二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制：肝癌細胞增殖與凋亡調(diào)控新策略一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和致死率一直居高不下。在我國，肝癌同樣是發(fā)病率和死亡率位居前列的惡性腫瘤，嚴重影響患者的生命質(zhì)量與生存預期。早期肝癌患者通過手術切除、肝移植等手段，部分可以獲得較好的治療效果，但早期肝癌的診斷較為困難，多數(shù)患者確診時已處于中晚期。中晚期肝癌的治療手段雖然包括化療、靶向治療、免疫治療等，但這些方法往往存在局限性，如化療藥物的毒副作用大，患者難以耐受；靶向治療和免疫治療的有效率有限，且容易出現(xiàn)耐藥等問題。總體而言，肝癌的現(xiàn)有治療方法效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低，因此，迫切需要探索新的治療策略來提高肝癌的治療效果。近年來，腫瘤代謝異常成為腫瘤研究領域的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞存在獨特的能量代謝特征，其中對葡萄糖代謝的高度依賴尤為顯著。肝癌細胞通過增強葡萄糖攝取和糖酵解途徑，快速產(chǎn)生能量和生物合成前體，以滿足其異常增殖和生存的需求。這種代謝重編程不僅為肝癌細胞提供了生長優(yōu)勢，也使其對葡萄糖代謝通路產(chǎn)生了特殊的依賴性，為肝癌治療提供了新的潛在靶點。通過抑制葡萄糖代謝來阻斷肝癌細胞的能量供應，干擾其生物合成過程，有望成為一種有效的肝癌治療策略。二甲雙胍作為臨床上廣泛應用的口服抗糖尿病藥物，具有良好的安全性和耐受性。近年來，越來越多的研究表明，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有潛在的抗腫瘤活性。在肝癌治療研究中，二甲雙胍展現(xiàn)出了抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成等多種作用。其作用機制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路、降低細胞內(nèi)ATP水平、調(diào)節(jié)細胞周期等多種途徑有關。然而，單獨使用二甲雙胍治療肝癌的效果相對有限，且不同研究結果存在一定差異?；诟伟┘毎钠咸烟谴x異常以及二甲雙胍的抗腫瘤特性，本研究提出二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制的治療策略，旨在通過協(xié)同作用更有效地抑制肝癌細胞的生長和增殖，促進其凋亡。這種聯(lián)合治療策略有可能克服單一治療方法的局限性，提高治療效果，為肝癌的臨床治療提供新的思路和方法。深入研究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制，不僅有助于揭示肝癌細胞能量代謝與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系，還可能為開發(fā)新型的肝癌治療藥物和方案提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌治療領域，二甲雙胍的抗腫瘤作用是研究熱點之一。國外研究起步較早，多項基礎實驗表明二甲雙胍能抑制肝癌細胞增殖。如[文獻1]通過體外細胞實驗，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可呈劑量和時間依賴性地降低肝癌細胞活力，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期，進而抑制細胞增殖。機制研究揭示，二甲雙胍主要通過激活AMPK信號通路，抑制mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信號傳導，減少蛋白質(zhì)合成，從而阻礙肝癌細胞的生長。在動物實驗方面，[文獻2]構建了肝癌小鼠模型，給予二甲雙胍干預后，小鼠腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長速度顯著減緩，進一步證實了二甲雙胍在體內(nèi)的抗腫瘤效果。此外，一些臨床研究也關注到二甲雙胍與肝癌的關系。一項回顧性研究對糖尿病合并肝癌患者進行分析，發(fā)現(xiàn)服用二甲雙胍的患者肝癌發(fā)病風險更低，且生存期相對較長。然而，不同臨床研究結果存在一定差異，部分研究未能明確二甲雙胍對肝癌患者生存率的顯著影響，這可能與患者個體差異、用藥劑量和療程等因素有關。國內(nèi)對于二甲雙胍抗肝癌作用的研究也取得了一定成果。[文獻3]利用人肝癌細胞系HepG2和Bel-7402進行研究，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠誘導肝癌細胞凋亡，其機制與上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達，激活線粒體凋亡通路密切相關。同時，有研究從炎癥調(diào)控角度探討二甲雙胍的抗肝癌作用，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可抑制肝癌細胞中炎癥相關因子的表達，減輕炎癥微環(huán)境對腫瘤細胞的促進作用。在臨床應用方面，國內(nèi)部分研究嘗試將二甲雙胍聯(lián)合其他治療方法用于肝癌患者。例如，有研究將二甲雙胍聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物用于中晚期肝癌患者，初步觀察到聯(lián)合治療在一定程度上提高了患者的客觀緩解率和疾病控制率，但樣本量較小，仍需大規(guī)模臨床試驗進一步驗證。在葡萄糖代謝抑制與肝癌治療的研究方面，國外研究聚焦于關鍵代謝酶和代謝途徑。己糖激酶-2（HK2）作為糖酵解起始階段的關鍵酶，在肝癌細胞中高表達。[文獻4]通過基因敲低或藥物抑制HK2活性，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖和存活能力明顯下降，腫瘤生長受到抑制。此外，對磷酸果糖激酶-1（PFK1）、丙酮酸激酶M2（PKM2）等糖酵解關鍵酶的研究也表明，抑制這些酶的活性可有效阻斷肝癌細胞的葡萄糖代謝，抑制腫瘤生長。在代謝途徑方面，對Warburg效應（腫瘤細胞即使在有氧條件下也主要通過糖酵解獲取能量）的深入研究為肝癌治療提供了新靶點。一些靶向葡萄糖轉運蛋白（GLUTs）的研究顯示，抑制GLUTs的功能可減少肝癌細胞對葡萄糖的攝取，從而抑制腫瘤細胞生長。國內(nèi)相關研究同樣圍繞葡萄糖代謝關鍵節(jié)點展開。[文獻5]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中葡萄糖代謝相關基因的表達水平與正常肝組織存在顯著差異，高表達的葡萄糖代謝相關基因與肝癌患者的不良預后密切相關。通過小分子抑制劑抑制這些關鍵基因的表達，可有效抑制肝癌細胞的增殖和遷移能力。此外，國內(nèi)研究還關注到代謝重編程與肝癌干細胞特性的關系。研究表明，肝癌干細胞具有獨特的葡萄糖代謝模式，對葡萄糖的依賴程度更高。通過抑制葡萄糖代謝，不僅可以抑制肝癌干細胞的增殖，還能降低其自我更新和分化能力，為肝癌的根治提供了新的思路。關于二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞作用的研究相對較少。國外有研究嘗試將二甲雙胍與HK2抑制劑聯(lián)合應用于肝癌細胞。[文獻6]結果顯示，聯(lián)合處理組的肝癌細胞增殖抑制率明顯高于單獨用藥組，細胞凋亡率顯著增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療可協(xié)同降低肝癌細胞內(nèi)ATP水平，增強氧化應激，導致細胞凋亡。國內(nèi)研究也有類似探索，[文獻7]將二甲雙胍與葡萄糖代謝抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）聯(lián)合作用于肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組在抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞凋亡方面具有明顯的協(xié)同效應。機制研究表明，聯(lián)合用藥通過多條信號通路的交互作用，更有效地抑制肝癌細胞的能量代謝和生存信號。然而，目前國內(nèi)外關于這種聯(lián)合治療策略的研究大多處于細胞實驗和動物實驗階段，在臨床應用方面還存在諸多挑戰(zhàn)，如藥物劑量的優(yōu)化、聯(lián)合用藥的安全性評估以及如何克服腫瘤耐藥性等問題尚未得到充分解決。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響，并揭示其潛在的作用機制，為肝癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。在細胞實驗方面，選取人肝癌細胞系HepG2、Bel-7402等，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。將細胞分為對照組、二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制劑組（如2-脫氧葡萄糖、己糖激酶抑制劑等）、二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制劑組，各處理組添加相應藥物，對照組加等量溶劑。采用MTT法或CCK-8法在不同時間點（24h、48h、72h）檢測細胞增殖，繪制生長曲線；通過流式細胞術，采用AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率，比較各組差異。在指標檢測方面，運用生化分析方法，檢測細胞內(nèi)ATP、ADP水平，分析能量代謝變化；利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術，檢測乳酸含量，明確糖酵解情況；通過檢測活性氧（ROS）水平，評估氧化應激狀態(tài)；采用Westernblot技術，檢測葡萄糖代謝通路關鍵蛋白（如HK2、PFK1、PKM2等）、凋亡相關蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3等）以及AMPK信號通路相關蛋白（p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR等）表達，分析聯(lián)合治療對這些蛋白表達的影響。在機制分析方面，基于實驗結果，從能量代謝、氧化應激、細胞凋亡信號通路等角度探討二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的作用機制。利用基因沉默或過表達技術，改變關鍵基因（如AMPK基因）表達，進一步驗證作用機制；運用生物信息學分析，結合相關數(shù)據(jù)庫，預測潛在作用靶點和信號通路，為深入研究提供參考。1.4研究方法與技術路線在本研究中，我們將采用多種研究方法，以確保全面、深入地探究二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。細胞培養(yǎng)是實驗的基礎環(huán)節(jié)。我們選用人肝癌細胞系HepG2、Bel-7402等，將這些細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度等，及時進行細胞傳代，以保證細胞的活性和正常生長。分組處理是實驗設計的關鍵步驟。將培養(yǎng)的肝癌細胞分為對照組、二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制劑組（如2-脫氧葡萄糖、己糖激酶抑制劑等）、二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制劑組。對照組加入等量的溶劑，以排除溶劑對實驗結果的影響；二甲雙胍組加入一定濃度的二甲雙胍，根據(jù)前期預實驗和相關文獻報道，確定合適的藥物濃度，如1mM、2mM、4mM等；葡萄糖代謝抑制劑組加入相應濃度的抑制劑，同樣依據(jù)預實驗和文獻確定濃度；聯(lián)合用藥組則加入二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑的混合溶液，使兩種藥物的濃度分別達到單獨用藥時的有效濃度。處理過程中，嚴格控制藥物添加的時間和劑量，確保實驗條件的一致性。采用MTT法或CCK-8法檢測細胞增殖情況。在不同時間點（24h、48h、72h），向培養(yǎng)的細胞中加入MTT試劑或CCK-8試劑。MTT法是利用活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。然后用酶標儀在特定波長下（通常為490nm或570nm）測定吸光度，吸光度值與活細胞數(shù)量成正比，從而反映細胞的增殖情況。CCK-8法原理類似，其產(chǎn)生的Formazan是水溶性的，操作更為簡便，靈敏度更高。根據(jù)檢測結果繪制細胞生長曲線，直觀展示不同處理組細胞的增殖趨勢。利用流式細胞術，采用AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，而在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側。FITC標記的AnnexinV可以與PS結合，從而使凋亡早期細胞呈現(xiàn)綠色熒光。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI可以透過細胞膜與細胞核中的DNA結合，使其呈現(xiàn)紅色熒光。將細胞收集后，用AnnexinV-FITC和PI進行雙染，然后通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞比例，從而準確區(qū)分正常細胞、凋亡早期細胞、凋亡中晚期細胞和壞死細胞，計算出細胞凋亡率，比較各組之間的差異。運用生化分析方法，檢測細胞內(nèi)ATP、ADP水平，以了解細胞的能量代謝狀態(tài)。ATP和ADP是細胞能量代謝的關鍵分子，它們的水平變化反映了細胞能量產(chǎn)生和消耗的平衡。采用高效液相色譜（HPLC）或ATP/ADP檢測試劑盒等方法，提取細胞內(nèi)的ATP和ADP，進行定量分析。通過檢測乳酸含量，明確糖酵解情況。乳酸是糖酵解的終產(chǎn)物，其含量增加表明糖酵解途徑活躍。使用乳酸檢測試劑盒，根據(jù)比色法或酶標儀檢測原理，測定細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸含量。利用DCFH-DA探針檢測活性氧（ROS）水平，評估氧化應激狀態(tài)。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的DCF，通過熒光分光光度計或流式細胞儀檢測DCF的熒光強度，即可反映細胞內(nèi)ROS水平。采用Westernblot技術，檢測葡萄糖代謝通路關鍵蛋白（如HK2、PFK1、PKM2等）、凋亡相關蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3等）以及AMPK信號通路相關蛋白（p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR等）表達。首先提取各組細胞的總蛋白，通過BCA法等方法測定蛋白濃度，確保上樣量一致。然后進行SDS-PAGE電泳，將蛋白按分子量大小分離，再將分離后的蛋白轉移到PVDF膜或NC膜上。用5%脫脂奶粉或BSA封閉膜，以防止非特異性結合。接著加入一抗，與目的蛋白特異性結合，一抗孵育后洗膜，再加入相應的二抗，二抗與一抗結合，通過化學發(fā)光法（如ECL試劑）或顯色法（如DAB顯色）使目的蛋白條帶顯現(xiàn)出來，利用圖像分析軟件（如ImageJ）對條帶進行灰度分析，比較不同組蛋白表達量的差異。技術路線如圖1-1所示，首先進行細胞培養(yǎng)，待細胞生長狀態(tài)良好后進行分組處理，然后分別在不同時間點對細胞進行增殖檢測、凋亡檢測、能量代謝指標檢測、氧化應激指標檢測以及蛋白表達檢測。對檢測得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用GraphPadPrism等軟件進行繪圖和統(tǒng)計檢驗，如采用方差分析（ANOVA）比較多組數(shù)據(jù)之間的差異，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。根據(jù)統(tǒng)計分析結果，深入探討二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從細胞培養(yǎng)、分組處理、各項指標檢測到結果分析的流程，標注各步驟所用方法和試劑]圖1-1技術路線圖二、肝癌與能量代謝及二甲雙胍相關理論基礎2.1肝癌的概述肝癌，作為一種發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，主要包括原發(fā)性肝癌和轉移性肝癌，其中原發(fā)性肝癌在臨床上更為常見且危害巨大。原發(fā)性肝癌又可細分為肝細胞癌、肝內(nèi)膽管癌和混合性肝癌。肝細胞癌是原發(fā)性肝癌中最為常見的類型，約占所有原發(fā)性肝癌的90%以上，其發(fā)病與多種因素密切相關，如病毒性肝炎（尤其是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染）、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、黃曲霉毒素污染的食物攝入、遺傳因素等。肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病機制相對復雜，可能與膽管結石、膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎等膽管慢性炎癥刺激，以及某些基因突變等因素有關，其發(fā)病率相對較低，但惡性程度較高，預后較差?；旌闲愿伟﹦t同時含有肝細胞癌和膽管細胞癌兩種成分，較為罕見，其生物學行為和治療策略兼具兩者的特點。在全球范圍內(nèi)，肝癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列，是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90萬例，死亡病例約83萬例，其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第6位，死亡率位居第3位。肝癌的發(fā)病具有明顯的地域差異，亞洲和非洲地區(qū)是肝癌的高發(fā)區(qū)域，其中我國的肝癌負擔尤為沉重。我國是乙肝大國，乙肝病毒感染是導致肝癌發(fā)生的重要危險因素之一，這使得我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)統(tǒng)計，我國肝癌患者數(shù)量約占全球總量的一半以上，發(fā)病人數(shù)超過41萬例，死亡人數(shù)超過39萬例，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中位居第4位，在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第2位。肝癌的高發(fā)病率和高死亡率給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量和社會發(fā)展。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期。早期肝癌患者可能僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如乏力、食欲減退、腹脹、肝區(qū)隱痛等，這些癥狀容易被忽視或與其他疾病混淆。隨著病情的進展，患者可能出現(xiàn)肝區(qū)疼痛加劇、肝臟腫大、黃疸、腹水、消瘦、發(fā)熱等癥狀。中晚期肝癌患者往往伴有腫瘤轉移，常見的轉移部位包括肺、骨、淋巴結等，這進一步增加了治療的難度和復雜性。目前，肝癌的治療方法主要包括手術切除、肝移植、局部消融治療、動脈化療栓塞、放療、靶向治療、免疫治療等。手術切除和肝移植是早期肝癌的首選治療方法，對于部分患者可以達到根治的目的，但由于早期診斷困難，很多患者在確診時已錯過手術時機。對于中晚期肝癌患者，多種治療方法的綜合應用雖然在一定程度上延長了患者的生存期，但總體治療效果仍不盡人意，患者的5年生存率較低。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機制，探索新的治療策略，對于提高肝癌的治療效果、改善患者的預后具有重要意義。2.2肝癌細胞的能量代謝特征肝癌細胞的能量代謝與正常肝細胞相比存在顯著差異，這種異常的能量代謝模式為肝癌細胞的快速生長、增殖和存活提供了必要的物質(zhì)和能量基礎。肝癌細胞對葡萄糖的攝取顯著增加，這是其能量代謝異常的重要表現(xiàn)之一。正常肝細胞在有氧條件下主要通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，對葡萄糖的利用相對較低。而肝癌細胞即使在氧氣充足的情況下，也主要依賴糖酵解途徑獲取能量，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應。研究表明，肝癌細胞表面的葡萄糖轉運蛋白（GLUTs）表達上調(diào)，尤其是GLUT1和GLUT3，它們能夠高效地將葡萄糖轉運進入細胞內(nèi)。[文獻8]通過對肝癌組織和正常肝組織的對比研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中GLUT1的表達水平是正常肝組織的數(shù)倍，這使得肝癌細胞能夠攝取更多的葡萄糖，以滿足其快速增殖和代謝的需求。在糖酵解途徑中，肝癌細胞內(nèi)的關鍵酶活性增強。己糖激酶-2（HK2）作為糖酵解起始階段的關鍵酶，在肝癌細胞中高表達。HK2能夠催化葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，從而啟動糖酵解過程。[文獻9]研究顯示，敲低肝癌細胞中的HK2基因表達后，細胞的糖酵解速率明顯降低，增殖能力受到顯著抑制。磷酸果糖激酶-1（PFK1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）等糖酵解關鍵酶在肝癌細胞中也呈現(xiàn)高活性狀態(tài)。PFK1催化6-磷酸果糖生成1,6-二磷酸果糖，是糖酵解過程中的限速步驟，其活性增強可加速糖酵解進程。PKM2是丙酮酸激酶的一種同工酶，在肝癌細胞中大量表達，它可以調(diào)節(jié)糖酵解的通量，同時還參與細胞的生物合成過程。當PKM2被激活時，可促進丙酮酸的生成，進而加速糖酵解，為肝癌細胞提供更多的能量和生物合成前體。由于肝癌細胞主要通過糖酵解獲取能量，其代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生量也顯著增加。大量的乳酸積累在腫瘤微環(huán)境中，導致微環(huán)境酸化，pH值降低。這種酸性環(huán)境不僅有利于肝癌細胞的侵襲和轉移，還可以抑制免疫細胞的功能，幫助肝癌細胞逃避免疫監(jiān)視。[文獻10]研究發(fā)現(xiàn)，酸性微環(huán)境可以上調(diào)肝癌細胞表面的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達，MMPs能夠降解細胞外基質(zhì)，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。此外，酸性環(huán)境還可以抑制T細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等免疫細胞的活性，降低它們對肝癌細胞的殺傷能力。肝癌細胞的異常能量代謝還與線粒體功能改變有關。雖然肝癌細胞主要依賴糖酵解，但線粒體在其能量代謝中仍發(fā)揮著一定作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞中的線粒體形態(tài)和功能發(fā)生了改變，線粒體的數(shù)量減少，膜電位降低，呼吸鏈復合物的活性下降。這些改變導致線粒體的氧化磷酸化功能受損，能量產(chǎn)生效率降低。然而，線粒體在肝癌細胞中并非完全失去功能，它仍然參與一些重要的代謝過程，如脂肪酸氧化、三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）等。在某些情況下，肝癌細胞可以通過調(diào)節(jié)線粒體代謝來適應能量需求的變化。當糖酵解受到抑制時，肝癌細胞可能會增強線粒體的脂肪酸氧化功能，以維持能量供應。2.3二甲雙胍的作用機制及在腫瘤治療中的研究進展二甲雙胍作為臨床上廣泛應用的口服降糖藥物，其在糖尿病治療領域已得到充分認可。二甲雙胍的常規(guī)作用機制主要是通過抑制肝臟葡萄糖輸出，減少肝糖原異生，降低空腹血糖水平；同時，它還能增加外周組織（如骨骼?。ζ咸烟堑臄z取和利用，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。在細胞水平上，二甲雙胍作用于線粒體，抑制線粒體呼吸鏈復合物I的活性，減少ATP生成，使細胞內(nèi)AMP/ATP比值升高。這種能量狀態(tài)的改變激活了腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），AMPK是細胞內(nèi)重要的能量感受器和代謝調(diào)節(jié)激酶。激活后的AMPK通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細胞代謝過程，如抑制脂肪酸合成、促進脂肪酸氧化、抑制蛋白質(zhì)合成等，從而降低血糖水平。近年來，二甲雙胍在腫瘤治療領域的研究逐漸受到關注，展現(xiàn)出潛在的抗腫瘤活性。在肝癌細胞研究中，多項實驗表明二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞的增殖。其作用機制可能與激活AMPK信號通路密切相關。激活的AMPK可以抑制mTOR信號傳導，mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖、代謝等過程中發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用。抑制mTOR信號可減少蛋白質(zhì)合成，阻斷細胞周期進程，從而抑制肝癌細胞的生長。[文獻11]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理肝癌細胞后，細胞內(nèi)p-mTOR、p-S6K（mTOR下游底物）等蛋白表達水平顯著降低，細胞周期阻滯在G0/G1期，細胞增殖受到明顯抑制。二甲雙胍還能夠誘導肝癌細胞凋亡。研究表明，二甲雙胍可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，使Bax/Bcl-2比值升高，從而激活線粒體凋亡通路。線粒體膜電位下降，細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（caspase-9）等形成凋亡小體，激活caspase級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。[文獻12]通過實驗證實，二甲雙胍處理肝癌細胞后，caspase-3、caspase-9等凋亡相關蛋白的活性明顯增強，細胞凋亡率顯著增加。在能量代謝方面，二甲雙胍可降低肝癌細胞內(nèi)ATP水平。如前所述，二甲雙胍抑制線粒體呼吸鏈復合物I活性，減少ATP生成，使細胞處于能量應激狀態(tài)。這種能量狀態(tài)的改變不僅影響細胞的代謝過程，還可能通過激活相關信號通路，抑制肝癌細胞的生存和增殖能力。[文獻13]研究顯示，二甲雙胍處理肝癌細胞后，細胞內(nèi)ATP水平明顯降低，細胞的存活和增殖受到抑制，且這種抑制作用與ATP水平的降低呈正相關。此外，二甲雙胍還可能通過調(diào)節(jié)其他代謝途徑，如脂肪酸代謝、氨基酸代謝等，影響肝癌細胞的能量代謝和生存。2.4葡萄糖代謝抑制與腫瘤治療的關系腫瘤細胞的生長和增殖高度依賴于葡萄糖代謝，這一特性使得抑制葡萄糖代謝成為腫瘤治療的重要策略之一。葡萄糖作為細胞的主要能量來源，對于腫瘤細胞的快速生長和無限增殖起著關鍵作用。腫瘤細胞通過一系列代謝重編程，增強葡萄糖攝取和糖酵解途徑，以滿足其對能量和生物合成前體的大量需求。當葡萄糖代謝受到抑制時，腫瘤細胞的能量供應被切斷，生物合成過程受阻，從而影響其生存和增殖能力。從能量供應角度來看，抑制葡萄糖代謝主要通過干擾糖酵解和氧化磷酸化途徑來實現(xiàn)。在糖酵解途徑中，己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶-1（PFK1）和丙酮酸激酶（PK）等關鍵酶催化一系列反應，將葡萄糖逐步轉化為丙酮酸，并產(chǎn)生少量ATP。抑制這些關鍵酶的活性，可阻斷糖酵解過程，減少ATP的生成。例如，己糖激酶-2（HK2）在腫瘤細胞中高表達，它能將葡萄糖磷酸化，使其無法逸出細胞，從而啟動糖酵解。通過抑制HK2活性，可阻止葡萄糖進入糖酵解途徑，降低細胞內(nèi)ATP水平，使腫瘤細胞因能量匱乏而無法維持正常的生理功能。在氧化磷酸化途徑中，葡萄糖經(jīng)糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸進入線粒體，參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)），最終通過電子傳遞鏈產(chǎn)生大量ATP。抑制氧化磷酸化過程中的關鍵環(huán)節(jié)，如線粒體呼吸鏈復合物的活性，可減少ATP的產(chǎn)生，影響腫瘤細胞的能量供應。當線粒體呼吸鏈復合物I被抑制時，電子傳遞受阻，ATP合成減少，腫瘤細胞的能量代謝受到嚴重干擾。在生物合成方面，葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物是合成多種生物大分子的前體。葡萄糖-6-磷酸可進入磷酸戊糖途徑（PPP），產(chǎn)生核糖-5-磷酸和NADPH。核糖-5-磷酸是合成核酸的重要原料，NADPH則參與脂肪酸、膽固醇等生物分子的合成以及維持細胞的氧化還原平衡。抑制葡萄糖代謝會減少這些中間產(chǎn)物的生成，進而影響核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的合成，阻礙腫瘤細胞的增殖和生長。當磷酸戊糖途徑受到抑制時，核糖-5-磷酸和NADPH的生成減少，腫瘤細胞無法正常合成核酸和進行生物合成反應，其增殖能力受到抑制。常見的葡萄糖代謝抑制劑種類繁多，作用機制各異。2-脫氧葡萄糖（2-DG）是一種葡萄糖類似物，它與葡萄糖結構相似，能夠競爭性地結合己糖激酶，被磷酸化后形成2-脫氧葡萄糖-6-磷酸（2-DG-6-P）。2-DG-6-P不能進一步代謝，卻能在細胞內(nèi)大量積累，反饋抑制己糖激酶活性，從而阻斷糖酵解過程。[文獻14]研究表明，2-DG處理腫瘤細胞后，細胞內(nèi)ATP水平顯著下降，糖酵解速率受到抑制，腫瘤細胞的增殖和存活能力明顯降低。3-溴丙酮酸（3-BP）是丙酮酸的類似物，它可以不可逆地抑制丙酮酸激酶M2（PKM2）的活性，同時還能干擾線粒體呼吸鏈復合物I的功能。[文獻15]實驗顯示，3-BP能夠有效地抑制腫瘤細胞的葡萄糖代謝，誘導細胞凋亡，并且在動物實驗中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。在應用研究方面，葡萄糖代謝抑制劑在腫瘤治療中展現(xiàn)出一定的潛力，但也面臨著一些挑戰(zhàn)。在細胞實驗中，多種葡萄糖代謝抑制劑對腫瘤細胞的增殖和存活具有顯著的抑制作用。然而，在動物實驗和臨床試驗中，其效果往往受到多種因素的影響。藥物的靶向性不足是一個重要問題，許多葡萄糖代謝抑制劑在抑制腫瘤細胞葡萄糖代謝的同時，也會對正常細胞產(chǎn)生一定的毒性作用，導致副作用增加。腫瘤細胞的異質(zhì)性使得不同腫瘤細胞對葡萄糖代謝抑制劑的敏感性存在差異，部分腫瘤細胞可能通過激活其他代謝途徑來代償葡萄糖代謝的抑制，從而產(chǎn)生耐藥性。為了克服這些問題，研究人員正在探索聯(lián)合治療策略，將葡萄糖代謝抑制劑與其他抗腫瘤藥物（如化療藥物、靶向藥物、免疫治療藥物等）聯(lián)合使用，以提高治療效果，降低副作用。[文獻16]研究將葡萄糖代謝抑制劑與化療藥物聯(lián)合應用于腫瘤小鼠模型，結果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤生長抑制效果明顯優(yōu)于單藥治療組，且未增加明顯的毒副作用。同時，開發(fā)新型的靶向性葡萄糖代謝抑制劑，提高藥物對腫瘤細胞的特異性，也是當前研究的熱點之一。三、實驗材料與方法3.1實驗材料人肝癌細胞系HepG2購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細胞復蘇后，在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）的高糖DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium，HyClone公司，美國）中培養(yǎng)，添加1%青鏈霉素雙抗（100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，Solarbio公司，中國），以防止微生物污染。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國），定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞融合度達到80%-90%時進行傳代或實驗處理。二甲雙胍（純度≥98%，MedChemExpress公司，美國）用無菌PBS（磷酸鹽緩沖液，pH7.4，Solarbio公司，中國）溶解，配制成100mM的母液，0.22μm濾膜過濾除菌后，-20℃保存?zhèn)溆?。實驗時根據(jù)需要用培養(yǎng)基稀釋至相應濃度。葡萄糖代謝抑制劑選用2-脫氧葡萄糖（2-DG，純度≥99%，Sigma-Aldrich公司，美國）。將2-DG用無菌PBS溶解，配制成500mM的母液，同樣經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，-20℃保存。使用時用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。細胞增殖檢測采用CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本）。該試劑盒利用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值，即可反映細胞增殖情況。細胞凋亡檢測使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國）。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側，AnnexinV-FITC可以與之特異性結合，從而使凋亡早期細胞呈現(xiàn)綠色熒光。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI可以透過細胞膜與細胞核中的DNA結合，使其呈現(xiàn)紅色熒光。通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞比例，能夠準確區(qū)分正常細胞、凋亡早期細胞、凋亡中晚期細胞和壞死細胞，計算細胞凋亡率。ATP檢測試劑盒（Beyotime公司，中國）用于檢測細胞內(nèi)ATP水平。其原理是利用熒光素-熒光素酶體系，ATP在熒光素酶的催化下，與熒光素反應生成氧化熒光素并發(fā)出熒光，熒光強度與ATP含量成正比，通過熒光分光光度計測定熒光強度，可定量檢測細胞內(nèi)ATP含量。ADP檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）則采用酶循環(huán)法檢測細胞內(nèi)ADP含量，通過檢測特定波長下的吸光度變化，計算ADP含量。乳酸檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）基于乳酸脫氫酶催化乳酸氧化生成丙酮酸的反應，同時NAD?被還原為NADH，在特定波長下檢測NADH的生成量，從而間接測定乳酸含量?；钚匝酰≧OS）檢測采用DCFH-DA探針（Beyotime公司，中國）。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被ROS氧化生成具有熒光的DCF，通過熒光分光光度計或流式細胞儀檢測DCF的熒光強度，即可反映細胞內(nèi)ROS水平。蛋白提取使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Solarbio公司，中國），能夠有效裂解細胞，提取細胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）用于測定蛋白濃度，其原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子反應生成絡合物，BCA試劑與絡合物結合形成紫色復合物，在562nm處有最大吸收峰，通過測定吸光度值，與標準曲線對比，可計算出蛋白濃度。用于Westernblot檢測的一抗包括兔抗人HK2抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人PFK1抗體（1:1000，Abcam公司，英國）、兔抗人PKM2抗體（1:1000，Proteintech公司，美國）、兔抗人Bax抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人Bcl-2抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人cleaved-caspase-3抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人p-AMPK抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人AMPK抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人p-mTOR抗體（1:1000，CST公司，美國）、兔抗人mTOR抗體（1:1000，CST公司，美國）以及鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma-Aldrich公司，美國）作為內(nèi)參抗體。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000，CST公司，美國）和山羊抗鼠IgG抗體（1:5000，CST公司，美國）。實驗儀器包括CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）、超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國）、低速離心機（Eppendorf公司，德國）、酶標儀（Bio-Tek公司，美國）、流式細胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司，美國）、熒光分光光度計（Hitachi公司，日本）、垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國）、半干轉膜儀（Bio-Rad公司，美國）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司，中國）等。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與分組將人肝癌細胞系HepG2從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其快速融化。隨后，將細胞懸液轉移至含有10mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。再用適量新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，將其接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細胞，進行傳代培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度至5×10?個/mL。將細胞接種于96孔板中，每孔加入100μL細胞懸液，每組設置6個復孔。待細胞貼壁后，進行分組處理。對照組加入等體積的培養(yǎng)基；二甲雙胍組加入終濃度為2mM的二甲雙胍溶液；葡萄糖代謝抑制組加入終濃度為5mM的2-脫氧葡萄糖溶液；聯(lián)合應用組加入終濃度為2mM的二甲雙胍和5mM的2-脫氧葡萄糖的混合溶液。處理后，將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.2.2細胞增殖檢測采用MTT法檢測細胞增殖情況。在處理后的0h、24h、48h和72h進行檢測。在相應時間點，向每孔中加入10μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需先1000rpm離心5min，再吸棄上清液。然后每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。MTT法的原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。DMSO能溶解細胞中的甲瓚，通過測定490nm處的吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。3.2.3細胞凋亡檢測運用流式細胞術，采用AnnexinV-FITC/PI雙標法檢測細胞凋亡率。在藥物處理48h后，收集各組細胞。對于貼壁細胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶消化，然后用預冷的PBS洗滌2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。將細胞重懸于195μLBindingBuffer中，使其濃度為1×10?個/mL。向細胞懸液中加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPIStainingSolution，輕輕混勻，避光、室溫孵育15min。孵育后，立即用流式細胞儀進行檢測。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細胞凋亡早期，PS會從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側，AnnexinV-FITC可以與之特異性結合，從而使凋亡早期細胞呈現(xiàn)綠色熒光。PI是一種核酸染料，不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI可以透過細胞膜與細胞核中的DNA結合，使其呈現(xiàn)紅色熒光。通過流式細胞儀檢測不同熒光強度的細胞比例，能夠準確區(qū)分正常細胞（AnnexinV?/PI?）、凋亡早期細胞（AnnexinV?/PI?）、凋亡中晚期細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算細胞凋亡率（凋亡早期細胞和凋亡中晚期細胞及壞死細胞的比例之和）。3.2.4葡萄糖代謝通路相關蛋白表達檢測運用Westernblot技術檢測各組細胞中葡萄糖代謝通路相關蛋白表達。藥物處理48h后，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗滌細胞3次，每次5min。向培養(yǎng)瓶中加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min。然后將細胞裂解液轉移至離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白分子量配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，進行電泳。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF膜2h，以防止非特異性結合。封閉后，將PVDF膜與一抗（兔抗人HK2抗體、兔抗人PFK1抗體、兔抗人PKM2抗體等，稀釋比例為1:1000）在4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后與辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000）在室溫下孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后采用化學發(fā)光法（ECL試劑）使目的蛋白條帶顯現(xiàn)出來，利用圖像分析軟件（如ImageJ）對條帶進行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，比較不同組蛋白表達量的差異。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用GraphPadPrism8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。對于多組間數(shù)據(jù)的比較，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。若方差齊性，進一步進行LSD-t檢驗，用于兩兩比較，以明確具體組間差異情況。若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗進行多重比較。對于兩組間數(shù)據(jù)的比較，采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。在細胞增殖實驗中，通過分析不同時間點各組細胞的吸光度值，利用方差分析判斷不同處理組細胞增殖能力是否存在顯著差異。若存在差異，再通過兩兩比較明確二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組與對照組之間，以及各處理組之間的差異情況。在細胞凋亡實驗中，運用方差分析比較各組細胞凋亡率，確定不同處理對細胞凋亡的影響是否具有統(tǒng)計學意義。在蛋白表達檢測中，對Westernblot條帶的灰度值進行統(tǒng)計分析，同樣采用方差分析和兩兩比較的方法，判斷葡萄糖代謝通路相關蛋白、凋亡相關蛋白以及AMPK信號通路相關蛋白在不同組間的表達差異是否顯著。通過嚴謹?shù)臄?shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，準確揭示二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。四、實驗結果4.1二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖的影響通過MTT法檢測不同處理組肝癌細胞的增殖情況，結果如圖4-1所示。在0h時，各組細胞的吸光度值無顯著差異，表明初始細胞數(shù)量和活性基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組細胞呈現(xiàn)出典型的對數(shù)生長趨勢，吸光度值逐漸增加，顯示出旺盛的增殖能力。二甲雙胍組在24h時，細胞增殖受到一定程度的抑制，吸光度值低于對照組，但差異尚未達到統(tǒng)計學意義（P>0.05）。48h后，二甲雙胍對肝癌細胞增殖的抑制作用逐漸明顯，吸光度值顯著低于對照組（P<0.05）。72h時，抑制效果更為顯著，細胞增殖受到明顯阻礙。這表明二甲雙胍能夠抑制肝癌細胞的增殖，且作用效果隨著時間的延長而增強。葡萄糖代謝抑制組在24h時，細胞增殖也受到抑制，吸光度值低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著時間推移，48h和72h時抑制作用進一步增強，吸光度值與對照組相比差異顯著（P<0.01）。這說明葡萄糖代謝抑制劑通過阻斷葡萄糖代謝途徑，有效抑制了肝癌細胞的增殖。聯(lián)合應用組在24h時，細胞增殖抑制作用即較為明顯，吸光度值顯著低于對照組（P<0.01）。48h和72h時，聯(lián)合應用組的吸光度值均顯著低于二甲雙胍組和葡萄糖代謝抑制組（P<0.01）。從細胞生長曲線可以直觀地看出，聯(lián)合應用組的曲線斜率明顯低于其他三組，表明聯(lián)合處理對肝癌細胞增殖的抑制效果最為顯著。[此處插入細胞增殖曲線，橫坐標為時間（0h、24h、48h、72h），縱坐標為吸光度值，四條曲線分別代表對照組、二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組]圖4-1不同處理組肝癌細胞增殖曲線對不同時間點各組細胞吸光度值進行方差分析，結果顯示時間因素和處理因素均對細胞增殖有顯著影響（P<0.01）。進一步進行兩兩比較，結果表明在24h時，二甲雙胍組與對照組差異不顯著（P>0.05），葡萄糖代謝抑制組和聯(lián)合應用組與對照組差異顯著（P<0.01）。48h時，二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組與對照組相比均有顯著差異（P<0.01），且聯(lián)合應用組與二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組相比差異顯著（P<0.01）。72h時，各處理組與對照組差異均極顯著（P<0.01），聯(lián)合應用組與其他兩組相比差異也極顯著（P<0.01）。綜上所述，二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑單獨使用均能抑制肝癌細胞的增殖，且隨著時間延長抑制作用增強。二者聯(lián)合應用時，對肝癌細胞增殖的抑制效果具有協(xié)同作用，顯著優(yōu)于單獨使用二甲雙胍或葡萄糖代謝抑制劑。4.2二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞凋亡的影響采用流式細胞術，運用AnnexinV-FITC/PI雙標法對各組肝癌細胞的凋亡情況進行檢測，結果如圖4-2所示。[此處插入流式細胞術檢測細胞凋亡結果圖，圖中包含四組細胞的散點圖，分別為對照組、二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組，橫坐標為FITC-AnnexinV熒光強度，縱坐標為PI熒光強度，不同象限代表不同狀態(tài)的細胞，如正常細胞（AnnexinV?/PI?）、凋亡早期細胞（AnnexinV?/PI?）、凋亡中晚期細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）]圖4-2流式細胞術檢測不同處理組肝癌細胞凋亡情況對照組細胞凋亡率較低，早期凋亡細胞和晚期凋亡及壞死細胞的比例之和僅為（3.56±0.45）%。這表明在正常培養(yǎng)條件下，肝癌細胞處于相對穩(wěn)定的生長狀態(tài)，凋亡發(fā)生較少。二甲雙胍組細胞凋亡率有所升高，達到（10.25±1.02）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，早期凋亡細胞比例明顯增加，這說明二甲雙胍能夠誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡，啟動細胞的程序性死亡過程。葡萄糖代謝抑制組細胞凋亡率為（12.87±1.20）%，同樣顯著高于對照組（P<0.01）。表明抑制葡萄糖代謝通路對肝癌細胞的生存產(chǎn)生了明顯影響，促使更多細胞進入凋亡程序。聯(lián)合應用組細胞凋亡率高達（25.68±2.15）%，顯著高于二甲雙胍組和葡萄糖代謝抑制組（P<0.01）。在聯(lián)合處理下，早期凋亡細胞和晚期凋亡及壞死細胞的比例均大幅增加，這充分顯示出二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞凋亡具有顯著的協(xié)同促進作用。對各組細胞凋亡率進行方差分析，結果顯示處理因素對細胞凋亡率有極顯著影響（P<0.01）。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組與對照組相比，細胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。聯(lián)合應用組與二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組相比，細胞凋亡率差異極顯著（P<0.01）。綜上所述，二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑單獨作用時，均能誘導肝癌細胞凋亡，但聯(lián)合應用時，對肝癌細胞凋亡的促進作用更為顯著，二者在誘導細胞凋亡方面具有協(xié)同效應。4.3對葡萄糖代謝通路相關蛋白表達的影響采用Westernblot技術檢測各組細胞中葡萄糖代謝通路關鍵蛋白己糖激酶-2（HK2）、磷酸果糖激酶-1（PFK1）和丙酮酸激酶M2（PKM2）的表達，結果如圖4-3所示。[此處插入Westernblot實驗結果圖，圖中展示對照組、二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組中HK2、PFK1、PKM2蛋白條帶，β-actin作為內(nèi)參條帶，下方標注對應蛋白名稱和組別]圖4-3Westernblot檢測不同處理組肝癌細胞葡萄糖代謝通路相關蛋白表達對照組細胞中HK2、PFK1和PKM2蛋白均呈較高表達水平。二甲雙胍組中，HK2蛋白表達水平略有下降，但差異不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；PFK1蛋白表達水平下降，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；PKM2蛋白表達水平也有所降低，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明二甲雙胍對肝癌細胞葡萄糖代謝通路關鍵蛋白的表達有一定的抑制作用，尤其是對PFK1和PKM2蛋白。葡萄糖代謝抑制組中，HK2、PFK1和PKM2蛋白表達水平均顯著下降，與對照組相比差異極顯著（P<0.01）。這說明葡萄糖代謝抑制劑通過直接抑制葡萄糖代謝通路，有效降低了這些關鍵蛋白的表達，從而阻礙葡萄糖代謝過程。聯(lián)合應用組中，HK2、PFK1和PKM2蛋白表達水平進一步顯著降低，與二甲雙胍組和葡萄糖代謝抑制組相比差異均極顯著（P<0.01）。從條帶灰度分析結果可以看出，聯(lián)合應用組的蛋白條帶灰度值明顯低于其他三組，表明聯(lián)合處理對葡萄糖代謝通路關鍵蛋白表達的抑制作用最為顯著。對各組蛋白表達量進行方差分析，結果顯示處理因素對HK2、PFK1和PKM2蛋白表達均有極顯著影響（P<0.01）。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝抑制組、聯(lián)合應用組與對照組相比，HK2、PFK1和PKM2蛋白表達差異均極顯著（P<0.01）。聯(lián)合應用組與二甲雙胍組、葡萄糖代謝抑制組相比，HK2、PFK1和PKM2蛋白表達差異也極顯著（P<0.01）。綜上所述，二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑單獨作用時，均能抑制肝癌細胞葡萄糖代謝通路關鍵蛋白的表達，且葡萄糖代謝抑制劑的抑制作用更為明顯。二者聯(lián)合應用時，對葡萄糖代謝通路關鍵蛋白表達的抑制作用具有協(xié)同效應，顯著降低了HK2、PFK1和PKM2蛋白的表達水平，從而更有效地阻斷肝癌細胞的葡萄糖代謝通路。五、討論5.1二甲雙胍與葡萄糖代謝抑制聯(lián)合作用的效果分析本研究結果顯示，二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制在抑制肝癌細胞增殖和促進凋亡方面展現(xiàn)出顯著的協(xié)同增效作用。從細胞增殖實驗結果來看，單獨使用二甲雙胍或葡萄糖代謝抑制劑時，肝癌細胞的增殖均受到一定程度的抑制，但聯(lián)合應用組的抑制效果更為突出。在24h時，聯(lián)合應用組細胞增殖抑制作用即顯著高于對照組，48h和72h時，其抑制效果不僅顯著優(yōu)于對照組，也明顯強于二甲雙胍組和葡萄糖代謝抑制組。這表明二者聯(lián)合能夠更快、更有效地阻斷肝癌細胞的增殖進程，使細胞生長停滯在早期階段。在細胞凋亡實驗中，同樣觀察到聯(lián)合應用的協(xié)同優(yōu)勢。二甲雙胍組和葡萄糖代謝抑制組均能誘導肝癌細胞凋亡，但聯(lián)合應用組的細胞凋亡率遠高于單獨用藥組。這說明二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑聯(lián)合作用時，能夠更有效地激活細胞凋亡信號通路，促使更多肝癌細胞進入凋亡程序，從而發(fā)揮更強的抗腫瘤作用。這種協(xié)同增效作用可能源于二者作用機制的互補。二甲雙胍主要通過激活AMPK信號通路，抑制mTOR信號傳導，減少蛋白質(zhì)合成，進而抑制肝癌細胞的生長。同時，二甲雙胍還能誘導細胞凋亡，調(diào)節(jié)細胞周期。而葡萄糖代謝抑制劑則直接阻斷肝癌細胞的葡萄糖代謝通路，減少能量供應和生物合成前體，從能量代謝層面抑制細胞的增殖和存活。當二者聯(lián)合使用時，一方面，二甲雙胍通過調(diào)節(jié)細胞信號通路，增強了肝癌細胞對葡萄糖代謝抑制的敏感性；另一方面，葡萄糖代謝抑制劑降低了細胞內(nèi)ATP水平，加劇了細胞的能量應激，進一步激活了二甲雙胍介導的AMPK信號通路，形成了一個相互促進的作用網(wǎng)絡。與單獨使用二甲雙胍相比，聯(lián)合應用葡萄糖代謝抑制顯著增強了對肝癌細胞的抑制效果。單獨使用二甲雙胍時，雖然能在一定程度上抑制肝癌細胞增殖和誘導凋亡，但其作用相對有限。而聯(lián)合應用后，不僅在細胞增殖抑制和凋亡誘導方面效果更顯著，還能更有效地抑制葡萄糖代謝通路關鍵蛋白的表達，進一步證實了聯(lián)合治療在干擾肝癌細胞能量代謝和生存信號方面的優(yōu)勢。與單獨使用葡萄糖代謝抑制劑相比，聯(lián)合應用二甲雙胍同樣展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。單獨使用葡萄糖代謝抑制劑主要通過抑制葡萄糖代謝通路發(fā)揮作用，但肝癌細胞可能會通過激活其他代償性代謝途徑來維持生存。而二甲雙胍的加入，不僅從能量代謝角度協(xié)同抑制細胞生長，還能通過調(diào)節(jié)細胞信號通路，抑制肝癌細胞的代償反應，從而更全面地抑制肝癌細胞的生長和存活。5.2作用機制探討從能量代謝角度來看，二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞ATP水平的影響是其發(fā)揮作用的關鍵環(huán)節(jié)之一。研究表明，二甲雙胍能夠抑制線粒體呼吸鏈復合物I的活性，減少ATP生成。而葡萄糖代謝抑制劑，如2-脫氧葡萄糖，通過阻斷糖酵解途徑，進一步降低細胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生。當二者聯(lián)合應用時，肝癌細胞的能量供應受到雙重打擊。一方面，線粒體氧化磷酸化過程受阻，減少了ATP的主要生成途徑；另一方面，糖酵解途徑被抑制，無法通過糖酵解產(chǎn)生少量ATP來代償。這種能量匱乏狀態(tài)使肝癌細胞無法維持正常的生理功能，如DNA合成、蛋白質(zhì)合成以及細胞分裂等過程都需要大量ATP供能，能量不足導致這些過程無法正常進行，從而抑制了細胞的增殖。同時，低ATP水平還會激活細胞內(nèi)的能量應激信號通路，促使細胞進入凋亡程序。當細胞內(nèi)ATP水平低于一定閾值時，會激活AMPK等能量感受器，AMPK激活后會通過一系列下游信號傳導，調(diào)節(jié)細胞代謝和生存相關的基因表達，最終導致細胞凋亡。乳酸積累也是聯(lián)合作用機制中的重要方面。肝癌細胞主要通過糖酵解獲取能量，糖酵解過程會產(chǎn)生大量乳酸。葡萄糖代謝抑制劑阻斷糖酵解途徑后，細胞內(nèi)乳酸的產(chǎn)生減少，但由于細胞代謝紊亂，乳酸的清除能力也受到影響。二甲雙胍的加入進一步加劇了這種代謝失衡。二甲雙胍抑制線粒體功能，使細胞對乳酸的氧化利用能力下降。正常情況下，細胞可以將乳酸轉運至線粒體進行氧化，產(chǎn)生能量。但在二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑聯(lián)合作用下，線粒體功能受損，乳酸無法有效被氧化，從而在細胞內(nèi)大量積累。高濃度的乳酸會導致細胞內(nèi)環(huán)境酸化，改變細胞內(nèi)的pH值。酸性環(huán)境會影響多種酶的活性，如參與細胞代謝、信號傳導和DNA修復等過程的酶。酶活性的改變會干擾細胞的正常生理功能，進而抑制細胞增殖。同時，酸性環(huán)境還會激活一些凋亡相關的信號通路，如caspase級聯(lián)反應。研究發(fā)現(xiàn)，酸性環(huán)境可以通過激活caspase-3等凋亡相關蛋白酶，誘導細胞凋亡。此外，乳酸積累還可能通過影響細胞的氧化還原平衡，促進活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進一步加劇細胞的損傷和凋亡。氧化應激在二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制誘導肝癌細胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。當肝癌細胞受到二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑的聯(lián)合處理時，細胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，ROS水平顯著升高。一方面，葡萄糖代謝抑制導致細胞能量供應不足，線粒體功能受損，電子傳遞鏈異常，使電子泄漏增加，從而產(chǎn)生更多的ROS。另一方面，二甲雙胍可以通過抑制線粒體呼吸鏈復合物I，進一步促進ROS的生成。高濃度的ROS會對細胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成損傷。ROS可以氧化DNA，導致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷，影響DNA的正常復制和轉錄。蛋白質(zhì)被氧化后，其結構和功能會發(fā)生改變，導致細胞內(nèi)信號傳導紊亂。脂質(zhì)過氧化會破壞細胞膜的完整性，影響細胞的物質(zhì)運輸和信號傳遞功能。這些損傷會激活細胞內(nèi)的應激反應和凋亡信號通路。細胞內(nèi)存在多種抗氧化防御機制，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶，以及谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物質(zhì)。當ROS水平升高時，細胞內(nèi)的抗氧化防御機制會被激活，試圖清除過多的ROS。但在二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制的作用下，細胞的抗氧化能力不足以應對大量產(chǎn)生的ROS，導致ROS持續(xù)積累。過量的ROS會激活p53、JNK等凋亡相關信號通路。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，當細胞受到氧化應激等損傷時，p53會被激活，通過調(diào)節(jié)下游基因的表達，誘導細胞周期阻滯、DNA修復或凋亡。JNK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，在氧化應激條件下，JNK會被激活，磷酸化下游的轉錄因子，如c-Jun等，促進凋亡相關基因的表達，最終導致細胞凋亡。5.3與現(xiàn)有研究結果的比較與分析與以往研究相比，本研究在二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞的作用方面，既有相似之處，也存在一些差異。在細胞增殖抑制和凋亡誘導方面，許多研究都證實了二甲雙胍和葡萄糖代謝抑制劑單獨使用時對肝癌細胞具有一定的抑制作用，且聯(lián)合應用能夠增強這種效果。[文獻17]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制肝癌細胞的增殖，其機制與激活AMPK信號通路，抑制mTOR信號傳導有關。本研究結果與之相符，二甲雙胍組在48h和72h時對肝癌細胞增殖的抑制作用顯著，且通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后，p-mTOR蛋白表達水平降低，表明AMPK-mTOR信號通路被激活。在葡萄糖代謝抑制方面，[文獻18]使用2-脫氧葡萄糖抑制肝癌細胞的葡萄糖代謝，結果顯示細胞增殖受到明顯抑制，凋亡率增加。本研究中，葡萄糖代謝抑制組同樣觀察到細胞增殖受到抑制，凋亡率升高，且葡萄糖代謝通路關鍵蛋白HK2、PFK1和PKM2的表達顯著下降。然而，本研究也發(fā)現(xiàn)了一些與現(xiàn)有研究不同的結果。在二甲雙胍對葡萄糖代謝通路關鍵蛋白表達的影響方面，部分研究認為二甲雙胍可顯著降低HK2蛋白表達，但本研究中二甲雙胍組HK2蛋白表達雖有下降趨勢，但差異不具有統(tǒng)計學意義。這種差異可能與實驗所用細胞系、藥物濃度和處理時間等因素有關。本研究選用的是HepG2細胞系，而其他研究可能使用了不同的肝癌細胞系，不同細胞系對藥物的敏感性和反應可能存在差異。此外，藥物濃度和處理時間的不同也可能導致實驗結果的差異。本研究中二甲雙胍的處理濃度和時間是根據(jù)前期預實驗和相關文獻確定的，但仍可能與其他研究存在差異，從而影響了對HK2蛋白表達的抑制效果。在聯(lián)合治療的協(xié)同作用機制方面，現(xiàn)有研究主要集中在能量代謝和細胞凋亡信號通路等方面。本研究不僅證實了聯(lián)合應用可降低肝癌細胞內(nèi)ATP水平，促進乳酸積累和產(chǎn)生氧化應激，導致細胞凋亡，還進一步探討了乳酸積累和氧化應激之間的相互關系。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸積累會導致細胞內(nèi)環(huán)境酸化，激活氧化應激相關信號通路，促進ROS的產(chǎn)生，進而加劇細胞的損傷和凋亡。這種對聯(lián)合作用機制的深入探討是本研究的創(chuàng)新點之一。在研究方法上，本研究采用多種檢測方法，從細胞增殖、凋亡、能量代謝和蛋白表達等多個層面全面分析了二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞的影響。與部分僅進行單一指標檢測的研究相比，本研究方法更為全面、系統(tǒng)，能夠更準確地揭示聯(lián)合治療的作用效果和機制。在樣本選擇上，本研究選用人肝癌細胞系HepG2，雖然細胞系實驗具有一定局限性，但HepG2細胞系是肝癌研究中常用的細胞系，具有代表性。后續(xù)研究可進一步結合動物模型和臨床樣本，驗證本研究結果，提高研究的可靠性和臨床應用價值。5.4研究的局限性與展望本研究在揭示二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制方面取得了一定成果，但也存在一些局限性。本研究僅在體外細胞實驗環(huán)境下進行，細胞實驗雖然能夠在一定程度上模擬體內(nèi)細胞的生理狀態(tài)，且具有實驗條件易于控制、成本相對較低、實驗周期較短等優(yōu)點，可對細胞的生物學行為和分子機制進行深入研究。然而，體外環(huán)境與體內(nèi)真實環(huán)境存在顯著差異。在體內(nèi)，肝癌細胞處于復雜的腫瘤微環(huán)境中，受到多種細胞因子、免疫細胞、血管生成等因素的影響。腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞，如T細胞、巨噬細胞等，與肝癌細胞相互作用，可能調(diào)節(jié)肝癌細胞的生長和凋亡。而在體外細胞實驗中，無法完全模擬這種復雜的相互作用。細胞外基質(zhì)的組成和結構在體內(nèi)外也存在差異，細胞外基質(zhì)對細胞的黏附、遷移和信號傳導等過程具有重要影響，體外實驗難以準確還原這些影響。因此，體外實驗結果不能完全代表體內(nèi)的真實情況，可能存在一定的偏差。本研究缺乏動物實驗的驗證。動物實驗在腫瘤研究中具有不可替代的作用，它能夠更全面地評估藥物的療效和安全性。通過建立肝癌動物模型，可以觀察藥物在體內(nèi)的藥代動力學和藥效學特征，了解藥物對腫瘤生長、轉移和機體整體狀態(tài)的影響。在動物模型中，可以動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長情況，評估藥物對腫瘤體積、重量等指標的影響。同時，還可以觀察藥物對動物生存時間、行為狀態(tài)等方面的影響，更直觀地反映藥物的治療效果。此外，動物實驗能夠研究藥物對機體其他器官和系統(tǒng)的潛在副作用，評估藥物的安全性。本研究未進行動物實驗，無法確定二甲雙胍聯(lián)合葡萄糖代謝抑制在體內(nèi)的有效性和安全性，這限制了研究結果向臨床應用的轉化。在臨床研究方面，本研究缺乏臨床數(shù)據(jù)的支持。臨床研究是驗證藥物治療效果和安全性的關鍵環(huán)節(jié)，直接關系到藥物能否應用于臨床治療患者。通過對肝癌患者進行臨床研究，可以獲取藥物在人體中的實際療效、不良反應等信息。不同患者的個體差異，如年齡、性別、基礎疾病、腫瘤分期等，會影響藥物的治療效果和安全性