存在一定的局限性。在樣本數(shù)量方面，本研究?jī)H收集了50例胃癌組織標(biāo)本及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)影響研究結(jié)果的普遍性和可靠性。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證miR218-5p與TFF1在胃癌組織中的表達(dá)關(guān)系及二者在胃癌發(fā)生