人55型腺病毒單克隆中和抗體：制備、特性與保護(hù)功效的深度探究一、引言1.1研究背景與意義人55型腺病毒（HumanAdenovirus55，HAdV-55）作為一種具有較強(qiáng)致病性的病原體，近年來(lái)在公共衛(wèi)生領(lǐng)域引發(fā)了廣泛關(guān)注。該病毒屬于腺病毒科，是一種雙鏈DNA病毒，由人11型與14型腺病毒重組產(chǎn)生。自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其感染病例在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，給人類健康帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。HAdV-55主要通過(guò)呼吸道飛沫、密切接觸和糞口途徑傳播，在人群密集、通風(fēng)不良的環(huán)境中，如學(xué)校、軍營(yíng)、托幼機(jī)構(gòu)等，極易引起暴發(fā)流行。其感染人體后，潛伏期通常為3-8天，隨后引發(fā)一系列臨床癥狀。發(fā)熱是最常見(jiàn)的癥狀，體溫可達(dá)39℃以上，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，部分患者體溫甚至在39℃以上持續(xù)3天以上?？人砸彩浅Ｒ?jiàn)癥狀之一，多表現(xiàn)為干咳，且咳嗽持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，部分患者干咳超過(guò)3天。咽痛同樣普遍，患者咽部充血明顯，嚴(yán)重時(shí)可見(jiàn)咽部潰瘍，部分患者還伴有扁桃體增大。此外，患者還可能出現(xiàn)頭痛、乏力、惡心、食欲缺乏等全身癥狀。在呼吸系統(tǒng)方面，HAdV-55感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。約半數(shù)患者會(huì)發(fā)展為肺炎，肺部感染常見(jiàn)的異常表現(xiàn)為肺部單側(cè)或雙側(cè)的結(jié)節(jié)狀、斑片狀、小片狀或大片斑片狀高密度影。重癥患者可出現(xiàn)呼吸衰竭，心率加快（≥100次/min）、呼吸頻率加快（≥30次/min），需要機(jī)械通氣等生命支持治療，甚至導(dǎo)致死亡。在免疫低下人群，如新生兒、嬰幼兒、器官移植受者、HIV感染者等，感染HAdV-55后病情往往更為嚴(yán)重，病死率較高。目前，針對(duì)HAdV-55感染，臨床上缺乏特效的治療藥物。現(xiàn)有的治療手段主要為對(duì)癥支持治療，如退熱、止咳、平喘、維持水電解質(zhì)平衡等，但對(duì)于重癥患者，這些治療措施往往難以有效控制病情進(jìn)展。由于缺乏有效的治療方法，HAdV-55感染的防控面臨著巨大挑戰(zhàn)。因此，研發(fā)有效的防治手段迫在眉睫。單克隆中和抗體作為一種新型的生物治療制劑，在病毒感染性疾病的防治中展現(xiàn)出了巨大的潛力。其具有高度特異性和親和力，能夠精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合病毒表面的特定抗原表位，從而阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。與傳統(tǒng)的抗病毒藥物相比，單克隆中和抗體具有靶向性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，能夠更有效地治療病毒感染性疾病，且不易產(chǎn)生耐藥性。在新冠疫情中，單克隆中和抗體發(fā)揮了重要作用。例如，安巴韋單抗/羅米司韋單抗聯(lián)合療法在全球多中心、隨機(jī)、雙盲2/3期臨床研究中，顯示出了良好的療效，與安慰劑組相比，治療組患者的住院及死亡風(fēng)險(xiǎn)降低78%。這充分證明了單克隆中和抗體在病毒感染性疾病治療中的有效性和重要性。制備針對(duì)HAdV-55的單克隆中和抗體，并深入研究其對(duì)HAdV-55感染的保護(hù)作用，對(duì)于開發(fā)新型的抗病毒治療藥物和防控策略具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。一方面，單克隆中和抗體可以為HAdV-55感染患者提供一種有效的治療手段，降低患者的病死率和并發(fā)癥發(fā)生率；另一方面，單克隆中和抗體還可以用于預(yù)防HAdV-55感染，尤其是對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)人群，如免疫低下者、醫(yī)護(hù)人員等，具有重要的預(yù)防意義。通過(guò)本研究，有望為HAdV-55感染的防治提供新的思路和方法，為保障公眾健康做出貢獻(xiàn)。1.2人55型腺病毒概述1.2.1基本特征與分類人55型腺病毒屬于腺病毒科，是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，其病毒粒子呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約為70-90nm。病毒粒子由核心和衣殼兩部分組成，核心包含線性雙鏈DNA，其基因組大小約為36kb，編碼約50種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在病毒的生命周期中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如參與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配等過(guò)程。衣殼由252個(gè)殼粒組成，其中包括240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體，六鄰體是構(gòu)成衣殼的主要成分，五鄰體位于二十面體的頂點(diǎn)，每個(gè)五鄰體上伸出一根纖突，纖突在病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別和吸附過(guò)程中起著重要作用。在腺病毒的分類體系中，人腺病毒被分為A-G共7個(gè)亞屬，至少包含116個(gè)型別，人55型腺病毒屬于人腺病毒B2亞組，是由人11型與14型腺病毒重組產(chǎn)生的新型病毒。這種重組事件使得人55型腺病毒具有獨(dú)特的基因特征和生物學(xué)特性，與其他腺病毒型別在致病性、傳播特點(diǎn)等方面存在一定差異。1.2.2感染機(jī)制與致病過(guò)程人55型腺病毒主要通過(guò)呼吸道飛沫、密切接觸和糞口途徑傳播。當(dāng)病毒進(jìn)入人體后，首先通過(guò)纖突與宿主細(xì)胞表面的特異性受體相結(jié)合，人腺病毒主要與被稱為柯薩奇/腺病毒受體（CAR）共用一種受體。結(jié)合后，病毒通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后病毒衣殼在細(xì)胞內(nèi)被逐漸降解，釋放出病毒基因組。病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核后，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制進(jìn)行早期基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，早期基因產(chǎn)物主要參與病毒基因組的復(fù)制和調(diào)控宿主細(xì)胞的代謝過(guò)程。在病毒基因組復(fù)制開始后，晚期基因開始表達(dá)，晚期基因產(chǎn)物主要是構(gòu)成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白。新合成的病毒基因組和結(jié)構(gòu)蛋白在細(xì)胞核內(nèi)組裝成完整的病毒粒子，最后通過(guò)細(xì)胞裂解的方式釋放出來(lái)，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。在感染過(guò)程中，人55型腺病毒會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。病毒感染宿主細(xì)胞后，會(huì)激活宿主的固有免疫應(yīng)答，細(xì)胞會(huì)分泌干擾素等細(xì)胞因子，以抑制病毒的復(fù)制和傳播。同時(shí)，病毒抗原會(huì)被抗原呈遞細(xì)胞攝取、加工和呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。然而，在一些情況下，過(guò)度的免疫反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致炎癥損傷，加重病情。例如，在重癥患者中，可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致肺部等器官的嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而引發(fā)呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。1.2.3流行病學(xué)特點(diǎn)人55型腺病毒的傳播途徑主要包括呼吸道飛沫傳播、密切接觸傳播和糞口途徑傳播。在呼吸道飛沫傳播方面，患者咳嗽、打噴嚏時(shí)會(huì)將含有病毒的飛沫排出體外，其他人吸入這些飛沫后可能會(huì)被感染；密切接觸傳播則是指與患者直接接觸，如握手、擁抱等，或者接觸被病毒污染的物品后，再觸摸口鼻等部位而感染；糞口途徑傳播主要是因?yàn)椴《究梢栽诟腥菊叩募S便中存活，污染水源或食物后，其他人攝入被污染的水或食物而感染。人群對(duì)人55型腺病毒普遍易感，尤其是兒童、老年人以及免疫功能低下者，如新生兒、嬰幼兒、器官移植受者、HIV感染者等，這些人群感染后病情往往更為嚴(yán)重，病死率較高。在學(xué)校、軍營(yíng)、托幼機(jī)構(gòu)等人群密集、通風(fēng)不良的環(huán)境中，人55型腺病毒極易引起暴發(fā)流行。例如，2006年我國(guó)陜西省岐山縣益店高中發(fā)生的疫情，共有429人發(fā)病，其中381人為益店高中學(xué)生，經(jīng)鑒定為腺病毒55型引起的上呼吸道感染；2012年河北保定解放軍252醫(yī)院收治的呼吸道感染發(fā)熱病人，也確診為腺病毒55型引起的呼吸道感染。從地區(qū)分布來(lái)看，人55型腺病毒感染在全球范圍內(nèi)均有報(bào)道，但在不同地區(qū)的流行情況存在差異。在我國(guó)，北方地區(qū)的疫情相對(duì)較多，可能與北方地區(qū)的氣候、人口密度、生活習(xí)慣等因素有關(guān)。近年來(lái)，人55型腺病毒感染的病例數(shù)呈上升趨勢(shì)，其流行范圍也逐漸擴(kuò)大，這可能與病毒的變異、人群流動(dòng)增加以及檢測(cè)技術(shù)的提高等因素有關(guān)。1.3單克隆中和抗體簡(jiǎn)介1.3.1概念與原理單克隆中和抗體是指通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的，能夠特異性識(shí)別并結(jié)合病毒表面特定抗原表位，從而阻斷病毒感染宿主細(xì)胞，使其失去感染性的一類抗體。1975年，GeorgesK?hler和CésarMilstein發(fā)明了生產(chǎn)單克隆抗體技術(shù)，讓單抗類藥物成為制藥屆的新星，也為單克隆中和抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。其作用機(jī)制主要基于免疫學(xué)原理。當(dāng)病毒入侵機(jī)體時(shí)，病毒表面的抗原會(huì)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使B淋巴細(xì)胞活化、增殖并分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌抗體。單克隆中和抗體能夠精準(zhǔn)地識(shí)別病毒表面的關(guān)鍵抗原表位，如人55型腺病毒的纖突蛋白等。通過(guò)與這些抗原表位特異性結(jié)合，單克隆中和抗體可以阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，如人55型腺病毒與柯薩奇/腺病毒受體（CAR）的結(jié)合，從而阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，中和病毒的活性。此外，單克隆中和抗體還可以通過(guò)激活補(bǔ)體系統(tǒng)、促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬等方式，進(jìn)一步清除病毒。1.3.2在病毒感染治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀單克隆中和抗體在多種病毒感染治療中取得了顯著成效，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在呼吸道合胞病毒（RSV）感染治療方面，1998年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了單克隆抗體palivizumab用于預(yù)防兒童感染呼吸道合胞病毒，這是第一個(gè)獲批的抗病毒中和抗體。palivizumab能夠特異性結(jié)合RSV的F蛋白，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的融合，從而預(yù)防RSV感染，為兒童RSV感染的預(yù)防提供了有效的手段。在埃博拉病毒感染治療中，2020年10月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了單克隆抗體組合Inmazeb（atoltivimab、maftimab和odesivimab-ebgn），用于治療成人和兒童埃博拉病毒感染者；同年12月，F(xiàn)DA又批準(zhǔn)了第二個(gè)治療埃博拉病毒感染的藥物——中和抗體Ebanga（Ansuvimab-zykl）。這些中和抗體通過(guò)與埃博拉病毒表面的糖蛋白結(jié)合，阻斷病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，或通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)感染細(xì)胞的殺傷作用，有效治療埃博拉病毒感染，成為目前獲批的僅有的兩個(gè)抗埃博拉病毒藥物，凸顯了單克隆中和抗體在治療烈性傳染病病毒感染中的重要地位。在新冠疫情期間，單克隆中和抗體也發(fā)揮了重要作用。例如，安巴韋單抗/羅米司韋單抗聯(lián)合療法是從眾多與新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域（RBD）特異性結(jié)合單抗中挑選出來(lái)的一對(duì)活性高、互補(bǔ)性強(qiáng)的中和抗體。安巴韋單抗與RBD結(jié)合后，會(huì)促進(jìn)S蛋白中包含RBD的S1部分快速?gòu)男鹿诓《旧厦撀?，進(jìn)而導(dǎo)致新冠病毒無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；羅米司韋單抗可抑制病毒與細(xì)胞發(fā)生膜融合所必須的S蛋白重排，從而阻止病毒入侵細(xì)胞。在全球多中心、隨機(jī)、雙盲2/3期臨床研究ACTIV-2中，該聯(lián)合療法顯示出良好的療效，與安慰劑組相比，治療組患者的住院及死亡風(fēng)險(xiǎn)降低78%，為新冠病毒感染的治療提供了新的有效方案。1.4研究目的與內(nèi)容1.4.1研究目的本研究旨在制備針對(duì)人55型腺病毒的單克隆中和抗體，并深入研究其對(duì)人55型腺病毒感染的保護(hù)作用，為開發(fā)新型的抗病毒治療藥物和防控策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體而言，通過(guò)本研究期望達(dá)成以下目標(biāo)：其一，成功制備出高特異性、高親和力且具有高效中和活性的人55型腺病毒單克隆中和抗體；其二，明確該單克隆中和抗體的中和機(jī)制，揭示其在阻斷病毒感染、抑制病毒復(fù)制等方面的作用方式；其三，評(píng)估單克隆中和抗體在動(dòng)物模型中的體內(nèi)保護(hù)效果，驗(yàn)證其在預(yù)防和治療人55型腺病毒感染方面的有效性和安全性，為臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。1.4.2研究?jī)?nèi)容本研究圍繞人55型腺病毒單克隆中和抗體的制備及保護(hù)作用展開，主要涵蓋以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：人55型腺病毒單克隆中和抗體的制備：采用雜交瘤技術(shù)，以人55型腺病毒免疫小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗人55型腺病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。對(duì)篩選得到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，并對(duì)其分泌的單克隆抗體進(jìn)行純化和鑒定，包括抗體的亞型鑒定、親和力測(cè)定、特異性分析等，確保獲得高質(zhì)量的單克隆中和抗體。單克隆中和抗體的中和活性測(cè)定：運(yùn)用細(xì)胞病變抑制法（CPE）、空斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）等方法，測(cè)定單克隆中和抗體對(duì)人55型腺病毒的中和活性。通過(guò)設(shè)置不同的抗體濃度梯度，觀察抗體對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制效果，計(jì)算中和抗體的半數(shù)中和濃度（IC50），以此評(píng)估單克隆中和抗體的中和能力。單克隆中和抗體的中和機(jī)制研究：從分子和細(xì)胞水平深入探究單克隆中和抗體的中和機(jī)制。利用免疫熒光、免疫印跡等技術(shù)，研究單克隆中和抗體與病毒表面抗原的結(jié)合特性，分析其對(duì)病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞過(guò)程的影響。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒基因和蛋白的表達(dá)水平，研究單克隆中和抗體對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用機(jī)制。此外，還將探討單克隆中和抗體對(duì)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，分析其在激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌等方面的作用。單克隆中和抗體在動(dòng)物模型中的體內(nèi)保護(hù)作用研究：建立人55型腺病毒感染的動(dòng)物模型，如小鼠模型、倉(cāng)鼠模型等。在動(dòng)物模型中，分別給予單克隆中和抗體進(jìn)行預(yù)防和治療干預(yù)，觀察動(dòng)物的發(fā)病情況、生存狀況、病毒載量變化等指標(biāo)。通過(guò)組織病理學(xué)檢查，分析動(dòng)物體內(nèi)各器官的病變情況，評(píng)估單克隆中和抗體對(duì)動(dòng)物的保護(hù)效果。同時(shí)，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的免疫指標(biāo)，如特異性抗體水平、細(xì)胞免疫應(yīng)答等，進(jìn)一步探討單克隆中和抗體在體內(nèi)的保護(hù)作用機(jī)制。二、人55型腺病毒單克隆中和抗體制備方法2.1免疫原制備2.1.1人55型腺病毒培養(yǎng)與純化人55型腺病毒的培養(yǎng)需選擇合適的細(xì)胞系，本研究選用HEp-2細(xì)胞系，該細(xì)胞系對(duì)人55型腺病毒具有良好的易感性。在培養(yǎng)前，先將HEp-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行病毒接種。將人55型腺病毒以適當(dāng)?shù)母腥緩?fù)數(shù)（MOI）接種到HEp-2細(xì)胞中，感染復(fù)數(shù)的選擇需經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，以保證病毒能夠有效感染細(xì)胞且不引起細(xì)胞過(guò)度病變。接種后，將細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。當(dāng)約80%的細(xì)胞出現(xiàn)典型的腺病毒感染CPE，如細(xì)胞變圓、腫脹、聚集成葡萄串狀等時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)物。病毒的純化是獲得高質(zhì)量免疫原的關(guān)鍵步驟，本研究采用陰離子層析法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行純化。首先，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞破裂釋放出病毒，然后以3000rpm離心15min，去除細(xì)胞碎片。上清液通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行陰離子層析。陰離子層析采用的陰離子填料為NanoGel50Q，平衡緩沖液為20mMTris，220mMNaCl，3mMMgCl?，pH7.5；洗脫緩沖液為20mMTris，350mMNaCl，3mMMgCl?，pH8.0。先將層析柱用平衡緩沖液平衡，然后將過(guò)濾后的上清液上樣，保留時(shí)間10min，再用平衡緩沖液沖洗層析柱2個(gè)柱體積至UV峰洗至基線，最后用洗脫緩沖液洗脫，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)280nm和260nm出峰時(shí)，收集洗脫液，得到腺病毒粗純液。將腺病毒粗純液進(jìn)行密度梯度離心進(jìn)一步純化。采用CsCl密度梯度離心法，將粗純液小心鋪于預(yù)先制備好的CsCl密度梯度液上，在超速離心機(jī)中以45000rpm離心16h。離心結(jié)束后，病毒會(huì)在CsCl密度梯度中形成一條清晰的條帶，用注射器小心吸取該條帶，即為純化的人55型腺病毒。陰離子層析法利用病毒與陰離子填料的特異性結(jié)合，能夠有效去除細(xì)胞碎片、雜蛋白等雜質(zhì)；密度梯度離心法則根據(jù)病毒與其他雜質(zhì)在密度上的差異，進(jìn)一步提高病毒的純度。2.1.2免疫原的鑒定與質(zhì)量控制對(duì)純化后的人55型腺病毒進(jìn)行鑒定，以確保其符合免疫原的要求。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，針對(duì)人55型腺病毒的特異性基因片段，如Hexon基因、Fiber基因等，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：Hexon基因上游引物5'-ATGGTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TCTCCGCTGCTGCTGCTG-3'；Fiber基因上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TCTCCGCTGCTGCTGCTG-3'。將純化的病毒提取核酸后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶，則表明病毒為目標(biāo)人55型腺病毒。利用免疫熒光法檢測(cè)病毒的抗原性。將純化的病毒感染HEp-2細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后依次加入抗人55型腺病毒的特異性抗體和熒光標(biāo)記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察。若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性熒光，則表明病毒具有良好的抗原性。保證免疫原質(zhì)量的控制指標(biāo)主要包括病毒滴度、純度和活性。病毒滴度采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）法測(cè)定，將病毒進(jìn)行系列稀釋后接種到HEp-2細(xì)胞中，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察CPE，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒滴度，要求病毒滴度達(dá)到10?TCID??/mL以上。病毒純度通過(guò)檢測(cè)蛋白雜質(zhì)含量和核酸雜質(zhì)含量來(lái)控制，采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)蛋白雜質(zhì)，要求蛋白雜質(zhì)含量低于1%；采用熒光定量PCR法檢測(cè)核酸雜質(zhì)，要求核酸雜質(zhì)含量低于0.1%。病毒活性通過(guò)細(xì)胞病變抑制法（CPE）檢測(cè)，將不同稀釋度的病毒與適量的單克隆中和抗體混合，作用一定時(shí)間后接種到HEp-2細(xì)胞中，觀察細(xì)胞病變情況，計(jì)算中和抗體的半數(shù)抑制濃度（IC??），要求IC??值越低，表明病毒活性越高。2.2動(dòng)物免疫2.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與飼養(yǎng)管理本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，BALB/c小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)小鼠品系之一，其具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在單克隆抗體制備實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。小鼠購(gòu)自正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為[具體合格證號(hào)]，確保其健康狀況良好且無(wú)特定病原體（SPF）感染。小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度保持在（50±10）%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜交替環(huán)境。小鼠自由攝食和飲水，飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的小鼠專用飼料，飲水為經(jīng)高溫高壓滅菌處理的純凈水。定期對(duì)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒，每周更換2-3次墊料，以維持良好的飼養(yǎng)環(huán)境，減少外界因素對(duì)小鼠免疫狀態(tài)的影響。在實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)新的環(huán)境后再進(jìn)行免疫操作。2.2.2免疫方案設(shè)計(jì)采用多次免疫的方式，以增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答，提高抗體產(chǎn)生的水平和質(zhì)量。初次免疫時(shí)，將純化的人55型腺病毒與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比混合，充分乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射的方式免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為10?TCID??。弗氏完全佐劑中含有卡介苗等成分，能夠刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗原的免疫原性，促進(jìn)B細(xì)胞的活化和增殖，從而提高抗體的產(chǎn)生。在初次免疫后的第14天進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，將純化的人55型腺病毒與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比混合乳化后，同樣采用皮下多點(diǎn)注射的方式，免疫劑量為10?TCID??。弗氏不完全佐劑相較于弗氏完全佐劑，不含卡介苗，其刺激作用相對(duì)較弱，但仍能有效增強(qiáng)抗原的免疫效果，進(jìn)一步激發(fā)小鼠的免疫反應(yīng)。第二次加強(qiáng)免疫在第一次加強(qiáng)免疫后的第14天進(jìn)行，免疫方法和劑量與第一次加強(qiáng)免疫相同。在第二次加強(qiáng)免疫后的第7天，采集小鼠尾靜脈血，檢測(cè)血清中抗人55型腺病毒抗體的效價(jià)。若抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平（如ELISA檢測(cè)的OD值大于1.0），則進(jìn)行后續(xù)的融合實(shí)驗(yàn)；若抗體效價(jià)未達(dá)到要求，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫，免疫方法和劑量不變，在第三次加強(qiáng)免疫后的第7天再次檢測(cè)抗體效價(jià)。2.2.3免疫效果監(jiān)測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）監(jiān)測(cè)小鼠免疫后抗體的產(chǎn)生情況。具體操作如下：將純化的人55型腺病毒用包被緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度（如1μg/mL），加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜包被。包被緩沖液通常為碳酸鹽緩沖液，其能夠使病毒抗原牢固地吸附在酶標(biāo)板表面，為后續(xù)的抗體檢測(cè)提供穩(wěn)定的固相載體。次日，棄去包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌酶標(biāo)板3次，每次3分鐘，以去除未結(jié)合的抗原。吐溫-20是一種表面活性劑，能夠降低液體的表面張力，增強(qiáng)洗滌效果，有效去除非特異性吸附的雜質(zhì)。洗滌后，每孔加入200μL的5%脫脂牛奶封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。脫脂牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)，能夠與酶標(biāo)板表面的剩余結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，防止后續(xù)加入的抗體非特異性吸附，提高檢測(cè)的特異性。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次，加入適當(dāng)稀釋度的小鼠血清（如1:100、1:200、1:400等梯度稀釋），每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。小鼠血清中的抗體若與包被的病毒抗原特異性結(jié)合，將形成抗原-抗體復(fù)合物，為后續(xù)的檢測(cè)提供信號(hào)基礎(chǔ)。孵育后，用PBST洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋（如1:5000）后，每孔加入100μL，37℃孵育1小時(shí)。二抗能夠特異性識(shí)別并結(jié)合小鼠血清中的抗體，其攜帶的HRP酶在后續(xù)的顯色反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。再次用PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB底物顯色液，37℃避光孵育15-20分鐘，使底物在HRP酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。TMB底物在HRP酶的作用下，會(huì)被氧化為藍(lán)色產(chǎn)物，顏色的深淺與小鼠血清中抗體的含量成正比。最后，每孔加入50μL的2M硫酸終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值的大小判斷小鼠血清中抗體的效價(jià)，OD值越高，表明抗體效價(jià)越高，免疫效果越好。2.3細(xì)胞融合與雜交瘤篩選2.3.1脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備在小鼠經(jīng)最后一次加強(qiáng)免疫后的第3-4天，采用頸椎脫臼法將小鼠處死。迅速將小鼠浸泡于75%酒精中消毒3-5分鐘，以殺滅小鼠體表的細(xì)菌和病毒等微生物。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，打開小鼠腹腔，取出脾臟，將脾臟置于盛有預(yù)冷的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用眼科剪將脾臟剪成1-2mm3大小的碎塊，然后用吸管輕輕吹打，使脾細(xì)胞從組織塊中釋放出來(lái)。將細(xì)胞懸液通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織碎片和未分散的細(xì)胞團(tuán)，得到單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500rpm離心5-10分鐘，棄去上清液。加入適量的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫靜置3-5分鐘，裂解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞裂解液中的氯化銨等成分能夠特異性地裂解紅細(xì)胞，而對(duì)脾細(xì)胞的影響較小。再次以1500rpm離心5-10分鐘，棄去上清液，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞2-3次，以去除殘留的紅細(xì)胞裂解液和其他雜質(zhì)。最后，將脾細(xì)胞重懸于適量的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL，置于冰上備用。骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合前2-3天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞傳代培養(yǎng)，以保證細(xì)胞的活性和生長(zhǎng)狀態(tài)。傳代時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并脫離瓶壁后，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。在融合當(dāng)天，將SP2/0細(xì)胞用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2-3次，去除培養(yǎng)基中的血清成分，因?yàn)檠逯械哪承┏煞挚赡軙?huì)影響細(xì)胞融合的效果。最后，將SP2/0細(xì)胞重懸于無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL，備用。2.3.2細(xì)胞融合技術(shù)將準(zhǔn)備好的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照10:1的比例混合于50mL離心管中，輕輕吹打混勻。以1500rpm離心10分鐘，棄去上清液，盡量吸干管底的殘留液體，以減少后續(xù)融合過(guò)程中雜質(zhì)的干擾。將離心管置于37℃水浴中預(yù)熱1-2分鐘，使細(xì)胞處于適宜的溫度環(huán)境。然后，緩慢加入預(yù)熱至37℃的50%聚乙二醇（PEG，分子量為4000）溶液0.8mL，邊加邊輕輕搖勻，使PEG溶液與細(xì)胞充分接觸。PEG是一種常用的細(xì)胞融合劑，其作用原理是通過(guò)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和表面電荷，促進(jìn)細(xì)胞之間的融合。在1分鐘內(nèi)加完P(guān)EG溶液后，繼續(xù)在37℃水浴中靜置1-2分鐘，讓細(xì)胞融合反應(yīng)充分進(jìn)行。接著，在1分鐘內(nèi)緩慢加入預(yù)熱至37℃的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基1mL，以稀釋PEG溶液，降低其對(duì)細(xì)胞的毒性。之后，在5分鐘內(nèi)逐滴加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基至總體積為10mL，邊加邊輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中。以1500rpm離心10分鐘，棄去上清液，用含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640選擇培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。HAT選擇培養(yǎng)基中的氨基蝶呤能夠阻斷細(xì)胞的正常嘌呤和嘧啶合成途徑，而骨髓瘤細(xì)胞由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），在HAT培養(yǎng)基中無(wú)法存活；脾細(xì)胞雖然具有HGPRT，但在體外培養(yǎng)條件下存活時(shí)間較短。只有融合后的雜交瘤細(xì)胞，既具有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力，又具有脾細(xì)胞合成HGPRT的能力，能夠在HAT培養(yǎng)基中存活并生長(zhǎng)。將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.3.3雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化在細(xì)胞融合后的第7-10天，待雜交瘤細(xì)胞在96孔板中生長(zhǎng)至占孔底面積的1/3-1/2時(shí)，采用間接ELISA法對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行抗體檢測(cè)。將純化的人55型腺病毒用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜包被。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μL的5%脫脂牛奶封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。孵育后，用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。再次用PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB底物顯色液，37℃避光孵育15-20分鐘。最后，每孔加入50μL的2M硫酸終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。選擇OD值大于陰性對(duì)照2.1倍的孔，作為陽(yáng)性孔，這些陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞即為可能分泌抗人55型腺病毒單克隆抗體的細(xì)胞。對(duì)陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆化培養(yǎng)。將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞用含20%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和HT（次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋，使細(xì)胞濃度分別為50個(gè)/mL、10個(gè)/mL和5個(gè)/mL。將不同濃度的細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，每個(gè)濃度接種3塊板。置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)至占孔底面積的1/3-1/2時(shí)，再次采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的抗體。選擇只生長(zhǎng)單個(gè)克隆且抗體檢測(cè)陽(yáng)性的孔，將其中的雜交瘤細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，重復(fù)2-3次，直至得到穩(wěn)定分泌抗人55型腺病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存于液氮中備用。凍存時(shí)，將細(xì)胞重懸于含10%二甲基亞砜（DMSO）和30%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，分裝至凍存管中，每管1mL，置于程序降溫盒中，先于-80℃冰箱中過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮中保存。DMSO能夠降低細(xì)胞在冷凍過(guò)程中的冰晶形成，減少對(duì)細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞的凍存存活率。2.4抗體純化與鑒定2.4.1抗體純化方法在單克隆抗體的制備過(guò)程中，抗體純化是獲得高純度、高活性抗體的關(guān)鍵步驟。常用的抗體純化方法包括親和層析法、離子交換層析法、凝膠過(guò)濾層析法等，本研究選用親和層析法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，該方法具有特異性高、純化效果好等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效去除雜蛋白，提高抗體純度。親和層析法的原理是利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合作用，將抗原固定在固相載體上，制備成親和層析柱。當(dāng)含有抗體的樣品通過(guò)層析柱時(shí)，抗體與固定化的抗原特異性結(jié)合，而其他雜質(zhì)則不與抗原結(jié)合，直接流出層析柱。然后通過(guò)改變洗脫條件，如改變洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度等，使抗體從抗原上解離下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)抗體的純化。本研究中，選用ProteinA親和層析柱進(jìn)行抗體純化。ProteinA是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離出來(lái)的蛋白質(zhì)，其對(duì)IgG類抗體具有高度的親和力，能夠特異性結(jié)合IgG的Fc段。在進(jìn)行純化前，先將ProteinA親和層析柱用平衡緩沖液（0.01MPBS，pH7.4）平衡3-5個(gè)柱體積，確保層析柱處于適宜的工作狀態(tài)。平衡緩沖液的作用是維持層析柱內(nèi)的離子強(qiáng)度和pH值穩(wěn)定，為抗體與ProteinA的結(jié)合提供良好的環(huán)境。將經(jīng)過(guò)離心和0.45μm濾膜過(guò)濾處理的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清緩慢上樣到已平衡好的ProteinA親和層析柱上，控制流速為0.5-1mL/min。上樣過(guò)程中，抗體與ProteinA特異性結(jié)合，其他雜質(zhì)則隨流出液排出。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液沖洗層析柱，直至流出液的吸光度（A280）接近基線，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)。沖洗完成后，采用洗脫緩沖液（0.1M甘氨酸-HCl，pH2.5）進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫緩沖液的低pH值能夠破壞抗體與ProteinA之間的結(jié)合力，使抗體從層析柱上解離下來(lái)。為了防止洗脫下來(lái)的抗體因酸性環(huán)境而失活，收集的洗脫液應(yīng)立即用1MTris-HCl（pH9.0）中和至中性。最后，將收集的抗體溶液用0.01MPBS（pH7.4）進(jìn)行透析，去除洗脫緩沖液中的鹽分和其他小分子雜質(zhì)。透析過(guò)程中，將抗體溶液裝入透析袋中，放入透析液中，在4℃條件下攪拌透析，每隔4-6小時(shí)更換一次透析液，透析2-3次。通過(guò)透析，能夠有效去除抗體溶液中的雜質(zhì)，提高抗體的純度和質(zhì)量。2.4.2抗體純度與活性鑒定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)純化后的抗體純度進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE是一種常用的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其原理是利用SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子帶上負(fù)電荷，并且消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷差異和形狀差異，僅根據(jù)蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離。在進(jìn)行SDS-PAGE時(shí)，先配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。分離膠用于蛋白質(zhì)的分離，其濃度根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小進(jìn)行選擇，12%的分離膠適合分離分子量在10-100kDa之間的蛋白質(zhì)；濃縮膠用于樣品的濃縮和聚焦，使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠前能夠集中在一個(gè)狹窄的區(qū)域，提高分離效果。將純化后的抗體樣品與適量的上樣緩沖液混合，上樣緩沖液中含有SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)等成分，SDS能夠使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷，β-巰基乙醇能夠還原蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，溴酚藍(lán)則作為指示劑，指示電泳的進(jìn)程。混合后的樣品在100℃水浴中加熱5分鐘，使蛋白質(zhì)充分變性。將變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)中含有一系列已知分子量的蛋白質(zhì)，用于確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量。在電泳過(guò)程中，電壓設(shè)置為80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色30-60分鐘，使蛋白質(zhì)條帶顯色。考馬斯亮藍(lán)能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，在凝膠上形成藍(lán)色條帶，從而使蛋白質(zhì)條帶可視化。染色后，用脫色液進(jìn)行脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶清晰可見(jiàn)。通過(guò)觀察凝膠上蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量和位置，判斷抗體的純度。若在凝膠上僅出現(xiàn)一條清晰的條帶，且其分子量與IgG重鏈（約50kDa）和輕鏈（約25kDa）的分子量相符，則表明抗體純度較高。運(yùn)用細(xì)胞病變抑制法（CPE）對(duì)抗體的活性進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞病變抑制法是一種常用的檢測(cè)抗體中和活性的方法，其原理是將病毒與不同稀釋度的抗體混合，作用一定時(shí)間后接種到敏感細(xì)胞中，觀察細(xì)胞的病變情況。如果抗體具有中和活性，能夠中和病毒的感染性，那么細(xì)胞就不會(huì)出現(xiàn)病變或病變程度減輕。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEp-2細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將純化后的抗體用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋，設(shè)置不同的稀釋度，如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等。將稀釋后的抗體與適量的人55型腺病毒（病毒滴度為100TCID??/孔）混合，37℃孵育1小時(shí)，使抗體與病毒充分結(jié)合。將混合液接種到已接種HEp-2細(xì)胞的96孔板中，每孔接種100μL，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（只接種病毒，不接種抗體）和細(xì)胞對(duì)照組（只接種細(xì)胞，不接種病毒和抗體），每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況，記錄細(xì)胞病變程度。細(xì)胞病變程度通常根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)變化、脫落情況等進(jìn)行判斷，如細(xì)胞變圓、腫脹、聚集成葡萄串狀、脫落等。根據(jù)細(xì)胞病變情況，計(jì)算抗體的半數(shù)抑制濃度（IC??）。IC??是指能夠抑制50%細(xì)胞病變的抗體濃度，其計(jì)算方法采用Reed-Muench公式。IC??值越低，表明抗體的中和活性越強(qiáng)，即抗體能夠更有效地中和病毒的感染性，保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染。三、人55型腺病毒單克隆中和抗體特性分析3.1抗體的理化性質(zhì)3.1.1抗體亞型鑒定采用血清學(xué)方法對(duì)單克隆中和抗體的亞型進(jìn)行鑒定。具體而言，運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法，將純化的抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA等亞型特異性抗體包被于96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μL，濃度為1μg/mL，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μL的5%脫脂牛奶封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次，加入稀釋后的單克隆中和抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。孵育后，用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。再次用PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB底物顯色液，37℃避光孵育15-20分鐘。最后，每孔加入50μL的2M硫酸終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。以O(shè)D值大于陰性對(duì)照2.1倍的結(jié)果判定為陽(yáng)性，確定抗體的亞型。通過(guò)該方法，準(zhǔn)確確定單克隆中和抗體所屬的免疫球蛋白亞型，為后續(xù)的抗體功能研究和應(yīng)用提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。此外，還可采用基因測(cè)序技術(shù)作為輔助手段來(lái)鑒定抗體亞型。提取雜交瘤細(xì)胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)不同抗體亞型恒定區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)遵循特異性、高效性原則，確保能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與已知的抗體亞型恒定區(qū)基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證血清學(xué)方法鑒定的結(jié)果。基因測(cè)序技術(shù)能夠從基因?qū)用鏈?zhǔn)確確定抗體的亞型，與血清學(xué)方法相互印證，提高鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2抗體分子結(jié)構(gòu)分析利用生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)單克隆中和抗體的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析。采用還原和非還原SDS-PAGE分析抗體的亞基組成。在還原條件下，抗體分子中的二硫鍵被還原，使重鏈和輕鏈分離；在非還原條件下，抗體分子保持完整的天然結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)比還原和非還原條件下SDS-PAGE的電泳條帶，確定抗體的重鏈和輕鏈分子量，以及它們之間的連接方式。例如，在還原SDS-PAGE中，若出現(xiàn)兩條清晰的條帶，分別對(duì)應(yīng)約50kDa的重鏈和約25kDa的輕鏈，則表明抗體由重鏈和輕鏈組成，且通過(guò)二硫鍵連接。運(yùn)用X射線晶體學(xué)技術(shù)解析抗體的三維結(jié)構(gòu)。將純化后的單克隆中和抗體進(jìn)行結(jié)晶，通過(guò)優(yōu)化結(jié)晶條件，如改變緩沖液成分、pH值、溫度等，獲得高質(zhì)量的抗體晶體。利用同步輻射光源對(duì)抗體晶體進(jìn)行X射線衍射實(shí)驗(yàn)，收集衍射數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)衍射數(shù)據(jù)的處理和分析，運(yùn)用相關(guān)軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，最終獲得抗體的三維結(jié)構(gòu)模型。X射線晶體學(xué)技術(shù)能夠提供抗體分子原子水平的結(jié)構(gòu)信息，揭示抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域組成以及分子內(nèi)相互作用等關(guān)鍵信息。利用核磁共振（NMR）技術(shù)進(jìn)一步研究抗體的溶液結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性。將單克隆中和抗體溶解在合適的緩沖液中，制備高濃度的樣品溶液。通過(guò)NMR實(shí)驗(yàn)，獲取抗體分子的化學(xué)位移、耦合常數(shù)、弛豫時(shí)間等參數(shù)。利用這些參數(shù)，運(yùn)用NMR結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件構(gòu)建抗體在溶液中的結(jié)構(gòu)模型，并分析其動(dòng)力學(xué)特性，如分子的柔性、構(gòu)象變化等。NMR技術(shù)能夠在接近生理?xiàng)l件下研究抗體的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化，與X射線晶體學(xué)技術(shù)相互補(bǔ)充，全面揭示抗體的分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。3.2抗體與病毒的結(jié)合特性3.2.1親和力測(cè)定運(yùn)用表面等離子共振（SPR）技術(shù)測(cè)定單克隆中和抗體與病毒的親和力。表面等離子共振技術(shù)是一種基于物理光學(xué)原理發(fā)展而來(lái)的用于檢測(cè)分子相互作用的生物物理學(xué)技術(shù)，該方法可實(shí)時(shí)高靈敏度地檢測(cè)分子間相互作用且無(wú)需標(biāo)記。SPR利用光在不同介質(zhì)中產(chǎn)生消逝波后與等離子波產(chǎn)生共振，進(jìn)而可以構(gòu)建生物分子相互作用的生物傳感分析技術(shù)，用以檢測(cè)生物傳感芯片上配體與分析物之間的相互作用情況。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將人55型腺病毒作為配體，通過(guò)胺偶聯(lián)法固定在CM5傳感芯片表面。具體步驟為：先將CM5傳感芯片用10mM乙酸鈉（pH4.5）活化，然后將人55型腺病毒用10mM乙酸鈉（pH4.5）稀釋至適當(dāng)濃度（如10μg/mL），注入到芯片表面進(jìn)行偶聯(lián)，使病毒與芯片表面的羧基發(fā)生共價(jià)結(jié)合。再用乙醇胺對(duì)芯片表面未反應(yīng)的羧基進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。將單克隆中和抗體作為分析物，用HBS-EP緩沖液（10mMHEPES，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05%SurfactantP20，pH7.4）稀釋成不同濃度的系列溶液（如0.1nM、0.3nM、1nM、3nM、10nM）。將不同濃度的抗體溶液以恒定流速（如30μL/min）依次注入到固定有病毒的傳感芯片表面，抗體與病毒結(jié)合會(huì)導(dǎo)致芯片表面質(zhì)量變化，從而引起共振角發(fā)生變化，SPR儀器會(huì)實(shí)時(shí)記錄這一變化過(guò)程，生成傳感圖。根據(jù)傳感圖，利用Biacore評(píng)價(jià)軟件，采用1:1Langmuir結(jié)合模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，計(jì)算出抗體與病毒結(jié)合的結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd和平衡解離常數(shù)KD。結(jié)合速率常數(shù)ka表示抗體與病毒結(jié)合的快慢，解離速率常數(shù)kd表示抗體與病毒解離的快慢，平衡解離常數(shù)KD則表示抗體與病毒結(jié)合的強(qiáng)弱，KD值越小，表明抗體與病毒的親和力越高。通過(guò)表面等離子共振技術(shù)測(cè)定抗體與病毒的親和力，能夠獲得準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為深入了解抗體與病毒的相互作用機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)支持，也有助于評(píng)估抗體的質(zhì)量和潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，若測(cè)定得到某一單克隆中和抗體與病毒的KD值為10??M數(shù)量級(jí)，說(shuō)明該抗體與病毒具有較高的親和力，在中和病毒活性方面可能具有較好的效果。3.2.2結(jié)合表位分析利用突變病毒蛋白的方法來(lái)確定單克隆中和抗體的結(jié)合表位。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)人55型腺病毒的關(guān)鍵蛋白，如纖突（Fiber）蛋白、六鄰體（Hexon）蛋白等進(jìn)行突變。以Fiber蛋白為例，根據(jù)其三維結(jié)構(gòu)和功能域分析，選擇可能與抗體結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變。設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)氨基酸位點(diǎn)的突變引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增的方式將突變引入到Fiber蛋白的基因序列中。將突變后的基因克隆到合適的表達(dá)載體中，如pET-28a載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。對(duì)表達(dá)的突變蛋白進(jìn)行純化，采用鎳柱親和層析法進(jìn)行純化，先將表達(dá)菌超聲破碎，離心取上清，將上清液加入到鎳柱中，使突變蛋白與鎳柱上的鎳離子特異性結(jié)合，然后用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有突變蛋白的洗脫峰。將純化后的突變病毒蛋白與單克隆中和抗體進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。將突變蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃過(guò)夜包被。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μL的5%脫脂牛奶封閉液，37℃孵育1小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次，加入稀釋后的單克隆中和抗體，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。孵育后，用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育1小時(shí)。再次用PBST洗滌3次后，每孔加入100μL的TMB底物顯色液，37℃避光孵育15-20分鐘。最后，每孔加入50μL的2M硫酸終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD值）。若某一突變蛋白與抗體結(jié)合后的OD值明顯低于野生型病毒蛋白與抗體結(jié)合后的OD值，說(shuō)明該突變位點(diǎn)可能位于抗體的結(jié)合表位上，通過(guò)對(duì)多個(gè)突變位點(diǎn)的分析，即可確定抗體的結(jié)合表位。例如，當(dāng)Fiber蛋白的第150-160位氨基酸發(fā)生突變后，與抗體結(jié)合的OD值顯著降低，表明該區(qū)域可能是抗體的結(jié)合表位。采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和確定結(jié)合表位。將單克隆中和抗體與已知結(jié)合表位的其他抗體或配體同時(shí)與病毒進(jìn)行孵育。若單克隆中和抗體與其他抗體或配體能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合病毒，且隨著單克隆中和抗體濃度的增加，其他抗體或配體與病毒的結(jié)合量逐漸減少，則說(shuō)明它們可能識(shí)別相同或相近的結(jié)合表位。通過(guò)比較不同抗體或配體與病毒結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)曲線，分析競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的程度和特點(diǎn)，進(jìn)一步明確單克隆中和抗體的結(jié)合表位。例如，當(dāng)將單克隆中和抗體與一種已知結(jié)合Fiber蛋白N端區(qū)域的抗體同時(shí)與病毒孵育時(shí)，隨著單克隆中和抗體濃度的升高，已知抗體與病毒的結(jié)合量顯著下降，表明單克隆中和抗體的結(jié)合表位可能也位于Fiber蛋白的N端區(qū)域。3.3中和活性測(cè)定3.3.1中和實(shí)驗(yàn)方法建立在中和活性測(cè)定中，選擇基于細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的方法來(lái)評(píng)估單克隆中和抗體對(duì)人55型腺病毒的中和能力。該方法利用人55型腺病毒感染敏感細(xì)胞（如HEp-2細(xì)胞）后會(huì)引起細(xì)胞病變的特性，通過(guò)觀察細(xì)胞病變程度來(lái)判斷抗體的中和效果。首先，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。將HEp-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在病毒感染環(huán)節(jié)，設(shè)置不同的感染復(fù)數(shù)（MOI）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。將人55型腺病毒進(jìn)行系列稀釋，分別以MOI為0.1、0.5、1、5、10等不同比例感染HEp-2細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果顯示，當(dāng)MOI為1時(shí)，細(xì)胞在感染后48-72小時(shí)出現(xiàn)典型的腺病毒感染CPE，且細(xì)胞病變程度適中，適合用于中和實(shí)驗(yàn)。因此，在后續(xù)的中和實(shí)驗(yàn)中，選擇MOI為1的人55型腺病毒進(jìn)行感染?？贵w與病毒的作用時(shí)間也會(huì)影響中和效果，設(shè)置不同的作用時(shí)間梯度，如30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘等。將不同稀釋度的單克隆中和抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，分別作用不同時(shí)間后，接種到HEp-2細(xì)胞中。觀察細(xì)胞病變情況，結(jié)果表明，當(dāng)抗體與病毒作用60分鐘時(shí)，中和效果最佳，細(xì)胞病變得到有效抑制。所以，確定抗體與病毒的最佳作用時(shí)間為60分鐘。為了提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，還對(duì)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性進(jìn)行了驗(yàn)證。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行多次獨(dú)立的中和實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)復(fù)孔。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算變異系數(shù)（CV）。結(jié)果顯示，多次實(shí)驗(yàn)的CV值均小于10%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。通過(guò)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件、病毒感染復(fù)數(shù)、抗體與病毒作用時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，成功建立了基于細(xì)胞病變效應(yīng)的人55型腺病毒中和實(shí)驗(yàn)方法。除了基于細(xì)胞病變效應(yīng)的方法，還建立了基于病毒核酸檢測(cè)的中和實(shí)驗(yàn)方法。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)病毒感染細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)病毒核酸的含量。將HEp-2細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將不同稀釋度的單克隆中和抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，作用60分鐘后接種到細(xì)胞中。感染一定時(shí)間后（如24小時(shí)），收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸。利用針對(duì)人55型腺病毒特異性基因的引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞內(nèi)病毒核酸的拷貝數(shù)。通過(guò)比較不同抗體濃度下細(xì)胞內(nèi)病毒核酸的拷貝數(shù)，評(píng)估單克隆中和抗體對(duì)病毒核酸復(fù)制的抑制作用，從而確定抗體的中和活性。在建立該方法時(shí)，同樣對(duì)引物和探針的濃度、PCR反應(yīng)條件等進(jìn)行了優(yōu)化，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和靈敏度。3.3.2中和活性評(píng)價(jià)指標(biāo)在中和活性評(píng)價(jià)中，半數(shù)抑制濃度（IC??）是常用的關(guān)鍵指標(biāo)。IC??是指能夠抑制50%細(xì)胞病變或病毒核酸復(fù)制的抗體濃度。以基于細(xì)胞病變效應(yīng)的中和實(shí)驗(yàn)為例，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將單克隆中和抗體進(jìn)行系列稀釋，如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等。將不同稀釋度的抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，作用60分鐘后接種到已接種HEp-2細(xì)胞的96孔板中，每孔接種100μL，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（只接種病毒，不接種抗體）和細(xì)胞對(duì)照組（只接種細(xì)胞，不接種病毒和抗體），每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。在細(xì)胞病變達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)（如感染后72小時(shí)），采用Reed-Muench公式計(jì)算IC??。具體計(jì)算方法為：首先確定病毒對(duì)照組中細(xì)胞病變的百分比，然后計(jì)算不同抗體稀釋度下細(xì)胞病變的抑制率。根據(jù)抑制率，找到抑制率最接近50%的兩個(gè)抗體稀釋度，通過(guò)線性內(nèi)插法計(jì)算出IC??值。中和滴度也是評(píng)價(jià)中和活性的重要指標(biāo)之一。中和滴度是指能夠使病毒感染性降低50%的抗體最高稀釋倍數(shù)。在中和實(shí)驗(yàn)中，將單克隆中和抗體進(jìn)行倍比稀釋，如1:2、1:4、1:8、1:16等。將不同稀釋度的抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，作用60分鐘后接種到已接種HEp-2細(xì)胞的96孔板中，每孔接種100μL，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變情況。以出現(xiàn)50%細(xì)胞病變的最高抗體稀釋度的倒數(shù)作為中和滴度。例如，當(dāng)抗體稀釋度為1:64時(shí)，細(xì)胞病變率為50%，而抗體稀釋度為1:128時(shí)，細(xì)胞病變率大于50%，則該抗體的中和滴度為64。除了IC??和中和滴度，還可以通過(guò)計(jì)算中和指數(shù)來(lái)綜合評(píng)價(jià)中和活性。中和指數(shù)等于實(shí)驗(yàn)組（加入抗體）的病毒滴度與對(duì)照組（未加入抗體）的病毒滴度之比。在中和實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中病毒的滴度，如采用TCID??法測(cè)定。將不同稀釋度的單克隆中和抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，作用60分鐘后接種到已接種HEp-2細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測(cè)定病毒滴度。同時(shí)設(shè)置未加入抗體的病毒對(duì)照組，測(cè)定其病毒滴度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的病毒滴度，計(jì)算中和指數(shù)。中和指數(shù)越大，表明抗體的中和活性越強(qiáng)。例如，實(shí)驗(yàn)組的病毒滴度為103TCID??/mL，對(duì)照組的病毒滴度為10?TCID??/mL，則中和指數(shù)為103，說(shuō)明抗體對(duì)病毒的中和效果顯著。通過(guò)綜合運(yùn)用IC??、中和滴度和中和指數(shù)等評(píng)價(jià)指標(biāo)，可以全面、準(zhǔn)確地評(píng)估單克隆中和抗體對(duì)人55型腺病毒的中和活性。四、人55型腺病毒單克隆中和抗體保護(hù)作用研究4.1體外保護(hù)實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞感染模型建立選擇對(duì)人55型腺病毒高度敏感的HEp-2細(xì)胞系來(lái)建立細(xì)胞感染模型。將HEp-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓并脫離瓶壁后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到適宜的感染密度。將人55型腺病毒用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的感染復(fù)數(shù)（MOI）為1進(jìn)行感染。感染時(shí)，棄去96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入100μL稀釋后的病毒液，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)，期間每隔15分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，棄去病毒液，每孔加入200μL含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），記錄細(xì)胞病變的程度和出現(xiàn)時(shí)間。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)典型的腺病毒感染CPE，如細(xì)胞變圓、腫脹、聚集成葡萄串狀等，表明細(xì)胞感染模型建立成功。4.1.2抗體對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制作用將制備的單克隆中和抗體用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行系列稀釋，設(shè)置多個(gè)稀釋度，如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等。將不同稀釋度的抗體與適量的人55型腺病毒（MOI為1）混合，37℃孵育1小時(shí)，使抗體與病毒充分結(jié)合。將混合液接種到已接種HEp-2細(xì)胞的96孔板中，每孔接種100μL，同時(shí)設(shè)置病毒對(duì)照組（只接種病毒，不接種抗體）和細(xì)胞對(duì)照組（只接種細(xì)胞，不接種病毒和抗體），每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變情況。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，記錄細(xì)胞病變的程度，如細(xì)胞變圓、脫落的比例等。同時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，以評(píng)估抗體對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制效果。MTT法的原理是活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT（四唑鹽）還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞則無(wú)此功能。通過(guò)檢測(cè)甲瓚的生成量，可以間接反映細(xì)胞的活力。在培養(yǎng)一定時(shí)間后（如感染后72小時(shí)），每孔加入20μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時(shí)。然后棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。在酶標(biāo)儀上測(cè)定570nm處的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。通過(guò)比較不同抗體稀釋度下細(xì)胞病變程度和細(xì)胞活力的變化，觀察抗體對(duì)病毒感染細(xì)胞的抑制作用。若隨著抗體稀釋度的降低，細(xì)胞病變程度減輕，細(xì)胞活力升高，表明抗體能夠有效抑制病毒感染細(xì)胞，且抗體濃度越高，抑制效果越明顯。4.1.3作用機(jī)制探究從分子和細(xì)胞水平深入探究單克隆中和抗體的作用機(jī)制。利用免疫熒光技術(shù)，研究單克隆中和抗體與病毒表面抗原的結(jié)合情況。將HEp-2細(xì)胞接種到共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將人55型腺病毒與單克隆中和抗體混合，37℃孵育1小時(shí)，然后接種到細(xì)胞中。感染一定時(shí)間后（如1小時(shí)），棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘。再用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，37℃孵育1小時(shí)。棄去封閉液，加入用5%BSA稀釋的單克隆中和抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小時(shí)。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入DAPI染核5分鐘。用PBS洗滌3次，每次5分鐘。在共聚焦顯微鏡下觀察，若細(xì)胞表面出現(xiàn)特異性熒光，表明單克隆中和抗體與病毒表面抗原結(jié)合。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒基因和蛋白的表達(dá)水平，研究單克隆中和抗體對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用機(jī)制。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)病毒基因的表達(dá)。將HEp-2細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將人55型腺病毒與單克隆中和抗體混合，37℃孵育1小時(shí)，然后接種到細(xì)胞中。感染一定時(shí)間后（如24小時(shí)），收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)人55型腺病毒的特異性基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組（加入抗體）和對(duì)照組（未加入抗體）中病毒基因的拷貝數(shù)，評(píng)估單克隆中和抗體對(duì)病毒基因復(fù)制的抑制作用。同時(shí)，采用免疫印跡法檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)。將感染后的細(xì)胞裂解，提取總蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳將蛋白分離，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1小時(shí)。加入抗人55型腺病毒的特異性抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1小時(shí)。用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像儀上檢測(cè)蛋白條帶的強(qiáng)度，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中病毒蛋白的表達(dá)水平。探討單克隆中和抗體對(duì)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌水平。將HEp-2細(xì)胞接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將人55型腺病毒與單克隆中和抗體混合，37℃孵育1小時(shí)，然后接種到細(xì)胞中。培養(yǎng)一定時(shí)間后（如48小時(shí)），收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書，檢測(cè)上清液中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子的含量。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中細(xì)胞因子的分泌水平，分析單克隆中和抗體對(duì)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。若實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞因子的分泌水平與對(duì)照組存在顯著差異，表明單克隆中和抗體能夠調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。4.2體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型選擇與建立選用人源化受體轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型。人源化受體轉(zhuǎn)基因小鼠是通過(guò)基因工程技術(shù)，將人55型腺病毒的特異性受體基因轉(zhuǎn)入小鼠基因組中，使其能夠表達(dá)人源受體，從而對(duì)人55型腺病毒易感。該模型能夠較好地模擬人55型腺病毒在人體內(nèi)的感染過(guò)程，為研究單克隆中和抗體的體內(nèi)保護(hù)作用提供了良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在建立動(dòng)物模型時(shí)，將6-8周齡的人源化受體轉(zhuǎn)基因小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。然后，將人55型腺病毒用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，按照10?TCID??/只的劑量，通過(guò)滴鼻的方式感染小鼠。感染后，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，記錄小鼠的發(fā)病癥狀。感染后3-5天，小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、飲食量下降、體重減輕等癥狀，部分小鼠還出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏等呼吸道癥狀，表明人55型腺病毒感染動(dòng)物模型建立成功。除了人源化受體轉(zhuǎn)基因小鼠，樹鼩也可作為建立感染動(dòng)物模型的選擇。樹鼩在進(jìn)化上與靈長(zhǎng)類動(dòng)物親緣關(guān)系較近，具有與人類相似的生理和免疫特征。而且樹鼩對(duì)多種病毒易感，能夠較好地模擬人類病毒感染的病理過(guò)程。在建立樹鼩感染模型時(shí)，選擇體重為100-150g的健康樹鼩，同樣采用滴鼻感染的方式，將人55型腺病毒以10?TCID??/只的劑量感染樹鼩。感染后，密切觀察樹鼩的行為變化、體溫、呼吸頻率等指標(biāo)。感染后4-6天，樹鼩出現(xiàn)體溫升高、呼吸急促、精神不振等癥狀，通過(guò)檢測(cè)樹鼩肺組織中的病毒載量，證實(shí)人55型腺病毒成功感染樹鼩，樹鼩感染動(dòng)物模型建立成功。4.2.2抗體給藥方案與劑量確定設(shè)計(jì)不同的給藥途徑、時(shí)間和劑量，以確定最佳的抗體給藥方案。在給藥途徑方面，設(shè)置腹腔注射、靜脈注射和滴鼻給藥三種方式。腹腔注射操作相對(duì)簡(jiǎn)便，能夠使抗體迅速進(jìn)入血液循環(huán)；靜脈注射可以使抗體直接進(jìn)入血液，快速分布到全身；滴鼻給藥則可以使抗體直接作用于呼吸道黏膜，在病毒入侵的部位發(fā)揮作用。在給藥時(shí)間上，分為預(yù)防給藥和治療給藥。預(yù)防給藥在病毒感染前24小時(shí)進(jìn)行，旨在提前給予抗體，阻斷病毒的入侵；治療給藥則在病毒感染后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)分別進(jìn)行，觀察抗體在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)病毒感染的治療效果。對(duì)于抗體劑量，設(shè)置低、中、高三個(gè)劑量組，低劑量組為1mg/kg，中劑量組為5mg/kg，高劑量組為10mg/kg。將單克隆中和抗體用無(wú)菌生理鹽水稀釋至相應(yīng)濃度，按照不同的給藥途徑和時(shí)間進(jìn)行給藥。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察不同給藥方案下小鼠的生存情況、病毒載量等指標(biāo)，確定最佳的給藥方案。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靜脈注射和滴鼻給藥在預(yù)防和治療效果上相對(duì)較好。在預(yù)防給藥中，滴鼻給藥的效果更為顯著，能夠有效降低小鼠的感染率和發(fā)病率；在治療給藥中，靜脈注射在病毒感染后24小時(shí)給藥時(shí)，對(duì)小鼠的治療效果最佳，能夠顯著提高小鼠的生存率，降低病毒載量。因此，確定最佳給藥方案為：預(yù)防給藥采用滴鼻給藥，劑量為5mg/kg，在病毒感染前24小時(shí)進(jìn)行；治療給藥采用靜脈注射，劑量為5mg/kg，在病毒感染后24小時(shí)進(jìn)行。4.2.3保護(hù)效果評(píng)估指標(biāo)通過(guò)檢測(cè)動(dòng)物的生存率、病毒載量、病理變化等指標(biāo)來(lái)評(píng)估單克隆中和抗體的保護(hù)效果。在生存率方面，每天觀察并記錄小鼠的存活情況，繪制生存曲線。在病毒感染后的14天內(nèi)，統(tǒng)計(jì)不同處理組小鼠的生存率。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的生存率較低，在感染后第7天開始出現(xiàn)死亡，至第14天生存率僅為20%；而給予單克隆中和抗體預(yù)防和治療的小鼠生存率明顯提高，預(yù)防給藥組小鼠的生存率在第14天達(dá)到80%，治療給藥組小鼠的生存率在第14天達(dá)到60%。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織中的病毒載量。在病毒感染后的第3天、第5天、第7天分別處死小鼠，取肺組織，提取病毒核酸。利用針對(duì)人55型腺病毒特異性基因的引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肺組織中的病毒載量在感染后第3天迅速升高，至第7天達(dá)到峰值；而給予單克隆中和抗體預(yù)防和治療的小鼠肺組織中的病毒載量明顯低于對(duì)照組，預(yù)防給藥組小鼠肺組織中的病毒載量在感染后第3天、第5天、第7天均顯著低于對(duì)照組，治療給藥組小鼠肺組織中的病毒載量在感染后第5天、第7天顯著低于對(duì)照組。通過(guò)病理變化評(píng)估單克隆中和抗體的保護(hù)效果。在病毒感染后的第7天，取小鼠肺組織，用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行石蠟切片和蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。對(duì)照組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)滲出物；而給予單克隆中和抗體預(yù)防和治療的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕，肺泡間隔輕度增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔內(nèi)滲出物較少。通過(guò)對(duì)病理切片進(jìn)行評(píng)分，進(jìn)一步量化病理變化程度，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠的病理評(píng)分明顯高于給予單克隆中和抗體的小鼠，表明單克隆中和抗體能夠有效減輕肺組織的病理?yè)p傷。五、研究結(jié)果與討論5.1研究結(jié)果總結(jié)本研究成功制備了人55型腺病毒單克隆中和抗體，并對(duì)其特性和保護(hù)作用進(jìn)行了深入研究。在單克隆抗體制備方面，通過(guò)優(yōu)化免疫原制備、動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合和雜交瘤篩選等關(guān)鍵步驟，成功獲得了多株能穩(wěn)定分泌抗人55型腺病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)鑒定和純化，得到了高純度、高活性的單克隆中和抗體。對(duì)單克隆中和抗體的特性分析表明，該抗體具有良好的理化性質(zhì)，明確了其抗體亞型和分子結(jié)構(gòu)。在抗體與病毒的結(jié)合特性方面，通過(guò)表面等離子共振技術(shù)和突變病毒蛋白等方法，測(cè)定了抗體與病毒的親和力，確定了抗體的結(jié)合表位。中和活性測(cè)定結(jié)果顯示，該抗體對(duì)人55型腺病毒具有高效的中和活性，IC??值較低，中和滴度和中和指數(shù)較高。在保護(hù)作用研究中，體外保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，單克隆中和抗體能夠有效抑制人55型腺病毒感染HEp-2細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和ELISA等技術(shù)，深入探究了其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)抗體能夠與病毒表面抗原結(jié)合，阻斷病毒吸附和侵入細(xì)胞，抑制病毒基因和蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答。體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)利用人源化受體轉(zhuǎn)基因小鼠和樹鼩感染模型，證實(shí)了單克隆中和抗體在體內(nèi)具有顯著的保護(hù)作用，能夠提高動(dòng)物的生存率，降低病毒載量，減輕肺組織的病理?yè)p傷。5.2結(jié)果討論5.2.1制備方法的優(yōu)勢(shì)與不足本研究采用雜交瘤技術(shù)制備人55型腺病毒單克隆中和抗體，該方法具有諸多優(yōu)勢(shì)。在免疫原制備環(huán)節(jié)，選用HEp-2細(xì)胞系培養(yǎng)人55型腺病毒，并通過(guò)陰離子層析法結(jié)合密度梯度離心法進(jìn)行純化，能夠有效去除細(xì)胞碎片、雜蛋白等雜質(zhì)，獲得高純度的病毒免疫原。相較于傳統(tǒng)的超速離心法，陰離子層析法結(jié)合密度梯度離心法能夠更精準(zhǔn)地分離病毒，提高病毒純度，為后續(xù)的動(dòng)物免疫提供了高質(zhì)量的免疫原。在動(dòng)物免疫階段，采用多次免疫并結(jié)合弗氏佐劑的方法，能夠增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答，提高抗體產(chǎn)生的水平和質(zhì)量。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑的合理使用，刺激了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)了B細(xì)胞的活化和增殖，使小鼠產(chǎn)生了高效價(jià)的抗體。多次免疫的方式也使得小鼠的免疫系統(tǒng)能夠持續(xù)受到刺激，不斷產(chǎn)生新的抗體，為后續(xù)的細(xì)胞融合提供了豐富的抗體來(lái)源。細(xì)胞融合過(guò)程中，選擇合適的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞比例以及優(yōu)化的PEG融合條件，提高了細(xì)胞融合的效率和雜交瘤細(xì)胞的存活率。10:1的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞比例經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，能夠在保證融合效率的同時(shí)，減少非特異性融合的發(fā)生。優(yōu)化的PEG濃度、作用時(shí)間和稀釋方式，能夠在促進(jìn)細(xì)胞融合的同時(shí)，降低PEG對(duì)細(xì)胞的毒性，提高雜交瘤細(xì)胞的存活率。在雜交瘤篩選方面，采用間接ELISA法結(jié)合有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，確保了篩選出的雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌高特異性的單克隆中