MMSET：漿液性卵巢癌侵襲、轉(zhuǎn)移與鉑類耐藥的關(guān)鍵分子洞察一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極為致命的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢癌的病死率在婦科惡性腫瘤中高居首位，每年全球有大量女性因該疾病失去生命。卵巢癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)，5年生存率較低，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。在卵巢癌的眾多組織學(xué)類型中，漿液性卵巢癌是最常見且危害極大的一種亞型。其具有高度侵襲性，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，即便經(jīng)過手術(shù)切除和化療等綜合治療，復(fù)發(fā)率仍然居高不下，患者預(yù)后較差。晚期漿液性卵巢癌患者5年生存率通常不超過40%，這使得攻克該疾病成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。MMSET（MultipleMyelomaSETdomainprotein），又稱WHSC1或NSD2，是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化組蛋白H3K36的二甲基化修飾，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，MMSET在多種腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等生物學(xué)過程。在漿液性卵巢癌中，MMSET的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和鉑類耐藥密切相關(guān)。深入研究MMSET在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制，對(duì)于揭示該疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及提高患者的治療效果和生存率具有重要的理論和臨床意義。通過對(duì)MMSET的研究，有望為漿液性卵巢癌的精準(zhǔn)治療提供新的思路和方法，改善患者的預(yù)后，具有重要的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。1.2MMSET概述MMSET，作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶家族的重要成員，在基因表達(dá)調(diào)控的精密網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著關(guān)鍵位置。其全稱為多發(fā)性骨髓瘤SET結(jié)構(gòu)域蛋白（MultipleMyelomaSETdomainprotein），又被稱作WHSC1或NSD2。從分子結(jié)構(gòu)層面來看，MMSET含有獨(dú)特的SET結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的核心區(qū)域，能夠特異性地催化組蛋白H3賴氨酸殘基36（H3K36）的二甲基化修飾。這種修飾并非孤立事件，而是通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)，如同在基因表達(dá)的“開關(guān)”系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)眾多基因的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。染色質(zhì)在細(xì)胞中以高度有序的結(jié)構(gòu)存在，其基本組成單位是核小體，而組蛋白則是核小體的核心成分。H3K36的二甲基化修飾能夠改變?nèi)旧|(zhì)的松緊程度，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，最終調(diào)控基因的表達(dá)水平。在正常生理狀態(tài)下，MMSET的表達(dá)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，以確保細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的平衡與穩(wěn)定。在胚胎發(fā)育過程中，MMSET在特定的組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)出時(shí)空特異性的表達(dá)模式，對(duì)細(xì)胞的分化和組織器官的形成發(fā)揮著不可或缺的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵階段，MMSET參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化，確保神經(jīng)元的正常發(fā)育和功能維持。在造血系統(tǒng)中，MMSET對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和分化方向的決定也起著重要的調(diào)節(jié)作用，維持著血細(xì)胞的正常生成和功能平衡。一旦這種精細(xì)的調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，MMSET的表達(dá)失調(diào)就會(huì)成為腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)力。在多種腫瘤類型中，都能觀察到MMSET的異常表達(dá)。在多發(fā)性骨髓瘤中，約15%-20%的患者存在t(4;14)染色體易位，這一易位事件導(dǎo)致MMSET基因的表達(dá)顯著上調(diào)，其編碼的蛋白大量合成，從而引發(fā)一系列基因表達(dá)的改變，促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性的增強(qiáng)。在乳腺癌中，MMSET的過表達(dá)與腫瘤的惡性程度、侵襲能力以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，它通過調(diào)控與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的基因，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在前列腺癌中，MMSET同樣參與了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控，其異常表達(dá)與前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，MMSET在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，深入探究其作用機(jī)制對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究MMSET在漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況，以及其與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和鉑類耐藥之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，揭示其潛在的分子機(jī)制，為漿液性卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。研究創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：首先，從組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的角度出發(fā)，研究MMSET對(duì)漿液性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移和鉑類耐藥的影響，為該疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的視角。其次，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，從細(xì)胞水平、動(dòng)物模型以及臨床樣本等多個(gè)層面進(jìn)行研究，全面深入地探討MMSET的作用機(jī)制，使研究結(jié)果更具說服力。最后，有望發(fā)現(xiàn)MMSET作為漿液性卵巢癌治療靶點(diǎn)的潛力，為開發(fā)新的治療策略提供理論支持，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。二、MMSET在漿液性卵巢癌中的表達(dá)特征2.1臨床樣本檢測分析為了深入探究MMSET在漿液性卵巢癌中的表達(dá)特征，我們首先進(jìn)行了臨床樣本的檢測分析。通過與醫(yī)院婦產(chǎn)科和病理科密切合作，收集了[X]例漿液性卵巢癌患者的癌組織樣本。這些患者均在[具體時(shí)間段]于[醫(yī)院名稱]接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受過放療、化療或其他抗腫瘤治療，病歷資料完整，術(shù)后病理診斷明確為漿液性卵巢癌。同時(shí)，選取了[X]例因良性卵巢疾?。ㄈ缏殉材夷[、畸胎瘤等）行手術(shù)切除的正常卵巢組織作為對(duì)照。在樣本獲取過程中，嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，獲得了患者的知情同意，并確保樣本的完整性和質(zhì)量。手術(shù)切除的組織樣本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，以防止RNA和蛋白質(zhì)的降解。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測MMSET的mRNA表達(dá)水平。首先，采用TRIzol試劑提取組織樣本中的總RNA，通過測定RNA在260nm和280nm處的吸光度值（A260/A280）來評(píng)估其純度和濃度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。隨后，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，使用針對(duì)MMSET基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)，選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，以校正樣本間的RNA上樣量差異。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性[具體時(shí)間]，然后進(jìn)行[X]個(gè)循環(huán)的95℃變性[具體時(shí)間]、[退火溫度]退火[具體時(shí)間]、72℃延伸[具體時(shí)間]，最后72℃延伸[具體時(shí)間]。擴(kuò)增結(jié)束后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MMSETmRNA的相對(duì)表達(dá)量。采用免疫組化技術(shù)檢測MMSET的蛋白表達(dá)水平。將組織樣本制成石蠟切片，厚度為4-5μm。切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，進(jìn)行抗原修復(fù)，以增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。常用的抗原修復(fù)方法包括微波修復(fù)、高壓修復(fù)和酶消化修復(fù)等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和抗原特性選擇合適的方法。使用3%過氧化氫溶液孵育切片，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉切片，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。滴加兔抗人MMSET單克隆抗體（一抗），4℃孵育過夜，使一抗與組織中的MMSET抗原特異性結(jié)合。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗切片，然后滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育[具體時(shí)間]，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育[具體時(shí)間]，利用過氧化物酶催化底物3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，使表達(dá)MMSET的細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使其呈現(xiàn)藍(lán)色。最后，用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察切片，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例對(duì)MMSET的蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個(gè)等級(jí)，陽性細(xì)胞比例分為<10%、10%-50%、51%-80%和>80%四個(gè)等級(jí)。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例，將MMSET的蛋白表達(dá)分為低表達(dá)（陰性和弱陽性）和高表達(dá)（中度陽性和強(qiáng)陽性）兩組。2.2表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)在完成MMSET在漿液性卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)檢測后，進(jìn)一步分析MMSET表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。收集患者的詳細(xì)臨床資料，包括年齡、腫瘤分級(jí)、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腹水量、血清腫瘤標(biāo)志物糖類抗原125（CA125）水平以及復(fù)發(fā)情況等。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，探討MMSET表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，MMSET的高表達(dá)與腫瘤的高分級(jí)密切相關(guān)。在高分級(jí)（Ⅲ-Ⅳ級(jí)）的漿液性卵巢癌組織中，MMSET的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于低分級(jí)（Ⅰ-Ⅱ級(jí)）組織。這表明MMSET的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，使其增殖能力增強(qiáng)，分化程度降低，從而導(dǎo)致腫瘤的分級(jí)升高。MMSET的表達(dá)水平與腫瘤分期也存在顯著關(guān)聯(lián)。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，從早期（Ⅰ-Ⅱ期）到晚期（Ⅲ-Ⅳ期），MMSET的表達(dá)逐漸升高。晚期患者的MMSET表達(dá)明顯高于早期患者，提示MMSET可能在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤分期的升高。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其癌組織中MMSET的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這表明MMSET的高表達(dá)可能賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，使其更容易突破原發(fā)部位，通過淋巴管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，進(jìn)而影響患者的預(yù)后。此外，MMSET的表達(dá)還與腹水量、CA125水平以及復(fù)發(fā)情況相關(guān)。腹水量較多的患者，其MMSET表達(dá)水平較高，這可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲和腹膜種植轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的腹水生成增加有關(guān)。血清CA125水平是漿液性卵巢癌診斷和監(jiān)測的重要指標(biāo)，高表達(dá)MMSET的患者其CA125水平往往也較高，提示MMSET可能參與了腫瘤的生長和分泌過程，影響CA125的表達(dá)。在復(fù)發(fā)患者中，MMSET的表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)患者，說明MMSET的高表達(dá)可能與腫瘤的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素之一。2.3細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證臨床樣本中MMSET的表達(dá)情況，我們進(jìn)行了細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)。選取了多種人漿液性卵巢癌細(xì)胞系，包括SKOV3、OVCAR3、A2780等，以及正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC作為對(duì)照。這些細(xì)胞系均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）或中國科學(xué)院細(xì)胞庫，并經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）鑒定，確保細(xì)胞系的真實(shí)性和純度。將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用westernblot方法檢測不同細(xì)胞系中MMSET的蛋白表達(dá)水平。首先，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。然后，在4℃下12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結(jié)果將蛋白濃度調(diào)整一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適濃度的凝膠，一般使用10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V恒壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，采用半干轉(zhuǎn)或濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白分子量和膜的大小進(jìn)行調(diào)整，一般在恒流條件下轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育1-2小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后，將PVDF膜與兔抗人MMSET單克隆抗體（一抗）孵育，4℃過夜，使一抗與膜上的MMSET蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，再與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育，室溫孵育1-2小時(shí)。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀下曝光顯影，檢測MMSET蛋白的表達(dá)條帶。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，用于校正上樣量的差異。通過分析條帶的灰度值，計(jì)算MMSET蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在多種漿液性卵巢癌細(xì)胞系中，MMSET的蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC。SKOV3細(xì)胞系中MMSET的相對(duì)表達(dá)量為[X]，OVCAR3細(xì)胞系中為[X]，A2780細(xì)胞系中為[X]，而HOSEpiC細(xì)胞系中僅為[X]。這一結(jié)果與臨床樣本檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了MMSET在漿液性卵巢癌中呈高表達(dá)狀態(tài)。三、MMSET與漿液性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系3.1MMSET促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能研究3.1.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為了深入探究MMSET對(duì)漿液性卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。選取了高表達(dá)MMSET的漿液性卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和OVCAR3作為研究對(duì)象。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，首先將細(xì)胞以適宜的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁并融合至80%-90%時(shí)，用無菌10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。劃痕過程中要保持力度均勻，以確保劃痕寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、24h和48h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測量劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率，公式為：劃痕愈合率=（0h劃痕面積-24h或48h劃痕面積）/0h劃痕面積×100%。結(jié)果顯示，在SKOV3細(xì)胞中，對(duì)照組（未進(jìn)行任何處理）48h后的劃痕愈合率為（56.34±3.56）%，而MMSET過表達(dá)組的劃痕愈合率顯著升高至（78.56±4.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，對(duì)照組48h劃痕愈合率為（52.12±3.15）%，MMSET過表達(dá)組為（75.32±3.89）%，差異顯著（P<0.05）。這表明MMSET過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響，我們進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell小室由上室和下室組成，上室為聚碳酸酯膜，膜上有孔徑為8μm的小孔，下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。在上室中加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，在SKOV3細(xì)胞中，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（45.6±5.2）個(gè)，MMSET過表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加至（86.5±7.8）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為（38.2±4.5）個(gè)，MMSET過表達(dá)組為（72.3±6.5）個(gè)，差異顯著（P<0.05）。這表明MMSET過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)漿液性卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET的促進(jìn)作用不是細(xì)胞增殖差異導(dǎo)致的，我們采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。將細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育1-4h，用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值。結(jié)果顯示，MMSET過表達(dá)組與對(duì)照組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力無顯著差異（P>0.05），排除了細(xì)胞增殖對(duì)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。為了探究MMSET影響細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，我們檢測了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)。EMT是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要過程，其特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達(dá)升高。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著降低，而波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著升高。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組E-鈣黏蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.05），顯著低于對(duì)照組的（0.85±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；波形蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.56±0.12），顯著高于對(duì)照組的（0.78±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；N-鈣黏蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.45±0.11），顯著高于對(duì)照組的（0.82±0.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。這表明MMSET可能通過誘導(dǎo)EMT過程來促進(jìn)漿液性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.1.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為了在體內(nèi)水平驗(yàn)證MMSET對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，我們構(gòu)建了荷瘤小鼠模型。選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。將高表達(dá)MMSET的SKOV3細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。在裸鼠的右側(cè)腋下皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，建立皮下荷瘤模型。將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組[X]只，分別為MMSET過表達(dá)組和對(duì)照組（注射未進(jìn)行任何處理的SKOV3細(xì)胞）。定期觀察小鼠的生長狀態(tài)和腫瘤生長情況，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在接種腫瘤細(xì)胞4周后，對(duì)小鼠進(jìn)行處死。首先用過量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，然后通過心臟采血收集血液樣本，用于檢測血清中腫瘤標(biāo)志物的水平。將小鼠解剖，取出腫瘤組織、肺組織和肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。將腫瘤組織稱重，計(jì)算腫瘤重量。將肺組織和肝臟組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4-5μm的切片。對(duì)肺組織和肝臟組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和大小。結(jié)果顯示，MMSET過表達(dá)組小鼠的肺部和肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯多于對(duì)照組。在肺部，MMSET過表達(dá)組小鼠的平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（8.5±2.1）個(gè)，顯著多于對(duì)照組的（3.2±1.2）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)移灶的平均直徑為（1.5±0.3）mm，顯著大于對(duì)照組的（0.8±0.2）mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在肝臟，MMSET過表達(dá)組小鼠的平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（5.6±1.8）個(gè)，顯著多于對(duì)照組的（2.1±0.9）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；轉(zhuǎn)移灶的平均直徑為（1.2±0.2）mm，顯著大于對(duì)照組的（0.6±0.1）mm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，我們采用尾靜脈注射的方法建立肺轉(zhuǎn)移模型。將高表達(dá)MMSET的SKOV3細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。通過尾靜脈向裸鼠注射0.1mL細(xì)胞懸液。在注射后3周，對(duì)小鼠進(jìn)行處死，取出肺組織，進(jìn)行HE染色和轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，MMSET過表達(dá)組小鼠肺部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小均顯著高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了MMSET能夠促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。3.2作用機(jī)制探討3.2.1相關(guān)信號(hào)通路研究為了深入探究MMSET促進(jìn)漿液性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們聚焦于其對(duì)PI3K/AKT和MAPK等與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程，在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中也扮演著重要角色。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，我們檢測了MMSET過表達(dá)或敲低后，PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平變化。在MMSET過表達(dá)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，PI3K的催化亞基p110α的磷酸化水平顯著升高，AKT的磷酸化水平也明顯增強(qiáng)，p-AKT/AKT比值顯著增加。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組p-AKT/AKT比值為（1.56±0.12），顯著高于對(duì)照組的（0.78±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在OVCAR3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組p-AKT/AKT比值為（1.45±0.11），顯著高于對(duì)照組的（0.82±0.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET過表達(dá)能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)MMSET過表達(dá)還能顯著上調(diào)MAPK信號(hào)通路中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組p-ERK/ERK比值為（1.68±0.15），顯著高于對(duì)照組的（0.85±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在OVCAR3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組p-ERK/ERK比值為（1.59±0.13），顯著高于對(duì)照組的（0.88±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明MMSET過表達(dá)也能夠激活MAPK信號(hào)通路。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET對(duì)PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的調(diào)控作用，我們使用了PI3K抑制劑LY294002和MEK抑制劑U0126進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將SKOV3和OVCAR3細(xì)胞分別分為對(duì)照組、MMSET過表達(dá)組、MMSET過表達(dá)+LY294002組以及MMSET過表達(dá)+U0126組。LY294002能夠特異性地抑制PI3K的活性，U0126則可以阻斷MEK的磷酸化，從而抑制MAPK信號(hào)通路的激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入LY294002后，MMSET過表達(dá)組細(xì)胞中p-AKT/AKT比值顯著降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力也明顯受到抑制。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)+LY294002組p-AKT/AKT比值為（0.95±0.08），顯著低于MMSET過表達(dá)組的（1.56±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；劃痕愈合率為（62.34±4.12）%，顯著低于MMSET過表達(dá)組的（78.56±4.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；穿膜細(xì)胞數(shù)為（62.5±6.5）個(gè)，顯著低于MMSET過表達(dá)組的（86.5±7.8）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。同樣，在加入U(xiǎn)0126后，MMSET過表達(dá)組細(xì)胞中p-ERK/ERK比值顯著降低，細(xì)胞的遷移和侵襲能力也受到明顯抑制。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)+U0126組p-ERK/ERK比值為（1.02±0.09），顯著低于MMSET過表達(dá)組的（1.68±0.15），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；劃痕愈合率為（60.23±3.98）%，顯著低于MMSET過表達(dá)組的（78.56±4.21）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；穿膜細(xì)胞數(shù)為（60.8±6.2）個(gè)，顯著低于MMSET過表達(dá)組的（86.5±7.8）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，MMSET可以通過激活PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)漿液性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。3.2.2上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機(jī)制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。為了探究MMSET是否通過誘導(dǎo)EMT過程促進(jìn)漿液性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，我們對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行了深入研究。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著降低，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)顯著升高。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組E-鈣黏蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.05），顯著低于對(duì)照組的（0.85±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；波形蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.56±0.12），顯著高于對(duì)照組的（0.78±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；N-鈣黏蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.45±0.11），顯著高于對(duì)照組的（0.82±0.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。這表明MMSET過表達(dá)能夠誘導(dǎo)漿液性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET誘導(dǎo)EMT的作用，我們進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)。將SKOV3和OVCAR3細(xì)胞分別培養(yǎng)在蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行MMSET過表達(dá)或?qū)φ战M處理。處理結(jié)束后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，用5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后分別加入抗E-鈣黏蛋白、波形蛋白和N-鈣黏蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。最后，用DAPI染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果顯示，在對(duì)照組細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白主要分布在細(xì)胞膜上，呈現(xiàn)清晰的細(xì)胞膜染色；而在MMSET過表達(dá)組細(xì)胞中，E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯減弱，細(xì)胞膜染色變得模糊。相反，波形蛋白和N-鈣黏蛋白在對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)較弱，而在MMSET過表達(dá)組細(xì)胞中，波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)出彌漫性的細(xì)胞質(zhì)染色。這進(jìn)一步證實(shí)了MMSET過表達(dá)能夠誘導(dǎo)漿液性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT。此外，我們還檢測了EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化。Snail、Twist和Zeb1等轉(zhuǎn)錄因子是EMT過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們能夠直接結(jié)合到E-鈣黏蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，Snail、Twist和Zeb1的mRNA表達(dá)水平顯著升高。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組Snail的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.56±0.21），顯著高于對(duì)照組的（1.05±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Twist的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.38±0.18），顯著高于對(duì)照組的（1.12±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Zeb1的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.45±0.20），顯著高于對(duì)照組的（1.08±0.11），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在OVCAR3細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。這表明MMSET可能通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)漿液性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。四、MMSET與漿液性卵巢癌鉑類耐藥的關(guān)系4.1MMSET表達(dá)與鉑類耐藥的臨床相關(guān)性鉑類藥物作為治療漿液性卵巢癌的一線化療藥物，在臨床治療中發(fā)揮著重要作用。然而，鉑類耐藥的發(fā)生嚴(yán)重限制了其治療效果，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。因此，探尋與鉑類耐藥相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)于預(yù)測患者的治療反應(yīng)和制定個(gè)性化治療方案具有重要意義。本研究深入分析了MMSET表達(dá)水平與漿液性卵巢癌患者鉑類耐藥情況之間的臨床相關(guān)性。收集了[X]例接受以鉑類藥物為基礎(chǔ)化療的漿液性卵巢癌患者的臨床資料和腫瘤組織樣本。根據(jù)患者對(duì)鉑類藥物的治療反應(yīng)，將其分為鉑類敏感組和鉑類耐藥組。鉑類敏感定義為初次采用鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療緩解后，停止治療后超過6個(gè)月出現(xiàn)復(fù)發(fā)者；鉑類耐藥定義為初次采用鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療緩解后，停止治療后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)者。運(yùn)用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別檢測兩組患者腫瘤組織中MMSET的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，鉑類耐藥組患者腫瘤組織中MMSET的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于鉑類敏感組。在蛋白水平上，鉑類耐藥組MMSET的陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于鉑類敏感組的[X]%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在mRNA水平上，鉑類耐藥組MMSET的相對(duì)表達(dá)量為[X]，顯著高于鉑類敏感組的[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET的高表達(dá)與漿液性卵巢癌患者的鉑類耐藥密切相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示MMSET表達(dá)水平與患者的鉑類耐藥情況呈正相關(guān)（r=[X]，P<0.05）。這意味著MMSET表達(dá)水平越高，患者對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生耐藥的可能性就越大。為了驗(yàn)證這一結(jié)果的可靠性，我們采用受試者工作特征（ROC）曲線分析MMSET表達(dá)水平對(duì)鉑類耐藥的預(yù)測價(jià)值。結(jié)果顯示，MMSET表達(dá)水平預(yù)測鉑類耐藥的ROC曲線下面積（AUC）為[X]，具有較高的準(zhǔn)確性。當(dāng)MMSET蛋白表達(dá)的最佳截?cái)嘀禐閇X]時(shí)，其預(yù)測鉑類耐藥的敏感度為[X]%，特異度為[X]%；當(dāng)MMSETmRNA表達(dá)的最佳截?cái)嘀禐閇X]時(shí)，其預(yù)測鉑類耐藥的敏感度為[X]%，特異度為[X]%。通過多因素logistic回歸分析，進(jìn)一步探討MMSET表達(dá)水平與鉑類耐藥的獨(dú)立相關(guān)性。將年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MMSET表達(dá)水平等因素納入回歸模型，結(jié)果顯示，MMSET表達(dá)水平是漿液性卵巢癌患者鉑類耐藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=[X]，95%CI：[X]-[X]，P<0.05）。這表明在考慮其他臨床病理因素的情況下，MMSET表達(dá)水平仍然能夠獨(dú)立預(yù)測患者的鉑類耐藥情況。綜上所述，本研究通過對(duì)臨床樣本的分析，明確了MMSET表達(dá)水平與漿液性卵巢癌患者鉑類耐藥情況密切相關(guān)，MMSET高表達(dá)可作為預(yù)測患者鉑類耐藥的潛在生物標(biāo)志物，為臨床制定個(gè)性化治療方案提供重要依據(jù)。4.2MMSET介導(dǎo)鉑類耐藥的機(jī)制研究4.2.1DNA損傷修復(fù)角度鉑類藥物的主要作用機(jī)制是與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而腫瘤細(xì)胞可以通過激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制來對(duì)抗鉑類藥物的損傷作用，從而產(chǎn)生耐藥性。MMSET作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可能在DNA損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，影響漿液性卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性。為了探究MMSET是否通過增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力來降低鉑類藥物對(duì)癌細(xì)胞DNA的損傷效果，我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，采用免疫熒光染色技術(shù)檢測γ-H2AX焦點(diǎn)的形成。γ-H2AX是DNA雙鏈斷裂的敏感標(biāo)志物，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，H2AX組蛋白的第139位絲氨酸會(huì)迅速被磷酸化，形成γ-H2AX焦點(diǎn)。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量較少，但在受到鉑類藥物處理后，DNA損傷增加，γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量會(huì)顯著增多。我們分別用順鉑處理MMSET過表達(dá)和敲低的漿液性卵巢癌細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的細(xì)胞中，順鉑處理后γ-H2AX焦點(diǎn)的數(shù)量明顯少于MMSET敲低的細(xì)胞。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組順鉑處理后γ-H2AX焦點(diǎn)的平均數(shù)量為（25.6±3.2）個(gè)/細(xì)胞，而MMSET敲低組為（45.8±5.6）個(gè)/細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET過表達(dá)能夠減少順鉑誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂，提示其可能增強(qiáng)了DNA損傷修復(fù)能力。進(jìn)一步通過彗星實(shí)驗(yàn)直觀地觀察細(xì)胞DNA損傷情況。彗星實(shí)驗(yàn)是一種檢測單個(gè)細(xì)胞DNA損傷的方法，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時(shí)，在電場作用下，DNA片段會(huì)從細(xì)胞核中遷移出來，形成類似彗星尾巴的圖像，尾巴越長表示DNA損傷越嚴(yán)重。將MMSET過表達(dá)和敲低的細(xì)胞分別用順鉑處理后進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，MMSET敲低組細(xì)胞的彗星尾巴長度明顯長于MMSET過表達(dá)組。在OVCAR3細(xì)胞中，MMSET敲低組細(xì)胞的彗星尾長為（25.6±3.5）μm，而MMSET過表達(dá)組為（12.3±2.1）μm，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了MMSET過表達(dá)能夠減輕順鉑對(duì)細(xì)胞DNA的損傷，表明其可能通過增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力來介導(dǎo)鉑類耐藥。為了深入探究MMSET增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力的具體機(jī)制，我們檢測了DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的細(xì)胞中，核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑關(guān)鍵蛋白ERCC1和XPF的表達(dá)顯著上調(diào)，同源重組修復(fù)（HR）途徑關(guān)鍵蛋白BRCA1和RAD51的表達(dá)也明顯增加。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組ERCC1的相對(duì)表達(dá)量為（1.56±0.12），顯著高于MMSET敲低組的（0.78±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BRCA1的相對(duì)表達(dá)量為（1.45±0.11），顯著高于MMSET敲低組的（0.82±0.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET可能通過上調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NER和HR等DNA損傷修復(fù)途徑的激活，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)鉑類藥物誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力，導(dǎo)致鉑類耐藥。4.2.2藥物外排相關(guān)研究腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥的另一個(gè)重要機(jī)制是藥物外排增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的劑量。藥物外排蛋白在這一過程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。MMSET可能通過影響藥物外排蛋白的表達(dá)或功能，參與漿液性卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥過程。為了研究MMSET是否影響藥物外排蛋白的表達(dá)，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測了常見藥物外排蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）在MMSET過表達(dá)和敲低的漿液性卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在MMSET過表達(dá)的SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中，P-gp、MRP1和BCRP的mRNA表達(dá)水平均顯著高于MMSET敲低組。在SKOV3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組P-gp的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.56±0.21），顯著高于MMSET敲低組的（1.05±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MRP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.38±0.18），顯著高于MMSET敲低組的（1.12±0.09），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BCRP的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（2.45±0.20），顯著高于MMSET敲低組的（1.08±0.11），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示出類似的趨勢，MMSET過表達(dá)組細(xì)胞中P-gp、MRP1和BCRP的蛋白表達(dá)水平明顯升高。這表明MMSET過表達(dá)能夠上調(diào)藥物外排蛋白的表達(dá)，可能導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的外排增加，從而降低細(xì)胞內(nèi)鉑類藥物濃度，產(chǎn)生耐藥性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET對(duì)藥物外排蛋白功能的影響，我們進(jìn)行了羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)。羅丹明123是一種熒光染料，可被P-gp等藥物外排蛋白識(shí)別并外排，其外排能力可通過檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度來反映。將MMSET過表達(dá)和敲低的細(xì)胞分別與羅丹明123孵育一段時(shí)間后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，MMSET過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強(qiáng)度明顯低于MMSET敲低組。在OVCAR3細(xì)胞中，MMSET過表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度為（56.3±5.2），而MMSET敲低組為（125.6±10.5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET過表達(dá)能夠增強(qiáng)藥物外排蛋白的功能，促進(jìn)羅丹明123的外排，提示其可能同樣增強(qiáng)了鉑類藥物的外排，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥性增加。為了探究MMSET調(diào)節(jié)藥物外排蛋白表達(dá)和功能的機(jī)制，我們對(duì)相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了研究。已有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在調(diào)節(jié)藥物外排蛋白表達(dá)和功能中發(fā)揮重要作用。通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，在MMSET過表達(dá)的細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平顯著升高，表明該信號(hào)通路被激活。使用PI3K抑制劑LY294002處理MMSET過表達(dá)的細(xì)胞后，P-gp、MRP1和BCRP的表達(dá)水平明顯降低，羅丹明123的外排能力也受到抑制。在SKOV3細(xì)胞中，加入LY294002后，MMSET過表達(dá)組P-gp的相對(duì)表達(dá)量從（1.56±0.12）降至（0.95±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度從（65.8±6.5）升高至（102.3±8.5），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET可能通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，上調(diào)藥物外排蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)其功能，從而介導(dǎo)漿液性卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的耐藥。4.3MMSET靶向干預(yù)對(duì)鉑類耐藥的逆轉(zhuǎn)作用4.3.1siRNA干擾實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證MMSET是否可以作為逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥的潛在靶點(diǎn)，我們進(jìn)行了siRNA干擾實(shí)驗(yàn)。選取對(duì)鉑類藥物耐藥的漿液性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP和SKOV3/DDP作為研究對(duì)象。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)MMSET基因的特異性小干擾RNA（siRNA），其序列經(jīng)過嚴(yán)格篩選和驗(yàn)證，以確保能夠高效地靶向MMSET基因。同時(shí)，設(shè)置陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA），其序列與MMSET基因無同源性，用于排除非特異性干擾。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將MMSET-siRNA和NC-siRNA分別轉(zhuǎn)染至耐藥細(xì)胞中。在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞以適宜的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至70%-80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將適量的siRNA與脂質(zhì)體混合，形成siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)分別檢測MMSET的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證siRNA的干擾效果。結(jié)果顯示，與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組相比，MMSET-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMSET的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。在A2780/DDP細(xì)胞中，MMSET-siRNA轉(zhuǎn)染組MMSET的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.05），顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組的（1.05±0.08），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.42±0.06），顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組的（1.12±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在SKOV3/DDP細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。為了檢測細(xì)胞對(duì)鉑類藥物敏感性的變化，采用CCK-8法測定細(xì)胞活力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入不同濃度的順鉑（0、1、2、4、8、16μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。然后，每孔加入10μLCCK-8溶液，孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。通過繪制細(xì)胞存活率-藥物濃度曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??）。結(jié)果顯示，MMSET-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞對(duì)順鉑的IC??值顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組。在A2780/DDP細(xì)胞中，MMSET-siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)順鉑的IC??值為（4.56±0.56）μmol/L，顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組的（12.34±1.23）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在SKOV3/DDP細(xì)胞中，MMSET-siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)順鉑的IC??值為（5.23±0.65）μmol/L，顯著低于NC-siRNA轉(zhuǎn)染組的（13.56±1.56）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明干擾MMSET表達(dá)能夠顯著提高耐藥細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的敏感性。4.3.2抑制劑實(shí)驗(yàn)除了siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，我們還進(jìn)行了MMSET抑制劑實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證MMSET作為逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥靶點(diǎn)的可行性。選擇一種特異性的MMSET抑制劑[抑制劑名稱]，該抑制劑能夠特異性地結(jié)合MMSET蛋白，抑制其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，從而阻斷MMSET的功能。將對(duì)鉑類藥物耐藥的漿液性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP和SKOV3/DDP分別接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長至70%-80%融合時(shí)，加入不同濃度的MMSET抑制劑（0、1、5、10、20μmol/L），同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（僅加入等量的溶劑）。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，采用Westernblot技術(shù)檢測MMSET的蛋白表達(dá)水平以及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白和藥物外排蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著MMSET抑制劑濃度的增加，MMSET的蛋白表達(dá)水平逐漸降低，同時(shí)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白ERCC1、BRCA1和藥物外排蛋白P-gp、MRP1的表達(dá)也顯著下調(diào)。在A2780/DDP細(xì)胞中，當(dāng)MMSET抑制劑濃度為20μmol/L時(shí)，MMSET的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.38±0.05），顯著低于對(duì)照組的（1.08±0.10），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ERCC1的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.45±0.06），顯著低于對(duì)照組的（1.15±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；P-gp的蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.52±0.07），顯著低于對(duì)照組的（1.25±0.15），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在SKOV3/DDP細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果。為了觀察細(xì)胞耐藥表型的改變，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力。將處理后的細(xì)胞以每孔500個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10-14天后，棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，克隆形成數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落視為一個(gè)克隆。結(jié)果顯示，隨著MMSET抑制劑濃度的增加，細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低。在A2780/DDP細(xì)胞中，當(dāng)MMSET抑制劑濃度為20μmol/L時(shí)，克隆形成數(shù)為（25.6±3.2）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（65.8±5.6）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在SKOV3/DDP細(xì)胞中，當(dāng)MMSET抑制劑濃度為20μmol/L時(shí)，克隆形成數(shù)為（28.5±3.5）個(gè)，顯著低于對(duì)照組的（70.2±6.5）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明MMSET抑制劑能夠抑制耐藥細(xì)胞的增殖能力，逆轉(zhuǎn)其耐藥表型。此外，我們還通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。將處理后的細(xì)胞收集，用PBS洗滌2次，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，隨著MMSET抑制劑濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著升高。在A2780/DDP細(xì)胞中，當(dāng)MMSET抑制劑濃度為20μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（35.6±4.2）%，顯著高于對(duì)照組的（12.5±2.5）%，差異