臨床微生物檢測的接種、培養(yǎng)、分離純化、

鑒定和保存等要點

接種

將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)

的過程叫做接種。

接種和分離工具

接種針、接種環(huán)、接種鉤、玻璃涂棒、接種圈、接種鋤、小解剖

刀。

常用的接種方法有以下兒種：

1、劃線接種

這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移

動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等C在

斜面接種和平板劃線中就常用此法。

2、三點接種

在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板

表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、

研究它們的形態(tài)。除三點外，也有一點或多點進行接種的。

3、穿刺接種

在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種

時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的

做法是：用接種針蘸取少量的菌和I沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直

線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。

4、澆混接種

該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45°

c左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。

待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。

5、涂布接種

與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌

液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均

勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。

6、液體接種

從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)

物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液

移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。

7、注射接種

該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人

或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，

來預(yù)防某些疾病。

8、活體接種

活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因

為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整

個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞

胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。

注：所有接種必須無菌操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）

在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上,

這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌

操作。

（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種

⑹塞好棉塞。

分離純化

含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（mixed

culture）o如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那

么這個菌落稱為純培養(yǎng)（pureculture）o在進行菌種鑒定時，所用

的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純

化，方法有許多種。

1、傾注平板法

首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好

的保持在40-50。左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液

傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。

單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)

上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。

2、涂布平板法

首先把微生物懸液通過適當?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌

的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻

地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。

3、平板劃線法

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培

養(yǎng)物少許在平板上進行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)

單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

當接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最

后在所劃的線上分散著單個細胞，經(jīng)培養(yǎng),每一個細胞長成一個菌落。

4、富集培養(yǎng)法

富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓

所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他

微生物進行競爭，在生長能力方面遠遠超過其他微生物。如果要分離

一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細胞群體中，使

其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。

5、厭氧法

在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試

管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出

培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進行接種。接種后，加入無菌

的石蠟于培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種

后，利用n2或co2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密

封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌，可以把所分離的樣品接種于

培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

6、單細胞（或單胞子）分離法

是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體

進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體。

個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或

顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個微生物細胞或泡子以獲得純培養(yǎng)。單細胞

分離法對操作技術(shù)有比較高的要求。

培養(yǎng)

1、根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大

類。

好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需

要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過

棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振

蕩，使外界的空氣源源不斷地進入瓶中。

厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧

氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點就是要除去培養(yǎng)

基中的氧氣。

2、根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。

固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合

適的條件下進行微生物培養(yǎng)的方法。

液體培養(yǎng)：在實驗中，通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖，獲

得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

常規(guī)鑒定技術(shù)

形態(tài)學(xué)生理生化學(xué)成基因型系統(tǒng)發(fā)

觀察化試驗分分析分析育分析

■?■S誑3加?■■■■■

脾嘉I

1、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察

(1)微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色，在顯微鏡下對

其形狀、大小、排列方式、細胞結(jié)構(gòu)(包括細胞壁、細胞膜、細胞

核、鞭毛、芽泡等)及染色特性進行觀察，直觀地了解細菌在形態(tài)

結(jié)構(gòu)上特性，根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達到區(qū)別、鑒定

微生物的目的。

(2)細菌細胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細胞群體叫菌落

(colony)o不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖，所形成的菌落

特征有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養(yǎng)特征卻有一

定穩(wěn)定性。以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培

養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。

2、生理生化試驗

微生物生化反應(yīng)：指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生

化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此

微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：

(1)糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能

利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。

(2)淀粉水解試驗

某些細菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄

糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。

(3)v-p試驗

某些細菌在葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮

酸，丙酮酸縮合，脫竣成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空

氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白豚中的胭基生成紅色化合物，

稱V—p(+)反應(yīng)，

(4)甲基紅(methylred)試驗

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙

酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀

酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基ph值下降至ph4.5

以下，使甲基紅指示劑變紅。

(5)靛基質(zhì)(imdole)試驗

某些細菌能分解蛋白陳中的色氨酸，生成口引味?？诠璉味的存在可

用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來?？谝迮c對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰口引

噪，為紅色化合物。

(6)硝酸鹽(nitrate)還原試驗

有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸

鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

(7)明膠(gelatin)液化試驗

有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶)，能將明膠先水解

為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

(8)尿素醐(urease)試驗

有些細菌能產(chǎn)生尿素酎，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使

培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素能不是誘導(dǎo)酶，因為不論底

物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適ph為7.0。

(9)氧化酶(oxidase)試驗

氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼

吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使

對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

(10)硫化氫(H2S)試驗

有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫

化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

（11）三糖鐵（TSI）瓊脂試驗

（12）硫化氫-靛基質(zhì)-動力（sim）瓊脂試驗

3、化學(xué)成分分析

微生物保藏

基本原理是在挑選優(yōu)良純培養(yǎng)物并使其處于休眠狀態(tài)基礎(chǔ)上，

人為地創(chuàng)造一個有利于休眠的環(huán)境，使其長期保存后仍能保持菌種

原有的優(yōu)良特性?；敬胧┦堑蜏?、真空、干燥。

保藏方法：

1、定期移植法

亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，

最適條件卜培養(yǎng)，完成培養(yǎng)于4?6“C進行保存并間隔一定時間（3-6

個月）進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。

2、液體石蠟法

指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)好后注

入滅菌的液體石蠟，