仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的制備工藝與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效能評(píng)估一、引言1.1研究背景與意義隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；⒓s化程度的不斷提高，仔豬疾病的防控成為影響?zhàn)B豬業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素。仔豬水腫病和仔豬副傷寒作為仔豬階段的常見多發(fā)病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。仔豬水腫病又稱溶血性大腸桿菌病，是由某些定植于小腸的大腸桿菌引起的一種傳染性腸毒血癥。這些大腸桿菌可產(chǎn)生能侵入血流并破壞血管壁的外毒素，主要臨床特征為突然發(fā)病、病程短促、全身或局部麻痹、行走困難、共濟(jì)失調(diào)，眼瞼和喉頭、胃、腸道等組織器官水腫。本病發(fā)病率通常為10％-30％，但致死率極高，可達(dá)80％-100％。一旦發(fā)病，不僅患病仔豬死亡率高，幸存仔豬也往往生長(zhǎng)發(fā)育受阻，飼料轉(zhuǎn)化率降低，增加養(yǎng)殖成本。仔豬副傷寒是由豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等引起的一種危害仔豬的慢性傳染病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉，嚴(yán)重者可出現(xiàn)敗血癥。常發(fā)生于6月齡以下的仔豬，尤其是2-4月齡仔豬多見，發(fā)病率可達(dá)40%，病死率達(dá)20%。本病不僅影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致飼料報(bào)酬降低，還會(huì)造成仔豬的死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)直接的經(jīng)濟(jì)損失，并且還可造成母豬流產(chǎn)，嚴(yán)重危害后備豬源的發(fā)展。這兩種疾病在養(yǎng)豬場(chǎng)中廣泛存在，且常?；旌细腥?，進(jìn)一步增加了防控的難度和損失。目前，針對(duì)這兩種疾病的防控主要依賴于疫苗接種。然而，現(xiàn)有的疫苗多為單價(jià)疫苗，需要分別進(jìn)行免疫接種，操作繁瑣，增加了養(yǎng)殖成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，且免疫效果存在一定的局限性。因此，研發(fā)一種安全、高效的仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)一次免疫即可同時(shí)預(yù)防兩種疾病，不僅可以簡(jiǎn)化免疫程序，減少養(yǎng)殖成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，還能提高免疫效果，有效降低仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發(fā)生率，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)于促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益提升和可持續(xù)發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在仔豬水腫病疫苗研發(fā)方面，國(guó)內(nèi)外都進(jìn)行了大量探索。傳統(tǒng)的仔豬水腫病疫苗多為滅活疫苗，通過(guò)將分離得到的產(chǎn)毒素大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)、滅活后制備而成。早期研究主要集中在篩選優(yōu)勢(shì)血清型菌株用于疫苗制備，國(guó)外學(xué)者通過(guò)大量的流行病學(xué)調(diào)查，確定了如O138:K81、O139:K82、O141:K85等常見的致水腫病大腸桿菌血清型，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)了相應(yīng)的單價(jià)或多價(jià)滅活疫苗。國(guó)內(nèi)也針對(duì)本土流行的血清型進(jìn)行研究，分離出多株具有代表性的菌株用于疫苗研制，在一定程度上對(duì)仔豬水腫病的防控起到了作用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程疫苗成為研究熱點(diǎn)。有研究將大腸桿菌的關(guān)鍵毒力基因如F18ab菌毛基因、類志賀毒素II型變異體（SLT-IIe）基因等進(jìn)行克隆、表達(dá)，制備亞單位疫苗或核酸疫苗。例如，將SLT-IIe的B亞基基因克隆到表達(dá)載體中，在合適的宿主菌中表達(dá)出具有免疫原性的蛋白，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，對(duì)仔豬水腫病有一定的免疫保護(hù)效果。在仔豬副傷寒疫苗研究領(lǐng)域，早期的疫苗主要是弱毒活疫苗，如C500弱毒株制成的活疫苗在國(guó)內(nèi)外都有應(yīng)用，該疫苗通過(guò)口服或注射免疫，能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，對(duì)仔豬副傷寒的預(yù)防有一定效果，但存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。滅活疫苗也是常見類型，通過(guò)化學(xué)方法滅活豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等病原菌制備，安全性較高，但免疫原性相對(duì)較弱，往往需要多次免疫。近年來(lái)，基因工程技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于仔豬副傷寒疫苗研發(fā)。利用基因缺失技術(shù)構(gòu)建減毒沙門氏菌載體，將外源保護(hù)性抗原基因?qū)肫渲校瑯?gòu)建重組活載體疫苗，既能激發(fā)機(jī)體針對(duì)沙門氏菌的免疫反應(yīng)，又能誘導(dǎo)針對(duì)外源抗原的特異性免疫。還有研究開發(fā)人源化的ZTJ4-5抗原和副傷寒B抗原的基因重組疫苗，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的免疫效價(jià)、保護(hù)效果和生物安全性。盡管在仔豬水腫病和仔豬副傷寒疫苗研發(fā)方面取得了諸多進(jìn)展，但當(dāng)前的二聯(lián)滅活疫苗研究仍存在一些問(wèn)題與挑戰(zhàn)。一方面，如何篩選出在不同地區(qū)都具有廣泛代表性的菌株用于二聯(lián)疫苗制備是關(guān)鍵問(wèn)題。不同地區(qū)的病原菌血清型分布存在差異，單一或少數(shù)菌株制備的疫苗可能無(wú)法對(duì)當(dāng)?shù)亓餍械木晏峁┯行ПＷo(hù)。另一方面，二聯(lián)疫苗中兩種抗原之間可能存在免疫干擾，影響疫苗的免疫效果。如何優(yōu)化疫苗配方和制備工藝，使兩種抗原在疫苗中相互協(xié)同，充分激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，現(xiàn)有疫苗的免疫程序較為復(fù)雜，部分疫苗需要多次免疫，增加了養(yǎng)殖成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，開發(fā)更加簡(jiǎn)便、高效的免疫程序也是未來(lái)研究的方向之一。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在制備一種安全、高效的仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗，并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估其免疫效果和安全性，為養(yǎng)豬業(yè)提供一種有效的疾病防控手段。具體研究?jī)?nèi)容如下：菌株篩選與鑒定：從臨床發(fā)病仔豬中采集病料，通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)，篩選出具有代表性的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌菌株。利用血清學(xué)方法、分子生物學(xué)技術(shù)如PCR擴(kuò)增等對(duì)分離菌株進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，確定其血清型和基因型，為后續(xù)疫苗制備提供優(yōu)質(zhì)種子菌株。疫苗制備工藝研究：優(yōu)化仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等，以提高菌體產(chǎn)量和質(zhì)量。采用合適的滅活方法，如甲醛滅活、β-丙內(nèi)酯滅活等，確保病原菌完全滅活且不影響其免疫原性。對(duì)滅活后的菌體進(jìn)行濃縮、純化處理，去除雜質(zhì)和有害成分，提高疫苗的純度。研究佐劑的種類和配比，如氫氧化鋁佐劑、油佐劑等，篩選出能有效增強(qiáng)疫苗免疫效果的佐劑配方，確定最終的疫苗制備工藝。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取健康的仔豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分組，分別進(jìn)行疫苗的安全性和免疫效力實(shí)驗(yàn)。安全性實(shí)驗(yàn)中，觀察仔豬接種疫苗后的臨床癥狀、體溫變化、采食情況等，檢測(cè)血液學(xué)指標(biāo)、生化指標(biāo)等，評(píng)估疫苗對(duì)仔豬的安全性，是否存在不良反應(yīng)。免疫效力實(shí)驗(yàn)中，在仔豬接種疫苗后的不同時(shí)間點(diǎn)采集血清，檢測(cè)抗體水平，如通過(guò)ELISA方法檢測(cè)特異性IgG抗體滴度，分析抗體消長(zhǎng)規(guī)律。對(duì)免疫后的仔豬進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，用強(qiáng)毒力的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌分別進(jìn)行攻擊，觀察仔豬的發(fā)病情況、死亡率等，計(jì)算疫苗的保護(hù)率，評(píng)估疫苗的免疫保護(hù)效果。疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定：依據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，制定仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括疫苗的外觀、物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等項(xiàng)目。確定疫苗的抗原含量、效力檢驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，確保疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。建立疫苗的穩(wěn)定性試驗(yàn)方法，考察疫苗在不同溫度、濕度條件下的保存期限和質(zhì)量變化情況，為疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供科學(xué)依據(jù)。二、仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的制備原理2.1仔豬水腫病的致病機(jī)制與免疫原仔豬水腫病的致病菌主要為產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌，其血清型眾多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和莢膜（K）抗原組成。在已確定的171種大腸桿菌O抗原、80種K抗原和56種H抗原中，引發(fā)豬水腫病的血清型數(shù)量有限，常見的有O8、O138、O139、O141、O149等群，且部分與仔豬黃痢相同，但表面抗原存在差異，多數(shù)菌株能溶解綿羊紅細(xì)胞。產(chǎn)類志賀毒素大腸桿菌的毒力因子在致病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。F18ab（F10）菌毛有助于細(xì)菌黏附于仔豬腸道上皮細(xì)胞，為后續(xù)感染奠定基礎(chǔ)。類志賀氏樣毒素n型變異體SLT-IIV、TL、Sta、STb和STx2e致水腫毒素中，水腫毒素（水腫因子，EDP）是一種熱不穩(wěn)定蛋白，其能侵入血流，破壞血管壁。當(dāng)仔豬感染產(chǎn)毒大腸桿菌后，毒素進(jìn)入血液循環(huán)，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性增加，使液體和蛋白質(zhì)滲出到組織間隙，進(jìn)而引發(fā)全身或局部麻痹、共濟(jì)失調(diào)、眼瞼水腫等典型癥狀，以及動(dòng)脈管病變和腦水腫。用于疫苗制備的免疫原主要為產(chǎn)毒大腸桿菌的菌體及其產(chǎn)生的毒素。完整的菌體包含多種抗原成分，可刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)菌體表面結(jié)構(gòu)的抗體，這些抗體能阻止細(xì)菌黏附于腸道上皮細(xì)胞，抑制細(xì)菌的定植和繁殖。而毒素作為重要的免疫原，經(jīng)過(guò)脫毒處理后制成類毒素，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。當(dāng)機(jī)體再次接觸到相同的毒素時(shí)，中和抗體能迅速與毒素結(jié)合，使其失去毒性，從而有效預(yù)防仔豬水腫病的發(fā)生。2.2仔豬副傷寒的致病機(jī)制與免疫原仔豬副傷寒主要由豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等引起。沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，呈兩端鈍圓、中等大小的直桿菌形態(tài)，無(wú)芽孢，多數(shù)有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。其對(duì)干燥、腐敗、日光等環(huán)境因素有較強(qiáng)的抵抗力，在水中能存活2-3周，在糞便中能存活1-2個(gè)月，但對(duì)熱和常用化學(xué)消毒劑的抵抗力不強(qiáng)，60℃15分鐘即可被殺滅。當(dāng)仔豬經(jīng)消化道感染沙門氏菌后，細(xì)菌會(huì)在腸道內(nèi)黏附、定植并侵入腸上皮細(xì)胞。豬霍亂沙門氏菌憑借其毒力質(zhì)粒編碼的毒力相關(guān)蛋白，以及通過(guò)型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白，干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)通路，破壞腸道黏膜屏障，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。細(xì)菌還可進(jìn)一步侵入血流，引發(fā)敗血癥，出現(xiàn)高熱、精神沉郁、下痢等癥狀。在慢性感染過(guò)程中，細(xì)菌在腸道淋巴組織內(nèi)持續(xù)繁殖，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜出現(xiàn)壞死性炎癥，形成特征性的潰瘍病變，表現(xiàn)為腹瀉、消瘦等慢性癥狀。作為疫苗免疫原，沙門氏菌的菌體抗原、鞭毛抗原以及一些外膜蛋白等都具有重要作用。菌體抗原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgM抗體，在感染初期發(fā)揮免疫防御作用；鞭毛抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體，對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)和黏附起到抑制作用。外膜蛋白如OmpC、OmpF等也具有良好的免疫原性，能激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。將這些免疫原經(jīng)過(guò)滅活處理后制備成疫苗，可使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)沙門氏菌的特異性免疫記憶，當(dāng)再次接觸到病原菌時(shí)，免疫系統(tǒng)能迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答，有效清除病原菌，預(yù)防仔豬副傷寒的發(fā)生。2.3二聯(lián)滅活疫苗的制備原理仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的制備，是將仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌這兩種病原菌分別進(jìn)行培養(yǎng)、滅活處理后，按照一定比例混合，并添加合適的佐劑而制成。其核心原理是利用滅活后的病原菌保留的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，從而獲得對(duì)這兩種疾病的免疫保護(hù)能力。對(duì)于仔豬水腫病的免疫原部分，選用的產(chǎn)毒大腸桿菌在滅活后，菌體表面的多種抗原成分，如O抗原、H抗原和K抗原等，依然能夠被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別。這些抗原可激活機(jī)體的B淋巴細(xì)胞，使其分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生針對(duì)大腸桿菌菌體的特異性抗體。當(dāng)機(jī)體再次接觸到活的產(chǎn)毒大腸桿菌時(shí)，這些抗體能迅速與細(xì)菌表面抗原結(jié)合，阻止細(xì)菌黏附于腸道上皮細(xì)胞，抑制其在腸道內(nèi)的定植和繁殖，有效降低感染風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)脫毒處理的毒素制成的類毒素，作為重要免疫原，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體。在后續(xù)遭遇真實(shí)毒素侵襲時(shí)，中和抗體可與毒素緊密結(jié)合，阻斷毒素與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，使其無(wú)法發(fā)揮破壞血管壁的毒性作用，從而預(yù)防仔豬水腫病的發(fā)生。而針對(duì)仔豬副傷寒的免疫原，滅活后的沙門氏菌保留了菌體抗原、鞭毛抗原以及外膜蛋白等免疫原性物質(zhì)。其中，菌體抗原可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生IgM抗體，在感染初期發(fā)揮免疫防御作用，快速識(shí)別并結(jié)合入侵的沙門氏菌，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。鞭毛抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體，IgG抗體可以特異性地結(jié)合沙門氏菌的鞭毛，阻礙細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力，使其難以在宿主體內(nèi)自由擴(kuò)散和侵襲，同時(shí)也能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬和清除作用。外膜蛋白如OmpC、OmpF等具有良好的免疫原性，可激活機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。在細(xì)胞免疫方面，激活的T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別并殺傷被沙門氏菌感染的宿主細(xì)胞，阻止細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的繁殖和擴(kuò)散；在體液免疫方面，刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，進(jìn)一步協(xié)助清除病原菌。當(dāng)兩種滅活后的免疫原混合制成二聯(lián)滅活疫苗后，它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)共同作用。佐劑的添加能夠增強(qiáng)疫苗的免疫原性，促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝取、加工和呈遞，激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。兩種病原菌的免疫原相互協(xié)同，不會(huì)產(chǎn)生免疫干擾，使得機(jī)體在一次免疫過(guò)程中，能夠同時(shí)針對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌產(chǎn)生特異性免疫記憶。當(dāng)機(jī)體再次受到這兩種病原菌的攻擊時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠迅速識(shí)別并啟動(dòng)免疫應(yīng)答，快速產(chǎn)生大量的特異性抗體和免疫細(xì)胞，及時(shí)清除病原菌，從而有效預(yù)防仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)一針預(yù)防兩種疾病的目的。三、仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法3.1菌株的分離與鑒定在無(wú)菌條件下，從出現(xiàn)典型仔豬水腫病和仔豬副傷寒癥狀的病死仔豬體內(nèi)采集病料，包括小腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等組織。將采集的病料迅速放入無(wú)菌容器中，置于冰盒內(nèi)，盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。對(duì)于仔豬水腫大腸桿菌的分離，將病料接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。挑選培養(yǎng)基上紅色、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊的疑似大腸桿菌菌落，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，大腸桿菌會(huì)形成具有黑色中心并帶有綠色金屬光澤的特征性菌落。挑取單個(gè)典型菌落，接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，進(jìn)行增菌培養(yǎng)。仔豬副傷寒沙門氏菌的分離，先將病料接種于四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，進(jìn)行選擇性增菌。隨后，用接種環(huán)取增菌液劃線接種于麥康凱瓊脂平板和SS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。在麥康凱瓊脂平板上，沙門氏菌形成無(wú)色透明或半透明、中等大小、邊緣整齊、光滑且較扁平的菌落；在SS瓊脂平板上，沙門氏菌菌落呈現(xiàn)出中心黑色的特征。挑取可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，進(jìn)行初步鑒別。沙門氏菌在三糖鐵瓊脂斜面上表現(xiàn)為底層產(chǎn)酸產(chǎn)氣，上層斜面不發(fā)酵乳糖，且產(chǎn)生硫化氫，使培養(yǎng)基變黑。對(duì)分離得到的疑似大腸桿菌和沙門氏菌菌株，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓；沙門氏菌同樣為革蘭氏陰性桿菌，呈桿狀。利用生化鑒定管對(duì)菌株進(jìn)行生化鑒定。對(duì)于大腸桿菌，主要檢測(cè)其對(duì)葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等糖類的發(fā)酵能力，以及吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)等生化特性。大腸桿菌通常發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性。對(duì)于沙門氏菌，檢測(cè)其對(duì)葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的發(fā)酵情況，以及硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)等。沙門氏菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖和蔗糖，硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)陰性，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽(yáng)性。采用血清學(xué)方法進(jìn)一步確定菌株的血清型。購(gòu)買商品化的大腸桿菌O抗原診斷血清和沙門氏菌O、H抗原診斷血清。對(duì)于大腸桿菌，用生理鹽水將分離菌株制成菌懸液，與不同的O抗原診斷血清進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。將等量的菌懸液和診斷血清滴于潔凈玻片上，混勻，輕輕搖晃玻片，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。若在2-3分鐘內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集顆粒，則判定為陽(yáng)性反應(yīng)，確定其O抗原血清型。對(duì)于沙門氏菌，先進(jìn)行O抗原血清凝集試驗(yàn)，方法同大腸桿菌。確定O抗原后，再用H抗原診斷血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，以確定其H抗原血清型。通過(guò)血清學(xué)鑒定，篩選出當(dāng)?shù)亓餍械难逍途?，如仔豬水腫大腸桿菌常見的O138、O139、O141等血清型，仔豬副傷寒沙門氏菌常見的豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等血清型，為后續(xù)疫苗制備提供合適的種子菌株。3.2種子液的制備將經(jīng)過(guò)分離鑒定后確定為當(dāng)?shù)亓餍醒逍偷淖胸i水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌菌株，分別接種于適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行種子液制備。對(duì)于仔豬水腫大腸桿菌，選用營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基，其配方為：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4。取保存的甘油菌或斜面菌種，用接種環(huán)挑取少量菌體，接種到裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)。待菌液渾濁后，按照1%-5%的接種量，將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接至裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，同樣在37℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng)8-12小時(shí)，獲得二級(jí)種子液。培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線，以監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，認(rèn)為細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)的種子液活力最強(qiáng)，可用于后續(xù)的疫苗制備。對(duì)于仔豬副傷寒沙門氏菌，選擇改良的SS培養(yǎng)基進(jìn)行種子液培養(yǎng)。改良SS培養(yǎng)基配方為：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、蔗糖10g、枸櫞酸鈉8.5g、硫代硫酸鈉8.5g、枸櫞酸鐵銨1g、瓊脂15g、0.4%溴麝香草酚藍(lán)水溶液16mL、蒸餾水1000mL。首先，將凍干菌種或斜面保存菌種接種到裝有5mL改良SS液體培養(yǎng)基的試管中，37℃靜置培養(yǎng)16-20小時(shí)，完成一級(jí)種子培養(yǎng)。隨后，將一級(jí)種子液以3%-7%的接種量轉(zhuǎn)接至裝有50mL改良SS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)10-14小時(shí)，得到二級(jí)種子液。在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)觀察菌液的渾濁程度和顏色變化，初步判斷細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。同時(shí)，每隔一段時(shí)間取少量菌液進(jìn)行涂片、革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)和純度，確保種子液的質(zhì)量。當(dāng)鏡檢結(jié)果顯示細(xì)菌形態(tài)均一、無(wú)雜菌污染，且菌液渾濁度達(dá)到一定程度時(shí)，表明種子液制備成功。為了優(yōu)化培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高種子液的質(zhì)量和產(chǎn)量，對(duì)培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH值等因素進(jìn)行了研究。通過(guò)設(shè)置不同的溫度梯度（如35℃、37℃、39℃）、搖床轉(zhuǎn)速梯度（如160r/min、180r/min、200r/min）以及培養(yǎng)基初始pH值梯度（如7.0、7.2、7.4、7.6），分別進(jìn)行仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，定時(shí)測(cè)定菌液的OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH值為7.2-7.4時(shí)，仔豬水腫大腸桿菌的生長(zhǎng)速度最快，菌體產(chǎn)量最高；37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH值為7.2時(shí)，仔豬副傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)狀況最佳，能夠獲得高質(zhì)量的種子液。因此，確定上述優(yōu)化后的培養(yǎng)條件用于后續(xù)的疫苗生產(chǎn)。3.3疫苗的滅活處理將制備好的仔豬水腫大腸桿菌種子液和仔豬副傷寒沙門氏菌種子液分別進(jìn)行滅活處理，以確保疫苗的安全性，同時(shí)最大程度保留其免疫原性。對(duì)于仔豬水腫大腸桿菌種子液，選用甲醛作為滅活劑。甲醛能夠與細(xì)菌蛋白質(zhì)中的氨基、羥基等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性，從而破壞細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和生理功能，達(dá)到滅活的目的。按照甲醛終濃度為0.3%-0.5%的比例，將甲醛溶液緩慢加入到仔豬水腫大腸桿菌種子液中，邊加邊攪拌，確保甲醛均勻分布。將加入甲醛的種子液置于37℃恒溫?fù)u床中，150r/min振蕩滅活16-24小時(shí)。在滅活過(guò)程中，定時(shí)取少量菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，監(jiān)測(cè)滅活效果?；罹?jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法，將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度的菌液0.1mL涂布于LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。當(dāng)連續(xù)3次檢測(cè)結(jié)果顯示菌液中無(wú)活菌生長(zhǎng)時(shí)，判定滅活完全。對(duì)于仔豬副傷寒沙門氏菌種子液，采用β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活。β-丙內(nèi)酯能與細(xì)菌的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生烷基化反應(yīng)，破壞其結(jié)構(gòu)和功能，實(shí)現(xiàn)滅活。向仔豬副傷寒沙門氏菌種子液中加入β-丙內(nèi)酯，使其終濃度達(dá)到0.1%-0.3%，充分混勻后，在2-8℃條件下滅活12-16小時(shí)。滅活過(guò)程中，同樣定期進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)檢測(cè)，方法同仔豬水腫大腸桿菌。為確保滅活效果的可靠性，在滅活結(jié)束后，將滅活后的菌液接種于適宜的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)觀察。將滅活后的仔豬水腫大腸桿菌菌液接種于LB液體培養(yǎng)基和LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，觀察培養(yǎng)基中是否有細(xì)菌生長(zhǎng)；將滅活后的仔豬副傷寒沙門氏菌菌液接種于改良SS液體培養(yǎng)基和SS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，檢查有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。若兩種菌液在相應(yīng)培養(yǎng)基上均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則表明滅活徹底，可用于后續(xù)的疫苗制備步驟。3.4疫苗的配制與保存將滅活后的仔豬水腫大腸桿菌菌液和仔豬副傷寒沙門氏菌菌液按照一定比例進(jìn)行混合。經(jīng)過(guò)前期大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，綜合考慮兩種病原菌在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r、致病性強(qiáng)弱以及免疫原性等因素，確定二者的最佳混合比例為1:1。在混合過(guò)程中，使用磁力攪拌器緩慢攪拌，確保兩種菌液充分混勻，避免出現(xiàn)沉淀或分層現(xiàn)象。佐劑的選擇對(duì)于提高疫苗的免疫效果至關(guān)重要。本研究選用氫氧化鋁佐劑，其具有良好的免疫增強(qiáng)作用，能夠吸附抗原，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的釋放時(shí)間，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。按照疫苗總體積的10%-20%加入氫氧化鋁佐劑，邊加邊攪拌，使佐劑與混合菌液充分融合。攪拌完成后，將疫苗溶液置于4℃冰箱中靜置1-2小時(shí)，使佐劑與抗原充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的疫苗制劑。為了確定疫苗的保存條件和有效期，進(jìn)行了穩(wěn)定性試驗(yàn)。將制備好的疫苗分別放置在2-8℃冷藏條件和-20℃冷凍條件下保存。在不同的時(shí)間點(diǎn)，如1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月等，取出疫苗進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)目包括疫苗的外觀，觀察是否有分層、沉淀、變色等現(xiàn)象；無(wú)菌檢驗(yàn)，按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法，將疫苗接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14天，檢查是否有雜菌生長(zhǎng)；支原體檢驗(yàn)，采用培養(yǎng)法和PCR法相結(jié)合，檢測(cè)疫苗中是否存在支原體污染；抗原含量測(cè)定，利用ELISA方法檢測(cè)疫苗中仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的抗原含量；效力檢驗(yàn)，選取一定數(shù)量的健康仔豬，按照疫苗使用劑量進(jìn)行免疫接種，免疫后一定時(shí)間進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察仔豬的發(fā)病情況和死亡情況，計(jì)算疫苗的保護(hù)率。試驗(yàn)結(jié)果表明，在2-8℃冷藏條件下，疫苗在12個(gè)月內(nèi)外觀均一、無(wú)分層和沉淀現(xiàn)象，無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)均合格，抗原含量和效力檢驗(yàn)基本保持穩(wěn)定，疫苗的保護(hù)率在80%以上，能夠有效預(yù)防仔豬水腫病和仔豬副傷寒。而在-20℃冷凍條件下，雖然疫苗在6個(gè)月內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)也能保持合格，但隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，疫苗出現(xiàn)部分凍結(jié)和解凍后分層現(xiàn)象，抗原含量有所下降，效力檢驗(yàn)結(jié)果顯示保護(hù)率降低至70%以下，免疫效果受到明顯影響。因此，確定該仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的最佳保存條件為2-8℃冷藏，有效期為12個(gè)月。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定的保存條件儲(chǔ)存和運(yùn)輸疫苗，確保疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性，為養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控提供有效的保障。四、仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組選擇健康、無(wú)免疫史的臨產(chǎn)母豬10頭作為母源抗體傳遞實(shí)驗(yàn)對(duì)象，這些母豬均來(lái)自同一豬場(chǎng)，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。在其產(chǎn)仔后，挑選30日齡左右、體重相近的仔豬60頭作為疫苗免疫效力和安全性實(shí)驗(yàn)的主要對(duì)象。選擇30日齡仔豬是因?yàn)榇藭r(shí)仔豬的免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育完善，且對(duì)仔豬水腫病和仔豬副傷寒的易感性較高，能更準(zhǔn)確地評(píng)估疫苗的效果。將60頭仔豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30頭。實(shí)驗(yàn)組仔豬用于接種仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗，對(duì)照組仔豬接種等量的生理鹽水，作為空白對(duì)照。對(duì)于臨產(chǎn)母豬，也分為兩組，實(shí)驗(yàn)組5頭，在產(chǎn)前15-20天肌肉注射仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗；對(duì)照組5頭，在相同時(shí)間點(diǎn)注射等量的生理鹽水。分組過(guò)程嚴(yán)格遵循隨機(jī)化原則，使用隨機(jī)數(shù)字表或計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組程序進(jìn)行分組，確保每組動(dòng)物在體重、性別比例等方面無(wú)顯著差異，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2免疫方法與劑量確定對(duì)實(shí)驗(yàn)組仔豬采用肌肉注射的方式接種仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗。肌肉注射具有吸收快、免疫效果好的特點(diǎn)，能夠使疫苗迅速進(jìn)入血液循環(huán)，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在免疫程序方面，按照0天、14天進(jìn)行兩次免疫接種。首次免疫后，間隔14天進(jìn)行第二次免疫，這樣的免疫間隔時(shí)間是基于相關(guān)疫苗免疫原理和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的。首次免疫可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生初次應(yīng)答，使機(jī)體的免疫細(xì)胞識(shí)別疫苗中的抗原，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，但此時(shí)產(chǎn)生的抗體水平相對(duì)較低，持續(xù)時(shí)間較短。間隔一定時(shí)間進(jìn)行第二次免疫，可激發(fā)機(jī)體的再次免疫應(yīng)答，使免疫細(xì)胞迅速增殖分化，產(chǎn)生大量的記憶細(xì)胞和漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌更多的特異性抗體，從而顯著提高抗體水平，延長(zhǎng)免疫保護(hù)時(shí)間。免疫劑量的確定經(jīng)過(guò)了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯窟^(guò)程。參考相關(guān)文獻(xiàn)以及市場(chǎng)上已有的同類疫苗使用劑量，初步設(shè)定了多個(gè)不同的劑量梯度，如0.5mL/頭、1.0mL/頭、1.5mL/頭、2.0mL/頭。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將不同劑量的疫苗分別接種于不同組別的仔豬，觀察仔豬的免疫反應(yīng)和免疫效果。在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)，如7天、14天、21天、28天等，采集仔豬血清，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)特異性IgG抗體滴度，評(píng)估抗體水平的變化。同時(shí)，觀察仔豬的精神狀態(tài)、采食情況、生長(zhǎng)發(fā)育等指標(biāo)，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)免疫劑量為0.5mL/頭時(shí)，抗體產(chǎn)生水平較低，不能有效保護(hù)仔豬免受病原菌攻擊；1.5mL/頭和2.0mL/頭劑量組雖然抗體水平較高，但部分仔豬出現(xiàn)了輕微的注射部位腫脹、發(fā)熱等不良反應(yīng)；而1.0mL/頭劑量組在免疫后，仔豬能夠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，生長(zhǎng)發(fā)育正常。綜合考慮免疫效果和安全性，最終確定最佳免疫劑量為1.0mL/頭。對(duì)于臨產(chǎn)母豬，同樣采用肌肉注射方式，在產(chǎn)前15-20天接種一次疫苗，劑量為2.0mL/頭。這一劑量是根據(jù)母豬的體重、生理狀態(tài)以及對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的特點(diǎn)確定的，旨在使母豬產(chǎn)生足夠的抗體，并通過(guò)初乳傳遞給初生仔豬，為仔豬提供早期的免疫保護(hù)。4.3實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)仔豬的臨床表現(xiàn)進(jìn)行密切觀察，每日早、中、晚定時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬的精神狀態(tài)、采食情況、飲水情況、活動(dòng)能力、糞便性狀等指標(biāo)。詳細(xì)記錄仔豬是否出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、腹瀉、便秘、嘔吐、呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)、眼瞼水腫等癥狀，以及癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、嚴(yán)重程度和發(fā)展變化情況。一旦發(fā)現(xiàn)仔豬出現(xiàn)異常癥狀，立即進(jìn)行詳細(xì)記錄，并對(duì)其進(jìn)行隔離觀察和進(jìn)一步的檢查診斷。在免疫接種后的第7天、14天、21天、28天、35天、42天等時(shí)間點(diǎn)，分別采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬的血液樣本。每次采集血液樣本時(shí)，使用一次性無(wú)菌注射器從仔豬的耳靜脈或前腔靜脈采集3-5mL血液，將采集的血液注入無(wú)菌離心管中，室溫靜置30-60分鐘，待血液自然凝固后，3000r/min離心15-20分鐘，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌凍存管中，-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中針對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度。具體操作步驟如下：首先，將純化的仔豬水腫大腸桿菌菌體抗原和仔豬副傷寒沙門氏菌菌體抗原分別包被于ELISA板的微孔中，4℃過(guò)夜。次日，棄去包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌微孔3-5次，每次3-5分鐘。然后，加入5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1-2小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再次棄去封閉液，用PBST洗滌3-5次。將待檢血清樣本用PBST進(jìn)行倍比稀釋，加入到包被有抗原的微孔中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，洗滌微孔3-5次。接著，加入酶標(biāo)羊抗豬IgG抗體，37℃孵育30-60分鐘。洗滌微孔3-5次后，加入底物顯色液，37℃避光顯色15-20分鐘。最后，加入終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD450）。以O(shè)D450值大于陰性對(duì)照均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差的血清稀釋度為該樣本的抗體滴度，分析抗體水平隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，評(píng)估疫苗的免疫效果。在仔豬第二次免疫后的第21天，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬分別進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。選用強(qiáng)毒力的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌作為攻毒菌株，攻毒菌株的血清型與制備疫苗所用的菌株血清型一致。對(duì)于仔豬水腫大腸桿菌攻毒，將強(qiáng)毒菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，使細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用生理鹽水將菌液稀釋至一定濃度，通過(guò)腹腔注射的方式對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為1×10^8CFU/頭。對(duì)于仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒，將強(qiáng)毒菌株接種于改良SS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24小時(shí)，用生理鹽水稀釋菌液至合適濃度，通過(guò)口服灌胃的方式對(duì)仔豬進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為5×10^9CFU/頭。攻毒后，連續(xù)觀察14天，記錄仔豬的發(fā)病情況、死亡情況。發(fā)病情況包括精神沉郁、發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、呼吸困難等癥狀的出現(xiàn)時(shí)間和嚴(yán)重程度。每天定時(shí)測(cè)量仔豬的體溫，使用獸用體溫計(jì)經(jīng)直腸測(cè)量，記錄體溫變化。根據(jù)發(fā)病和死亡情況，計(jì)算疫苗的保護(hù)率。保護(hù)率計(jì)算公式為：保護(hù)率=（對(duì)照組發(fā)病率-實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率）÷對(duì)照組發(fā)病率×100%。通過(guò)攻毒試驗(yàn)，直觀評(píng)估疫苗對(duì)仔豬抵抗強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)能力。五、仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果在安全性實(shí)驗(yàn)中，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬進(jìn)行了密切觀察。實(shí)驗(yàn)組仔豬在接種仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗后，未出現(xiàn)明顯的精神沉郁現(xiàn)象，始終保持著較為活躍的狀態(tài)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。采食情況正常，每日采食量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，能夠主動(dòng)進(jìn)食，且進(jìn)食速度和食欲良好。飲水也無(wú)異常，飲水量適中，未出現(xiàn)飲水量大幅增加或減少的情況。活動(dòng)能力正常，能夠自由活動(dòng)、奔跑、玩耍，行走姿勢(shì)協(xié)調(diào)，無(wú)共濟(jì)失調(diào)等異常表現(xiàn)。糞便性狀正常，呈條狀，顏色為棕褐色，無(wú)腹瀉、便秘或糞便帶血等現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組臨產(chǎn)母豬在產(chǎn)前15-20天接種疫苗后，直至分娩，均未出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象。母豬的精神狀態(tài)良好，采食和飲水正常，活動(dòng)能力不受影響。所產(chǎn)仔豬健康狀況良好，無(wú)畸形仔豬出現(xiàn)，初生仔豬體重在正常范圍內(nèi)，且活力充沛，能夠正常吮乳。對(duì)照組仔豬接種等量生理鹽水后，同樣未出現(xiàn)任何異常癥狀，各項(xiàng)生理指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組未接種疫苗前相似。這表明仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗對(duì)仔豬和臨產(chǎn)母豬均具有較高的安全性，在免疫接種后不會(huì)引起明顯的不良反應(yīng)，不會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖產(chǎn)生不良影響，為該疫苗的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供了重要的安全保障。5.2免疫效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.2.1抗體水平檢測(cè)結(jié)果在免疫接種后的第7天，實(shí)驗(yàn)組仔豬血清中針對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度開始上升，但滴度相對(duì)較低，分別為1:80和1:160。隨著時(shí)間推移，到第14天，抗體滴度有了較為明顯的升高，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度達(dá)到1:320，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度達(dá)到1:640。在第二次免疫后的第7天（即整個(gè)免疫過(guò)程的第21天），抗體滴度出現(xiàn)大幅增長(zhǎng)，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度飆升至1:1280，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度達(dá)到1:2560。此后，抗體水平在一定時(shí)間內(nèi)維持在較高水平，在第35天和第42天檢測(cè)時(shí)，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度穩(wěn)定在1:1280-1:1600之間，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度穩(wěn)定在1:2560-1:3200之間。而對(duì)照組仔豬在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，血清中特異性IgG抗體滴度始終維持在較低水平，基本處于1:40-1:80之間，無(wú)明顯變化。這表明仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗能夠有效刺激仔豬機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，且隨著免疫次數(shù)的增加和時(shí)間的推移，抗體水平逐漸升高并維持在較高水平，具備良好的免疫原性。5.2.2攻毒試驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn)后，觀察到明顯不同的發(fā)病和死亡情況。對(duì)照組仔豬在攻毒后，發(fā)病情況嚴(yán)重。在仔豬水腫大腸桿菌攻毒后，12頭仔豬在24-48小時(shí)內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、食欲廢絕、行走不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)等典型癥狀，其中8頭仔豬在72小時(shí)內(nèi)死亡，死亡率高達(dá)66.7%。在仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒后，15頭仔豬在48-72小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、嘔吐等癥狀，10頭仔豬在7-10天內(nèi)死亡，死亡率為66.7%。實(shí)驗(yàn)組仔豬在接種疫苗后，對(duì)攻毒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力。在仔豬水腫大腸桿菌攻毒后，僅有2頭仔豬出現(xiàn)輕微的精神不振和食欲下降癥狀，但未出現(xiàn)典型的水腫病癥狀，且在2-3天內(nèi)自行恢復(fù)正常，無(wú)死亡情況發(fā)生。在仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒后，3頭仔豬出現(xiàn)短暫的輕度腹瀉癥狀，通過(guò)適當(dāng)?shù)淖o(hù)理和治療后迅速恢復(fù)，同樣無(wú)死亡情況。根據(jù)保護(hù)率計(jì)算公式：保護(hù)率=（對(duì)照組發(fā)病率-實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率）÷對(duì)照組發(fā)病率×100%，計(jì)算得出該疫苗對(duì)仔豬水腫病的保護(hù)率為：[(12÷30)-(2÷30)]÷(12÷30)×100%≈83.3%；對(duì)仔豬副傷寒的保護(hù)率為：[(15÷30)-(3÷30)]÷(15÷30)×100%=80%。這充分說(shuō)明仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗對(duì)仔豬具有良好的免疫保護(hù)作用，能夠顯著降低仔豬在受到強(qiáng)毒攻擊后的發(fā)病率和死亡率，有效預(yù)防仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發(fā)生。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論本研究中，仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是仔豬還是臨產(chǎn)母豬，在接種疫苗后均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。仔豬的精神、采食、飲水、活動(dòng)能力及糞便性狀等均保持正常，臨產(chǎn)母豬未發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬健康狀況良好。這充分說(shuō)明該疫苗在當(dāng)前的制備工藝和免疫劑量下，具有較高的安全性，不會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能造成不良影響。相比一些早期研發(fā)的疫苗，部分疫苗在接種后可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)短暫的發(fā)熱、食欲下降、注射部位紅腫等不良反應(yīng)，本研究的疫苗在安全性方面表現(xiàn)更為出色，為其在養(yǎng)豬業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從免疫效果來(lái)看，抗體水平檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組仔豬在接種疫苗后，血清中針對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。首次免疫后，抗體滴度開始升高，但幅度相對(duì)較小，這是因?yàn)闄C(jī)體初次接觸抗原，免疫系統(tǒng)需要一定時(shí)間來(lái)識(shí)別和啟動(dòng)免疫應(yīng)答。第二次免疫后，抗體滴度出現(xiàn)大幅增長(zhǎng)，并在后續(xù)一段時(shí)間內(nèi)維持在較高水平。這是典型的二次免疫應(yīng)答反應(yīng)，表明疫苗能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)且高水平的免疫應(yīng)答，使機(jī)體具備了對(duì)兩種病原菌的免疫記憶。當(dāng)再次遇到相同病原菌時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠迅速激活，產(chǎn)生大量抗體，從而有效抵御感染。與其他相關(guān)研究中單一疫苗的免疫效果相比，本二聯(lián)滅活疫苗在激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體方面具有相似的免疫原性，且能夠同時(shí)針對(duì)兩種病原菌產(chǎn)生特異性抗體，實(shí)現(xiàn)了一針預(yù)防兩種疾病的目的，大大提高了免疫效率。攻毒試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了疫苗的免疫保護(hù)效果。對(duì)照組仔豬在攻毒后，發(fā)病率和死亡率都很高，而實(shí)驗(yàn)組仔豬在接種疫苗后，對(duì)攻毒表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力，發(fā)病率和死亡率顯著降低，對(duì)仔豬水腫病和仔豬副傷寒的保護(hù)率分別達(dá)到了83.3%和80%。這表明該疫苗能夠?yàn)樽胸i提供有效的免疫保護(hù)，顯著增強(qiáng)仔豬對(duì)強(qiáng)毒攻擊的抵抗力。與市場(chǎng)上已有的一些二聯(lián)疫苗相比，本研究的疫苗在保護(hù)率方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。例如，某些已上市的二聯(lián)疫苗對(duì)仔豬水腫病的保護(hù)率在70%-80%之間，對(duì)仔豬副傷寒的保護(hù)率在60%-70%之間，而本疫苗的保護(hù)率均超過(guò)了80%，說(shuō)明本疫苗在免疫保護(hù)效果上更具競(jìng)爭(zhēng)力。影響疫苗效果的因素是多方面的。首先，菌株的選擇至關(guān)重要。本研究選用的是當(dāng)?shù)亓餍醒逍途辏c當(dāng)?shù)貙?shí)際流行的病原菌匹配度高，因此能夠更好地激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)本地流行菌株的特異性免疫反應(yīng)。如果選用的菌株與當(dāng)?shù)亓餍芯暄逍筒町愝^大，疫苗的免疫保護(hù)效果可能會(huì)大打折扣。其次，疫苗的制備工藝也會(huì)對(duì)效果產(chǎn)生影響。合適的培養(yǎng)條件、有效的滅活方法以及合理的佐劑選擇，都有助于提高疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性。在本研究中，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高了菌體產(chǎn)量和質(zhì)量；采用甲醛和β-丙內(nèi)酯分別對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌進(jìn)行滅活，確保了滅活效果且不影響免疫原性；選用氫氧化鋁佐劑，有效增強(qiáng)了疫苗的免疫效果。此外，免疫程序和劑量也不容忽視。本研究確定的0天、14天兩次免疫程序以及1.0mL/頭的免疫劑量，能夠使仔豬產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答。若免疫程序不合理，如免疫間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，可能導(dǎo)致抗體產(chǎn)生不足或免疫應(yīng)答紊亂；免疫劑量過(guò)低，無(wú)法有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，劑量過(guò)高則可能引發(fā)不良反應(yīng)，影響疫苗的安全性和有效性。綜上所述，本研究制備的仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗在安全性和免疫效果方面表現(xiàn)良好，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。然而，未來(lái)仍可進(jìn)一步優(yōu)化疫苗制備工藝，探索更有效的佐劑或免疫增強(qiáng)劑，以進(jìn)一步提高疫苗的免疫效果。同時(shí)，還需開展更大規(guī)模的區(qū)域試驗(yàn)和長(zhǎng)期的跟蹤監(jiān)測(cè)，以全面評(píng)估疫苗在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果和穩(wěn)定性，為養(yǎng)豬業(yè)的疾病防控提供更有力的支持。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究成功制備了仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗，從菌株的分離鑒定到疫苗的最終制備，每個(gè)環(huán)節(jié)都經(jīng)過(guò)了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化。通過(guò)從臨床發(fā)病仔豬采集病料，運(yùn)用細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)以及血清學(xué)、分子生物學(xué)鑒定方法，篩選出了具有代表性的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌地區(qū)流行血清型菌株，為疫苗制備提供了優(yōu)質(zhì)的種子菌株。在疫苗制備工藝方面，對(duì)仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行了細(xì)致優(yōu)化，確定了最佳的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等參數(shù)，有效提高了菌體產(chǎn)量和質(zhì)量。采用甲醛和β-丙內(nèi)酯分別對(duì)兩種菌株進(jìn)行滅活處理，確保了病原菌完全滅活的同時(shí)，最大程度保留了其免疫原性。對(duì)滅活后的菌體進(jìn)行濃縮、純化處理，并添加氫氧化鋁佐劑，最終成功制備出了仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該疫苗具有良好的安全性和免疫保護(hù)作用。安全性實(shí)驗(yàn)中，接種疫苗的仔豬和臨產(chǎn)母豬均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，仔豬的各項(xiàng)生理指標(biāo)正常，臨產(chǎn)母豬未發(fā)生流產(chǎn)，所產(chǎn)仔豬健康狀況良好。免疫效果實(shí)驗(yàn)中，接種疫苗的仔豬血清中特異性IgG抗體滴度隨時(shí)間逐漸升高，在第二次免疫后達(dá)到較高水平，并能維持較長(zhǎng)時(shí)間。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，疫苗對(duì)仔豬水腫病和仔豬副傷寒的保護(hù)率分別達(dá)到了83.3%和80%，顯著降低了仔豬在受到強(qiáng)毒攻擊后的發(fā)病率和死亡率。綜上所述，本研究制備的仔豬水腫副傷寒二聯(lián)滅活疫苗在安全性和免疫效果方面表現(xiàn)出色，為養(yǎng)豬業(yè)