概述

1.維生素B2片含量測定：照高效液相色譜法（通則0512）測定?

1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為

填充劑；以0.Olmol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙月青一甲醇（85：

10：5）為流動相；檢測波長為444nm°理論板數(shù)按維生素峰計算不

低于2000。

1.2測定法避光操作。取本品20片，精密稱定，研細，精密稱

取適量（約相當(dāng)于維生素B?10mg）,置500nli量瓶中，加鹽酸溶液（1T

2）10ml,振搖使維生素B2溶解，加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加

水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，精密量取20ul注入液相電譜

儀，記錄色譜圖；另取維生素B2對照品約10mg,同法測定。按外標法

以峰面積計算，即得。

1.3本品含維生素B2計算，應(yīng)為標示量的90.0%~110.0%。

2.維生素B2片溶出度測定：照溶出度與釋放度測定法（通則C931

第二法）

測定法避光操作。取本品，以冰醋酸3ml與4%氫氧化鈉溶液

18ml用水稀釋至600nli為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，依法操作，

經(jīng)20分鐘時，取溶液10ml,濾過，取續(xù)濾液，照紫外-可分光光度法

（理圖0401）,在444nm的波長處測定吸光度,按G7H別幾的吸收系數(shù)

（七二）為323計算每片的溶出量。限度為標示量的75%,應(yīng)符合規(guī)定。

3.維生素B2片有關(guān)物質(zhì)測定：照高效液相色譜法（通則0512）測

定。

色譜條件照含量測定。

避光操作。取本品的細粉適量（約相當(dāng)于維生素BzlOmg）,置100ml

量瓶中，加鹽酸溶液（lT2）5ml,振搖使維生素B,溶解，加水10ml,

繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供

試品溶液；精密量取1ml,置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，

作為對照溶液。精密量取供試品溶液與對照溶液各20ul,分別注入液

相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液的色

譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的

0.75倍（1.5%）,各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的

1.5倍（3.0%）o供試品溶液色譜圖中小于對照溶液主峰而積0.025

倍的色譜峰忽略不計。

4.工藝處方組成

規(guī)格：5mg

物料名稱基準處方1000片

維生素B25.00g

淀粉30.70g

糊精24.00g

硬脂酸鎂0.30g

45%乙醇溶液21.00g

乙醇(95%)9.75g

純化水11.25g

合計60g

5、儀器基本情況:

設(shè)備名稱XXXX設(shè)備編號XXXX

型號XXXX出廠編號XXXX

出廠日期XXXX安裝位置XXXX

島津國際貿(mào)易（上海

生產(chǎn)廠家日本島津供貨廠家

有限公司）

設(shè)備名稱XXX設(shè)備編號XXXX

型號XXXX出廠編號XXXX

安裝位置XXXX

生產(chǎn)廠家XXX

供貨廠家島津公司

6.相關(guān)術(shù)語：

6.1準確度系指采用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。

一般用回收率（％）表示?；厥章氏薅葢?yīng)在98%?102%之間。

6.2精密度系指在規(guī)定的條件下同一份均勻的供試品，經(jīng)多次取樣測

定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標準偏差或相對標

準偏差表示。

6.3線性系指在設(shè)計的范圍內(nèi)，測定響應(yīng)值與試樣中被測物質(zhì)濃度呈

比例關(guān)系的程度

6.4范圍系指分析方法能達到一定精密度、準確度和線性要求時的高

低限濃度或量的區(qū)間。

6.5檢測限系指試樣中被測物能被檢測出的最低量。

6.6耐用性系指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受

程度。

二.驗證目的

通過臉證以確認所采用的方法適合于維生素B2片的測定。根

據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根

據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件

進行維生素B2片檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗

條件，再進行臉證，直至臉證結(jié)果符合設(shè)立的臉證標準。

三.驗證依據(jù)

中國藥典2015年版二部

中國藥典2015年版四部9101《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)

原則》

四.參考文件

1、驗證管理規(guī)程

2、驗證總計劃

3、SIL-20A高效液相色譜儀操作維護保養(yǎng)規(guī)程

4UV-1800紫外可見分光光度計操作維護保養(yǎng)規(guī)程

5、中國藥典2015年版

6、變更控制規(guī)程

18Ag/ml>20l^g/ml>22pg/ml、24Mg/ml的溶液。

1.2.2測定

精密量取經(jīng)微孔濾膜過濾后各不同濃度稀釋液20uI,注入液相

色譜儀，每個樣品進樣2次，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算。

1.2.3判定標準：維生素B2在16%/ml至24%/ml的濃度范圍內(nèi),維

生素B2峰面積成線性且相關(guān)系數(shù)R299.8%。

1.3維生素B2片含量分析方法精密度驗證

1.3.1流動相配制見維生素B2片含量分析方法線性驗證項下。

1.3.2樣品溶液配制

取維生素B2片20片（XXXX生產(chǎn)），精密稱定，計算平均片重，

研細，精密稱取樣品適量（約相當(dāng)于維生素B210mg）置500ml量瓶

中，鹽酸溶液（（lT2）10ml）振搖使維生素B2溶解，加水20ml,繼

續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過制成20Ng/ml的溶液，

取續(xù)濾液作為樣品溶液。

1.3.3測定

精密量取20nl注入液相色譜儀，記錄邑譜圖，連續(xù)6次，得到維

生素B2峰面積，計算維生素B2峰的S同。

1.3.4判定標準：維生素B2峰面積的S，eW2.0%。

1.4維生素B2片含量分析方法準確度驗證

1.4.1流動相配制、處方量輔料配制見維生素B2片含量分析方法線

性驗證項下。

1.4.2樣品溶液配制

精密稱定維生素B2對照品約25mg,置250nli容量瓶中，加入處

方量混合輔料275mg,加鹽酸溶液（（1T2）10ml）振搖使維生素B2

溶解，加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，

取續(xù)濾液，制成濃度為100Ng/ml的溶液。

按80%、100%、120%的倍數(shù)稀釋，精密量取續(xù)濾液8ml、10ml、

12ml,分別置于50ml容量瓶中，加水配制成濃度為16隨/ml、20吆

/mI、24Mg/mI的測試溶液。

1.4.3測定

精密量取20Hl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，得到維生素B2

峰面積。通過線性方程計算維生素B2濃度。用測得濃度和實際濃度

之比計算回收率。

1.4.4判定標準:回收率限度應(yīng)在98%-102%之間,回收率的九￡2.0%。

1.5維生素B2片含量分析方法范圍險證

1.5.1數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果計算

依據(jù)1.2線性，1.3精密度，1.4準確度，確定高效液相色譜法

符合《中國藥典》2015版維生素B2峰含量的范圍一般為測定濃度的

范圍。

1.5.2判定標準：含量的范圍一般為測定濃度的80%?120%。

1.6維生素B2片含量分析方法專屬性驗證

1.6.1流動相配制、溶劑I配制、處方量輔料配制見維生素B2片含

量分析方法線性驗證項下。

1.6.2溶液配制

1.6.2.1供試品溶液：取維生素B2片（XXXX生產(chǎn)）20片，精密稱定，

計算平均片重，研細，精密稱取樣品（約相當(dāng)于維生素B210mg）,置

500ml量瓶中，加鹽酸溶液（（lT2）10ml）振搖使維生素B2溶解，加

水20mI,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過制成20Ng/ml

的溶液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.6.2.2對照品溶液：精密稱取維生素B2對照品10mg,置500ml量

瓶中,加鹽酸溶液（（1T2）10ml）振搖使維生素B2溶解，加水20ml,

繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，制成20照/ml的對

照品溶液。

1.6.2.3空白溶液：在500ml量瓶中，加鹽酸溶液（（1-2）10ml）振

搖，再加水稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。

1.6.2.4陰性溶液：按照片劑配方，加入處方量混合輔料55mg,置

250nli量瓶中，加鹽酸溶液（（lT2）10ml）,加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分

鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液，作為陰性溶液。

1.6.3測定

精密量取經(jīng)微孔濾膜過濾后的供試品溶液、對照品溶液、空白溶

液、陰性溶液各20uI,注入液相色譜儀，每個樣品進樣2次，記錄

色譜圖。

1.6.4判定標準：維生素B2對照品溶液與樣品溶液主峰保留時間一致,

空白溶液與陰性溶液在主峰保留時間處應(yīng)為平直基線，無吸收峰。

1.7維生素B2片含量分析方法耐用性臉證

1.7.1改變流動相比例

1.7.1.1色譜條件

①固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（C18）;

②檢測器：紫外檢測器，檢測波長444nm;

③流動相：0.Olmol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙聘-田醇

（80：15：5）為流動相

④流速：1.OmL/mino

⑤柱溫：30℃

⑥進樣量：20uLo

照高效液相色譜法（通則0512）測定。

1.7.1.2系統(tǒng)適用性試驗溶液：系統(tǒng)適用性試驗溶液：取維生素B2

對照品10mg,置500ml的容量瓶中，加鹽酸溶液（（1T2）10ml）振

搖使維生素B2溶解，加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻

度，搖勻。溶解并稀釋制成每1ml中各約含20%的溶液，

1.7.1.3取系統(tǒng)適用性試臉溶液2O|1L注入液相色譜儀。

1.7.2改變柱溫及流動相

1.7.2.1色譜條件

①固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（C18）;

②檢測器：紫外檢測器，檢測波長444nm;

③流動相：0.Olmol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙睛-口醇

（85:10:5）為流動相

④流速：1.0mL/min。

⑤柱溫：33℃

⑥進樣量：20RLO

照高效液相色譜法（通則0512）測定。

1.7.1.2系統(tǒng)適用性試驗溶液：取維生素B2對照品10mg,置500ml

的容量瓶中，加鹽酸溶液（（lT2）10ml）振搖使維生素B2溶解，加

水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勺。溶解并稀釋

制成每1ml中各約含維生素B220噸的溶液。

1.7.1.3取系統(tǒng)適用性試驗溶液20uL注入液相色譜儀。

1.7.2.2系統(tǒng)適用性試驗溶液：取維生素B2對照品10mg,置500ml

的容量瓶中，加鹽酸溶液（（lT2）10ml）振搖使維生素B2溶解，加

水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，再加水稀釋至刻度，搖勻。溶解并稀釋

制成每1ml中各約含維生素B220照的溶液。

1.7.2.3取系統(tǒng)適用性試臉溶液20nL注入液相色譜儀。

1.7.3判定標準：在改變流動相比例及改變柱溫后，方法通過系統(tǒng)適

用性試驗，理論板數(shù)按維生素B2峰計算不低于2000o

2.維生素B2片溶出度分析方法驗證

2.1維生素B2片溶出度分析方法線性驗證

照溶出度與釋放度測定法（通則0931第一法（籃法）及紫外分光光

度法測定法測定（通則0401）。

2.1.1溶液配制

2.1.1.1溶出介質(zhì)制備：冰醋酸3nli與4%氫氧化鈉溶液18ml用水稀

釋至600ml為溶出介質(zhì)。

2.1.1.2樣品溶液配制

分別精密稱定維生素B2對照品約6mg、約7mg、約8mg、約9mg、

約10mg,置100ml容量瓶中，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，

分別制成含維生素B2濃度約為6股/ml、7阻/ml、8服/ml、9服/ml、

10l^g/ml的溶液。

2.1.2測定

以溶出介質(zhì)作為空白試臉；照紫外分光光度法，取供試品溶液在

444nm的波長處測定吸光度A,記錄色譜圖。（圖譜附后）

2.1.3判定標準：維生素B2片在6Ng/ml至10Ng/ml的濃度范圍內(nèi)，

維生素B2溶出度吸光度成線性且相關(guān)系數(shù)R299.0%。

2.2維生素B2片溶出度分析方法精密度驗證

2.2.1樣品溶液配制

取維生素B2片1片（XXXX生產(chǎn)），以冰醋酸3ml與4%氫氧化

鈉溶液18ml用水稀釋至600ml為溶出介質(zhì)。照溶出度第一法（通則

0931）測定，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，依法操作。經(jīng)20分鐘時，在漿

葉頂端至液面中心，距溶出杯內(nèi)壁10mm處取溶液10ml,濾過，作為

樣品溶液。

2.2.2測定

取供試品溶液在444nm的波長處測定吸光度A。

2.2.3判定標準：維生素B2片溶出度溶液峰面積的SreW2.0%。

2.3維生素B2片溶出度分析方法耐用性驗證

2.3.1樣品溶液配制

取維生素B2片1片（XXXX生產(chǎn)），以冰醋酸3ml與4%氫氧化鈉

溶液18ml用水稀釋至600ml為溶出介質(zhì)。照溶出度第一法（通則0931）

測定，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，依法操作。經(jīng)20分鐘時，在漿葉頂端

至液面中心，距溶出杯內(nèi)壁10mm處取溶液10ml,濾過，作為樣品溶

液。

2.3.2測定

樣品溶液，在室溫下放置，分別于0、1、2、3、4、5、6小時精

密樣品溶液，在444nm的波長處測定吸光度A。

2.3.3判定標準：溶出度溶液6小時內(nèi)溶液穩(wěn)定，維生素B2片溶出

度溶液峰面積的RSDW2%。

2.4維生素B2片溶出度分析方法準確度臉證

2.4.1處方量原輔料配制

處方量50%原輔料：精密稱定維生素B2對照品2.5mg、淀粉約

15.35mg.糊精約12mg、硬脂酸鎂約0.15mg?；旌?。

處方量80%原輔料：精密稱定維生素B2對照品4mg、淀粉約

24.56mg、糊精約19.2mg>硬脂酸鎂約0.24mgo混合。

處方量100%原輔料：精密稱定維生素B2對照品5mg、淀粉約

30.7mg、糊精約24mg、硬脂酸鎂約0.3mg?；旌?。

2.4.2樣品溶液配制

分別將處方量50%、80%、100%原輔料置溶出杯中，加冰醋酸3ml

與4%氫氧化鈉溶液18ml用水稀釋至600ml為溶出介質(zhì)，照溶出度第

一法（通則0931）測定，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，依法操作。經(jīng)20分

鐘時，在漿葉頂端至液面中心，距溶出杯內(nèi)壁10mm處取溶液10ml,

濾過，作為樣品溶液。每個濃度水平配制3份。

2.4.3測定

取供試品溶液在444nm的波長處測定吸光度A,記錄色譜圖，得

到維生素B2的吸光度。通過線性方程計算維生素B2濃度。用測得濃

度和實際濃度之比計算回收率。

2.4.4判定標準：回收率應(yīng)為標示量的95%-105%之間，回收率的

Srel<2.5%o

3.維生素B2片有關(guān)物質(zhì)分析方法驗證

3.1系統(tǒng)適用性實驗

3.1.1色譜條件

,?固定廟：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（C18）;

②檢測器：紫外檢測器，檢測波長444nm;

③流動相：0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液：乙臍：

甲醇二85:10:50

④流速：1.OmL/mino

⑤柱溫：30℃

⑥進樣量：20nLo

3.1.2測定方法

按高效液相色譜法（通則0512）測定。

3.1.3溶液配制

取維生素B2對照品10mg,置500ml的容量瓶中，加鹽酸溶液

（（1T2）10HII）振搖使維生素B2溶解，加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，

再加水稀釋至刻度，搖句。溶解并稀釋制成每1ml中各約含20Ng的

溶液。

3.1.4取系統(tǒng)適用性試驗溶液20uL注入液相色譜儀。

3.1.5系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取系統(tǒng)適用性實驗溶液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3.1.6判定標準：理論板數(shù)按維生素B2峰計算不低于2000o

3.2維生素B2片有關(guān)物質(zhì)分析方法專屬性驗證

3.2.1溶液配制

A.處方量輔料：精密稱定淀粉約30.7mg、糊精約24mg、硬脂酸鎂約

0.3mgo混合。

B.供試品溶液：取維生素B2片（XXXXX生產(chǎn)）20片，精密稱定，研

細，精密稱取細粉適量（約相當(dāng)于維生素B210mg）,置100ml的量

瓶中，加鹽酸溶液（1-2）5ml,振搖使維生素B2溶解，加水10ml,

充分振搖勻，使維生素B2溶解并加水稀釋至刻度,搖勻，濾過，取續(xù)濾

液，作為供試品溶液。

C.空白溶液：取已配制的全部處方量輔料，置100ml量瓶中，力口鹽酸

溶液（1T2）5ml,充分振搖勻，加水并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)

濾液，作為儲備液。

3.2.2測定

按高效液相色譜法（通則0512）測定。色譜條件同3.1.1。

精密量取供試品溶液和儲備液各20uI,注入液相色譜儀，記錄

色譜圖。

3.2.3判定標準：維生素B2片在444nm處有吸收峰出現(xiàn)，維生素B2

片的處方量輔料無吸收峰出現(xiàn)，維生素B2片的處方量輔料不干擾有

關(guān)物質(zhì)的檢查。

3.3維生素B2片有關(guān)物質(zhì)分析方法檢測限驗證

3.3.1溶液配制

供試品溶液：見專屬性臉證項下供試品溶液。

樣品溶液：取供試品溶液適量，加水分別配置成lOONg/ml、

50Ng/ml、25kg/ml、12.5kg/ml、2.5Ng/ml、0.25Ng/ml、0.025l-lg/mI

濃度的溶液。

3.3.2測定

按高效液相色譜法(通則0512)測定。色譜條件同3.1.1。

精密量取樣品溶液20口I,注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3.3.3判定標準：當(dāng)S/N73時為檢測限。

3.4維生素B2片有關(guān)物質(zhì)分析方法耐用性臉證

3.4.1溶液配制：

取維生素B2對照品10mg,置500ml的容量瓶中，加鹽酸溶液

((112)10ml)振搖使維生素B2溶解，加水20ml,繼續(xù)振搖數(shù)分鐘，

再加水稀釋至刻度，搖勻。溶解并稀釋制成每1ml中各約含20Ng的

溶液，作為系統(tǒng)適用性實驗溶液。

3.4.2

色譜條件

①'固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(C18);

②檢測器：紫外檢測器，檢測波長444nm;

③流動相：0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液：乙般：

甲醇二85:10:5o

(4)流速：1.OmL/mino

⑤柱溫：33℃

⑥進樣量：20uLo

3.4.3測定

按高效液相色譜法(通則0512)測定。取系統(tǒng)適用性實驗溶

液20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

3.4.4判定標準：

理論板數(shù)按維生素B