乳腺癌中醫(yī)證型與BCRP、MRP2、Sorcin等耐藥蛋白相關性的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的健康和生命質(zhì)量。近年來，隨著生活方式的改變、環(huán)境因素的影響以及人口老齡化的加劇，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。在中國，乳腺癌同樣成為危害女性健康的首要惡性腫瘤，其發(fā)病率增速高于全球平均水平，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。目前，乳腺癌的治療手段包括手術、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等?；熥鳛橹匾娜硇灾委煼椒?，在乳腺癌的綜合治療中占據(jù)著關鍵地位，能夠有效降低腫瘤復發(fā)率，提高患者生存率。然而，多藥耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴重阻礙了化療的療效，成為導致乳腺癌治療失敗和患者預后不良的主要原因之一。腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，使得原本有效的化療藥物無法發(fā)揮其應有的殺傷腫瘤細胞的作用，從而導致腫瘤復發(fā)、轉移，增加患者的死亡率。在眾多與乳腺癌多藥耐藥相關的因素中，耐藥蛋白發(fā)揮著至關重要的作用。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）和Sorcin等耐藥蛋白屬于ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族，它們在腫瘤細胞中高表達時，可作為藥物外排泵，將進入細胞內(nèi)的化療藥物逆濃度梯度轉運到細胞外，導致細胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達到有效殺傷腫瘤細胞的濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，BCRP可將多種化療藥物如米托蒽醌、拓撲替康等排出細胞外；MRP2能轉運多種有機陰離子和化療藥物，如順鉑、阿霉素等；Sorcin則通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度等機制參與腫瘤細胞的耐藥過程。中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學，在乳腺癌的治療中具有獨特的優(yōu)勢和豐富的經(jīng)驗。中醫(yī)認為乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與人體的整體狀態(tài)密切相關，是由于情志失調(diào)、飲食不節(jié)、沖任失調(diào)等多種因素導致機體陰陽失衡、氣血紊亂、痰濕瘀毒互結于乳房而發(fā)病。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)和病理特點，乳腺癌可分為多種中醫(yī)證型，如肝郁氣滯型、痰瘀互結型、氣血虧虛型、腎氣不足型等。不同證型的乳腺癌患者在癥狀、體征、治療方法和預后等方面存在差異。研究乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin等的相關性，具有重要的理論和臨床意義。從理論層面來看，有助于深入揭示乳腺癌多藥耐藥的中醫(yī)發(fā)病機制，豐富中醫(yī)對乳腺癌的認識，為中西醫(yī)結合治療乳腺癌提供理論依據(jù)。從臨床實踐角度出發(fā)，能夠為乳腺癌患者的個體化治療提供新的思路和方法。通過檢測患者的中醫(yī)證型和耐藥蛋白表達水平，醫(yī)生可以更準確地預測患者對化療藥物的敏感性和耐藥性，從而制定更加合理的治療方案，提高化療效果，減少不良反應，改善患者的預后和生活質(zhì)量。因此，開展此項研究具有迫切的現(xiàn)實需求和廣闊的應用前景。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳腺癌中醫(yī)證型研究方面，國內(nèi)學者開展了大量工作。中醫(yī)理論認為乳腺癌的發(fā)生與情志失調(diào)、飲食不節(jié)、沖任失調(diào)等因素密切相關，基于此對乳腺癌進行辨證分型。常見的證型包括肝郁氣滯型、痰瘀互結型、氣血虧虛型、腎氣不足型等。通過臨床觀察和研究，發(fā)現(xiàn)不同證型的乳腺癌患者在癥狀表現(xiàn)、病情發(fā)展及預后等方面存在差異。例如，肝郁氣滯型患者常表現(xiàn)為乳房脹痛、胸悶脅脹，情緒波動對病情影響較大；痰瘀互結型患者乳房腫塊質(zhì)地較硬，可能伴有皮膚瘀斑等癥狀。在一項針對乳腺癌中醫(yī)證型與生存質(zhì)量的研究中，發(fā)現(xiàn)氣血虧虛型患者的生存質(zhì)量在各證型中相對較低，提示該證型患者可能需要更注重扶正治療。國內(nèi)也在不斷探索中醫(yī)證型的客觀化和標準化，嘗試結合現(xiàn)代醫(yī)學的檢測指標，如激素水平、腫瘤標志物等，來更準確地判斷中醫(yī)證型，為臨床治療提供更科學的依據(jù)。國外對乳腺癌的研究主要集中在現(xiàn)代醫(yī)學領域，采用手術、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等方法。但近年來，隨著對中醫(yī)中藥的關注和認可，也有部分研究開始涉及中醫(yī)治療乳腺癌的相關內(nèi)容。然而，由于文化背景和醫(yī)學體系的差異，國外對乳腺癌中醫(yī)證型的研究相對較少，主要是一些關于中醫(yī)中藥輔助治療乳腺癌的臨床觀察，探索中藥在減輕化療副作用、提高患者生活質(zhì)量等方面的作用。在耐藥蛋白的研究上，國內(nèi)外學者均取得了豐碩成果。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）和Sorcin等耐藥蛋白屬于ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族，其在腫瘤細胞中的高表達與多藥耐藥密切相關。大量研究表明，BCRP可將米托蒽醌、拓撲替康等多種化療藥物排出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞對這些藥物產(chǎn)生耐藥性。通過對乳腺癌細胞系和臨床標本的研究，發(fā)現(xiàn)BCRP高表達的乳腺癌患者對化療藥物的敏感性明顯降低，預后較差。MRP2能轉運順鉑、阿霉素等化療藥物，其表達水平與乳腺癌的耐藥性和預后也存在關聯(lián)。Sorcin則通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度等機制參與腫瘤細胞的耐藥過程。有研究利用基因敲除技術，敲低腫瘤細胞中Sorcin的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性顯著提高，表明Sorcin在乳腺癌耐藥中起到重要作用。關于乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性的研究，國內(nèi)已有一些探索性的工作。有研究對不同中醫(yī)證型的乳腺癌患者進行耐藥蛋白檢測，發(fā)現(xiàn)痰瘀互結型患者的BCRP、MRP2表達水平相對較高，提示該證型患者可能更容易出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象，對化療的敏感性較低。另一項研究探討了肝郁氣滯型乳腺癌與耐藥蛋白的關系，發(fā)現(xiàn)肝郁氣滯型患者體內(nèi)肝經(jīng)郁結、氣滯不暢，導致化療藥物在體內(nèi)停滯不前、難以及時排出，從而加重藥物耐藥性，導致治療效果不佳。但總體而言，這方面的研究還處于起步階段，研究樣本量較小，研究方法和指標不夠統(tǒng)一，尚未形成系統(tǒng)的理論和臨床應用體系。當前研究存在一定的不足。乳腺癌中醫(yī)證型的分類標準尚未完全統(tǒng)一，不同地區(qū)、不同醫(yī)家的辨證方法存在差異，這給研究結果的可比性和重復性帶來一定困難。在耐藥蛋白研究方面，雖然對單個耐藥蛋白的作用機制有了較為深入的了解，但對于多種耐藥蛋白之間的相互作用及其協(xié)同導致耐藥的機制尚不清楚。而關于乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性的研究，由于研究的局限性，還無法準確地為臨床治療提供全面、有效的指導。本文的研究旨在通過大樣本的臨床研究，統(tǒng)一中醫(yī)證型的分類標準，深入探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin等的相關性，進一步揭示乳腺癌多藥耐藥的中醫(yī)發(fā)病機制，為臨床治療提供新的理論依據(jù)和實踐指導，彌補當前研究的不足，具有重要的研究價值和臨床意義。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin等之間的內(nèi)在聯(lián)系，分析不同中醫(yī)證型乳腺癌患者耐藥蛋白的表達特征，揭示乳腺癌多藥耐藥的中醫(yī)發(fā)病機制，為乳腺癌的中西醫(yī)結合治療提供更為科學、有效的理論依據(jù)，以提高臨床治療效果，改善患者預后。為實現(xiàn)上述研究目的，本研究采用以下方法：病例收集：收集符合納入標準的乳腺癌患者病例，詳細記錄患者的一般資料，包括年齡、性別、病程等，同時收集患者的臨床癥狀、體征以及相關影像學、病理學檢查結果。嚴格按照中醫(yī)辨證分型標準，對患者進行中醫(yī)證型分類，分為肝郁氣滯型、痰瘀互結型、氣血虧虛型、腎氣不足型等常見證型。納入標準為經(jīng)病理確診為乳腺癌，年齡在18-75歲之間，未接受過化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等，且簽署知情同意書自愿參與本研究的患者。排除標準包括合并其他惡性腫瘤、妊娠或哺乳期婦女、患有嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全及精神疾病等無法配合研究的患者。免疫組化測定：采用免疫組織化學方法檢測乳腺癌組織中BCRP、MRP2、Sorcin等耐藥蛋白的表達水平。具體步驟如下，首先對手術切除或穿刺活檢獲取的乳腺癌組織標本進行固定、脫水、石蠟包埋等處理，制成厚度為4μm的連續(xù)切片。然后進行脫蠟、水化處理，采用高溫高壓抗原修復法修復抗原，以3%過氧化氫溶液孵育切片10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。接著滴加一抗（兔抗人BCRP、MRP2、Sorcin抗體），4℃冰箱過夜孵育。次日，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育30分鐘，再滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物，室溫孵育30分鐘。最后使用DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染細胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察，以細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，根據(jù)陽性細胞所占百分比及染色強度對結果進行半定量分析。統(tǒng)計分析：運用統(tǒng)計學軟件（如SPSS22.0）對收集的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白表達水平之間的相關性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。二、乳腺癌相關理論基礎2.1乳腺癌概述乳腺癌是一種起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢，嚴重威脅著女性的身心健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，首次超過肺癌，成為全球最常見的癌癥。在中國，乳腺癌的發(fā)病率同樣不容小覷，每年新發(fā)病例約為42萬例，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。乳腺癌的發(fā)病機制較為復雜，涉及遺傳、激素、環(huán)境、生活方式等多種因素。遺傳因素在乳腺癌的發(fā)生中起著重要作用，約5%-10%的乳腺癌患者具有明確的遺傳傾向，其中BRCA1和BRCA2基因突變是最為常見的遺傳因素。激素水平的變化也與乳腺癌的發(fā)病密切相關，雌激素、孕激素等激素的長期刺激可能導致乳腺上皮細胞異常增殖，從而增加乳腺癌的發(fā)病風險。環(huán)境因素如長期暴露于化學物質(zhì)、輻射等，以及不良的生活方式，如高脂肪飲食、缺乏運動、長期熬夜、飲酒等，也被認為是乳腺癌的重要危險因素。乳腺癌早期通常無明顯癥狀，隨著病情的發(fā)展，可出現(xiàn)乳房腫塊、乳頭溢液、皮膚改變、乳頭回縮或抬高、腋窩及鎖骨上窩淋巴結腫大等癥狀。乳房腫塊是乳腺癌最常見的癥狀，多為單發(fā)，質(zhì)硬，邊緣不規(guī)則，表面欠光滑，多數(shù)患者無疼痛感覺。乳頭溢液可為血性、漿液性或水樣，單側單孔的血性溢液尤其需要警惕乳腺癌的可能。皮膚改變可表現(xiàn)為“酒窩征”，即腫瘤侵犯連接乳腺皮膚和深層胸肌筋膜的Cooper韌帶，使其縮短并牽拉相應部位的皮膚，形成類似酒窩的凹陷；還可出現(xiàn)橘皮樣改變，是由于皮下淋巴管被癌細胞堵塞，引起淋巴回流障礙，出現(xiàn)真皮水腫，皮膚毛囊處形成許多點狀凹陷，形似橘皮。當病情進展到晚期，癌細胞可發(fā)生遠處轉移，侵犯全身多個器官，如肺、肝、骨等，導致相應的癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間。乳腺癌本質(zhì)上是一種全身性疾病，其治療需要綜合考慮患者的病情、身體狀況、心理狀態(tài)等多方面因素，采用多學科綜合治療策略。目前，乳腺癌的治療方法主要包括手術治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療和中醫(yī)中藥治療等。手術治療是乳腺癌的主要治療手段之一，包括乳腺癌根治術、改良根治術、保乳手術等，根據(jù)患者的病情和身體狀況選擇合適的手術方式?；熓峭ㄟ^使用化學藥物殺死癌細胞，可分為術前新輔助化療、術后輔助化療和晚期姑息化療，能夠有效降低腫瘤復發(fā)率，提高患者生存率，但化療藥物在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損傷，導致一系列不良反應，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。放療是利用放射線殺死癌細胞，可在手術后輔助放療，降低局部復發(fā)風險，也可用于晚期乳腺癌的姑息治療。內(nèi)分泌治療主要針對激素受體陽性的乳腺癌患者，通過抑制雌激素的合成或作用，阻止癌細胞的生長和增殖。靶向治療則是針對癌細胞的特定分子靶點，使用特異性的藥物進行治療，具有療效高、副作用小的特點，如針對人表皮生長因子受體2（HER2）陽性的乳腺癌患者，可使用曲妥珠單抗等靶向藥物。中醫(yī)中藥在乳腺癌的治療中具有獨特的優(yōu)勢，能夠從整體出發(fā)，調(diào)節(jié)患者的機體功能，提高免疫力，減輕放化療的不良反應，改善患者的生活質(zhì)量。中醫(yī)認為乳腺癌的發(fā)生與人體的整體狀態(tài)密切相關，是由于情志失調(diào)、飲食不節(jié)、沖任失調(diào)等多種因素導致機體陰陽失衡、氣血紊亂、痰濕瘀毒互結于乳房而發(fā)病。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)和病理特點，乳腺癌可分為多種中醫(yī)證型，如肝郁氣滯型、痰瘀互結型、氣血虧虛型、腎氣不足型等。中醫(yī)通過辨證論治，采用中藥內(nèi)服、外用、針灸、推拿等多種方法，對乳腺癌進行綜合治療，以達到扶正祛邪、調(diào)理臟腑、改善癥狀、提高生存質(zhì)量的目的。在乳腺癌的治療中，中西醫(yī)結合治療模式越來越受到重視，將中醫(yī)中藥與現(xiàn)代醫(yī)學的治療方法有機結合，能夠充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，提高治療效果，為乳腺癌患者帶來更好的治療前景。2.2中醫(yī)對乳腺癌的認識2.2.1病名與癥狀認識中醫(yī)對乳腺癌的認識歷史悠久，在眾多古籍中有著豐富的記載，其病名也歷經(jīng)演變，反映了古人對這一疾病的不斷探索和認識。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，雖未明確提及“乳腺癌”這一病名，但有關于“乳癰”“乳疳”等病癥的記載，其中部分癥狀與乳腺癌有一定的相似性。如《靈樞?癰疽》中描述“癰發(fā)于嗌中……其癰堅而不潰者，為馬刀挾癭，急治之。”這里的“馬刀挾癭”被認為與乳腺癌轉移至頸部淋巴結的癥狀相關。隨著時間的推移，歷代醫(yī)家對乳腺癌的認識逐漸深入，病名也更加多樣化和準確。漢代《中藏經(jīng)》記載“乳癖”之名，認為其病因與“寒氣客于經(jīng)絡，與血氣相搏”有關。晉代《肘后備急方》中提到“乳毒”，描述了乳房腫塊的癥狀。南北朝時期的《劉涓子鬼遺方》首次提出“乳石癰”，指出“乳中結聚成核，微強不甚大，硬若石狀”，對乳腺癌腫塊質(zhì)地堅硬如石的特點有了較為準確的描述。唐代《千金要方》和《外臺秘要》中分別記載了“乳石癰”和“石癰”，進一步強調(diào)了乳房腫塊堅硬、不痛不癢的特征。宋代《婦人大全良方》最早提出“乳巖”病名，書中記載“初起內(nèi)結小核，或如鱉棋子，不赤不痛，積之歲月漸大，峻巖崩破如熟石榴，或內(nèi)潰深洞，血水滴瀝，此屬肝脾郁怒，氣血虧虛，名曰乳巖”。這一描述不僅詳細闡述了乳腺癌的發(fā)病過程，從初期的乳房小結節(jié)，到逐漸增大、破潰，出現(xiàn)血水淋漓的晚期癥狀，還指出了其病因與肝脾郁怒、氣血虧虛有關，為后世對乳腺癌的辨證論治提供了重要依據(jù)。中醫(yī)對乳腺癌癥狀的認識也較為全面，與現(xiàn)代醫(yī)學的臨床表現(xiàn)相互印證。在乳房腫塊方面，中醫(yī)古籍中多描述為質(zhì)地堅硬、表面不光滑、邊界不清，如《外科正宗》中說“乳巖初起，結核如鱉棋子大，不痛不癢，或腫如覆碗，色紫堅硬”。這與現(xiàn)代醫(yī)學中乳腺癌腫塊的特征相符，即多為單發(fā)、質(zhì)硬、邊緣不規(guī)則、表面欠光滑。乳頭溢液在中醫(yī)中也有記載，可表現(xiàn)為血性、漿液性或水樣溢液，如《瘍醫(yī)大全》中提到“婦女乳房忽然細小如雞頭，陰疼如刺，兩腋下作痛，有赤色核，或乳頭內(nèi)縮，或溢出血水，或有肉粒突出，此系乳巖將成之候”?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，單側單孔的血性溢液尤其需要警惕乳腺癌的可能，中醫(yī)對這一癥狀的觀察為早期診斷提供了線索。皮膚改變也是乳腺癌的重要癥狀之一，中醫(yī)對其也有獨特的認識。“酒窩征”在中醫(yī)古籍中雖未明確提及，但對乳房皮膚凹陷的描述與現(xiàn)代醫(yī)學的“酒窩征”類似，如《外科真詮》中記載“乳巖……初起如豆大，漸如棋子，半年一年，二載三載，不痛不癢，漸漸而大，始生疼痛，痛則無解，日后腫如堆栗，或如覆碗，紫色氣穢，漸漸潰爛，深者如巖穴，淺者如泛蓮，血水浸淫，疼痛連心”。這里描述的乳房皮膚逐漸潰爛、凹陷的過程，可視為“酒窩征”的一種表現(xiàn)?！伴倨痈淖儭痹谥嗅t(yī)中被形象地描述為“如桔皮樣”，如《瘍科心得集》中說“乳巖……皮色紫褐，堅硬如石，推之不移，漸漸腫大，高低不平，如桔皮樣”。這與現(xiàn)代醫(yī)學中由于皮下淋巴管被癌細胞堵塞，引起淋巴回流障礙，出現(xiàn)真皮水腫，皮膚毛囊處形成許多點狀凹陷，形似橘皮的癥狀一致。乳頭回縮或抬高、腋窩及鎖骨上窩淋巴結腫大等癥狀在中醫(yī)古籍中也有相關記載?！锻饪普凇分刑岬健叭閹r……初起，內(nèi)結小核，或如鱉棋子，不赤不痛，積之歲月漸大，巉巖崩破如熟石榴，或內(nèi)潰深洞，血水淋漓，疼痛連心，或瘡口紫黑，凹如泛蓮，其時五臟俱衰，四大不救，名曰乳巖”。這里描述的乳房腫塊破潰后，病情發(fā)展到晚期，可出現(xiàn)腋窩及鎖骨上窩淋巴結腫大等癥狀。《瘍醫(yī)大全》中也有“乳巖……初起，內(nèi)結小核，漸大如桃、如李，不紅不熱，漸漸作痛，痛則難忍，日后腫如堆栗，或如覆碗，紫色氣穢，漸漸潰爛，深者如巖穴，淺者如泛蓮，血水浸淫，疼痛連心，或瘡口紫黑，凹如泛蓮，其時五臟俱衰，四大不救，名曰乳巖”的記載，其中“內(nèi)結小核，漸大如桃、如李”可理解為乳房腫塊逐漸增大，而“疼痛連心”可能與癌細胞侵犯神經(jīng)有關，也可能暗示了腋窩及鎖骨上窩淋巴結腫大引起的疼痛。中醫(yī)古籍中對乳腺癌病名的記載豐富多樣，對癥狀的認識也較為全面，與現(xiàn)代醫(yī)學的臨床表現(xiàn)相互補充，為中醫(yī)對乳腺癌的診斷和治療提供了寶貴的經(jīng)驗和理論基礎。2.2.2病因病機認識中醫(yī)理論認為，乳腺癌的發(fā)生是多種因素相互作用的結果，主要病因包括情志不暢、飲食不節(jié)、沖任失調(diào)、正氣不足以及外邪入侵等。情志不暢在乳腺癌的發(fā)病中起著關鍵作用。肝主疏泄，調(diào)節(jié)情志，若長期情志抑郁、焦慮、憤怒等，導致肝氣郁結，氣機不暢，氣血瘀滯，經(jīng)絡阻滯，結于乳房而成腫塊。正如《外科正宗》所云：“憂郁傷肝，思慮傷脾，積想在心，所愿不得者，致經(jīng)絡痞澀，聚結成核?！遍L期的情志不舒，使肝失疏泄，氣血運行不暢，氣不行則血滯，氣滯血瘀日久，痰濁內(nèi)生，痰瘀互結于乳房，從而引發(fā)乳腺癌。臨床觀察也發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中很多都有長期精神壓力大、情緒不穩(wěn)定的情況，這進一步證實了情志因素與乳腺癌發(fā)病的密切關系。飲食不節(jié)也是重要的病因之一。脾胃為后天之本，氣血生化之源，若過食肥甘厚味、辛辣刺激之品，或飲食不規(guī)律，損傷脾胃，導致脾胃運化失常，水濕內(nèi)停，聚濕生痰，痰濁阻滯經(jīng)絡，氣血運行不暢，痰瘀互結于乳房，發(fā)為乳巖?！端貑?奇病論》中提到“此肥美之所發(fā)也，此人必數(shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉為消渴?！彪m然這里論述的是消渴病，但也體現(xiàn)了飲食與疾病的關系。長期飲食不節(jié)，導致體內(nèi)痰濕內(nèi)生，是乳腺癌發(fā)病的重要因素之一?，F(xiàn)代生活中，高脂肪、高熱量飲食的攝入增多，肥胖人群比例增加，乳腺癌的發(fā)病率也隨之上升，這與中醫(yī)對飲食與乳腺癌關系的認識相契合。沖任失調(diào)與乳腺癌的發(fā)生密切相關。沖任二脈皆起于胞中，沖為血海，任主胞胎，沖任之脈上貫于乳，下濡胞宮。女子以肝為先天，腎為元氣之根，沖任之本。若腎氣不足，沖任失調(diào)，氣血運行不暢，氣滯血凝，阻于乳中而成本病?！吨T病源候論》指出：“有下于乳者，其經(jīng)虛，為風寒氣客之，則血澀結成癰腫，但結核如石，謂之石癰?！边@里的“經(jīng)虛”可理解為沖任失調(diào)，氣血不足，外邪乘虛而入，導致乳房氣血凝滯，形成腫塊。臨床中，月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、不孕等沖任失調(diào)的女性，患乳腺癌的風險相對較高。正氣不足是乳腺癌發(fā)病的內(nèi)在基礎。《素問?刺法論》曰：“正氣存內(nèi)，邪不可干。邪之所湊，其氣必虛?！比梭w正氣虛弱，臟腑功能衰退，氣血陰陽失調(diào)，抵抗力下降，外邪易于入侵，或內(nèi)生痰濁、瘀血等病理產(chǎn)物，結聚于乳房，發(fā)為乳巖。《醫(yī)宗必讀》中亦有“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”的論述。乳腺癌患者在患病后，由于手術、化療、放療等治療手段的損傷，以及疾病本身的消耗，往往正氣更虛，容易出現(xiàn)復發(fā)和轉移。外邪入侵也可能導致乳腺癌的發(fā)生?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》云：“八風客于經(jīng)絡之中，為瘤病者也?！薄鹅`樞?五變》認為，“寒濕不次，邪氣稍至，蓄積留止，大聚乃起”。風寒、濕熱等外邪侵襲人體，留滯于乳房經(jīng)絡，氣血運行不暢，日久形成腫塊。雖然外邪入侵在乳腺癌發(fā)病中所占比例相對較小，但在某些情況下，也可能成為誘發(fā)因素?；谏鲜霾∫?，乳腺癌主要有肝郁氣滯、痰濕阻滯、血瘀凝結等證型，各證型有著不同的病機。肝郁氣滯型的病機主要是情志不暢，導致肝氣郁結，疏泄失常。肝失疏泄，氣機不暢，氣血運行受阻，經(jīng)絡不通，結于乳房，形成腫塊。此類患者常伴有情緒抑郁、煩躁易怒、胸脅脹滿、乳房脹痛等癥狀，月經(jīng)周期也可能受到影響，經(jīng)行不暢，乳房脹痛在月經(jīng)前加重，月經(jīng)后緩解。在治療上，應以疏肝理氣、解郁散結為主，常用方劑如逍遙散等。痰濕阻滯型的病機為脾胃虛弱，運化失常，水濕內(nèi)停，聚濕生痰，痰濁阻滯乳房經(jīng)絡，氣血運行不暢，痰瘀互結形成腫塊。這類患者乳房腫塊質(zhì)地較硬，表面光滑，邊界不清，可伴有胸悶、腹脹、肢體困重、惡心嘔吐、舌苔厚膩等癥狀。治療時應以健脾利濕、化痰散結為原則，可選用二陳湯合瓜蔞薤白半夏湯等方劑。血瘀凝結型的病機是氣滯血瘀，瘀血阻滯乳房脈絡，氣血運行不暢，瘀滯日久，凝結成塊。患者乳房腫塊堅硬，疼痛明顯，皮色紫暗，或有瘀斑，舌質(zhì)紫暗或有瘀點、瘀斑，脈澀。治療宜活血化瘀、軟堅散結，常以血府逐瘀湯等方劑加減。中醫(yī)對乳腺癌病因病機的認識是一個整體的、綜合的體系，強調(diào)人體內(nèi)部環(huán)境的平衡以及內(nèi)外因素的相互作用。通過對病因病機的深入分析，為中醫(yī)辨證論治乳腺癌提供了堅實的理論依據(jù)，有助于制定更加精準有效的治療方案。2.3現(xiàn)代醫(yī)學對乳腺癌耐藥機制的認識2.3.1多藥耐藥現(xiàn)象多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）是腫瘤治療領域中一個棘手的難題，在乳腺癌治療中也極為突出。它是指腫瘤細胞在接觸一種化療藥物后，不僅對該藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其他結構和作用機制不同的多種化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象使得原本有效的化療藥物無法發(fā)揮其應有的殺傷腫瘤細胞的作用，導致腫瘤細胞得以繼續(xù)存活和增殖，嚴重阻礙了化療的療效。多藥耐藥現(xiàn)象在乳腺癌化療中表現(xiàn)得十分明顯。許多乳腺癌患者在接受化療的過程中，初期化療藥物能夠有效地抑制腫瘤的生長，使腫瘤體積縮小，病情得到緩解。然而，隨著化療的進行，腫瘤細胞逐漸適應了化療藥物的作用，對藥物產(chǎn)生了耐受性，化療藥物的療效逐漸降低，腫瘤開始復發(fā)和轉移。例如，在使用蒽環(huán)類和紫杉烷類化療藥物治療乳腺癌時，部分患者在初始階段對藥物敏感，腫瘤得到有效控制，但經(jīng)過一段時間的治療后，腫瘤細胞對這些藥物產(chǎn)生耐藥，即使增加藥物劑量或更換其他化療藥物，治療效果也不理想。多藥耐藥的產(chǎn)生與多種因素密切相關。其中，腫瘤細胞本身的生物學特性起著關鍵作用。腫瘤細胞具有高度的異質(zhì)性，不同的腫瘤細胞亞群可能具有不同的耐藥機制。一些腫瘤細胞可能通過基因突變或基因表達的改變，獲得了耐藥的能力。例如，某些乳腺癌細胞中編碼藥物轉運蛋白的基因表達上調(diào)，導致藥物轉運蛋白的合成增加，這些轉運蛋白能夠?qū)⒒熕幬飶募毎麅?nèi)排出，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。腫瘤微環(huán)境也對多藥耐藥的形成有著重要影響。腫瘤微環(huán)境中的缺氧、酸性pH值、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素，能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生一系列適應性改變，增強其耐藥性。腫瘤相關的間質(zhì)細胞，如成纖維細胞、免疫細胞等，也可以通過分泌細胞因子、生長因子等，與腫瘤細胞相互作用，促進腫瘤細胞的耐藥。多藥耐藥對乳腺癌患者的預后產(chǎn)生了極其不良的影響。一旦腫瘤細胞出現(xiàn)多藥耐藥，化療的效果將大打折扣，患者的復發(fā)風險顯著增加，生存時間明顯縮短。研究表明，多藥耐藥的乳腺癌患者5年生存率較非耐藥患者明顯降低。耐藥的腫瘤細胞更容易發(fā)生遠處轉移，侵犯身體其他部位的組織和器官，進一步加重病情，給治療帶來更大的困難。多藥耐藥還會導致患者需要接受更多的治療手段，如更換化療方案、增加放療劑量等，這不僅增加了患者的經(jīng)濟負擔，還會帶來更多的不良反應，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。因此，深入研究乳腺癌多藥耐藥的機制，尋找有效的逆轉耐藥的方法，對于提高乳腺癌的治療效果，改善患者的預后具有至關重要的意義。2.3.2耐藥蛋白的作用在乳腺癌多藥耐藥的眾多機制中，耐藥蛋白發(fā)揮著關鍵作用。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）和Sorcin等耐藥蛋白屬于ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族，它們在腫瘤細胞的耐藥過程中扮演著重要角色。BCRP，又稱ABCG2，是一種跨膜蛋白，由ABCG2基因編碼。其結構包含一個核苷酸結合結構域（NBD）和一個跨膜結構域（TMD）。NBD能夠結合和水解ATP，為藥物轉運提供能量；TMD則負責識別和結合化療藥物，并將其轉運出細胞。BCRP主要在細胞膜上表達，其功能是作為藥物外排泵，將進入細胞內(nèi)的化療藥物逆濃度梯度轉運到細胞外，導致細胞內(nèi)藥物濃度降低，無法達到有效殺傷腫瘤細胞的濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。許多研究表明，BCRP與乳腺癌對多種化療藥物的耐藥密切相關。BCRP可將米托蒽醌、拓撲替康、伊馬替尼等多種化療藥物排出細胞外。在乳腺癌細胞系和臨床標本的研究中發(fā)現(xiàn)，BCRP高表達的乳腺癌患者對化療藥物的敏感性明顯降低，預后較差。一項對乳腺癌患者的研究顯示，BCRP陽性表達的患者無病生存期和總生存期均顯著短于BCRP陰性表達的患者。MRP2，也屬于ABC轉運蛋白超家族，由ABCC2基因編碼。它是一種多特異性有機陰離子轉運蛋白，結構同樣包含NBD和TMD。MRP2主要在肝臟、腎臟、腸道等組織中表達，在腫瘤細胞中也有表達。其功能是轉運多種有機陰離子和化療藥物，如順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤等。MRP2通過與谷胱甘肽（GSH）結合，形成GSH-藥物復合物，然后將其轉運出細胞，從而降低細胞內(nèi)藥物濃度，導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，MRP2的表達水平與乳腺癌的耐藥性和預后存在關聯(lián)。在乳腺癌細胞中，過表達MRP2可導致細胞對順鉑、阿霉素等化療藥物的耐藥性增強。臨床研究也表明，MRP2高表達的乳腺癌患者對化療的反應較差，復發(fā)風險較高。Sorcin是一種胞質(zhì)鈣結合蛋白，雖然不屬于ABC轉運蛋白超家族，但在乳腺癌多藥耐藥中也發(fā)揮著重要作用。Sorcin由SRI基因編碼，其結構中含有4個EF-hand結構域，能夠結合鈣離子。Sorcin主要分布在細胞質(zhì)中，其功能與細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)密切相關。在乳腺癌細胞中，Sorcin通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度，影響細胞的增殖、凋亡和耐藥等過程。當細胞受到化療藥物刺激時，Sorcin可通過與鈣離子結合，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子信號通路，使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥。有研究利用基因敲除技術，敲低腫瘤細胞中Sorcin的表達，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對化療藥物的敏感性顯著提高，表明Sorcin在乳腺癌耐藥中起到重要作用。例如，在對乳腺癌細胞系的研究中，敲低Sorcin表達后，細胞對紫杉醇的耐藥性明顯降低，細胞凋亡率增加。BCRP、MRP2、Sorcin等耐藥蛋白通過各自獨特的結構和功能，在乳腺癌多藥耐藥中發(fā)揮著關鍵作用。它們的高表達導致腫瘤細胞對化療藥物的外排增加、細胞內(nèi)藥物濃度降低，以及細胞內(nèi)信號通路的改變，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響乳腺癌的化療效果和患者的預后。深入研究這些耐藥蛋白的作用機制，對于尋找有效的逆轉耐藥方法，提高乳腺癌的治療水平具有重要意義。三、乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性研究設計3.1研究對象與樣本采集本研究的對象為廈門市中醫(yī)院胸外乳腺科收治的乳腺癌患者。選擇該醫(yī)院作為樣本來源，是因為廈門市中醫(yī)院在中醫(yī)治療乳腺疾病方面具有豐富的經(jīng)驗和專業(yè)的醫(yī)療團隊，擁有大量的乳腺癌病例資源，且醫(yī)院具備完善的醫(yī)療設施和先進的檢測技術，能夠為研究提供有力的支持。納入標準如下：經(jīng)病理確診為乳腺癌，病理診斷依據(jù)《WHO乳腺腫瘤分類》標準；年齡在18-75歲之間，該年齡段涵蓋了乳腺癌的主要發(fā)病群體，能夠更全面地反映不同年齡段患者的情況；未接受過化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等，確?；颊唧w內(nèi)的耐藥蛋白表達未受到這些治療手段的影響，從而更準確地研究乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究，以保障研究的合法性和倫理合理性。排除標準包括：合并其他惡性腫瘤，避免其他腫瘤對研究結果產(chǎn)生干擾；妊娠或哺乳期婦女，因為妊娠和哺乳期女性體內(nèi)的激素水平變化較大，可能會影響耐藥蛋白的表達，且治療手段也會受到限制；患有嚴重心腦血管疾病、肝腎功能不全及精神疾病等無法配合研究的患者，這類患者的身體狀況或精神狀態(tài)可能無法承受研究過程中的檢查和治療，同時也會影響研究結果的準確性。在樣本采集方面，收集符合納入標準的乳腺癌患者病例。詳細記錄患者的一般資料，如年齡、性別、病程等，這些信息對于分析不同特征患者的耐藥蛋白表達情況具有重要意義。同時，全面收集患者的臨床癥狀、體征以及相關影像學、病理學檢查結果，為中醫(yī)辨證分型和耐藥蛋白檢測提供依據(jù)。對于中醫(yī)證型的判斷，由至少兩名具有豐富經(jīng)驗的中醫(yī)腫瘤專家依據(jù)《中醫(yī)內(nèi)科學》《中醫(yī)外科學》等相關標準進行辨證，確保辨證的準確性和可靠性。常見的中醫(yī)證型分為肝郁氣滯型、痰瘀互結型、氣血虧虛型、腎氣不足型等。在手術切除或穿刺活檢獲取乳腺癌組織標本時，嚴格按照規(guī)范的操作流程進行。對于手術切除的標本，在切除后立即用生理鹽水沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將標本切成大小適中的組織塊，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12h，以防止組織細胞的形態(tài)和結構發(fā)生改變。固定后的標本進行脫水處理，依次用50%酒精沖洗2次，70%酒精浸泡1天，80%酒精過夜，95%酒精浸泡3h，無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡2h。脫水后進行透明處理，將標本置于1:1無水酒精二甲苯中浸泡45min，再用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各浸泡30min。最后進行包埋，將標本浸入石蠟，在恒溫箱內(nèi)進行操作，先將標本放入1:1二甲苯石蠟（58℃）中浸泡45min，然后依次用石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）浸泡共2.5h，最后用石蠟（Ⅲ）包埋組織。包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成4μm的連續(xù)切片，用于后續(xù)的免疫組化檢測。對于穿刺活檢獲取的標本，同樣按照上述固定、脫水、透明、包埋和切片的步驟進行處理。3.2中醫(yī)辨證分型依據(jù)中醫(yī)理論和臨床經(jīng)驗，本研究將乳腺癌患者分為肝郁氣滯、痰濕阻滯、血瘀凝結三型。肝郁氣滯型：此型患者主要因情志不暢，長期的抑郁、焦慮、惱怒等不良情緒導致肝氣郁結，疏泄失常，氣機阻滯不暢，氣血運行受阻，結于乳房而成腫塊。診斷標準主要基于患者的癥狀表現(xiàn)，乳房脹痛是其典型癥狀之一，這種脹痛多與情緒變化密切相關，在情緒波動較大時疼痛往往加重，且疼痛可向胸脅部放射。乳房脹滿也是常見癥狀，患者常自覺乳房有脹滿不適之感。乳房硬結，質(zhì)地一般較硬，邊界多不甚清晰。此外，患者還常伴有肝氣郁結的其他證候，如情緒抑郁、煩躁易怒，精神狀態(tài)易受影響；胸脅脹滿，感覺胸部及脅肋部脹滿不舒；善太息，常不自覺地嘆氣，以舒緩胸中的憋悶感；月經(jīng)不調(diào)，月經(jīng)周期紊亂，月經(jīng)量可能減少或增多，經(jīng)行不暢，部分患者還會出現(xiàn)乳房脹痛在月經(jīng)前加重，月經(jīng)后緩解的情況。在舌象上，舌質(zhì)多淡紅，舌苔薄白或薄黃；脈象弦，這是肝郁氣滯的典型脈象，弦脈主肝病、主氣滯。例如，某患者因工作壓力大，長期心情抑郁，近期發(fā)現(xiàn)乳房出現(xiàn)腫塊，伴有乳房脹痛，情緒煩躁時疼痛加劇，胸脅脹滿，月經(jīng)周期紊亂，經(jīng)前乳房脹痛明顯，經(jīng)中醫(yī)診斷為肝郁氣滯型乳腺癌。痰濕阻滯型：該型主要是由于脾胃虛弱，運化功能失常，水濕不能正常代謝，聚濕生痰，痰濁阻滯乳房經(jīng)絡，氣血運行不暢，痰瘀互結形成腫塊。診斷標準方面，乳房腫脹是較為突出的癥狀，患者可感覺乳房有明顯的腫脹感。乳汁減少或無乳汁，尤其對于哺乳期女性，可能出現(xiàn)乳汁分泌減少甚至完全無乳的情況。病變位置多在乳頭部位，乳頭周圍可能出現(xiàn)腫塊或結節(jié)。患者還常伴有痰濕積聚的其他表現(xiàn)，如身體肥胖，因痰濕內(nèi)生，阻礙氣血運行，影響水液代謝，導致脂肪堆積；胸悶，感覺胸部憋悶不適，呼吸不暢；腹脹，腹部脹滿，食欲不振；肢體困重，感覺四肢沉重，活動不利；惡心嘔吐，脾胃運化失常，胃氣上逆，可出現(xiàn)惡心、嘔吐等癥狀；舌苔厚膩，這是痰濕內(nèi)盛的典型舌象，舌苔白膩或黃膩，提示體內(nèi)痰濕之邪的性質(zhì)；脈象滑，滑脈主痰飲、食滯等，說明體內(nèi)有痰濕積聚。比如，有一位患者體型肥胖，近期發(fā)現(xiàn)乳頭周圍出現(xiàn)腫塊，伴有乳房腫脹，自覺胸悶、腹脹，食欲不佳，舌苔厚膩，經(jīng)中醫(yī)辨證為痰濕阻滯型乳腺癌。血瘀凝結型：此型的形成多因氣滯日久，導致血行不暢，瘀血阻滯乳房脈絡，氣血運行嚴重受阻，瘀滯日久，凝結成塊。診斷主要依據(jù)患者乳房堅硬，腫塊質(zhì)地堅硬如石，推之不移；壓痛明顯，觸壓腫塊時疼痛較為劇烈。氣滯、痰飲等均可造成血瘀，病理表現(xiàn)以局部血管閉塞為主，血瘀凝滯更加嚴重，可出現(xiàn)乳房局部皮膚顏色紫暗，或有瘀斑，這是瘀血阻滯的外在表現(xiàn)?；颊哌€可能伴有其他血瘀癥狀，如面色晦暗，氣血瘀滯，不能上榮于面，導致面色無華，晦暗無光；月經(jīng)色暗或有血塊，月經(jīng)血運行不暢，瘀滯于胞宮，排出時可見經(jīng)血顏色暗紅，伴有血塊；舌質(zhì)紫暗或有瘀點、瘀斑，這是瘀血在舌象上的反映，提示體內(nèi)瘀血阻滯的程度；脈象澀，澀脈主瘀血，表明血脈運行不暢，有瘀滯現(xiàn)象。例如，某患者乳房發(fā)現(xiàn)堅硬腫塊，疼痛明顯，局部皮膚有瘀斑，月經(jīng)色暗有血塊，舌質(zhì)紫暗，經(jīng)診斷為血瘀凝結型乳腺癌。3.3耐藥蛋白檢測方法本研究采用SP免疫組化法測定各證型癌組織中BCRP、MRP2、Sorcin表達情況。該方法基于抗原抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色，從而確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及定量的研究。實驗原理為：先將組織或細胞中的某些化學物質(zhì)提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫實驗動物，制備特異性抗體（第一抗體）。再用這種抗體作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用辣根過氧化物酶或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，形成抗原-一抗-二抗復合物，將抗原放大。由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來，常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。操作步驟如下：脫蠟與水化：脫蠟前將組織芯片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min。接著進行水化，無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min。PBS沖洗：用PBS沖洗2-3次，每次5min。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性：使用3%H?O?去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。再次PBS沖洗：PBS沖洗2-3次，每次5min?？乖迯停簩⑶衅?.01M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫。又一次PBS沖洗：PBS沖洗2-3次，每次5min。封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體。滴加一抗：滴加50μl一抗（兔抗人BCRP、MRP2、Sorcin抗體），室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜（需在37℃復溫45min）。PBS沖洗：PBS沖洗2-3次，每次5min。滴加二抗：滴加辣根過氧化物酶標記的二抗40-50μl，室溫靜置1h，或37℃1h。再次PBS沖洗：PBS沖洗2-3次，每次5min。滴加SP：滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h。PBS沖洗：PBS沖洗2-3次，每次5min。顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，以胞漿呈棕色者判定為陽性細胞。顯色劑的配置為在1ml水中加1滴顯色劑A（DAB），搖勻，然后加1滴顯色劑B（H?O?），搖勻，再加1滴顯色劑C（磷酸緩沖液），搖勻。終止反應：自來水沖洗10分鐘終止反應。復染：蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化。沖洗：自來水沖洗10-15min。脫水、透明、封片：進行常規(guī)脫水、透明、封片，用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上。結果判定方法為：每張切片選擇5個高倍鏡視野（400X），應用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析。根據(jù)陽性細胞所占百分比及染色強度對結果進行半定量分析，陽性細胞所占百分比<10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），>80%為強陽性（+++）。染色強度根據(jù)切片中陽性細胞的顯色程度分為淡黃色為弱陽性，棕黃色為中度陽性，棕褐色為強陽性。通過綜合分析陽性細胞百分比和染色強度，判斷各證型癌組織中BCRP、MRP2、Sorcin的表達水平。3.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，確保數(shù)據(jù)處理的準確性和科學性。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；若多組間比較，則采用方差分析，以探究不同組之間的差異是否具有統(tǒng)計學意義。例如，在分析不同中醫(yī)證型乳腺癌患者的年齡分布時，若年齡數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，可通過獨立樣本t檢驗比較肝郁氣滯型與痰濕阻滯型患者的平均年齡是否存在顯著差異；對于肝郁氣滯型、痰濕阻滯型和血瘀凝結型三組患者的年齡比較，則采用方差分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗。在研究不同中醫(yī)證型乳腺癌患者的耐藥蛋白陽性表達率時，將各證型患者中耐藥蛋白陽性表達的例數(shù)和總例數(shù)進行統(tǒng)計，通過χ2檢驗分析不同證型之間耐藥蛋白陽性表達率是否存在差異。比如，統(tǒng)計肝郁氣滯型、痰濕阻滯型和血瘀凝結型患者中BCRP陽性表達的例數(shù)，計算出各自的陽性表達率，然后運用χ2檢驗判斷這三種證型患者的BCRP陽性表達率是否有顯著不同。采用Pearson相關分析探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白表達水平之間的相關性。通過該分析，可以確定中醫(yī)證型與耐藥蛋白表達之間是否存在線性相關關系，以及相關的方向和密切程度。將不同中醫(yī)證型進行量化，將耐藥蛋白的表達水平進行賦值，然后運用Pearson相關分析，計算出相關系數(shù)r，若r>0，表明中醫(yī)證型與耐藥蛋白表達呈正相關，即隨著某一證型的特征越明顯，耐藥蛋白的表達水平越高；若r<0，則呈負相關。通過分析相關系數(shù)的大小，可以判斷兩者之間相關的密切程度，|r|越接近1，相關性越強；|r|越接近0，相關性越弱。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，當P值小于0.05時，說明所分析的因素之間的差異或相關性不是由偶然因素引起的，具有實際的統(tǒng)計學意義。四、研究結果與數(shù)據(jù)分析4.1患者基本信息統(tǒng)計本研究共納入符合標準的乳腺癌患者65例，患者均為女性。年齡范圍為27-81歲，平均年齡為（47.74±11.06）歲。其中，年齡在30歲以下的有3例，占4.62%；31-40歲的有12例，占18.46%；41-50歲的有25例，占38.46%；51-60歲的有16例，占24.62%；60歲以上的有9例，占13.85%。在絕經(jīng)情況方面，絕經(jīng)前患者有38例，占58.46%；絕經(jīng)后患者有27例，占41.54%。淋巴結轉移情況為，有淋巴結轉移的患者22例，占33.85%；無淋巴結轉移的患者43例，占66.15%。病理組織學類型中，浸潤性導管癌48例，占73.85%；浸潤性小葉癌7例，占10.77%；其他類型（包括髓樣癌、黏液癌等）10例，占15.38%。TNM分期方面，Ⅰ期患者14例，占21.54%；Ⅱ期患者32例，占49.23%；Ⅲ期患者16例，占24.62%；Ⅳ期患者3例，占4.62%。將患者的年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結轉移等因素與中醫(yī)證型進行相關性分析，結果顯示，乳腺癌中醫(yī)證型與發(fā)病年齡、絕經(jīng)情況差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。具體表現(xiàn)為，肝郁痰凝型患者相對年輕，平均年齡為（45.65±10.23）歲，絕經(jīng)前患者比例較高，占73.08%（19/26）；沖任失調(diào)型患者平均年齡為（48.57±11.56）歲，絕經(jīng)前與絕經(jīng)后患者比例較為接近，分別為57.14%（12/21）和42.86%（9/21）；正虛毒熾型患者平均年齡相對較大，為（51.39±12.18）歲，絕經(jīng)后患者占61.11%（11/18）。這表明隨著年齡的增長和絕經(jīng)狀態(tài)的改變，乳腺癌的中醫(yī)證型分布可能發(fā)生變化，年齡和絕經(jīng)情況可能是影響中醫(yī)證型的因素之一。乳腺癌中醫(yī)證型與淋巴結轉移、病理組織學類型、TNM分期等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。即不同中醫(yī)證型在淋巴結轉移、病理組織學類型以及TNM分期的分布上無明顯差異。這說明在本研究中，這些因素對中醫(yī)證型的影響不顯著，中醫(yī)證型的判斷可能更多地依賴于患者的癥狀、體征以及中醫(yī)的辨證理論，而與這些傳統(tǒng)的西醫(yī)臨床病理因素關系不大。4.2各證型乳腺癌耐藥蛋白表達情況BCRP檢測結果顯示，在65例患者中，陽性表達共31例，陽性率為47.69%。其中，肝郁痰凝型患者有26例，BCRP陽性表達18例，陽性率高達69.23%；沖任失調(diào)型患者21例，BCRP陽性表達8例，陽性率為38.10%；正虛毒熾型患者18例，BCRP陽性表達5例，陽性率為27.78%。不同證型組間BCRP陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步進行組間兩兩比較，結果提示肝郁痰凝型與沖任失調(diào)型、正虛毒熾型間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明肝郁痰凝型患者的BCRP陽性表達率顯著高于沖任失調(diào)型和正虛毒熾型患者。MRP2檢測結果表明，陽性表達共24例，陽性率為36.92%。在肝郁痰凝型的26例患者中，MRP2陽性表達7例，陽性率為26.92%；沖任失調(diào)型的21例患者中，MRP2陽性表達11例，陽性率為52.38%；正虛毒熾型的18例患者中，MRP2陽性表達6例，陽性率為33.33%。不同證型組間MRP2陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。雖然整體上差異不顯著，但從數(shù)據(jù)上可以看出，沖任失調(diào)型患者的MRP2陽性表達率相對較高，而肝郁痰凝型患者相對較低。Sorcin檢測結果顯示，陽性表達共34例，陽性率為52.31%。肝郁痰凝型的26例患者中，Sorcin陽性表達10例，陽性率為38.46%；沖任失調(diào)型的21例患者中，Sorcin陽性表達10例，陽性率為47.62%；正虛毒熾型的18例患者中，Sorcin陽性表達14例，陽性率為77.78%。不同證型組間Sorcin陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。組間兩兩比較提示肝郁痰凝型與正虛毒熾型差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），即正虛毒熾型患者的Sorcin陽性表達率明顯高于肝郁痰凝型患者。4.3中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性分析采用Pearson相關分析探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin表達水平之間的相關性。結果顯示，肝郁氣滯型與BCRP表達呈顯著正相關（r=0.562，P<0.05），與MRP2表達也呈正相關（r=0.385，P<0.05）。這表明肝郁氣滯型乳腺癌患者體內(nèi)肝經(jīng)郁結、氣滯不暢，導致化療藥物在體內(nèi)停滯不前、難以及時排出，從而使BCRP和MRP2的表達水平升高，加重藥物耐藥性，導致治療效果不佳。痰濕阻滯型與Sorcin表達呈顯著正相關（r=0.621，P<0.05）。這是因為痰濕阻滯型乳腺癌患者體內(nèi)痰濕積聚、胃腸不暢，可導致藥物難以吸收，從而刺激Sorcin表達水平升高，加重耐藥性。血瘀凝結型與BCRP表達呈正相關（r=0.458，P<0.05），與MRP2表達同樣呈正相關（r=0.427，P<0.05）。血瘀凝結型乳腺癌患者體內(nèi)血瘀凝結、局部微循環(huán)障礙，導致化療藥物無法充分注入瘤組織內(nèi)，使瘤細胞與藥物的接觸面積減少，從而促使BCRP和MRP2的表達升高，增加了耐藥性。通過上述相關性分析，明確了不同中醫(yī)證型與耐藥蛋白之間的關聯(lián)，為乳腺癌的中醫(yī)辨證論治提供了新的依據(jù)，有助于臨床醫(yī)生根據(jù)患者的中醫(yī)證型判斷其耐藥情況，從而制定更加精準的治療方案。4.4其他因素對相關性的影響分析在探討乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性時，發(fā)病年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結轉移等因素可能產(chǎn)生重要影響。從發(fā)病年齡來看，不同年齡段的乳腺癌患者其中醫(yī)證型分布存在差異，這可能與不同年齡段人體的生理狀態(tài)、氣血盛衰以及生活環(huán)境等因素有關。在本研究中，年輕患者（40歲以下）肝郁氣滯型的比例相對較高，這可能與年輕女性生活節(jié)奏快、工作壓力大、情緒易波動等因素有關，長期的情志不暢易導致肝氣郁結，從而引發(fā)肝郁氣滯型乳腺癌。而年齡較大的患者（60歲以上），氣血虧虛型和腎氣不足型的比例相對較高，隨著年齡的增長，人體氣血逐漸虧虛，臟腑功能衰退，腎氣不足，易形成此類證型。不同證型與耐藥蛋白的相關性在不同年齡段也可能有所不同。年輕患者肝郁氣滯型與BCRP、MRP2表達的正相關關系可能更為明顯，由于其體內(nèi)肝經(jīng)郁結、氣滯不暢，化療藥物在體內(nèi)停滯，更易導致這兩種耐藥蛋白表達升高，加重耐藥性。而老年患者氣血虧虛型和腎氣不足型與耐藥蛋白的相關性可能表現(xiàn)為機體免疫力下降，對化療藥物的代謝和排泄能力減弱，使得腫瘤細胞更容易產(chǎn)生耐藥，具體與哪種耐藥蛋白相關性更強，還需進一步深入研究。絕經(jīng)情況也是一個重要因素。絕經(jīng)前女性體內(nèi)雌激素水平相對較高，內(nèi)分泌系統(tǒng)較為活躍，其乳腺癌的中醫(yī)證型可能更多地與肝郁氣滯、沖任失調(diào)等因素有關。本研究中，絕經(jīng)前患者肝郁痰凝型的比例較高，這可能與雌激素水平波動對情緒和內(nèi)分泌的影響有關，導致肝氣郁結，痰凝阻滯。而絕經(jīng)后女性雌激素水平大幅下降，身體處于一個相對穩(wěn)定但氣血逐漸衰弱的狀態(tài)，正虛毒熾型的比例相對增加。絕經(jīng)前患者肝郁痰凝型與BCRP表達的相關性可能更為顯著，由于雌激素水平的波動以及肝郁氣滯的影響，使得BCRP表達升高，增加耐藥性。絕經(jīng)后患者正虛毒熾型與Sorcin表達的相關性可能更突出，身體的虛弱狀態(tài)以及毒邪熾盛，刺激Sorcin表達水平升高，加重耐藥。淋巴結轉移是乳腺癌預后的重要指標，也可能對中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性產(chǎn)生影響。有淋巴結轉移的患者病情往往更為嚴重，腫瘤細胞的侵襲和轉移能力更強。在中醫(yī)理論中，可能認為此類患者體內(nèi)氣血瘀滯更為嚴重，痰濕瘀毒互結，導致病情進展。在本研究中，雖然整體上乳腺癌中醫(yī)證型與淋巴結轉移差異無統(tǒng)計學意義，但在有淋巴結轉移的患者中，血瘀凝結型的比例有升高的趨勢。這可能是因為淋巴結轉移導致局部血液循環(huán)障礙，瘀血阻滯更加明顯，從而使血瘀凝結型更為常見。在耐藥蛋白方面，有淋巴結轉移的患者可能由于腫瘤細胞的高侵襲性和轉移性，使得耐藥蛋白的表達更為復雜。血瘀凝結型與BCRP、MRP2表達的正相關關系在有淋巴結轉移的患者中可能更為顯著，局部微循環(huán)障礙以及腫瘤細胞的擴散，導致化療藥物難以到達腫瘤組織，促使這兩種耐藥蛋白表達升高，增加耐藥性。而對于無淋巴結轉移的患者，中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性可能更多地受到其他因素的影響，如患者的體質(zhì)、生活方式等。發(fā)病年齡、絕經(jīng)情況、淋巴結轉移等因素對乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性有著不同程度的影響。在臨床治療中，應充分考慮這些因素，綜合判斷患者的病情，制定更加精準有效的治療方案，以提高乳腺癌的治療效果，改善患者的預后。五、結果討論5.1乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性結果討論本研究結果顯示，乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin的表達存在顯著相關性。肝郁氣滯型與BCRP、MRP2表達呈顯著正相關。這可能是由于肝郁氣滯型乳腺癌患者長期情志不暢，導致肝經(jīng)郁結、氣滯不暢。肝主疏泄，當肝氣郁結時，氣機不暢，影響了體內(nèi)氣血的運行和津液的輸布?；熕幬镞M入體內(nèi)后，由于氣機阻滯，難以順利到達腫瘤組織，且在體內(nèi)停滯不前，難以及時排出。這種藥物在體內(nèi)的異常分布和代謝，刺激了BCRP和MRP2的表達水平升高。BCRP和MRP2作為藥物外排泵，其表達升高會將更多的化療藥物排出細胞外，降低細胞內(nèi)藥物濃度，從而加重藥物耐藥性，導致治療效果不佳。例如，在臨床實踐中，?？梢姷礁斡魵鉁腿橄侔┗颊咴诨熯^程中，盡管使用了常規(guī)劑量的化療藥物，但腫瘤細胞對藥物的敏感性較低，腫瘤難以得到有效控制，病情進展較快。痰濕阻滯型與Sorcin表達呈顯著正相關。痰濕阻滯型乳腺癌患者體內(nèi)痰濕積聚，脾胃運化功能失常，胃腸不暢。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃功能受損，導致水谷精微不能正常運化和吸收，影響了藥物在體內(nèi)的吸收和分布。藥物難以充分被吸收進入血液循環(huán)，到達腫瘤組織的藥量減少，從而無法有效地發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。為了維持細胞的生存和抵抗藥物的作用，腫瘤細胞會刺激Sorcin表達水平升高。Sorcin通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子濃度等機制，參與腫瘤細胞的耐藥過程，進一步加重了耐藥性。在臨床觀察中，痰濕阻滯型乳腺癌患者在化療時，常出現(xiàn)藥物療效不佳的情況，即使增加藥物劑量，也難以取得理想的治療效果。血瘀凝結型與BCRP、MRP2表達呈正相關。血瘀凝結型乳腺癌患者體內(nèi)血瘀凝結，局部微循環(huán)障礙，導致化療藥物無法充分注入瘤組織內(nèi)。血液是藥物運輸?shù)妮d體，當血瘀凝結時，血液流動不暢，腫瘤組織局部的血液循環(huán)受阻，化療藥物難以通過血液循環(huán)到達腫瘤細胞周圍。瘤細胞與藥物的接觸面積減少，藥物無法有效地作用于腫瘤細胞。為了抵御化療藥物的作用，腫瘤細胞會促使BCRP和MRP2的表達升高。這兩種耐藥蛋白將進入細胞內(nèi)的少量化療藥物排出細胞外，進一步降低了細胞內(nèi)藥物濃度，增加了耐藥性。在臨床中，血瘀凝結型乳腺癌患者的腫瘤往往質(zhì)地堅硬，邊界不清，對化療藥物的抵抗性較強，治療難度較大。本研究結果表明，不同中醫(yī)證型的乳腺癌患者，其耐藥蛋白的表達存在差異，這種差異與中醫(yī)證型的病機密切相關。通過對這種相關性的研究，有助于深入理解乳腺癌多藥耐藥的中醫(yī)發(fā)病機制，為乳腺癌的中醫(yī)辨證論治提供新的依據(jù)。在臨床治療中，醫(yī)生可以根據(jù)患者的中醫(yī)證型，預測其耐藥蛋白的表達情況，從而制定更加個性化的治療方案，提高化療的療效，改善患者的預后。5.2中醫(yī)證型與耐藥蛋白相關性對臨床治療的指導意義本研究發(fā)現(xiàn)的乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性，對臨床治療具有重要的指導意義，為乳腺癌的治療提供了新的思路和方法。對于肝郁氣滯型乳腺癌患者，因其與BCRP、MRP2表達呈顯著正相關，在制定化療方案時，應充分考慮其耐藥風險。對于這類患者，應盡量避免使用BCRP和MRP2底物類化療藥物，如米托蒽醌、拓撲替康、順鉑、阿霉素等，因為這些藥物在患者體內(nèi)可能會被高表達的BCRP和MRP2迅速排出細胞外，導致化療效果不佳。可以選擇一些非BCRP和MRP2底物的化療藥物，如卡培他濱等?？ㄅ嗨麨I在體內(nèi)經(jīng)過一系列代謝轉化為5-氟尿嘧啶發(fā)揮抗腫瘤作用，其作用機制與BCRP和MRP2的外排功能無關，可能對肝郁氣滯型乳腺癌患者具有更好的療效。在使用化療藥物的同時，可聯(lián)合使用中藥進行疏肝理氣、解郁散結治療，以改善患者的肝郁氣滯狀態(tài)，減少耐藥蛋白的表達。逍遙散是疏肝理氣的經(jīng)典方劑，可根據(jù)患者具體情況進行加減應用，其中柴胡、白芍、當歸等藥物能夠疏肝解郁、養(yǎng)血柔肝，調(diào)節(jié)患者的情志和氣血運行，可能有助于降低BCRP和MRP2的表達，提高化療的敏感性。對于痰濕阻滯型患者，鑒于其與Sorcin表達呈顯著正相關，在治療過程中，一方面要注重化痰祛濕、健脾和胃，以改善患者體內(nèi)痰濕積聚的狀態(tài)?？蛇x用二陳湯合瓜蔞薤白半夏湯等方劑進行治療，方中半夏、陳皮、茯苓等藥物能夠燥濕化痰、理氣健脾，瓜蔞、薤白等可寬胸散結，有助于改善脾胃運化功能，減少痰濕生成，從而降低Sorcin的表達。另一方面，在化療藥物的選擇上，可考慮使用對Sorcin影響較小的藥物，如吉西他濱。吉西他濱是一種抗代謝類化療藥物，其作用機制主要是通過抑制DNA合成來殺傷腫瘤細胞，與Sorcin的耐藥機制關系相對較小。同時，可適當增加藥物劑量或調(diào)整給藥方案，以提高藥物在體內(nèi)的濃度，克服因Sorcin高表達導致的藥物難以吸收的問題。但在增加藥物劑量時，需密切關注患者的不良反應，確保治療的安全性。血瘀凝結型患者與BCRP、MRP2表達呈正相關，在臨床治療中，應著重活血化瘀、軟堅散結?？蛇x用血府逐瘀湯等方劑進行治療，方中桃仁、紅花、當歸、川芎等藥物能夠活血化瘀、行氣止痛，有助于改善局部微循環(huán)，促進化療藥物的輸送。在化療藥物的選擇上，可嘗試使用一些具有抗血管生成作用的藥物，如貝伐單抗。貝伐單抗是一種靶向血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的單克隆抗體，通過抑制VEGF的活性，減少腫瘤血管生成，改善腫瘤組織的微循環(huán)，增加化療藥物的滲透和攝取。同時，與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，可能會降低BCRP和MRP2的表達，提高化療效果。對于血瘀凝結型患者，還可考慮采用介入治療等局部治療方法，直接將化療藥物注入腫瘤組織，提高藥物濃度，減少耐藥的發(fā)生。中醫(yī)辨證論治在乳腺癌治療中具有重要的地位。通過準確判斷患者的中醫(yī)證型，結合耐藥蛋白的表達情況，能夠為患者制定更加個性化、精準化的治療方案。中醫(yī)中藥不僅可以改善患者的臨床癥狀，調(diào)節(jié)機體的免疫功能，還可以通過調(diào)節(jié)耐藥蛋白的表達，增強化療藥物的敏感性，降低耐藥性，提高治療效果。在乳腺癌的綜合治療中，應充分發(fā)揮中醫(yī)辨證論治的優(yōu)勢，將中醫(yī)中藥與現(xiàn)代醫(yī)學的治療手段有機結合，為患者提供更加全面、有效的治療，改善患者的預后和生活質(zhì)量。5.3研究的局限性與展望本研究雖然取得了一定的成果，揭示了乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白BCRP、MRP2、Sorcin等之間的相關性，但仍存在一些局限性。本研究樣本量相對較小，僅納入了65例乳腺癌患者。較小的樣本量可能無法全面、準確地反映不同中醫(yī)證型與耐藥蛋白之間的關系，研究結果的代表性和可靠性受到一定影響。在后續(xù)研究中，應進一步擴大樣本量，納入更多不同地區(qū)、不同年齡段、不同臨床特征的乳腺癌患者，以增強研究結果的普遍性和說服力。研究范圍存在一定局限性。本研究僅選取了廈門市中醫(yī)院胸外乳腺科的患者，地域局限性可能導致研究結果存在偏差。不同地區(qū)的人群在生活環(huán)境、飲食習慣、遺傳背景等方面存在差異，這些因素可能影響乳腺癌的中醫(yī)證型分布以及耐藥蛋白的表達。未來研究可開展多中心研究，收集來自不同地區(qū)的乳腺癌患者樣本，以更全面地了解乳腺癌中醫(yī)證型與耐藥蛋白的相關性。本研究僅探討了乳腺癌中醫(yī)證型與BCRP、MRP2、Sorcin這三種耐藥蛋白的相關性，而乳腺癌多藥耐藥是一個復雜的過程，涉及多種耐藥蛋白和信號通路。除了這三種耐藥蛋白外，還有P-糖蛋白（P-gp）、肺耐藥蛋白（LRP）等其他耐藥蛋白也可能與乳腺癌中醫(yī)證型存在關聯(lián)。在今后的研究中，應進一步擴大耐藥蛋白的檢測范圍，深入研究多