常見微生物檢測(cè)項(xiàng)目常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)致病微生物項(xiàng)目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)為什么需要微生物快速檢測(cè)？日益嚴(yán)峻的食品安全局勢(shì)的需要提高檢測(cè)效率節(jié)約人力資源成本與國(guó)際接軌企業(yè)為什么需要微生物快速檢測(cè)？市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質(zhì)期較短的產(chǎn)品。減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金周轉(zhuǎn)。節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出）對(duì)于運(yùn)行HACCP質(zhì)量保證體系的企業(yè)來說，快速檢測(cè)方法尤其重要?？梢钥焖贆z測(cè)原料及半成品的污染情況，以采取相應(yīng)的措施控制最終產(chǎn)品的微生物超標(biāo)情況?？焖俜椒▌?shì)在必行國(guó)外許多政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)都在大量使用快速檢測(cè)方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國(guó)外應(yīng)用相當(dāng)成功。國(guó)內(nèi)的許多政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國(guó)外先進(jìn)的快速檢測(cè)技術(shù)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展趨勢(shì)來說，快速方法是微生物檢測(cè)的一大方向。常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法：1、螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計(jì)數(shù)2、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測(cè)。3、紙片法：培養(yǎng)基固體在載體上。省去制做培養(yǎng)基的時(shí)間。主要用于細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。4、其它：如Simplate即用膠,改良MPN產(chǎn)品。螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀aColyte自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀螺旋平板原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品稀釋1000倍螺旋平板法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋3個(gè)梯度，每個(gè)梯度倒2個(gè)平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點(diǎn)：檢測(cè)時(shí)間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時(shí)。需要配合自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。濾膜法濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度增大，菌落無擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)：需要額外的支出購(gòu)買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對(duì)菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。皿膜法—以紙片法為代表紙片法是目前被廣泛接受的方法。國(guó)標(biāo)餐具大腸菌群采用的就是紙片法。優(yōu)點(diǎn)：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計(jì)數(shù)較方便。缺點(diǎn)：不能節(jié)省檢測(cè)時(shí)間。檢測(cè)成本相對(duì)偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無法對(duì)應(yīng)的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細(xì)菌總數(shù)紙片有一些用戶。常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀快速檢測(cè)微生物數(shù)量的新方法：1、ATP法：目前產(chǎn)品較多，如CHARM，Biotrace,…..等。2、電化學(xué)法：Sy-Lab公司Bactrac4300，Tempo,…3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測(cè)量法表面潔凈的檢測(cè)方法微生物學(xué)法：紙片、瓊脂板、棉簽拭子、海綿拭子非微生物學(xué)法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白質(zhì),降解糖、NADP(輔酶II)，其它。ATP---三磷酸腺苷ATP來源于細(xì)菌酵母霉菌生物膜組織殘留廢棄物污染人的污染1.

人接觸設(shè)備或器具2.設(shè)備或器具被污染3.清洗不正常4.非正常的敏感物污染5.微生物污染ATP存在表明什么？檢測(cè)原理熒光素?zé)晒馑孛赶佘找涣姿嵫鹾蠠晒馑責(zé)晒釧TP法兩大用途1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對(duì)生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測(cè)。政府檢測(cè)機(jī)構(gòu)用ATP方法缺乏法律依據(jù)。ATP法與微生物數(shù)量沒有必然的聯(lián)系。2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測(cè)或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。LUM－T清潔程度快速檢測(cè)PocketSwab

Plus<30

秒獲得結(jié)果取樣混合檢測(cè)LUM-T的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)CHEF熟肉制品成熟度檢驗(yàn)MicroQ水中微生物污染程度檢測(cè)Cidelite殺蟲劑殘留初篩Paslite牛奶巴氏消毒效果Somalite體細(xì)胞計(jì)數(shù)SL/MRLtest抗生素殘留檢測(cè)（連接ROSA

imager)Celsis和LUM-96保溫2天，檢測(cè)30分鐘（96個(gè)樣）ATP法檢測(cè)成品的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：LUM-96通常用于進(jìn)行商業(yè)無菌檢測(cè)?？纱蟠罂s短庫存時(shí)間，減少物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個(gè)檢測(cè)代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測(cè)，其風(fēng)險(xiǎn)是一定存在的。(如保溫增菌時(shí)間不夠，菌數(shù)未達(dá)到一定數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標(biāo)致病菌未大量增菌等原因)Millipore公司最新推出的MicroStarMicroStar的原理及局限性MicroStar快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)是結(jié)合了生物熒光、膜過濾及CCD熒光照相檢測(cè)等技術(shù)的新型檢測(cè)系統(tǒng).可過濾樣品經(jīng)膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素和熒光素酶，顯示的熒光信號(hào)在熒光顯微鏡或熒光檢測(cè)器下觀察并計(jì)數(shù)。MicroStar的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高靈敏度。適合于菌數(shù)較低的可過濾產(chǎn)品使用。缺點(diǎn)：儀器較昂貴，運(yùn)行成本也非常貴。不能用于檢測(cè)未知的可能菌數(shù)較高的樣品(不知稀釋多少倍，因菌數(shù)必須稀釋至80個(gè)左右)。整個(gè)檢測(cè)時(shí)間還不夠快，通常需16小時(shí)以上。MicroFoss(Biosys)微生物自動(dòng)監(jiān)測(cè)儀微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。Microfoss的特點(diǎn)與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。缺點(diǎn)：需要購(gòu)買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。因此在我國(guó)目前還沒有用戶。梅里埃的BacT/Alert微生物檢測(cè)儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測(cè)反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。方法較新，用戶還需要一個(gè)過程了解。FOSS公司

BactoScanFC牛奶中總菌數(shù)快速檢測(cè)儀采用流式細(xì)胞原理。對(duì)微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)BactoScanFC的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：速度快(50-150樣品/小時(shí))缺點(diǎn)：死活細(xì)胞一起檢測(cè)，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測(cè)原奶中細(xì)菌總數(shù)。美國(guó)Chemunex公司

微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)美國(guó)Chemunex公司將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測(cè)儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，速度極快，處理量大。與FOSS的BactoScanFC檢測(cè)死活細(xì)胞都檢測(cè)不同。是目前國(guó)際上正在認(rèn)可的生物熒光定量檢測(cè)微生物數(shù)量的兩種方法之一。另一種是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP檢測(cè)的產(chǎn)品。熒光酶標(biāo)記原理

直接單細(xì)胞標(biāo)記(包括孢子)

細(xì)胞無增菌要求標(biāo)記在90分鐘內(nèi)完成直接對(duì)活細(xì)胞和酵母進(jìn)行標(biāo)記標(biāo)記的細(xì)菌標(biāo)記后的酵母標(biāo)記后的霉菌ChemScanRDI三個(gè)簡(jiǎn)單的步驟2.標(biāo)記3.激光掃描1.過濾檢測(cè)步驟-TVC

1.過濾2.標(biāo)記3.激光掃描樣品過濾預(yù)標(biāo)記60min濾膜轉(zhuǎn)移ChemScanRDI

?儀器分析標(biāo)記30minChemScanòRDI

主機(jī)激光掃描分析儀3分鐘分析時(shí)間結(jié)果直接顯示細(xì)胞個(gè)數(shù)Laserscanning致病菌快速檢測(cè)方法顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場(chǎng)上的產(chǎn)品多，如BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix等。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測(cè)法和PCR法為主?；蛐酒貉芯繜狳c(diǎn)。華粵行儀器有限公司致病微生物快速檢測(cè)產(chǎn)品免疫磁分離法—Matrix公司的Pathatrix致病菌快速檢測(cè)系統(tǒng)ELISA方法—澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測(cè)華粵行儀器有限公司分子生物學(xué)方法(基因探針及PCR方法)GLISA---膠體金免疫層析致病菌快速檢測(cè)條熒光酶免—Vidas系列產(chǎn)品(略)顯色培養(yǎng)基–法國(guó)AES公司GLISA－膠體金免疫層析檢測(cè)條氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金檢測(cè)條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡(jiǎn)便。關(guān)鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水紙層析條上固定。膠體金微生物檢測(cè)條在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有不少產(chǎn)品，但用戶并不多，主要是質(zhì)量不穩(wěn)定。外來的膠體金微生物檢測(cè)產(chǎn)品比較多。常見的膠體金檢測(cè)條舉例大腸桿菌O157李斯特氏菌沙門氏菌膠體金檢測(cè)條的優(yōu)缺點(diǎn)膠體金檢測(cè)方法屬于免疫檢測(cè)法，檢測(cè)的是死菌和活菌。一般需要增菌過夜。增菌后的檢測(cè)非常簡(jiǎn)單，約10分鐘一般能完成。無需專門的檢測(cè)儀器。進(jìn)口的檢測(cè)條的價(jià)格比較高，通常要30－90元。分子生物學(xué)方法基因探針法及PCR方法在國(guó)外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法。基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)間，通過PCR方法對(duì)待測(cè)微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。分子生物學(xué)方法應(yīng)用前景試劑盒開發(fā)相對(duì)比較容易。只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關(guān)注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應(yīng)。分子生物學(xué)方法病原菌檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)分子生物學(xué)方法檢測(cè)致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對(duì)國(guó)標(biāo)方面來說。但國(guó)外用戶反映其假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢(shì)實(shí)驗(yàn)要求1.分組：每班6組，必須穿實(shí)驗(yàn)服。嚴(yán)查出勤率，有事需持假條。2.實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：檢驗(yàn)樣品中的菌落總數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌（第一法）3.及時(shí)書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。微生物綜合實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆帐称分芯淇倲?shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。

二、主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材：

PCA培養(yǎng)基、LST培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯、血平板、氯化鈉；

顯微鏡、生化培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)、電子天平、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋；

移液管、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、均質(zhì)袋。

三、實(shí)驗(yàn)步驟：

1.無菌取樣25g置于均質(zhì)袋1，倒入225mL無菌生理鹽水（0.85%），均質(zhì)；領(lǐng)取25g置于均質(zhì)袋2，倒入225mL7.5%氯化鈉肉湯，均質(zhì)，培養(yǎng)。

2.將均質(zhì)袋1中稀釋液依次做梯度稀釋至10-3

3.選取-1，-2，-3三個(gè)連續(xù)稀釋度各1mL至9mL發(fā)酵管中；同時(shí)選取這-2，-3稀釋度傾注平板，每個(gè)稀釋度做一個(gè)平行樣；空白對(duì)照2個(gè)，傾注平