第二章蛋白質(zhì)的化學(xué)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化和含量測定第四節(jié)蛋白質(zhì)的功能和分類第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第一節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)組成內(nèi)

容

提

要第六節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)二、蛋白質(zhì)的兩性電離性質(zhì)和等電點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性四、蛋白質(zhì)的沉淀六、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)五、蛋白質(zhì)的紫外吸收

回顧已有的知識(shí)，膠粒的大小是多少呢？膠體溶液有哪些特性？蛋白質(zhì)是生物大分子化合物，其顆粒大小介于1~100nm之間，屬于膠粒的范疇，因此蛋白質(zhì)溶液是膠體溶液，具有膠體溶液的性質(zhì)。如不能透過半透膜，具有布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾現(xiàn)象等。一、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)1.水化膜

阻止蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀。

2.帶電荷

同性電荷相互排斥，使蛋白質(zhì)顆粒不易聚集而沉淀。

蛋白質(zhì)親水膠體示意圖蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定的兩大因素ProH2OH2OH2O某蛋白粗品中含有尿素分子，利用膠體溶液什么性質(zhì)可以達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的？利用蛋白分子不能透過半透膜的特性，應(yīng)用透析法可以達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)不能透過半透膜的應(yīng)用——透析透析裝置血液透析儀原理尿毒癥患者透析日常D:\2021\蛋白質(zhì)化學(xué)——蛋白質(zhì)性質(zhì)\12f58bb90b2144da286184259dd49938.mp4中國血液透析機(jī)研制第一人二、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)蛋白質(zhì)分子除兩端的α-NH2和α-COOH可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈上尚有不少可解離的基團(tuán)，比如-NH2、-COOH、-OH、咪唑基、胍基。所以蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。PrNH2COOHPrNH3+COO-pH=pIpH>pI+OH-+H+pH<pI兼性離子正離子負(fù)離子PrNH2COO-PrNH3+COOH

pI狀態(tài)下蛋白質(zhì)溶解度最低，可采用等電點(diǎn)沉淀法分離制備蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。

等電點(diǎn)

在一定的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)所帶電荷不同，可用離子交換層析法和電泳法分離純化。

例：兩種蛋白質(zhì)的pI分別為5.35和7.80，在pH6.5的緩沖溶液中電泳，泳向陽極的是哪種蛋白質(zhì)？只有帶負(fù)電荷才能泳向陽極，當(dāng)溶液pH＞pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，所以泳向陽極的是pI為5.35的蛋白質(zhì)。三、蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和某些理化性質(zhì)的改變，這種現(xiàn)象叫做蛋白質(zhì)的變性作用。蛋白質(zhì)的變性作用物理因素：高溫、紫外線、X射線、超聲波和劇烈震蕩、高壓、攪拌和研磨等。

化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、去污劑（如十二烷基磺酸鈉，縮寫為SDS）、有機(jī)溶劑（如濃乙醇）、重金屬鹽和生物堿試劑（如三氯醋酸）變性主要破壞了維持空間構(gòu)象的二硫鍵和次級(jí)鍵，不涉及肽鍵的斷裂，故一級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞。1.變性因素2.變性的本質(zhì)（1）生物活性喪失

如：煮熟的雞蛋孵不出雞仔；血紅蛋白失去運(yùn)輸O2和CO2的能力，脊髓灰質(zhì)炎糖丸用熱水吞服會(huì)降低藥效，酶失去催化活性等。（2）某些理化性質(zhì)的改變

變性的蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)外露，溶解度降低，易產(chǎn)生沉淀；蛋白質(zhì)溶液的黏度增加、旋光度改變、pI提高；色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基外露，紫外吸收能力增強(qiáng)；變性后容易被蛋白酶水解，如，煮熟的牛肉容易消化。3.變性作用的特征在工業(yè)生產(chǎn)和臨床上，常利用變性的因素進(jìn)行滅菌和消毒，比如蒸汽滅菌，酒精、紫外線的消毒；中草藥有效成分的提取或其注射液的制備也常用變性的方法（加熱、濃乙醇等）除去雜蛋白；生化制品包括多肽、激素、酶制劑和其他生物制品如疫苗等，在生產(chǎn)和儲(chǔ)運(yùn)過程中也要有效防止其變性失活。4.變性的應(yīng)用牛核糖核酸酶的變性與復(fù)性

若蛋白質(zhì)的變性程度較輕，去除變性因素，有些蛋白質(zhì)可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和生物活性，稱為復(fù)性。蛋白質(zhì)的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑制素（化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)）系采用大腸埃希菌作為蛋白表達(dá)體系生產(chǎn)出的，主要能抑制腫瘤新生血管形成，阻斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)，最終達(dá)到“餓死”腫瘤細(xì)胞的目的。其變性和復(fù)性，就是采用加入8mol/L尿素，使其變性，然后逐漸降低尿素濃度，達(dá)到除去尿素使其復(fù)性的目的。四、蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)顆粒相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。沉淀方法1.中性鹽沉淀（鹽析）2.有機(jī)溶劑沉淀3.加熱沉淀4.重金屬鹽沉淀5.生物堿試劑沉淀向蛋白質(zhì)溶液中加入高濃度的中性鹽，破壞了蛋白質(zhì)的水化層并中和其電荷，使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。常用的中性鹽包括（NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4等。

鹽析出的蛋白質(zhì)不變性。本法常用于各種蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)的分離制備。

1．中性鹽沉淀（鹽析）向雞蛋清蛋白中加入高濃度的NaCl，雞蛋清蛋白會(huì)發(fā)生什么現(xiàn)象？在蛋白質(zhì)溶液中加入一定量的與水互溶的有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇和丙酮），破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀。

有機(jī)溶劑沉淀常引起變性，用此法分離制備生物活性蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)確保在低溫下操作，盡可能縮短操作時(shí)間，同時(shí)也要掌握好有機(jī)溶劑的濃度。2．有機(jī)溶劑沉淀加熱可使蛋白質(zhì)變性沉淀，但與pH密切相關(guān)。在pI時(shí)加熱最易沉淀，但偏離pI即使加熱也不易沉淀。比如，在鏈霉素的生產(chǎn)中就是采用加熱除去菌體蛋白的方法達(dá)到分離純化的目的。3．加熱沉淀蛋白質(zhì)在pH>pI的條件下帶負(fù)電荷，可與重金屬離子（Ag+、Hg2+、Pb2+）結(jié)合成不溶性蛋白鹽而變性沉淀。臨床上常用口服大量蛋白質(zhì)（如牛奶、蛋清）和催吐劑搶救誤服重金屬中毒的病人。4．重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)在pH<pI的條件下帶正電荷，與生物堿試劑（鞣酸、苦味酸、鎢酸）和三氯醋酸、磺基水楊酸、硝酸等結(jié)合成不溶性的鹽而沉淀。無蛋白血濾液的制備、中草藥注射液中蛋白的檢查以及鞣酸、苦味酸的收斂作用皆以此原理為依據(jù)。

5．生物堿試劑沉淀五、蛋白質(zhì)的紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于含有共軛雙鍵，在280nm附近有最大吸收峰，測定蛋白質(zhì)在280nm光吸收度，是定量分析溶液中蛋白質(zhì)濃度的快速簡便方法。色氨酸酪氨酸苯丙氨酸紫外分光光度計(jì)

六、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)（一）雙縮脲反應(yīng)（二）Folin-酚反應(yīng)（三）茚三酮反應(yīng)含兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的蛋白質(zhì)和多肽，在堿性條件下與CuSO4共熱，形成紫色或紅色的絡(luò)合物。肽鍵越多，反應(yīng)的顏色越深。氨基酸和二肽無此反應(yīng)，此法可用于蛋白質(zhì)的定性和定量。

（一）雙縮脲反應(yīng)在堿性條件下，蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑（主要成分是磷鎢酸-磷鉬酸）反應(yīng)生成藍(lán)色化合物（鎢藍(lán)-鉬藍(lán)）。在680nm處有最大吸收。藍(lán)色的強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比。此法是測定蛋白質(zhì)濃度的常用方法。

在pH5~7時(shí)，蛋白質(zhì)與茚三酮丙酮液加熱可產(chǎn)生藍(lán)紫色（脯氨酸顯黃色）。凡是含-NH2的化合物皆有此反應(yīng)，可用于氨基酸、蛋白質(zhì)、肽類化合物的定性和定量測定。（二）Folin-酚反應(yīng)（三）茚三酮反應(yīng)第四節(jié)

蛋白質(zhì)的功能和分類

一、蛋白質(zhì)的生理功能

二、蛋白質(zhì)的分類1.生物催化作用：酶2.代謝調(diào)節(jié)作用：激素3.免疫保護(hù)作用：抗體、補(bǔ)體4.轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存作用：血紅蛋白、血漿脂蛋白5.運(yùn)動(dòng)與支持作用：肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白；膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白6.控制生長和分化作用：核蛋白7.接收和傳遞信息的作用：受體蛋白8.參與生物膜組成作用一、蛋白質(zhì)的生理功能*根據(jù)分子組成分類單純蛋白質(zhì)：僅由氨基酸組成*根據(jù)分子形狀和空間構(gòu)象分類纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)(長軸:短軸>10)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)（輔基）球狀蛋白質(zhì)(長軸:短軸<10)二、蛋白質(zhì)的分類第五節(jié)

蛋白質(zhì)的分離純化和含量測定一、蛋白質(zhì)的提取二、蛋白質(zhì)的分離純化三、蛋白質(zhì)的含量測定一、蛋白質(zhì)的提取勻漿法，超聲破碎法先用纖維素酶處理，再用研磨法細(xì)胞破碎方法動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞對于細(xì)菌添加溶菌酶，再配合研磨法總的要求是既要盡量提取所需蛋白質(zhì)，又要防止蛋白酶的水解和其他因素對蛋白質(zhì)特定構(gòu)象的破壞作用。（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法（二）根據(jù)分子大小和形狀不同的分離純化方法（三）根據(jù)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法（四）根據(jù)配體特異性不同的分離純化方法二、蛋白質(zhì)的分離純化1.鹽析法2.低溫有機(jī)溶劑沉淀法3.等電點(diǎn)沉淀法（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1.鹽析法鹽析沉淀的蛋白質(zhì)一般保持著天然構(gòu)象而不變性。有時(shí)不同鹽濃度可有效地使蛋白質(zhì)分級(jí)沉淀。對不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行鹽析時(shí)，需要采用不同的鹽濃度和不同的pH。鹽析時(shí)的pH多選擇在pI附近。例如，在pH7.0附近時(shí)，血清清蛋白（白蛋白）溶于半飽和的(NH4)2SO4中，球蛋白沉淀下來；當(dāng)(NH4)2SO4達(dá)到飽和濃度時(shí)，清蛋白也隨之析出。所以鹽析可將蛋白質(zhì)初步分離。2.低溫有機(jī)溶劑沉淀法

此法沉淀蛋白質(zhì)的選擇性較高，且無需脫鹽，較為常用。但應(yīng)注意低溫操作，以避免蛋白質(zhì)變性。如用丙酮沉淀時(shí)，必須在0~4℃低溫條件下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。除了丙酮之外，也常用乙醇。

3.等電點(diǎn)沉淀法

此法很少單獨(dú)使用，常與其他方法結(jié)合使用。近年來新興的免疫沉淀法，是指將某一純化蛋白免疫動(dòng)物，獲得抗該蛋白的特異抗體，形成抗原抗體復(fù)合物，然后從復(fù)合物中中分離獲得抗原蛋白，這就是免疫沉淀法。1.透析2.超濾3.凝膠過濾法4.離心分離法

（二）根據(jù)分子大小和形狀不同的分離純化方法

利用蛋白質(zhì)大分子對半透膜的不可通過性而與小分子物質(zhì)分開。如火棉膠、玻璃紙等，可用來做成透析袋常用于鹽析法中除去中性鹽，以及離心法純化蛋白質(zhì)混入的氯化銫、蔗糖等小分子物質(zhì)。

1.透析透析裝置利用超濾膜在一定的壓力或離心力的作用下，大分子物質(zhì)被截留而小分子物質(zhì)則濾過排出。選擇不同孔徑的超濾膜可截留不同相對分子質(zhì)量的物質(zhì)。常用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮、脫鹽和分級(jí)純化等。2.超濾原理：按照蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離。又稱分子篩層析或排阻層析。常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子的直徑大于凝膠的孔徑時(shí)，被排阻于凝膠之外；小于孔徑者則進(jìn)入凝膠。在層析洗脫時(shí)，大分子受阻小而最先流出；小分子受阻大而最后流出，從而使相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分開。3.凝膠過濾法離心分離是利用機(jī)械的快速旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質(zhì)分離開來的方法。超速離心機(jī)可產(chǎn)生比地心吸引力（g）大60萬倍以上的離心力（即600000g），蛋白質(zhì)分子的沉降速度與其相對分子質(zhì)量的大小、分子形狀、密度及溶劑的密度有關(guān)。目前，超速離心法是分離生物高分子普遍使用的有效方法。

4.離心分離法

1.離子交換層析法利用蛋白質(zhì)兩性解離特性和pI作為分離依據(jù)的一種方法，應(yīng)用廣泛。

2.電泳法在一定條件下，各種蛋白質(zhì)分子因所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量及分子大小不同，其在電場中的電泳遷移率各異，這樣就達(dá)到了分離不同蛋白質(zhì)的目的。（三）

根據(jù)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法

親和層析是根據(jù)具有特異親和力的化合物之間能可逆結(jié)合與解離的性質(zhì)建立的層析方法，是一種具有高度專一性分離純化蛋白質(zhì)的有效方法。（四）根據(jù)配體特異性不同的分離純化方法

凱式定氮法：缺點(diǎn)是時(shí)間較長且易受非蛋白氮化合物的干擾

雙縮脲法：此法簡便，受蛋白質(zhì)氨基酸組成影響??；但靈敏度低、樣品用量大

Folin-酚法（Lowry法）：優(yōu)點(diǎn)操作簡便、靈敏度高；缺點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中顯色氨基酸的量應(yīng)與樣品接近紫外分光光度法：考馬斯亮藍(lán)法：快速、靈敏度范圍一般25~200μg/mL

BCA比色法：幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響三、蛋白質(zhì)的含量測定采用Folin-酚法，測定注射用促肝細(xì)胞生長素（一種從新鮮乳豬肝臟中提取的多肽類生化制劑，主要用于肝炎、肝硬化及肝癌的治療）的含量，若輔料中加入甘露醇，會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生何種影響？為什么？第六節(jié)多肽和蛋白質(zhì)類藥物

一、多肽和蛋白質(zhì)類藥物二、常見的多肽和蛋白質(zhì)類藥物

一、多肽和蛋白質(zhì)類藥物（一）氨基酸及其衍生物類（二）多肽類（三）蛋白質(zhì)類藥物降低血氨，用于治療肝硬化、肝昏迷谷.精.鳥氨酸賴氨酸促進(jìn)生長發(fā)育，為兒童、產(chǎn)婦、恢復(fù)期病人的優(yōu)良營養(yǎng)劑甘氨酸用于肌無力癥與缺鐵性貧血的治療甲硫氨酸用于脂肪肝、肝炎、肝硬化的防治（一）氨基酸及其衍生物類（一）氨基酸及其衍生物類天冬氨酸保護(hù)心肌L-胱氨酸抗過敏、脫發(fā)癥、肝炎、白細(xì)胞減少癥半胱氨酸抗輻射和解毒精氨酸-阿司匹林鎮(zhèn)痛和消炎氨基酸的衍生物N-乙酰半胱氨酸用于化痰，L-多巴（L-二羥苯丙氨酸）可治療帕金森?。ǘ┒嚯念惙诸愋☆愃幬锒嚯念惣に卮贵w多肽激素促皮質(zhì)素、促黑激素、脂肪水解激素、催產(chǎn)素、加壓素下丘腦激素促甲狀腺素釋放激素、生長素抑制激素、促性腺激素釋放激素等甲狀腺激素甲狀旁腺激素、降鈣素等胰島激素胰高血糖素、胰解痙多肽等胃腸道激素胃泌素、膽囊收縮素-促胰酶素、腸泌素、腸血管活性肽、抑胃素、緩激肽等胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子等多肽類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子表皮生長因子、轉(zhuǎn)移因子、心鈉素等其他類骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、腦氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、神經(jīng)營養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素、醋酸格拉替雷、醋酸亮丙瑞林、醋酸奧曲肽、艾塞那肽、腦苷肌肽等（三）蛋白質(zhì)類藥物分類小類藥物蛋白質(zhì)類激素垂體蛋白質(zhì)激素生長素、催乳激素、促甲狀腺素、促黃體生成激素、促卵泡激素等促性腺激素人絨毛膜促性腺激素、絕經(jīng)尿促性腺激素、血清促性腺激素等胰島素及其他蛋白質(zhì)激素胰島素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素等血漿蛋白質(zhì)白蛋白、纖維蛋白溶酶原、血漿纖維結(jié)合蛋白、免疫丙種球蛋白及各種免疫球蛋白、纖維蛋白原、抗凝血酶III、凝血因子VIII等蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子干擾素α、β、γ、白細(xì)胞介素1~7、神經(jīng)生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血小板衍生的生長因子、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、組織纖維溶酶原激活因子、促紅細(xì)胞生成素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、內(nèi)在因子等膠原蛋白明膠、阿膠等堿性蛋白硫酸魚精蛋白等蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑、大豆蛋白酶抑制劑等凝集素植物血凝素、刀豆蛋白A1．醋酸格拉替雷一種人工合成的多肽制劑，由谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和賴氨酸四種氨基酸組成。用于治療多發(fā)性硬化癥2．醋酸亮丙瑞林一種自然產(chǎn)生的促性腺激素釋放激素或促黃體生成釋放激素的合成九肽類似物。適應(yīng)癥較廣，包括子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、絕經(jīng)前乳腺癌、前列腺癌；中樞性性早熟癥等。3．醋酸奧曲肽一種人工合成的天然生長抑素的八肽衍生物，它保留了與生長抑素類似的藥理作用，且作用持久。適應(yīng)癥包括肢端肥大癥；緩解與功能性胃腸胰內(nèi)分泌瘤有關(guān)的癥狀和體征；并對具有類癌綜合征表現(xiàn)的類癌腫瘤、VIP瘤、胰高糖素瘤有效。二、常見的多肽和蛋白質(zhì)類藥物

4．艾塞那肽第一個(gè)腸降血糖素類似物，是人工合成的由39個(gè)氨基酸組成的肽酰胺，為皮下