Tim-3信號通路對動脈粥樣硬化中單核巨噬細(xì)胞與NK細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，在全球范圍內(nèi)，其導(dǎo)致的心血管疾病嚴(yán)重威脅著人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，心血管疾病是全球首要的死亡原因，每年導(dǎo)致約1790萬人死亡，而動脈粥樣硬化正是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、腦卒中等，給患者家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。隨著對動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究的深入，免疫細(xì)胞在其中的作用逐漸受到關(guān)注。固有免疫和適應(yīng)性免疫共同參與調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化病變，動脈粥樣硬化斑塊中存在著多種免疫細(xì)胞，其中單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。單核巨噬細(xì)胞是動脈粥樣硬化先天免疫反應(yīng)的核心參與者。在動脈粥樣硬化的起始階段，單核細(xì)胞在黏附分子和趨化因子（如MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和CCR2）的吸引下，從血液循環(huán)遷移到血管內(nèi)皮下空間，并分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過表面的清道夫受體大量攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），形成富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞，這是動脈粥樣硬化早期病變的重要標(biāo)志。泡沫細(xì)胞的形成不僅導(dǎo)致膽固醇在血管壁的沉積，還會引發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。巨噬細(xì)胞還可通過分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)代謝，影響斑塊的穩(wěn)定性。在斑塊發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞的死亡會導(dǎo)致壞死核心的形成，增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而引發(fā)急性心血管事件。巨噬細(xì)胞還具有異質(zhì)性，根據(jù)所處微環(huán)境的不同，可分化為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和病變進(jìn)展；M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10和TGF-β等，參與組織修復(fù)和炎癥消退。巨噬細(xì)胞極性的失衡在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。NK細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞的重要成員，在動脈粥樣硬化中的作用也逐漸被揭示。NK細(xì)胞具有自然殺傷活性，能夠非特異性地識別和殺傷靶細(xì)胞，如某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞等，其殺傷活性無MHC限制且不依賴抗體。在動脈粥樣硬化中，NK細(xì)胞可以通過直接殺傷感染病原體的細(xì)胞、衰老細(xì)胞或異常增殖的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視和保護(hù)作用。NK細(xì)胞還能分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程。IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，同時也能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移；TNF-α則具有促炎作用，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能和炎癥細(xì)胞的募集。NK細(xì)胞還可以通過ADCC效應(yīng)，在特異性IgG抗體的介導(dǎo)下殺傷靶細(xì)胞，參與動脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（Tim-3）作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞。Tim-3與其配體的相互作用可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，在腫瘤免疫、感染免疫和自身免疫性疾病等領(lǐng)域的研究中取得了重要進(jìn)展。然而，Tim-3在動脈粥樣硬化中對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的調(diào)控作用及其機(jī)制尚未完全明確。深入研究Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示動脈粥樣硬化的免疫發(fā)病機(jī)制，為動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。通過干預(yù)Tim-3信號通路，有可能調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能，抑制炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，從而降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在動脈粥樣硬化的研究領(lǐng)域，Tim-3、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞各自與動脈粥樣硬化的關(guān)系都有了一定程度的探索，且取得了不少成果，但仍存在許多未知和需要深入研究的地方。單核巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的研究較為廣泛和深入。國內(nèi)外研究均已明確單核巨噬細(xì)胞是動脈粥樣硬化先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者。早在1995年，安靚和李進(jìn)就在《解剖科學(xué)進(jìn)展》發(fā)表論文，綜述了單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、轉(zhuǎn)變與泡沫細(xì)胞形成以及與動脈粥樣硬化早期和增生性病變等問題。隨著研究的不斷深入，巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性以及M1/M2型巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的不同作用被逐漸揭示。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中，M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，可介導(dǎo)血管壁內(nèi)的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的遷移和增生，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其產(chǎn)生的活性氧還能氧化修飾低密度脂蛋白，進(jìn)一步促進(jìn)病變形成，且與易損斑塊穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)；M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β等，參與組織修復(fù)和炎癥消退，主要位于斑塊的外膜和纖維帽區(qū)域，可能促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成和組織修復(fù)。同時，巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，其可塑性在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中起著動態(tài)調(diào)節(jié)作用。然而，對于如何精準(zhǔn)調(diào)控巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，使其向有利于抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的方向轉(zhuǎn)變，目前仍缺乏有效的手段和深入的機(jī)制研究。NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的作用研究也取得了一定進(jìn)展。NK細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞，具有自然殺傷活性和分泌細(xì)胞因子等功能，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)炎癥等作用。有研究表明，NK細(xì)胞可以殺傷感染病原體的細(xì)胞、衰老細(xì)胞或異常增殖的血管平滑肌細(xì)胞，還能通過分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥過程。NK細(xì)胞還可通過ADCC效應(yīng)參與動脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)。但NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化不同階段的具體功能變化以及其與其他免疫細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制，尚未完全明確。例如，NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化早期與晚期對病變發(fā)展的影響是否存在差異，以及NK細(xì)胞如何與巨噬細(xì)胞等協(xié)同作用來影響動脈粥樣硬化進(jìn)程，這些問題都有待進(jìn)一步深入研究。Tim-3作為免疫調(diào)節(jié)分子，在腫瘤免疫、感染免疫和自身免疫性疾病等方面的研究成果豐富，但在動脈粥樣硬化領(lǐng)域的研究相對較少。已有研究表明，Tim-3在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)，包括單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，其與配體的相互作用可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能。然而，Tim-3在動脈粥樣硬化中對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制幾乎處于初步探索階段。目前尚不清楚Tim-3信號通路如何具體影響單核巨噬細(xì)胞的極化和功能，以及對NK細(xì)胞的殺傷活性和細(xì)胞因子分泌的調(diào)控方式。綜上所述，當(dāng)前對于Tim-3、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究雖有一定基礎(chǔ)，但在Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的調(diào)控機(jī)制方面存在明顯不足。本研究擬從這一角度出發(fā)，深入探討Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與動脈粥樣硬化的具體機(jī)制，以期為動脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的調(diào)控作用，以及這種調(diào)控如何參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，具體研究目標(biāo)如下：明確Tim-3在動脈粥樣硬化模型中對單核巨噬細(xì)胞極化和功能的調(diào)控機(jī)制。揭示Tim-3對NK細(xì)胞殺傷活性和細(xì)胞因子分泌的影響及其在動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制。探索Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞之間相互作用，以及對動脈粥樣硬化病變進(jìn)展和斑塊穩(wěn)定性的影響。圍繞上述研究目標(biāo)，本研究將開展以下幾方面的研究內(nèi)容：Tim-3對單核巨噬細(xì)胞的調(diào)控研究：構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型，通過基因敲除或過表達(dá)技術(shù)改變Tim-3的表達(dá)水平，觀察單核巨噬細(xì)胞在數(shù)量、表型和功能上的變化。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，分析M1型和M2型巨噬細(xì)胞的比例變化；采用實(shí)時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)細(xì)胞因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β等）和趨化因子的基因和蛋白表達(dá)水平，以明確Tim-3對單核巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子分泌的影響。還將利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，體外分離培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞，通過添加Tim-3激動劑或拮抗劑，進(jìn)一步驗(yàn)證Tim-3對單核巨噬細(xì)胞功能的直接調(diào)控作用，并深入研究其調(diào)控的信號通路。Tim-3對NK細(xì)胞的調(diào)控研究：在動脈粥樣硬化動物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究Tim-3表達(dá)改變對NK細(xì)胞殺傷活性的影響。采用乳酸脫氫酶（LDH）釋放法檢測NK細(xì)胞對靶細(xì)胞（如感染病原體的細(xì)胞、異常增殖的血管平滑肌細(xì)胞等）的殺傷能力；通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的水平，分析Tim-3對NK細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體的表達(dá)變化，探討Tim-3調(diào)控NK細(xì)胞功能的分子機(jī)制。還將研究Tim-3信號通路相關(guān)分子在NK細(xì)胞中的表達(dá)和活化情況，明確其在Tim-3調(diào)控NK細(xì)胞功能中的作用。Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用對動脈粥樣硬化的影響研究：通過共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞之間相互作用的影響。觀察兩種細(xì)胞在共培養(yǎng)體系中的細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞增殖和凋亡等變化，探討Tim-3如何調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞之間的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。在動脈粥樣硬化動物模型中，綜合分析Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的調(diào)控作用，以及這種調(diào)控對動脈粥樣硬化病變進(jìn)展和斑塊穩(wěn)定性的影響。采用組織病理學(xué)方法觀察動脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)、大小、組成成分（如脂質(zhì)含量、纖維帽厚度、壞死核心大小等）的變化；通過免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞外基質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)等，評估Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞相互作用對動脈粥樣硬化病變的影響。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合采用多種研究方法，從整體動物水平、細(xì)胞水平以及分子水平，全面深入地探討Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與動脈粥樣硬化的機(jī)制。具體研究方法如下：實(shí)驗(yàn)研究：動物實(shí)驗(yàn)：選用合適的動脈粥樣硬化動物模型，如ApoE基因敲除小鼠或LDLR基因敲除小鼠，通過高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。將動物隨機(jī)分為對照組、動脈粥樣硬化模型組、Tim-3基因敲除或過表達(dá)組等。在實(shí)驗(yàn)過程中，定期采集動物的血液、組織樣本，用于后續(xù)的檢測分析。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血液中炎癥因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10等）和血脂指標(biāo)（如總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等）的水平；通過組織病理學(xué)方法，如蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色等，觀察動脈粥樣硬化斑塊的形態(tài)、大小、脂質(zhì)含量等；運(yùn)用免疫組化和免疫熒光技術(shù)，檢測斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的浸潤情況以及相關(guān)分子的表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：體外分離培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，可從健康志愿者的外周血或小鼠的骨髓、脾臟中獲取。通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在不同的培養(yǎng)條件下研究Tim-3對細(xì)胞功能的影響。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD14、CD68、CD86、CD206等）和NK細(xì)胞表面活化性受體（如NKG2D、NKp30、NKp46等）、抑制性受體（如KIRs、CD94/NKG2A等）的表達(dá)變化；采用實(shí)時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，如Tim-3及其配體、細(xì)胞因子、趨化因子、信號通路相關(guān)分子等；通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（如Transwell小室法）等，研究Tim-3對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響；在單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，添加Tim-3激動劑或拮抗劑，觀察兩種細(xì)胞之間的相互作用和細(xì)胞因子分泌的變化。文獻(xiàn)綜述：系統(tǒng)檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，包括PubMed、WebofScience、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，以“Tim-3”“單核巨噬細(xì)胞”“NK細(xì)胞”“動脈粥樣硬化”等為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選出與本研究相關(guān)的高質(zhì)量文獻(xiàn)。對已有研究成果進(jìn)行綜合分析和總結(jié)，了解Tim-3、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞與動脈粥樣硬化之間關(guān)系的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，為本研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。同時，對相關(guān)研究中存在的問題和不足進(jìn)行梳理，明確本研究的切入點(diǎn)和創(chuàng)新點(diǎn)。生物信息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，如GeneCards、STRING、DAVID等，對Tim-3、單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。預(yù)測Tim-3與其他分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，挖掘可能參與Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞功能的信號通路和關(guān)鍵分子；對動脈粥樣硬化相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)或RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與Tim-3、單核巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞相關(guān)的差異表達(dá)基因，并進(jìn)行功能富集分析和通路分析，進(jìn)一步揭示Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與動脈粥樣硬化的潛在分子機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先，通過構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型和體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，分別在動物水平和細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。在動物實(shí)驗(yàn)中，對不同處理組的動物進(jìn)行觀察和樣本采集，進(jìn)行組織病理學(xué)、免疫組化、ELISA等檢測分析；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)、處理和檢測分析。同時，進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，總結(jié)已有研究成果和不足。然后，將實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)綜述的結(jié)果相結(jié)合，利用生物信息學(xué)分析工具進(jìn)行深入分析。最后，綜合各項(xiàng)研究結(jié)果，總結(jié)Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞參與動脈粥樣硬化的機(jī)制，為動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中應(yīng)清晰展示從動物模型構(gòu)建、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、文獻(xiàn)綜述、生物信息學(xué)分析到結(jié)果總結(jié)的整個研究流程，各環(huán)節(jié)之間的邏輯關(guān)系和數(shù)據(jù)流向應(yīng)明確標(biāo)注]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1動脈粥樣硬化概述2.1.1定義與流行病學(xué)動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性、進(jìn)行性的心血管疾病，主要特征是動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔狹窄。其病理變化表現(xiàn)為動脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，形成粥樣斑塊，這些斑塊主要由膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯、磷脂等脂質(zhì)成分以及纖維組織、平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等組成。隨著病情的發(fā)展，斑塊可逐漸增大，導(dǎo)致血管狹窄，影響血液供應(yīng)，嚴(yán)重時可引發(fā)斑塊破裂、血栓形成，導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生。動脈粥樣硬化在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率和死亡率升高的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，心血管疾病每年導(dǎo)致約1790萬人死亡，占全球死亡人數(shù)的31%，而動脈粥樣硬化是大多數(shù)心血管疾病的病理基礎(chǔ)，如冠心病、腦卒中等。在發(fā)達(dá)國家，動脈粥樣硬化及其相關(guān)心血管疾病一直是主要的健康問題，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和壽命。隨著發(fā)展中國家經(jīng)濟(jì)水平的提高和生活方式的改變，如高熱量飲食、體力活動減少、吸煙等不良生活習(xí)慣的增加，動脈粥樣硬化的發(fā)病率也呈現(xiàn)出快速上升的趨勢。在中國，隨著人口老齡化和生活方式的西方化，動脈粥樣硬化性心血管疾病的負(fù)擔(dān)日益加重。據(jù)《中國心血管健康與疾病報(bào)告2021》顯示，我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)達(dá)3.3億，其中冠心病1139萬，腦卒中1300萬。動脈粥樣硬化不僅給患者個人帶來身體和心理上的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，包括醫(yī)療費(fèi)用、護(hù)理費(fèi)用以及因勞動力喪失造成的經(jīng)濟(jì)損失等。因此，深入研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的防治策略，對于降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，提高人類健康水平具有重要意義。2.1.2發(fā)病機(jī)制動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多年來眾多學(xué)者從不同角度提出了多種學(xué)說，這些學(xué)說在一定程度上解釋了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，但目前尚未有一種學(xué)說能夠完全闡明其機(jī)制。常見的學(xué)說包括脂質(zhì)浸潤學(xué)說、血栓形成學(xué)說、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說以及近年來備受關(guān)注的炎癥免疫學(xué)說等。脂質(zhì)浸潤學(xué)說：該學(xué)說認(rèn)為動脈粥樣硬化與脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，其本質(zhì)是動脈壁對從血漿侵入的脂質(zhì)的反應(yīng)。在正常情況下，血漿中的脂質(zhì)成分如低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）等能夠維持動態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂時，血液中增高的脂質(zhì)，尤其是LDL和VLDL，以完整形式或經(jīng)動脈內(nèi)膜表面脂蛋白脂酶作用分解成殘片后，通過受損的內(nèi)皮進(jìn)入動脈壁。進(jìn)入動脈壁的脂蛋白堆積在平滑肌細(xì)胞間、膠原和彈力纖維上，引起平滑肌細(xì)胞增生，平滑肌細(xì)胞和來自血液的單核細(xì)胞吞噬大量脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞。脂蛋白進(jìn)一步降解，釋出膽固醇、膽固醇酯、甘油三酯和其他脂質(zhì)，LDL還與動脈壁的蛋白多糖結(jié)合產(chǎn)生不溶性沉淀，這些產(chǎn)物共同刺激纖維組織增生，最終形成粥樣斑塊。血栓形成學(xué)說：此學(xué)說認(rèn)為，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血栓形成起著重要作用。血管內(nèi)皮損傷是血栓形成的始動因素，受損的內(nèi)皮細(xì)胞暴露內(nèi)皮下的膠原纖維等成分，激活血小板，使其黏附在損傷部位。血小板被激活后，會釋放二磷酸腺苷（ADP）、血栓素A?（TXA?）等物質(zhì)，進(jìn)一步誘導(dǎo)血小板聚集，形成血小板血栓。血小板血栓逐漸增大，可導(dǎo)致血管狹窄或阻塞。血栓中的血小板和其他成分還可釋放多種生長因子和細(xì)胞因子，如血小板源性生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些因子可刺激平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)動脈粥樣硬化病變的發(fā)展。平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說：該學(xué)說認(rèn)為，動脈粥樣硬化斑塊中的平滑肌細(xì)胞來源于單個平滑肌細(xì)胞的增殖，如同腫瘤細(xì)胞的克隆性生長。在動脈粥樣硬化的早期，內(nèi)皮細(xì)胞損傷或其他因素刺激下，動脈中膜的平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖，并遷移到內(nèi)膜下。這些平滑肌細(xì)胞在生長因子和細(xì)胞因子的作用下，不斷增殖和分化，形成一個具有相同遺傳特征的細(xì)胞克隆。隨著時間的推移，這個克隆逐漸擴(kuò)大，形成粥樣斑塊中的平滑肌細(xì)胞成分。平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移不僅導(dǎo)致斑塊的形成和發(fā)展，還可合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，使斑塊更加穩(wěn)定和堅(jiān)固。內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說：目前多數(shù)研究支持內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說，認(rèn)為動脈粥樣硬化各種主要危險(xiǎn)因素，如血脂異常、高血壓、吸煙、糖尿病等，最終都損傷動脈內(nèi)膜。在長期血脂異常等危險(xiǎn)因素的作用下，LDL通過受損的內(nèi)皮進(jìn)入管壁內(nèi)膜，并被氧化修飾成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL對動脈內(nèi)膜造成進(jìn)一步損傷。同時，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面特性發(fā)生變化，黏附因子表達(dá)增加，黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上的數(shù)量增多，并從內(nèi)皮細(xì)胞之間移入內(nèi)膜下成為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過清道夫受體吞噬ox-LDL，轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，形成最早的粥樣硬化病變——脂質(zhì)條紋。隨著病變的發(fā)展，平滑肌細(xì)胞從動脈中膜遷移到內(nèi)膜下，增殖并合成細(xì)胞外基質(zhì)，逐漸形成纖維斑塊。炎癥免疫學(xué)說：近年來，炎癥免疫學(xué)說逐漸成為研究的熱點(diǎn)，該學(xué)說認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，免疫細(xì)胞和炎癥因子在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。多種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞會表達(dá)黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，吸引血液中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞黏附并遷移到血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞在血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL變成泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞會釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)一步招募炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞也參與動脈粥樣硬化的炎癥過程，Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）等，可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-4、IL-10等，則具有一定的抗炎作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）可通過抑制免疫反應(yīng)，維持免疫平衡，在動脈粥樣硬化中發(fā)揮保護(hù)作用。固有免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等也在動脈粥樣硬化的炎癥免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。炎癥免疫反應(yīng)貫穿動脈粥樣硬化的整個過程，從病變的起始、發(fā)展到斑塊的不穩(wěn)定和破裂，都與炎癥免疫細(xì)胞和炎癥因子密切相關(guān)。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段相互作用的復(fù)雜過程，這些學(xué)說并非孤立存在，而是相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同推動動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。在動脈粥樣硬化的形成過程中，脂質(zhì)浸潤為病變的發(fā)生提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，內(nèi)皮損傷是病變啟動的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，血栓形成和平滑肌細(xì)胞克隆參與了病變的發(fā)展和演變，而炎癥免疫反應(yīng)則貫穿始終，調(diào)節(jié)著病變的進(jìn)程和斑塊的穩(wěn)定性。深入研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，有助于揭示其本質(zhì)，為開發(fā)有效的防治策略提供理論依據(jù)。2.1.3病理過程動脈粥樣硬化的病理過程是一個逐漸發(fā)展的過程，通?？煞譃橹y、纖維斑塊、粥樣斑塊和繼發(fā)性病變四個階段。脂紋（fattystreak）：脂紋是動脈粥樣硬化的早期病變，常見于主動脈后壁及其分支開口處、冠狀動脈、腦動脈等大、中動脈內(nèi)膜。肉眼觀，脂紋表現(xiàn)為黃色斑點(diǎn)或長短不一的條紋，平坦或微隆起于內(nèi)膜表面，寬約1-2mm，長約1-5cm，常呈長短不一的條紋狀，可相互融合。光鏡下，脂紋由大量泡沫細(xì)胞聚集而成。泡沫細(xì)胞來源于血液中的單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，單核細(xì)胞在趨化因子的作用下從血管腔進(jìn)入內(nèi)膜下，分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，形成富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞；中膜的平滑肌細(xì)胞也可遷移至內(nèi)膜下，吞噬脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞。除泡沫細(xì)胞外，脂紋中還可見少量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。脂紋的形成是動脈對脂質(zhì)浸潤的早期反應(yīng)，通常無明顯的臨床癥狀，但可作為動脈粥樣硬化發(fā)生的早期標(biāo)志。纖維斑塊（fibrousplaque）：隨著病變的發(fā)展，脂紋進(jìn)一步演變?yōu)槔w維斑塊。肉眼觀，纖維斑塊呈灰白色，隆起于內(nèi)膜表面，形狀不規(guī)則，大小不等，直徑可達(dá)1-2cm。纖維斑塊的表面為一層由大量平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的纖維帽，纖維帽下方為脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞、炎細(xì)胞等組成的脂質(zhì)區(qū)。光鏡下，纖維帽主要由增生的平滑肌細(xì)胞、膠原纖維、彈性纖維及蛋白多糖等組成，纖維帽的厚度和組成成分在不同病變部位和不同階段有所差異。在纖維斑塊的形成過程中，平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移起著重要作用，它們不僅合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建纖維帽，還可吞噬脂質(zhì)，參與脂質(zhì)區(qū)的形成。纖維斑塊的出現(xiàn)標(biāo)志著動脈粥樣硬化病變的進(jìn)一步發(fā)展，此時血管壁開始增厚，管腔可能出現(xiàn)不同程度的狹窄，但一般仍能維持正常的血液供應(yīng)。粥樣斑塊（atheromatousplaque）：粥樣斑塊也稱粥瘤（atheroma），是在纖維斑塊的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。肉眼觀，粥樣斑塊呈灰黃色，明顯隆起于內(nèi)膜表面，大小不一，直徑可達(dá)2-5cm，其切面可見纖維帽深部為大量黃色粥樣物質(zhì)，主要由脂質(zhì)和壞死物質(zhì)組成。光鏡下，粥樣斑塊的纖維帽進(jìn)一步增厚，膠原纖維玻璃樣變，平滑肌細(xì)胞因缺血而變性、壞死；脂質(zhì)區(qū)明顯擴(kuò)大，其中含有大量的膽固醇結(jié)晶、壞死細(xì)胞碎片、鈣鹽沉積等；底部和邊緣可見肉芽組織增生，外周有少量淋巴細(xì)胞和泡沫細(xì)胞浸潤。粥樣斑塊的形成使動脈管壁明顯增厚、變硬，管腔狹窄更加明顯，嚴(yán)重影響血液供應(yīng)，導(dǎo)致相應(yīng)器官的缺血癥狀。粥樣斑塊的穩(wěn)定性也較差，容易發(fā)生破裂、出血等繼發(fā)性病變，引發(fā)急性心血管事件。繼發(fā)性病變（secondarylesions）：在粥樣斑塊的基礎(chǔ)上，可出現(xiàn)多種繼發(fā)性病變，這些病變往往是導(dǎo)致急性心血管事件發(fā)生的重要原因。常見的繼發(fā)性病變包括：斑塊內(nèi)出血：由于斑塊內(nèi)新生的毛細(xì)血管破裂或動脈腔內(nèi)的血液經(jīng)斑塊破裂口進(jìn)入斑塊內(nèi)，形成斑塊內(nèi)血腫。斑塊內(nèi)出血可使斑塊迅速增大，導(dǎo)致管腔急性狹窄或阻塞，引發(fā)急性缺血癥狀。斑塊破裂：粥樣斑塊的纖維帽變薄、變脆，在血流沖擊或血壓波動等因素的作用下，容易發(fā)生破裂。斑塊破裂后，其內(nèi)部的粥樣物質(zhì)暴露于血流中，可形成血栓，導(dǎo)致血管急性閉塞，引發(fā)心肌梗死、腦卒中等嚴(yán)重后果。血栓形成：斑塊破裂后，暴露的膠原纖維和組織因子等可激活血小板和凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血栓形成。血栓可進(jìn)一步阻塞血管，或脫落隨血流運(yùn)行，引起栓塞。鈣化：在粥樣斑塊的基礎(chǔ)上，鈣鹽可在壞死灶及纖維帽內(nèi)沉積，使動脈壁變硬、變脆，進(jìn)一步加重血管狹窄，增加心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。動脈瘤形成：嚴(yán)重的粥樣斑塊可使動脈壁中膜萎縮、變薄，在血管內(nèi)壓力的作用下，動脈壁局部向外膨出，形成動脈瘤。動脈瘤一旦破裂，可導(dǎo)致大出血，危及生命。動脈粥樣硬化的病理過程是一個連續(xù)的、漸進(jìn)的過程，從早期的脂紋發(fā)展到晚期的繼發(fā)性病變，病變程度逐漸加重，對血管和器官的影響也越來越大。了解動脈粥樣硬化的病理過程，對于早期診斷、及時干預(yù)和預(yù)防心血管事件的發(fā)生具有重要意義。2.2Tim-3分子2.2.1結(jié)構(gòu)與表達(dá)Tim-3（Tcellimmunoglobulinandmucindomain-3），又稱HAVCR2（hepatitisAviruscellularreceptor2），是T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白家族（TIM家族）的重要成員。在人類中，TIM家族包含TIM1-TIM8八個成員，其中TIM1、TIM3和TIM4被發(fā)現(xiàn)存在。Tim-3基因定位于人類染色體5q33.2，其編碼的Tim-3蛋白是一種跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分構(gòu)成。Tim-3的胞外區(qū)由具有FG-CC’環(huán)和N-連接聚糖的N-末端細(xì)胞外免疫球蛋白可變區(qū)（IgV結(jié)構(gòu)域）、含有O-連接糖基化位點(diǎn)的粘蛋白結(jié)構(gòu)域和含有N-連接聚糖的柄結(jié)構(gòu)域組成。IgV結(jié)構(gòu)域包含其配體的結(jié)合位點(diǎn)，如磷脂酰絲氨酸（Ptdser）、癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子（CEACAM1）和高遷移率族蛋白1（HMGB1）結(jié)合到FG-CC’環(huán)，而Gal9結(jié)合到N-連接的聚糖。粘蛋白結(jié)構(gòu)域富含脯氨酸、蘇氨酸和絲氨酸殘基，這些位點(diǎn)的O-糖基化修飾可以影響Tim-3的結(jié)構(gòu)和功能。柄結(jié)構(gòu)域則連接IgV結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，在維持分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用?？缒^(qū)由疏水氨基酸組成，將Tim-3錨定在細(xì)胞膜上。胞內(nèi)區(qū)由帶有五個酪氨酸殘基的胞質(zhì)尾組成，這些酪氨酸殘基在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可被磷酸化后招募下游信號分子，從而激活或抑制相關(guān)信號通路。Tim-3在多種免疫細(xì)胞上表達(dá)。在T淋巴細(xì)胞中，Tim-3選擇性地表達(dá)在分泌IFN-γ的T輔助細(xì)胞（Th1和Th17）、T調(diào)控細(xì)胞（Treg）以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）上。在Th1細(xì)胞中，Tim-3的表達(dá)與細(xì)胞的活化和功能狀態(tài)密切相關(guān)，其高表達(dá)往往提示Th1細(xì)胞的功能失調(diào)或耗竭。Treg細(xì)胞上組成性表達(dá)Tim-3，且Tim-3的表達(dá)水平與Treg細(xì)胞的抑制功能增強(qiáng)相關(guān)。在CTL中，Tim-3的表達(dá)可抑制其殺傷活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。在固有免疫細(xì)胞中，Tim-3也廣泛表達(dá)。在樹突狀細(xì)胞（DCs）上，Tim-3的表達(dá)參與了抗原呈遞和免疫激活的調(diào)節(jié)。DCs攝取抗原后，Tim-3的表達(dá)會發(fā)生變化，影響其與T細(xì)胞的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的啟動和強(qiáng)度。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表達(dá)Tim-3。在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過程中，Tim-3的表達(dá)水平可能發(fā)生改變，并且巨噬細(xì)胞所處的微環(huán)境也會影響Tim-3的表達(dá)。巨噬細(xì)胞上的Tim-3參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其與配體結(jié)合后可調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化和細(xì)胞因子分泌。NK細(xì)胞表面同樣表達(dá)Tim-3，NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)對其殺傷活性和細(xì)胞因子分泌具有重要調(diào)節(jié)作用。在某些病理狀態(tài)下，如腫瘤、感染等，NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致其殺傷活性降低，影響機(jī)體的免疫防御功能。除免疫細(xì)胞外，Tim-3在一些腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)，如黑色素瘤、胃癌、B細(xì)胞淋巴瘤等，腫瘤細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)與腫瘤的免疫逃逸、增殖和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。2.2.2生物學(xué)功能Tim-3在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著復(fù)雜的作用，具有正負(fù)調(diào)控雙重功能。在正常生理狀態(tài)下，Tim-3主要參與維持免疫平衡和免疫耐受。在T細(xì)胞免疫中，Tim-3與配體Galectin-9（Gal-9）結(jié)合后，通過改變細(xì)胞內(nèi)的鈣離子流量，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡，從而抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這種負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制有助于防止過度的免疫反應(yīng)，避免自身免疫性疾病的發(fā)生。在Treg細(xì)胞中，Tim-3通過與CEACAM1的順式二聚體相互作用，促進(jìn)Treg細(xì)胞的成熟和穩(wěn)定，增強(qiáng)其抑制功能，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化和增殖，維持免疫耐受。在固有免疫中，Tim-3也參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在DCs中，Tim-3與PtdSer的相互作用可促進(jìn)凋亡小體的清除，參與免疫穩(wěn)態(tài)的維持。DCs攝取凋亡小體后，Tim-3識別PtdSer，介導(dǎo)凋亡小體的內(nèi)化和處理，從而避免凋亡小體引發(fā)的過度炎癥反應(yīng)。在巨噬細(xì)胞中，Tim-3與HMGB1結(jié)合，阻斷其核酸向內(nèi)體運(yùn)輸，從而抑制先天免疫反應(yīng)。當(dāng)巨噬細(xì)胞處于炎癥微環(huán)境中時，HMGB1釋放，若Tim-3與HMGB1結(jié)合，可抑制巨噬細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌，防止炎癥反應(yīng)過度激活。然而，在某些病理情況下，如腫瘤、慢性感染和自身免疫性疾病等，Tim-3的功能失調(diào)，導(dǎo)致免疫逃逸和免疫抑制，促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤免疫中，腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)Tim-3配體，如Gal-9、PtdSer等，與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）表面的Tim-3結(jié)合，誘導(dǎo)TILs凋亡或功能耗竭，從而逃避免疫監(jiān)視。在多種腫瘤中，如非小細(xì)胞肺癌、肝癌、黑色素瘤等，TILs上Tim-3的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，腫瘤微環(huán)境中的髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）也可表達(dá)Tim-3，通過與T細(xì)胞表面的Tim-3配體相互作用，抑制T細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在慢性感染中，如HIV、HCV等病毒感染，病毒特異性T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致T細(xì)胞功能耗竭，無法有效清除病毒。HIV感染患者中，CD4+和CD8+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)增加，與病毒載量升高和免疫功能受損相關(guān)。在自身免疫性疾病中，Tim-3的異常表達(dá)和功能失調(diào)也參與了疾病的發(fā)病機(jī)制。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中，T細(xì)胞和B細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)異常，導(dǎo)致免疫細(xì)胞活化和自身抗體產(chǎn)生失調(diào)，加重疾病的炎癥反應(yīng)。Tim-3作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子，在免疫平衡的維持和病理狀態(tài)下的免疫失調(diào)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入研究Tim-3的生物學(xué)功能及其在不同疾病中的作用機(jī)制，對于開發(fā)新的免疫治療策略具有重要意義。2.3單核巨噬細(xì)胞2.3.1來源與分化單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)由單核細(xì)胞及其分化而來的具有吞噬功能的細(xì)胞組成，包括血液中的單核細(xì)胞、組織中的巨噬細(xì)胞等。單核細(xì)胞來源于骨髓中的造血干細(xì)胞，在骨髓中，造血干細(xì)胞首先分化為多能祖細(xì)胞，多能祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為共同髓系祖細(xì)胞（CMP）。CMP在多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，分化為粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞（GMP）。GMP在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等細(xì)胞因子的作用下，逐漸分化為單核母細(xì)胞，單核母細(xì)胞再經(jīng)過前單核細(xì)胞階段，最終發(fā)育為成熟的單核細(xì)胞。成熟的單核細(xì)胞從骨髓釋放進(jìn)入血液循環(huán)，在血液中停留1-3天后，遷移到全身各組織和器官，在不同的組織微環(huán)境中，單核細(xì)胞可分化為各種類型的巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化是一個復(fù)雜的過程，受到多種因素的調(diào)控。在炎癥或損傷等刺激下，組織局部會產(chǎn)生一系列趨化因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1，也稱為CCL2）等。MCP-1與單核細(xì)胞表面的趨化因子受體CCR2結(jié)合，介導(dǎo)單核細(xì)胞從血液循環(huán)中穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞，遷移到組織間隙。一旦進(jìn)入組織，單核細(xì)胞在組織微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用下，逐漸分化為巨噬細(xì)胞。M-CSF是促進(jìn)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，它通過與單核細(xì)胞表面的M-CSF受體（c-Fms）結(jié)合，激活下游的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等信號通路，促進(jìn)單核細(xì)胞的存活、增殖和分化為巨噬細(xì)胞。GM-CSF也能參與單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化過程，GM-CSF與單核細(xì)胞表面的GM-CSF受體結(jié)合，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞表達(dá)一系列與巨噬細(xì)胞功能相關(guān)的基因和蛋白，促進(jìn)其向巨噬細(xì)胞的分化。此外，其他細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等也可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的分化，它們可以增強(qiáng)M-CSF和GM-CSF的作用，或直接影響單核細(xì)胞的分化方向。在不同的組織中，由于微環(huán)境的差異，單核細(xì)胞分化形成的巨噬細(xì)胞具有不同的表型和功能特點(diǎn)。在肝臟中，單核細(xì)胞分化為庫普弗細(xì)胞（Kupffercells），它們在肝臟的免疫防御、清除衰老紅細(xì)胞和代謝產(chǎn)物等方面發(fā)揮重要作用；在肺臟中，單核細(xì)胞分化為肺泡巨噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除吸入的病原體和異物，維持肺部的免疫平衡；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，單核細(xì)胞分化為小膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)組織的免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。2.3.2在動脈粥樣硬化中的作用單核巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和并發(fā)癥的形成過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。參與脂質(zhì)攝取與泡沫細(xì)胞形成：在動脈粥樣硬化的起始階段，血脂異常導(dǎo)致血液中低密度脂蛋白（LDL）水平升高。LDL經(jīng)過氧化修飾形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），ox-LDL具有細(xì)胞毒性，并可作為趨化因子和炎癥介質(zhì)，吸引單核細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移。單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)膜下后，分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)多種清道夫受體，如CD36、SR-A等，這些受體可以識別并大量攝取ox-LDL。隨著ox-LDL攝取的增加，巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)不斷積累，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是動脈粥樣硬化早期病變的重要標(biāo)志，它們不僅導(dǎo)致膽固醇在血管壁的沉積，還會釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，進(jìn)一步引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移：單核巨噬細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子和生長因子在動脈粥樣硬化過程中對血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的增殖和遷移起到重要調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞分泌的血小板源性生長因子（PDGF）是一種強(qiáng)效的促有絲分裂因子，它可以與VSMC表面的PDGF受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶活性，進(jìn)而激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-Akt等信號通路，促進(jìn)VSMC的增殖和DNA合成。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）也能刺激VSMC的增殖和遷移，F(xiàn)GF與VSMC表面的FGF受體結(jié)合，通過激活PLCγ-IP3-Ca2?和Ras-Raf-MEK-ERK等信號通路，調(diào)節(jié)VSMC的生物學(xué)行為。這些細(xì)胞因子和生長因子還可以促進(jìn)VSMC合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，導(dǎo)致血管壁增厚、變硬，管腔狹窄。參與炎癥與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)：單核巨噬細(xì)胞是動脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)的核心參與者。在動脈粥樣硬化病變部位，巨噬細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，攝取、加工和呈遞抗原給T淋巴細(xì)胞，激活T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ類分子和共刺激分子，如CD80、CD86等，它們與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR）和共刺激受體相互作用，啟動T細(xì)胞的活化和增殖?；罨腡細(xì)胞可分化為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17和Treg等，它們分泌的細(xì)胞因子進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Th1細(xì)胞分泌的IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，同時促進(jìn)炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10等具有抗炎作用，可抑制炎癥反應(yīng)；Th17細(xì)胞分泌的IL-17等細(xì)胞因子可招募中性粒細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)；Treg細(xì)胞則通過抑制免疫反應(yīng)，維持免疫平衡。巨噬細(xì)胞自身也分泌多種炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，這些炎癥因子可以激活內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和遷移，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞還可分泌趨化因子，如MCP-1、CCL5等，進(jìn)一步招募單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞到病變部位，形成惡性循環(huán)，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。在動脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細(xì)胞的死亡會導(dǎo)致壞死核心的形成，增加斑塊的不穩(wěn)定性。巨噬細(xì)胞的死亡方式包括凋亡和壞死，凋亡的巨噬細(xì)胞如果不能被及時清除，會發(fā)生繼發(fā)性壞死，釋放大量的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)容物，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，壞死核心擴(kuò)大。壞死核心中富含脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞碎片等，其周圍的纖維帽變薄，容易破裂，一旦斑塊破裂，暴露的組織因子和膠原纖維等可激活血小板和凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致血栓形成，引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。2.4NK細(xì)胞2.4.1來源與功能NK細(xì)胞即自然殺傷細(xì)胞（NaturalKillercell），是淋巴細(xì)胞的重要亞群，屬于固有免疫細(xì)胞。NK細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞，在骨髓中，造血干細(xì)胞首先分化為共同淋巴樣祖細(xì)胞（CLP）。CLP在多種細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，逐步分化為NK細(xì)胞前體，NK細(xì)胞前體進(jìn)一步發(fā)育成熟，離開骨髓進(jìn)入血液循環(huán)，并分布到全身各個組織和器官，如脾臟、肝臟、肺臟、淋巴結(jié)等。NK細(xì)胞具有多種重要的生物學(xué)功能。首先，NK細(xì)胞具有自然殺傷活性，能夠非特異性地識別和殺傷靶細(xì)胞。NK細(xì)胞表面表達(dá)多種活化性受體和抑制性受體，通過這些受體與靶細(xì)胞表面相應(yīng)配體的相互作用，調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。當(dāng)活化性受體與靶細(xì)胞表面的配體結(jié)合，傳遞活化信號，激活NK細(xì)胞；而抑制性受體與靶細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子結(jié)合，傳遞抑制信號，抑制NK細(xì)胞的活化。在正常情況下，機(jī)體細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子能夠與NK細(xì)胞的抑制性受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，從而避免NK細(xì)胞對自身正常細(xì)胞的攻擊。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生病變，如被病毒感染或發(fā)生癌變時，細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子表達(dá)下調(diào)或缺失，NK細(xì)胞的抑制性信號減弱，而活化性信號相對增強(qiáng)，NK細(xì)胞被激活，釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。穿孔素在靶細(xì)胞膜上形成孔道，使顆粒酶等物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，激活靶細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白酶，引發(fā)靶細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞還可通過分泌腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）等，與靶細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞還具有抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC作用）。當(dāng)靶細(xì)胞表面結(jié)合特異性IgG抗體時，NK細(xì)胞表面的FcγRⅢ（CD16）可識別并結(jié)合IgG抗體的Fc段，從而激活NK細(xì)胞，使其對靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。ADCC作用在清除病毒感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。例如，在病毒感染過程中，機(jī)體產(chǎn)生的特異性IgG抗體與被病毒感染的細(xì)胞表面抗原結(jié)合，NK細(xì)胞通過ADCC作用殺傷感染細(xì)胞，有助于控制病毒感染的擴(kuò)散。NK細(xì)胞能夠分泌多種細(xì)胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IFN-γ是NK細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子之一，它可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷能力，促進(jìn)其分泌炎癥因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。IFN-γ還能抑制病毒的復(fù)制，在抗病毒免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α具有促炎作用，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。IL-2可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)其殺傷活性。IL-10則具有抗炎作用，可抑制炎癥因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫平衡。2.4.2在動脈粥樣硬化中的作用NK細(xì)胞在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)作用。在動脈粥樣硬化早期，血脂異常、高血壓、吸煙等危險(xiǎn)因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子增加，吸引血液中的單核細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞黏附并遷移到血管內(nèi)膜下。NK細(xì)胞可以識別并殺傷感染病原體的細(xì)胞、衰老細(xì)胞或異常增殖的血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，有助于維持血管壁的穩(wěn)態(tài)。研究表明，在動脈粥樣硬化小鼠模型中，NK細(xì)胞能夠殺傷ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡，減少脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)。NK細(xì)胞還可通過分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取和清除，抑制泡沫細(xì)胞的形成，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中，NK細(xì)胞的數(shù)量和活性變化對病變進(jìn)展產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化患者的血液和斑塊組織中，NK細(xì)胞的數(shù)量減少，活性降低。NK細(xì)胞數(shù)量和活性的降低可能導(dǎo)致其免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)功能受損，無法有效清除病變細(xì)胞和抑制炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。NK細(xì)胞活性的降低還可能與NK細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體的表達(dá)失衡有關(guān)。在動脈粥樣硬化微環(huán)境中，炎癥因子和細(xì)胞因子的變化可能影響NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)，導(dǎo)致抑制性受體表達(dá)上調(diào)，活化性受體表達(dá)下調(diào)，使NK細(xì)胞的活性受到抑制。NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化的炎癥免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。IFN-γ是NK細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，在動脈粥樣硬化中，IFN-γ可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化。IFN-γ可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，增強(qiáng)其炎癥反應(yīng)和吞噬能力，有助于清除病原體和壞死細(xì)胞，但過度的IFN-γ也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，加重動脈粥樣硬化病變。IFN-γ還能抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，對動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。TNF-α也是NK細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，它具有促炎作用，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的募集和活化，參與動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。適量的TNF-α有助于啟動免疫反應(yīng)，清除病變細(xì)胞，但持續(xù)高表達(dá)的TNF-α可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過度激活，損傷血管壁，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。NK細(xì)胞還可以通過與其他免疫細(xì)胞的相互作用，調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。NK細(xì)胞可以通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的活化和分化。NK細(xì)胞分泌的IFN-γ可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增強(qiáng)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；而NK細(xì)胞分泌的IL-10則可抑制Th1細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)免疫平衡。NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞之間也存在相互調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷能力；巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子也可調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活性。在動脈粥樣硬化病變部位，NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同參與炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)，它們之間的相互作用失衡可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，影響動脈粥樣硬化的發(fā)展。三、Tim-3對單核巨噬細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制3.1Tim-3與單核巨噬細(xì)胞的相互作用3.1.1Tim-3在單核巨噬細(xì)胞上的表達(dá)Tim-3在單核巨噬細(xì)胞上的表達(dá)情況是研究其調(diào)控作用的基礎(chǔ)。為了明確Tim-3在單核巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平，科研人員通常采用多種實(shí)驗(yàn)檢測方法。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)是常用的檢測手段之一。通過使用針對Tim-3的特異性熒光抗體標(biāo)記單核巨噬細(xì)胞，然后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，能夠精確地分析Tim-3在單核巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)比例和表達(dá)強(qiáng)度。例如，從健康志愿者的外周血中分離出單核細(xì)胞，在體外誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞后，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞表面有一定水平的Tim-3表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)可從基因水平檢測Tim-3的表達(dá)情況。提取單核巨噬細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特定的引物對Tim-3基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量來反映Tim-3基因的表達(dá)豐度。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）則可從蛋白質(zhì)水平對Tim-3的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，用特異性的Tim-3抗體進(jìn)行孵育，再通過化學(xué)發(fā)光等方法檢測Tim-3蛋白的表達(dá)。在動脈粥樣硬化的研究中，構(gòu)建合適的動物模型有助于進(jìn)一步研究Tim-3在體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞上的表達(dá)。以ApoE基因敲除小鼠作為動脈粥樣硬化模型，給予高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化病變。在不同時間點(diǎn)取材，通過免疫組化技術(shù)檢測動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著動脈粥樣硬化病變的發(fā)展，斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)水平逐漸升高。在早期的脂紋階段，單核巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)相對較低；而在進(jìn)展為纖維斑塊和粥樣斑塊階段，Tim-3的表達(dá)顯著上調(diào)。這表明在動脈粥樣硬化的病理過程中，單核巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)與病變的發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平的變化可能參與了動脈粥樣硬化的免疫調(diào)節(jié)過程。不同條件下Tim-3在單核巨噬細(xì)胞上的表達(dá)水平具有重要意義。在炎癥刺激條件下，如給予單核巨噬細(xì)胞脂多糖（LPS）刺激，可模擬體內(nèi)的炎癥微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，單核巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)迅速上調(diào)。這可能是機(jī)體的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制，通過上調(diào)Tim-3的表達(dá)來抑制過度的炎癥反應(yīng)。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）形成泡沫細(xì)胞時，Tim-3的表達(dá)也會發(fā)生改變。研究表明，隨著泡沫細(xì)胞的形成，Tim-3的表達(dá)水平升高。這可能與泡沫細(xì)胞在動脈粥樣硬化中的促炎作用以及Tim-3對免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。Tim-3表達(dá)的改變可能影響單核巨噬細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響動脈粥樣硬化的發(fā)展進(jìn)程。3.1.2單核巨噬細(xì)胞對Tim-3表達(dá)的影響單核巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)對Tim-3的表達(dá)有著顯著影響。在正常生理狀態(tài)下，單核巨噬細(xì)胞處于相對靜止的狀態(tài)，Tim-3的表達(dá)維持在較低水平。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞受到病原體相關(guān)分子模式（PAMP）如LPS、病毒核酸等，或損傷相關(guān)分子模式（DAMP）如高遷移率族蛋白1（HMGB1）、熱休克蛋白等刺激時，會發(fā)生活化?；罨蟮膯魏司奘杉?xì)胞可通過多種信號通路調(diào)節(jié)Tim-3的表達(dá)。以LPS刺激為例，LPS與單核巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活下游的髓樣分化因子88（MyD88）依賴和非依賴信號通路。在MyD88依賴通路中，MyD88招募白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）等分子，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路?；罨腘F-κB進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到Tim-3基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)Tim-3基因的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)Tim-3的表達(dá)。在非依賴MyD88通路中，LPS刺激可激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）等分子，誘導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生，I型干擾素通過與其受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，也可影響Tim-3的表達(dá)。炎癥因子在單核巨噬細(xì)胞對Tim-3表達(dá)的影響中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的炎癥因子，由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌。TNF-α可通過自分泌或旁分泌的方式作用于單核巨噬細(xì)胞自身或周圍的單核巨噬細(xì)胞。TNF-α與單核巨噬細(xì)胞表面的TNF受體1（TNFR1）結(jié)合，激活TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），進(jìn)而招募受體相互作用蛋白1（RIP1）等分子，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。DISC激活下游的NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路。這些信號通路的激活可促進(jìn)Tim-3的表達(dá)。白細(xì)胞介素-6（IL-6）也是一種常見的炎癥因子，在動脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境中含量升高。IL-6與單核巨噬細(xì)胞表面的IL-6受體結(jié)合，激活JAK-STAT3信號通路，使STAT3磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到Tim-3基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)Tim-3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。單核巨噬細(xì)胞的代謝狀態(tài)也可能影響Tim-3的表達(dá)。在動脈粥樣硬化過程中，單核巨噬細(xì)胞攝取大量的ox-LDL，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。細(xì)胞內(nèi)過多的脂質(zhì)積累可激活一些代謝相關(guān)的信號通路，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）信號通路。PPARγ是一種核受體，被激活后可與視黃醇類X受體（RXR）形成異二聚體，結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ的激活可抑制Tim-3的表達(dá)。這可能是因?yàn)镻PARγ通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)，影響了單核巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)，進(jìn)而間接影響了Tim-3的表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)的能量代謝狀態(tài)也可能對Tim-3的表達(dá)產(chǎn)生影響。當(dāng)單核巨噬細(xì)胞處于低氧或營養(yǎng)缺乏等能量應(yīng)激狀態(tài)時，細(xì)胞內(nèi)的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）被激活。AMPK通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑和信號通路，可能對Tim-3的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。3.2Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能的信號通路3.2.1經(jīng)典信號通路在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能的過程中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等亞家族。當(dāng)Tim-3與配體結(jié)合后，可激活MAPK信號通路。以Galectin-9（Gal-9）與Tim-3結(jié)合為例，Gal-9是Tim-3的重要配體之一，在動脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境中，Gal-9的表達(dá)可能發(fā)生改變。當(dāng)Gal-9與Tim-3結(jié)合后，可導(dǎo)致Tim-3胞內(nèi)段的酪氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）。Grb2與SOS蛋白結(jié)合，激活Ras蛋白，Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化并激活ERK1/2。激活的ERK1/2可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如激活蛋白-1（AP-1）等。AP-1由c-Jun和c-Fos等組成，它可以結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。在單核巨噬細(xì)胞中，ERK1/2激活后可促進(jìn)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的基因轉(zhuǎn)錄，從而增加這些炎癥因子的表達(dá)和分泌。JNK和p38MAPK信號通路在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能中也有重要作用。當(dāng)Tim-3被激活后，可通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活JNK和p38MAPK。激活的JNK可以磷酸化c-Jun，增強(qiáng)AP-1的活性，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。p38MAPK被激活后，可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，如ATF2、MAPKAPK2等，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過程。在動脈粥樣硬化的背景下，p38MAPK的激活可能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和泡沫細(xì)胞形成。研究表明，在ApoE基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化模型中，抑制p38MAPK的活性可以減少單核巨噬細(xì)胞的炎癥因子分泌，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路也參與了Tim-3對單核巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控。PI3K-Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮重要作用。在單核巨噬細(xì)胞中，Tim-3與配體結(jié)合后，可激活PI3K-Akt信號通路。當(dāng)Tim-3被激活時，其胞內(nèi)段的酪氨酸殘基磷酸化，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的PI3K調(diào)節(jié)亞基，激活PI3K的催化亞基。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，結(jié)合并激活A(yù)kt蛋白。Akt蛋白被激活后，可磷酸化多種下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等。mTOR是PI3K-Akt信號通路的重要下游靶點(diǎn)，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成、代謝和自噬等過程。在單核巨噬細(xì)胞中，激活的mTOR可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增加炎癥因子和趨化因子的產(chǎn)生。Akt還可以通過磷酸化GSK3β，抑制其活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化的細(xì)胞模型中，抑制PI3K-Akt信號通路可以減少單核巨噬細(xì)胞對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取，抑制泡沫細(xì)胞的形成。這表明PI3K-Akt信號通路在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)中起著重要作用。3.2.2新發(fā)現(xiàn)的信號通路Janus激酶（JAK）-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能中起重要作用的信號通路。JAK-STAT信號通路在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在單核巨噬細(xì)胞中，當(dāng)Tim-3與配體結(jié)合后，可激活JAK-STAT信號通路。以高遷移率族蛋白1（HMGB1）與Tim-3結(jié)合為例，HMGB1是一種損傷相關(guān)分子模式，在動脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境中，受損細(xì)胞會釋放HMGB1。HMGB1與Tim-3結(jié)合后，可導(dǎo)致Tim-3構(gòu)象改變，招募并激活JAK家族成員，如JAK1、JAK2等。激活的JAK激酶使STAT蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的STAT蛋白形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在單核巨噬細(xì)胞中，JAK-STAT信號通路的激活可促進(jìn)炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-6等的表達(dá)。研究表明，在脂多糖（LPS）刺激的單核巨噬細(xì)胞中，阻斷JAK-STAT信號通路可以抑制Tim-3誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，提示JAK-STAT信號通路在Tim-3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。JAK-STAT信號通路還可能參與調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的極化。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，而M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，JAK-STAT信號通路的激活狀態(tài)可能影響單核巨噬細(xì)胞向M1或M2型極化的方向。在動脈粥樣硬化的背景下，JAK-STAT信號通路的異常激活可能導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞極化失衡，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。雖然對JAK-STAT等新信號通路在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能中的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多問題。目前對于JAK-STAT信號通路中具體的JAK激酶和STAT蛋白亞型在Tim-3調(diào)控中的作用機(jī)制還不完全清楚。不同的JAK激酶和STAT蛋白亞型可能在不同的條件下發(fā)揮不同的作用，其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相互作用關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。JAK-STAT信號通路與其他信號通路之間的相互作用也有待進(jìn)一步闡明。在單核巨噬細(xì)胞中，存在多種信號通路相互交織形成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。JAK-STAT信號通路與MAPK、PI3K-Akt等經(jīng)典信號通路之間可能存在相互激活或抑制的關(guān)系，這種相互作用如何影響Tim-3對單核巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控，目前還缺乏系統(tǒng)的研究。此外，在動脈粥樣硬化的體內(nèi)環(huán)境中，JAK-STAT信號通路在Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能中的作用是否與體外實(shí)驗(yàn)一致，還需要更多的體內(nèi)研究來驗(yàn)證。由于動脈粥樣硬化是一個復(fù)雜的多因素疾病，體內(nèi)的微環(huán)境與體外實(shí)驗(yàn)存在差異，因此需要進(jìn)一步研究在動脈粥樣硬化模型中JAK-STAT信號通路的作用機(jī)制，為動脈粥樣硬化的防治提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。3.3Tim-3調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能對動脈粥樣硬化的影響3.3.1對泡沫細(xì)胞形成的影響在動脈粥樣硬化的起始階段，泡沫細(xì)胞的形成是關(guān)鍵事件，而Tim-3對單核巨噬細(xì)胞的調(diào)控在其中發(fā)揮著重要作用。單核巨噬細(xì)胞通過表面的清道夫受體攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），從而轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。Tim-3可能通過多種途徑影響這一過程。研究表明，Tim-3與配體結(jié)合后，可激活下游的信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)清道夫受體的表達(dá)。當(dāng)Tim-3與Galectin-9結(jié)合后，激活了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）被激活后，可促進(jìn)清道夫受體CD36的表達(dá)。CD36作為一種重要的清道夫受體，可特異性識別并結(jié)合ox-LDL，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取。在體外實(shí)驗(yàn)中，用Galectin-9刺激單核巨噬細(xì)胞，使其表面Tim-3激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD36的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞對ox-LDL的攝取量顯著增加，從而促進(jìn)了泡沫細(xì)胞的形成。在動脈粥樣硬化的體內(nèi)模型中，如ApoE基因敲除小鼠，給予高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化病變。研究發(fā)現(xiàn)，在病變部位的單核巨噬細(xì)胞中，Tim-3的表達(dá)上調(diào)，同時伴隨著CD36表達(dá)的升高和泡沫細(xì)胞數(shù)量的增加。當(dāng)通過基因敲除或使用拮抗劑阻斷Tim-3信號通路后，CD36的表達(dá)下降，單核巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取減少，泡沫細(xì)胞的形成受到抑制，動脈粥樣硬化病變的發(fā)展也得到一定程度的延緩。這進(jìn)一步證實(shí)了Tim-3通過調(diào)節(jié)清道夫受體表達(dá)促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成的作用。Tim-3還可能影響單核巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性。膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）是一種參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯化的關(guān)鍵酶，可將游離膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，促進(jìn)脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的儲存。研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3激活后，通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt信號通路，可上調(diào)ACAT1的表達(dá)和活性。在單核巨噬細(xì)胞中，激活Tim-3信號通路后，ACAT1的表達(dá)增加，細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量升高，促進(jìn)了泡沫細(xì)胞的形成。而抑制PI3K-Akt信號通路后，ACAT1的表達(dá)和活性下降，細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的積累減少，泡沫細(xì)胞的形成受到抑制。這表明Tim-3通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，影響單核巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的酯化和儲存，進(jìn)而促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。3.3.2對炎癥反應(yīng)的影響Tim-3對單核巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中具有重要意義。單核巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，可分泌多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子在動脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)Tim-3與配體結(jié)合后，可激活單核巨噬細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和分泌。以脂多糖（LPS）刺激單核巨噬細(xì)胞為例，LPS可誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的Tim-3與配體結(jié)合后，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮核心調(diào)控作用。在Tim-3的作用下，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，結(jié)合到炎癥因子基因的啟動子區(qū)域，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用LPS刺激單核巨噬細(xì)胞，并同時阻斷Tim-3信號通路，發(fā)現(xiàn)炎癥因子的分泌明顯減少，表明Tim-3在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要促進(jìn)作用。在動脈粥樣硬化的體內(nèi)環(huán)境中，炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞和信號通路的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，在ApoE基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化模型中，病變部位的單核巨噬細(xì)胞高表達(dá)Tim-3，同時炎癥因子的表達(dá)也顯著升高。當(dāng)阻斷Tim-3信號通路后，炎癥因子的表達(dá)下降，炎癥細(xì)胞的浸潤減少，動脈粥樣硬化病變的炎癥程度減輕。這表明Tim-3通過促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌，加劇了動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)。Tim-3還可能影響單核巨噬細(xì)胞的極化，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。單核巨噬細(xì)胞可根據(jù)微環(huán)境的不同分化為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎作用，主要分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子；M2型巨噬細(xì)胞則具有抗炎和組織修復(fù)作用，主要分泌白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等抗炎細(xì)胞因子。研究表明，Tim-3的激活可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向M1型極化。在體外實(shí)驗(yàn)中，用Tim-3激動劑處理單核巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向M1型極化的比例增加，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物如CD86等表達(dá)上調(diào)，同時促炎細(xì)胞因子的分泌增加。而阻斷Tim-3信號通路后，單核巨噬細(xì)胞向M2型極化的比例增加，抗炎細(xì)胞因子的分泌增加。這表明Tim-3通過調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞的極化，影響炎癥因子的分泌，從而調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化的炎癥微環(huán)境。四、Tim-3對NK細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制4.1Tim-3與NK細(xì)胞的相互作用4.1.1Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)在探索Tim-3對NK細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制時，Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)情況是一個關(guān)鍵的切入點(diǎn)。研究人員通常采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)來檢測Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)。在細(xì)胞水平，流式細(xì)胞術(shù)是常用的檢測手段。通過使用熒光標(biāo)記的抗Tim-3抗體，能夠特異性地結(jié)合NK細(xì)胞表面的Tim-3分子，再利用流式細(xì)胞儀對標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行分析，可精確地測定NK細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)水平。例如，從健康個體的外周血中分離出NK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，NK細(xì)胞表面就有一定水平的Tim-3表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)則可從基因?qū)用鏅z測Tim-3的表達(dá)。提取NK細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以針對Tim-3基因的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量來反映Tim-3基因的轉(zhuǎn)錄水平。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）可以從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證Tim-3的表達(dá)。提取NK細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟后，用特異性的Tim-3抗體進(jìn)行孵育，再通過化學(xué)發(fā)光等方法檢測Tim-3蛋白的表達(dá)。在疾病狀態(tài)下，如動脈粥樣硬化，Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)會發(fā)生顯著變化。構(gòu)建動脈粥樣硬化動物模型，如ApoE基因敲除小鼠，給予高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化病變。通過免疫組化技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，小鼠脾臟和外周血中NK細(xì)胞表面Tim-3的表達(dá)逐漸升高。在早期的動脈粥樣硬化病變中，NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)雖然有所增加，但幅度較小；而在病變后期，Tim-3的表達(dá)顯著上調(diào)。這表明Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)與動脈粥樣硬化的發(fā)展密切相關(guān)。不同條件下Tim-3在NK細(xì)胞上的表達(dá)變化具有重要意義。在炎癥刺激條件下，如給予NK細(xì)胞脂多糖（LPS）刺激，模擬體內(nèi)的炎癥微環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激后，NK細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)迅速上調(diào)。這可能是機(jī)體的一種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，通過上調(diào)Tim-3的表達(dá)來抑制NK細(xì)胞過度活化，避免過度的免疫反應(yīng)對機(jī)體造成損傷。當(dāng)NK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞接觸時，Tim-3的表達(dá)也會發(fā)生改變。在腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞上Tim-3