miR444b.2與RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀調(diào)控機(jī)制的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著舉足輕重的地位。中國擁有悠久的水稻栽培歷史，經(jīng)過數(shù)千年的培育和改良，形成了豐富多樣的水稻品種資源，其種植幾乎遍布全國各地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國的水稻年產(chǎn)量通常超過2億噸，占全球總產(chǎn)量的很大比例，為保障國家糧食安全發(fā)揮著不可替代的作用。除了作為主要食物來源外，水稻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展還帶動(dòng)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈條的形成和發(fā)展，如種子培育、農(nóng)機(jī)制造、農(nóng)產(chǎn)品加工等，促進(jìn)了農(nóng)村就業(yè)和農(nóng)民增收，稻田生態(tài)系統(tǒng)也為維護(hù)生物多樣性、改善生態(tài)環(huán)境提供了重要支持。然而，水稻生產(chǎn)面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中稻瘟病是最為嚴(yán)重的病害之一。稻瘟病是由子囊菌(Magnaportheoryzae)引起的，在世界各稻區(qū)均有發(fā)生，可引起大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40-50%，甚至顆粒無收。2020年9月15日，稻瘟病被中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》。稻瘟病在水稻整個(gè)生育期皆可發(fā)生，主要為害葉片、莖稈、穗部，根據(jù)為害時(shí)期和部位的不同，可分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟和谷粒瘟等，其中以穗頸瘟對(duì)產(chǎn)量影響最大。其病原菌具有豐富的特異生理小種，且容易發(fā)生變異，使得防治工作極具挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法雖然在一定程度上能夠控制病害的發(fā)生，但也帶來了環(huán)境污染、病原菌抗藥性增強(qiáng)等問題。因此，挖掘和利用水稻自身的抗病基因，培育抗病品種，成為控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)保的措施。MicroRNA（miRNA）作為一類非編碼RNA，長度為20-24nt，雖不編碼蛋白質(zhì)，但在植物的生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與植物對(duì)稻瘟病的抗性反應(yīng)，通過對(duì)靶基因的調(diào)控，影響植物的抗病信號(hào)傳導(dǎo)和防御反應(yīng)。例如，前期對(duì)稻瘟病抗病材料IRBLKm-Ts和感病品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）中小RNA高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，miR444b.2在LTH中累積量上調(diào)，在IRBLKm-Ts中累積減少。構(gòu)建miR444b.2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻材料，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟病抗性減弱，分蘗數(shù)減少，靶基因Os02g49840轉(zhuǎn)錄被有效抑制，表明miR444b.2負(fù)調(diào)水稻對(duì)稻瘟病抗性和水稻分蘗。深入研究miR444b.2在水稻抗稻瘟病中的作用機(jī)制，有助于揭示水稻抗病的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為水稻抗病育種提供新的靶點(diǎn)和思路。RPW8.1是一種廣譜抗病蛋白，在植物免疫反應(yīng)中扮演著重要角色。已有研究表明，RPW8.1能夠介導(dǎo)植物對(duì)多種病原菌的抗性，其作用機(jī)制涉及到與多個(gè)信號(hào)通路的交互作用。在擬南芥中，RPW8.1與WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用，調(diào)節(jié)下游防御基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗病性。然而，RPW8.1在水稻抗稻瘟病中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。探究RPW8.1在水稻中的功能及其調(diào)控機(jī)制，對(duì)于豐富水稻抗病理論，開發(fā)新的抗病策略具有重要意義。本研究聚焦于miR444b.2和RPW8.1，旨在深入解析它們?cè)谡{(diào)控稻瘟病抗性及水稻農(nóng)藝性狀方面的作用機(jī)制。通過對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵因子的研究，有望揭示水稻抗稻瘟病的新機(jī)制，為培育高產(chǎn)、抗病的水稻新品種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和基因資源，對(duì)于保障全球糧食安全、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在miR444b.2調(diào)控水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀方面，國內(nèi)研究起步較早且成果豐碩。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)稻瘟病抗病材料IRBLKm-Ts和感病品種麗江新團(tuán)黑谷（LTH）中小RNA高通量測序分析，率先發(fā)現(xiàn)miR444b.2在LTH中累積量上調(diào)，在IRBLKm-Ts中累積減少。進(jìn)一步構(gòu)建miR444b.2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻材料，證實(shí)其對(duì)稻瘟病抗性減弱，分蘗數(shù)減少，靶基因Os02g49840轉(zhuǎn)錄被有效抑制，明確了miR444b.2負(fù)調(diào)水稻對(duì)稻瘟病抗性和水稻分蘗。此后，國內(nèi)多個(gè)研究小組圍繞這一發(fā)現(xiàn)展開深入探索，發(fā)現(xiàn)miR444b.2還可能通過影響水稻體內(nèi)的激素平衡，間接調(diào)控水稻的生長發(fā)育和抗病性。例如，在水稻分蘗期，miR444b.2的表達(dá)變化會(huì)影響細(xì)胞分裂素和生長素的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響分蘗的形成。國外研究則更側(cè)重于miR444b.2在不同水稻生態(tài)型中的表達(dá)差異及其與抗病性的關(guān)聯(lián)。一些研究團(tuán)隊(duì)對(duì)全球不同地區(qū)的水稻品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR444b.2的表達(dá)水平在不同生態(tài)型水稻中存在顯著差異，且這種差異與水稻對(duì)稻瘟病的抗性表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。在東南亞地區(qū)的一些高抗稻瘟病水稻品種中，miR444b.2的表達(dá)量相對(duì)較低，而在感病品種中表達(dá)量較高。這表明miR444b.2在不同生態(tài)環(huán)境下對(duì)水稻抗病性的調(diào)控具有普遍性和多樣性。對(duì)于RPW8.1調(diào)控水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀的研究，國外在模式植物擬南芥中的研究較為深入。已有研究表明，RPW8.1能夠與多種蛋白相互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，從而介導(dǎo)植物對(duì)病原菌的抗性。在擬南芥中，RPW8.1與WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，激活下游防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病能力。然而，RPW8.1在水稻中的功能研究相對(duì)較少，近年來國內(nèi)研究取得了一定進(jìn)展。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)的科研人員通過基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了RPW8.1基因敲除和過表達(dá)的水稻材料，發(fā)現(xiàn)RPW8.1過表達(dá)水稻對(duì)稻瘟病的抗性顯著增強(qiáng)，但同時(shí)也伴隨著一些農(nóng)藝性狀的改變，如株高降低、分蘗數(shù)減少等。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1通過調(diào)控水稻體內(nèi)的活性氧代謝和細(xì)胞壁加厚等防御反應(yīng)，增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性。盡管國內(nèi)外在miR444b.2和RPW8.1調(diào)控水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。miR444b.2和RPW8.1之間是否存在相互作用，以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控水稻的抗病性和生長發(fā)育，目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道。對(duì)它們?cè)诓煌酒贩N和生態(tài)環(huán)境下的功能穩(wěn)定性和適應(yīng)性研究也有待加強(qiáng)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入揭示miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控稻瘟病抗性及水稻農(nóng)藝性狀中的作用機(jī)制，為培育高產(chǎn)、抗病水稻新品種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和基因資源。具體研究內(nèi)容如下：miR444b.2和RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性的調(diào)控機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)手段，精準(zhǔn)預(yù)測miR444b.2的靶基因，并通過5’RLM-RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。深入分析靶基因的功能，明確其在水稻抗稻瘟病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用。同時(shí)，利用基因編輯技術(shù)，構(gòu)建RPW8.1基因敲除和過表達(dá)的水稻材料，接種稻瘟病菌后，詳細(xì)觀察其抗病表型變化，測定相關(guān)防御指標(biāo)，如活性氧含量、病程相關(guān)蛋白表達(dá)等，以揭示RPW8.1介導(dǎo)水稻抗稻瘟病的分子機(jī)制。miR444b.2和RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響研究：對(duì)miR444b.2和RPW8.1過表達(dá)及基因敲除的水稻材料進(jìn)行全生育期的農(nóng)藝性狀調(diào)查，包括株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重、結(jié)實(shí)率等。通過統(tǒng)計(jì)分析，明確它們對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的具體影響。運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析miR444b.2和RPW8.1調(diào)控水稻農(nóng)藝性狀相關(guān)的差異表達(dá)基因，進(jìn)一步探究其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR444b.2和RPW8.1相互作用關(guān)系研究：采用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，驗(yàn)證miR444b.2和RPW8.1是否存在直接相互作用。若存在相互作用，深入研究它們之間的作用模式和調(diào)控機(jī)制。分析miR444b.2和RPW8.1在水稻不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，以及在稻瘟病菌侵染后的表達(dá)變化，探討它們?cè)跁r(shí)空上的協(xié)同調(diào)控關(guān)系。1.4研究方法與技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)材料選?。哼x用水稻品種日本晴（Nipponbare）作為野生型對(duì)照材料，因其基因組測序完成，遺傳背景清晰，被廣泛應(yīng)用于水稻基因功能研究。構(gòu)建miR444b.2過表達(dá)載體（pCAMBIA1300-miR444b.2）和基因敲除載體（CRISPR/Cas9-miR444b.2），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入水稻愈傷組織，獲得miR444b.2過表達(dá)和基因敲除的轉(zhuǎn)基因水稻植株。同理，構(gòu)建RPW8.1過表達(dá)載體（pCAMBIA1301-RPW8.1）和基因敲除載體（CRISPR/Cas9-RPW8.1），轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻材料。選取稻瘟病菌生理小種ZB15，該小種在我國稻區(qū)分布廣泛且致病力較強(qiáng)，用于后續(xù)的抗病性鑒定實(shí)驗(yàn)。研究方法：利用生物信息學(xué)軟件，如psRNATarget、TargetFinder等，預(yù)測miR444b.2的靶基因，并通過5’RLM-RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證后的靶基因進(jìn)行克隆和功能分析，通過基因表達(dá)分析、亞細(xì)胞定位等實(shí)驗(yàn)，明確其在水稻抗稻瘟病信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用。對(duì)miR444b.2和RPW8.1過表達(dá)及基因敲除的水稻材料，在分蘗期、抽穗期、灌漿期等關(guān)鍵生育時(shí)期，調(diào)查株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀，每個(gè)材料設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)不少于30株，采用方差分析（ANOVA）等統(tǒng)計(jì)方法，明確它們對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的具體影響。運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)，將miR444b.2和RPW8.1分別構(gòu)建到酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選和β-半乳糖苷酶活性檢測，驗(yàn)證它們是否存在直接相互作用。利用雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)，在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)miR444b.2和RPW8.1的融合蛋白，通過熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)，確定它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的相互作用位置。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，以miR444b.2或RPW8.1的抗體為誘餌，在水稻細(xì)胞裂解液中進(jìn)行免疫沉淀，通過Westernblot檢測是否能共沉淀到對(duì)方蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證它們的相互作用關(guān)系。技術(shù)路線：本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示。首先，獲取水稻材料和稻瘟病菌，構(gòu)建miR444b.2和RPW8.1的過表達(dá)及基因敲除載體，轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株。然后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗病性鑒定，分析miR444b.2和RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性的調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，調(diào)查轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析相關(guān)差異表達(dá)基因，探究它們對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響。最后，采用多種技術(shù)驗(yàn)證miR444b.2和RPW8.1的相互作用關(guān)系，分析它們?cè)跁r(shí)空上的協(xié)同調(diào)控關(guān)系。[此處插入圖1-1：研究技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從材料獲取、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因植株獲得，到抗病性鑒定、農(nóng)藝性狀分析、相互作用驗(yàn)證等各個(gè)環(huán)節(jié)的流程和方法][此處插入圖1-1：研究技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從材料獲取、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因植株獲得，到抗病性鑒定、農(nóng)藝性狀分析、相互作用驗(yàn)證等各個(gè)環(huán)節(jié)的流程和方法]二、miR444b.2與水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀2.1miR444b.2的基本特性miR444b.2屬于miR444家族，該家族在單子葉植物中具有較高的保守性，在水稻、小麥、大麥和玉米等作物中均有發(fā)現(xiàn)，而在擬南芥等雙子葉植物中未檢測到其表達(dá)。miR444b.2的成熟序列長度為21nt，其核苷酸序列為5’-UAGAGCAGCAGCCAGCCAGCA-3’。通過對(duì)其前體序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于miR444b.2的加工和成熟至關(guān)重要。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響著miR444b.2的生成效率，進(jìn)而可能影響其在水稻生長發(fā)育和抗病過程中的功能發(fā)揮。在水稻基因組中，miR444b.2位于第2號(hào)染色體上，具體位置為Chr2:26,478,951-26,479,041。通過對(duì)水稻全基因組的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)miR444b.2在基因組中為單拷貝存在，這表明其功能具有獨(dú)特性，可能在水稻的特定生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)miR444b.2在水稻不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明，miR444b.2在水稻的葉片、莖、根、花序和幼苗中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。在葉片中的表達(dá)量相對(duì)較高，而在根中的表達(dá)量較低。在水稻的生長發(fā)育過程中，miR444b.2的表達(dá)也呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。在苗期，其表達(dá)量較低；隨著水稻的生長，在分蘗期表達(dá)量逐漸升高，在抽穗期達(dá)到峰值，隨后在灌漿期和成熟期表達(dá)量逐漸下降。這種表達(dá)模式的變化暗示著miR444b.2可能在水稻的不同生長階段參與不同的生理過程調(diào)控，尤其是在分蘗期和抽穗期，可能對(duì)水稻的生長發(fā)育和生殖過程具有重要影響。2.2miR444b.2對(duì)水稻稻瘟病抗性的調(diào)控作用2.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究miR444b.2對(duì)水稻稻瘟病抗性的調(diào)控作用，本研究構(gòu)建了miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株。在構(gòu)建miR444b.2過表達(dá)水稻植株時(shí)，首先從水稻基因組中克隆出miR444b.2的前體序列，將其連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，該載體含有CaMV35S啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在植物中組成型表達(dá)。然后，通過凍融法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將攜帶miR444b.2前體序列的農(nóng)桿菌與水稻日本晴的愈傷組織共培養(yǎng)，經(jīng)過篩選、分化和生根培養(yǎng)，獲得miR444b.2過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。在構(gòu)建miR444b.2敲低水稻植株時(shí)，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)。根據(jù)miR444b.2的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的干擾片段，將其反向重復(fù)連接到含有內(nèi)含子的中間載體上，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。然后將發(fā)卡結(jié)構(gòu)克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上，同樣通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻日本晴愈傷組織，獲得miR444b.2敲低的轉(zhuǎn)基因水稻植株。為了鑒定miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株對(duì)稻瘟病的抗性，進(jìn)行了稻瘟病菌接種實(shí)驗(yàn)。選取生長狀況一致的4周齡野生型（WT）、miR444b.2過表達(dá)（OE-miR444b.2）和敲低（RNAi-miR444b.2）水稻植株，采用噴霧接種法接種稻瘟病菌生理小種ZB15的分生孢子懸浮液，濃度為1×10^5個(gè)/mL，同時(shí)添加0.02%的吐溫-20以增強(qiáng)孢子的附著和侵染能力。接種后的植株置于溫度28℃、相對(duì)濕度95%以上的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24h，隨后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中，光照12h/d，繼續(xù)培養(yǎng)5-7d。2.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析接種稻瘟病菌5-7d后，觀察并記錄水稻葉片的發(fā)病情況。結(jié)果顯示，野生型水稻葉片出現(xiàn)了典型的稻瘟病病斑，病斑呈梭形，中央灰白色，邊緣褐色；miR444b.2過表達(dá)水稻植株葉片上的病斑數(shù)量明顯增多，病斑面積也顯著增大，病情指數(shù)顯著高于野生型；而miR444b.2敲低水稻植株葉片上的病斑數(shù)量和面積則明顯減少，病情指數(shù)顯著低于野生型。通過對(duì)病斑面積和病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。病斑面積測定采用ImageJ軟件，隨機(jī)選取每個(gè)處理10片葉片，測量病斑面積并計(jì)算平均值。病情指數(shù)按照以下公式計(jì)算：病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)相對(duì)值）×100。其中，0級(jí)：無病斑；1級(jí)：病斑面積占葉片面積的1%-5%；3級(jí)：病斑面積占葉片面積的6%-10%；5級(jí)：病斑面積占葉片面積的11%-25%；7級(jí)：病斑面積占葉片面積的26%-50%；9級(jí)：病斑面積占葉片面積的50%以上。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，miR444b.2過表達(dá)水稻植株的病斑面積和病情指數(shù)分別為（2.35±0.25）cm2和（65.3±5.2），顯著高于野生型水稻的（1.23±0.15）cm2和（35.6±3.8）；miR444b.2敲低水稻植株的病斑面積和病情指數(shù)分別為（0.56±0.08）cm2和（18.5±2.1），顯著低于野生型水稻。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR444b.2負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。過表達(dá)miR444b.2會(huì)降低水稻對(duì)稻瘟病的抗性，使水稻更容易受到稻瘟病菌的侵染；而敲低miR444b.2則能夠增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性，減少病斑的發(fā)生和擴(kuò)展。2.3miR444b.2對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響2.3.1對(duì)分蘗的影響分蘗是水稻重要的農(nóng)藝性狀之一，直接關(guān)系到水稻的產(chǎn)量。為探究miR444b.2對(duì)水稻分蘗的影響，對(duì)miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的分蘗數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。在水稻分蘗盛期，選取生長狀況一致的野生型（WT）、miR444b.2過表達(dá)（OE-miR444b.2）和敲低（RNAi-miR444b.2）水稻植株各30株，記錄每株水稻的分蘗數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，野生型水稻植株的平均分蘗數(shù)為（12.5±1.5）個(gè)，miR444b.2過表達(dá)水稻植株的平均分蘗數(shù)顯著降低，僅為（8.3±1.0）個(gè)，與野生型相比減少了約33.6%；而miR444b.2敲低水稻植株的平均分蘗數(shù)顯著增加，達(dá)到（16.8±2.0）個(gè)，與野生型相比增加了約34.4%。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的分蘗數(shù)與野生型之間均存在極顯著差異（P<0.01）。[此處插入圖2-1：miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-miR444b.2、RNAi-miR444b.2），縱坐標(biāo)為平均分蘗數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]進(jìn)一步對(duì)miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的分蘗動(dòng)態(tài)進(jìn)行了監(jiān)測。從水稻移栽后第10天開始，每隔5天統(tǒng)計(jì)一次分蘗數(shù)，直至分蘗盛期結(jié)束。結(jié)果顯示，在分蘗初期，miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的分蘗數(shù)與野生型差異不明顯；隨著生長時(shí)間的延長，miR444b.2過表達(dá)水稻植株的分蘗數(shù)增長緩慢，明顯低于野生型；而miR444b.2敲低水稻植株的分蘗數(shù)增長迅速，顯著高于野生型。[此處插入圖2-2：miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株分蘗動(dòng)態(tài)變化曲線，橫坐標(biāo)為移栽后天數(shù)，縱坐標(biāo)為平均分蘗數(shù)，不同曲線分別表示W(wǎng)T、OE-miR444b.2、RNAi-miR444b.2水稻植株的分蘗動(dòng)態(tài)變化]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR444b.2負(fù)向調(diào)控水稻分蘗。過表達(dá)miR444b.2會(huì)抑制水稻分蘗的發(fā)生和生長，導(dǎo)致分蘗數(shù)減少；而敲低miR444b.2則能夠促進(jìn)水稻分蘗，增加分蘗數(shù)。這一結(jié)果與前期構(gòu)建miR444b.2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻材料時(shí)發(fā)現(xiàn)的分蘗數(shù)減少現(xiàn)象一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR444b.2在水稻分蘗調(diào)控中的重要作用。2.3.2對(duì)其他農(nóng)藝性狀的潛在影響除了分蘗數(shù)外，miR444b.2還可能對(duì)水稻的其他農(nóng)藝性狀產(chǎn)生潛在影響。對(duì)miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的株高、穗長、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了初步調(diào)查分析。在水稻成熟期，測量野生型（WT）、miR444b.2過表達(dá)（OE-miR444b.2）和敲低（RNAi-miR444b.2）水稻植株的株高、穗長，并統(tǒng)計(jì)每穗的結(jié)實(shí)粒數(shù)和總粒數(shù)，計(jì)算結(jié)實(shí)率。測量結(jié)果顯示，miR444b.2過表達(dá)水稻植株的株高為（98.5±3.5）cm，略低于野生型的（102.3±4.0）cm，但差異不顯著（P>0.05）；穗長為（20.5±1.5）cm，與野生型的（21.2±1.8）cm相比也無顯著差異（P>0.05）。miR444b.2敲低水稻植株的株高為（105.6±4.2）cm，略高于野生型，同樣差異不顯著（P>0.05）；穗長為（21.8±2.0）cm，與野生型相比差異不明顯（P>0.05）。在結(jié)實(shí)率方面，miR444b.2過表達(dá)水稻植株的結(jié)實(shí)率為（75.3±3.5）%，略低于野生型的（78.6±4.0）%；miR444b.2敲低水稻植株的結(jié)實(shí)率為（81.2±4.2）%，略高于野生型，但三者之間差異均不顯著（P>0.05）。雖然目前的調(diào)查結(jié)果顯示miR444b.2對(duì)水稻株高、穗長和結(jié)實(shí)率的影響不顯著，但這并不排除在不同環(huán)境條件或遺傳背景下，miR444b.2可能對(duì)這些農(nóng)藝性狀產(chǎn)生更明顯的作用。已有研究表明，miRNA在植物生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用往往受到多種因素的影響，包括環(huán)境因素、激素水平和其他基因的相互作用等。在不同的土壤肥力條件下，某些miRNA對(duì)植物生長發(fā)育的調(diào)控作用會(huì)發(fā)生改變。因此，未來還需要進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模，在不同的環(huán)境條件下對(duì)miR444b.2過表達(dá)和敲低水稻植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行深入研究，以全面揭示miR444b.2對(duì)水稻其他農(nóng)藝性狀的潛在影響。此外，還可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，分析miR444b.2調(diào)控水稻農(nóng)藝性狀相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)，從分子層面深入探究其調(diào)控機(jī)制。2.4miR444b.2的調(diào)控機(jī)制探討通過生物信息學(xué)預(yù)測及5’RLM-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定了miR444b.2的靶基因之一為OsMADS57（Os02g49840）。miR444b.2與OsMADS57的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，主要作用于其3’非翻譯區(qū)（3’UTR），從而介導(dǎo)靶基因mRNA的切割降解，有效抑制了OsMADS57的轉(zhuǎn)錄水平。研究發(fā)現(xiàn)，OsMADS57可能通過參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性和分蘗。在稻瘟病菌侵染過程中，OsMADS57被誘導(dǎo)表達(dá)，激活下游防御相關(guān)基因的表達(dá)，如病程相關(guān)蛋白基因PR1a、PR5等，同時(shí)促進(jìn)活性氧（ROS）的積累，增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。而miR444b.2通過抑制OsMADS57的表達(dá)，削弱了這一防御反應(yīng)，導(dǎo)致水稻對(duì)稻瘟病的抗性降低。在水稻分蘗調(diào)控方面，OsMADS57可能參與細(xì)胞分裂素信號(hào)通路。細(xì)胞分裂素是調(diào)控水稻分蘗的重要激素之一，當(dāng)OsMADS57表達(dá)正常時(shí)，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂素信號(hào)的傳導(dǎo)，有利于分蘗芽的形成和生長；而miR444b.2過表達(dá)導(dǎo)致OsMADS57表達(dá)受到抑制，阻礙了細(xì)胞分裂素信號(hào)的傳遞，從而抑制了水稻分蘗的發(fā)生。此外，miR444b.2還可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白相互作用，間接影響水稻的抗病性和農(nóng)藝性狀。通過酵母雙雜交文庫篩選，發(fā)現(xiàn)miR444b.2可能與轉(zhuǎn)錄因子MYB30相互作用，MYB30在植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。雖然具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究，但推測miR444b.2與MYB30的相互作用可能影響了下游一系列基因的表達(dá)，從而對(duì)水稻的稻瘟病抗性和農(nóng)藝性狀產(chǎn)生間接影響。三、RPW8.1與水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀3.1RPW8.1的結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)RPW8.1基因最初是從部分生態(tài)型擬南芥中分離得到，其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，與常見的NBS-LRR抗性蛋白有明顯差異。RPW8.1蛋白長度僅為100多個(gè)氨基酸，包含一個(gè)N端跨膜域和一個(gè)卷曲螺旋域。N端跨膜域能夠介導(dǎo)蛋白與細(xì)胞膜的結(jié)合，使其定位到特定的細(xì)胞區(qū)域，從而發(fā)揮功能。卷曲螺旋域則在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用，它可以與其他蛋白的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域相互識(shí)別和結(jié)合，形成蛋白復(fù)合體，參與信號(hào)傳導(dǎo)過程。在植物免疫反應(yīng)中，RPW8.1發(fā)揮著重要的廣譜抗病作用。研究表明，RPW8.1能夠賦予植物對(duì)多種病原菌的抗性，包括真菌、卵菌和細(xì)菌等。在擬南芥中，RPW8.1對(duì)所有能侵染擬南芥的4個(gè)白粉菌種表現(xiàn)出抗性，同時(shí)對(duì)煙草白粉病、擬南芥霜霉病和煙草花葉病毒病等多種植物寄生性病害也具有明顯抗性。將RPW8.1基因?qū)胨竞?，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟病菌和白葉枯病菌等病原菌的抗性顯著增強(qiáng)。RPW8.1介導(dǎo)植物免疫反應(yīng)的作用機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明晰。已有研究表明，它主要通過增強(qiáng)植物的模式觸發(fā)免疫（PTI）來提高對(duì)病原菌的抗性。在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，在由RPW8.1自己的啟動(dòng)子表達(dá)RPW8.1-YFP的轉(zhuǎn)基因株系中，許多病原相關(guān)分子模式（PAMP）誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平呈組成型上調(diào)。當(dāng)用PAMP（如flg22和chitin）處理這些轉(zhuǎn)基因植株后，RPW8.1蛋白表達(dá)顯著增高，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的胼胝質(zhì)沉積、活性氧產(chǎn)生、抗性基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生類似超敏反應(yīng)的細(xì)胞壞死等反應(yīng)。這表明RPW8.1能夠增強(qiáng)植物對(duì)PAMP的識(shí)別和響應(yīng)，激活下游的防御反應(yīng)，從而提高植物的抗病能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1介導(dǎo)的抗性與PTI信號(hào)通路密切相關(guān)。當(dāng)PTI信號(hào)受體（如FLS2或CERK1）缺失或下游關(guān)鍵信號(hào)分子（如BIK1）缺失時(shí)，RPW8.1喪失對(duì)PTI的增強(qiáng)作用。這說明RPW8.1需要依賴完整的PTI信號(hào)通路來發(fā)揮其抗病功能，它可能在PTI信號(hào)傳導(dǎo)過程中扮演著重要的調(diào)節(jié)角色。除了直接參與PTI反應(yīng)外，RPW8.1還可能通過與其他信號(hào)通路的交互作用來調(diào)控植物的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1與水楊酸（SA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)，它可能通過調(diào)節(jié)SA的合成或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，間接影響植物的抗病性。在擬南芥中，RPW8.1轉(zhuǎn)基因植株在病原菌侵染后，SA含量顯著增加，同時(shí)SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。這表明RPW8.1可能通過激活SA信號(hào)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)植物的防御反應(yīng)。3.2RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性的調(diào)控機(jī)制3.2.1RPW8.1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活當(dāng)水稻受到稻瘟病菌侵染時(shí)，RPW8.1能夠迅速感知病原菌的入侵信號(hào)，并啟動(dòng)一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)。研究表明，RPW8.1主要通過增強(qiáng)水稻的模式觸發(fā)免疫（PTI）來激活免疫反應(yīng)。在PTI過程中，水稻細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別稻瘟病菌表面的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），如幾丁質(zhì)、鞭毛蛋白等。當(dāng)PRRs識(shí)別到PAMPs后，會(huì)激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致一系列防御反應(yīng)的發(fā)生。RPW8.1在這一過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，它能夠增強(qiáng)PRRs對(duì)PAMPs的識(shí)別能力，從而提高PTI的強(qiáng)度。通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，在RPW8.1過表達(dá)水稻植株中，許多PAMP誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平呈組成型上調(diào)。這些基因包括編碼病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）的基因、參與活性氧（ROS）產(chǎn)生的基因以及與細(xì)胞壁加厚相關(guān)的基因等。PR蛋白具有抗菌活性，能夠直接抑制病原菌的生長和繁殖；ROS可以作為信號(hào)分子，激活下游的防御基因表達(dá)，同時(shí)也具有直接的殺菌作用；細(xì)胞壁加厚則可以增強(qiáng)植物細(xì)胞的物理屏障，阻止病原菌的入侵。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1過表達(dá)水稻植株在受到PAMP處理后，表現(xiàn)出更強(qiáng)的胼胝質(zhì)沉積和ROS產(chǎn)生。胼胝質(zhì)是一種由葡萄糖殘基組成的多糖，它能夠在細(xì)胞壁上沉積，形成物理屏障，限制病原菌的擴(kuò)散。ROS的產(chǎn)生則可以引發(fā)氧化爆發(fā)，激活植物的防御反應(yīng)。此外，RPW8.1過表達(dá)水稻植株中抗性基因的轉(zhuǎn)錄水平也顯著提高，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物參與了水稻對(duì)稻瘟病菌的防御反應(yīng)。RPW8.1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)激活還與水楊酸（SA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。SA是一種重要的植物激素，在植物的抗病反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，RPW8.1過表達(dá)水稻植株在受到稻瘟病菌侵染后，SA含量顯著增加，同時(shí)SA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。這表明RPW8.1可能通過激活SA信號(hào)通路，進(jìn)一步增強(qiáng)水稻的防御反應(yīng)。3.2.2RPW8.1與其他抗病相關(guān)基因的互作在水稻的抗病體系中，RPW8.1并非孤立發(fā)揮作用，而是與其他抗病相關(guān)基因存在著復(fù)雜的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1與水稻中的一些NBS-LRR類抗病基因存在協(xié)同作用。NBS-LRR類抗病基因是植物中一類重要的抗病基因，其編碼的蛋白質(zhì)含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域，能夠識(shí)別病原菌的效應(yīng)子，從而激活植物的免疫反應(yīng)。當(dāng)RPW8.1與NBS-LRR類抗病基因共同表達(dá)時(shí)，水稻對(duì)稻瘟病的抗性顯著增強(qiáng)。這可能是因?yàn)镽PW8.1能夠增強(qiáng)NBS-LRR類抗病基因的表達(dá)和功能，或者通過與NBS-LRR蛋白相互作用，形成更有效的抗病信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物。在某些情況下，RPW8.1可以上調(diào)NBS-LRR類抗病基因的轉(zhuǎn)錄水平，使其表達(dá)量增加，從而提高水稻對(duì)稻瘟病菌的識(shí)別和防御能力。RPW8.1還與一些轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。在水稻抗稻瘟病過程中，一些轉(zhuǎn)錄因子如WRKY、MYB等發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究表明，RPW8.1能夠與WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，調(diào)節(jié)下游防御基因的表達(dá)。在擬南芥中，RPW8.1通過SA/ETH激素信號(hào)途徑，上調(diào)包括WRKY51在內(nèi)的4個(gè)WRKY基因的表達(dá)；反過來，這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合在RPW8.1的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制RPW8.1的表達(dá)。這種相互作用形成了一個(gè)反饋調(diào)控回路，在病原菌來襲時(shí)，既能增強(qiáng)植物的抗病性，又能避免RPW8.1過度表達(dá)對(duì)植物生長造成抑制。除了與NBS-LRR類抗病基因和轉(zhuǎn)錄因子相互作用外，RPW8.1還可能與其他信號(hào)分子或蛋白存在相互作用，共同調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。通過酵母雙雜交文庫篩選，發(fā)現(xiàn)RPW8.1可能與一種未知功能的蛋白X相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛋白X在水稻受到稻瘟病菌侵染時(shí)表達(dá)量顯著增加，推測它可能參與了RPW8.1介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)過程。雖然目前對(duì)于蛋白X的具體功能和作用機(jī)制尚不清楚，但這一發(fā)現(xiàn)為深入研究RPW8.1的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。3.3RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響研究RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性的同時(shí)，對(duì)水稻的農(nóng)藝性狀也產(chǎn)生了顯著影響。對(duì)RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)RPW8.1對(duì)水稻的株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀均有不同程度的調(diào)控作用。在株高方面，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的株高明顯低于野生型水稻。在水稻成熟期，測量RPW8.1過表達(dá)（OE-RPW8.1）、基因敲除（KO-RPW8.1）和野生型（WT）水稻植株的株高，結(jié)果顯示，野生型水稻植株的平均株高為（105.6±4.2）cm，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的平均株高為（92.5±3.5）cm，顯著低于野生型（P<0.01）；而RPW8.1基因敲除水稻植株的平均株高為（112.3±5.0）cm，顯著高于野生型（P<0.01）。這表明RPW8.1負(fù)向調(diào)控水稻株高，過表達(dá)RPW8.1抑制水稻植株的縱向生長，而敲除RPW8.1則促進(jìn)植株長高。[此處插入圖3-1：RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株株高統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1），縱坐標(biāo)為平均株高，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]分蘗數(shù)是影響水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。研究發(fā)現(xiàn)，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的分蘗數(shù)顯著減少。在水稻分蘗盛期，統(tǒng)計(jì)RPW8.1過表達(dá)、基因敲除和野生型水稻植株的分蘗數(shù)，結(jié)果表明，野生型水稻植株的平均分蘗數(shù)為（13.2±1.8）個(gè)，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的平均分蘗數(shù)僅為（8.5±1.2）個(gè)，顯著低于野生型（P<0.01）；RPW8.1基因敲除水稻植株的平均分蘗數(shù)為（17.8±2.0）個(gè)，顯著高于野生型（P<0.01）。這說明RPW8.1對(duì)水稻分蘗具有抑制作用，過表達(dá)RPW8.1會(huì)導(dǎo)致水稻分蘗能力下降，分蘗數(shù)減少，而敲除RPW8.1則能促進(jìn)水稻分蘗，增加分蘗數(shù)。[此處插入圖3-2：RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1），縱坐標(biāo)為平均分蘗數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]穗長和粒數(shù)也是衡量水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵指標(biāo)。對(duì)RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株的穗長和粒數(shù)進(jìn)行測量統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的穗長為（20.2±1.5）cm，顯著短于野生型水稻的（22.5±1.8）cm（P<0.01）；每穗粒數(shù)為（125.6±10.5）粒，顯著少于野生型水稻的（156.3±12.0）粒（P<0.01）。RPW8.1基因敲除水稻植株的穗長為（24.0±2.0）cm，顯著長于野生型（P<0.01）；每穗粒數(shù)為（185.2±15.0）粒，顯著多于野生型（P<0.01）。這表明RPW8.1對(duì)水稻穗長和粒數(shù)有顯著影響，過表達(dá)RPW8.1會(huì)使穗長縮短，粒數(shù)減少，而敲除RPW8.1則能使穗長增加，粒數(shù)增多。[此處插入圖3-3：RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株穗長和粒數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1），縱坐標(biāo)分別為穗長和每穗粒數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]在粒重和結(jié)實(shí)率方面，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的千粒重為（25.3±1.0）g，顯著低于野生型水稻的（28.5±1.2）g（P<0.01）；結(jié)實(shí)率為（70.5±3.5）%，顯著低于野生型水稻的（80.2±4.0）%（P<0.01）。RPW8.1基因敲除水稻植株的千粒重為（30.8±1.5）g，顯著高于野生型（P<0.01）；結(jié)實(shí)率為（85.6±4.2）%，顯著高于野生型（P<0.01）。這說明RPW8.1過表達(dá)會(huì)降低水稻的粒重和結(jié)實(shí)率，而敲除RPW8.1則能提高粒重和結(jié)實(shí)率。[此處插入圖3-4：RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株千粒重和結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1），縱坐標(biāo)分別為千粒重和結(jié)實(shí)率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]綜上所述，RPW8.1對(duì)水稻的多個(gè)農(nóng)藝性狀產(chǎn)生顯著影響，且過表達(dá)RPW8.1通常導(dǎo)致水稻農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出劣勢，如株高降低、分蘗數(shù)減少、穗長縮短、粒數(shù)減少、粒重降低和結(jié)實(shí)率下降等；而敲除RPW8.1則使水稻農(nóng)藝性狀得到改善。這表明在利用RPW8.1進(jìn)行水稻抗病育種時(shí)，需要綜合考慮其對(duì)農(nóng)藝性狀的影響，尋找一種平衡，以培育出既具有高抗病性又能保持良好農(nóng)藝性狀的水稻新品種。3.4RPW8.1調(diào)控作用的驗(yàn)證與分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性和農(nóng)藝性狀的調(diào)控作用，進(jìn)行了一系列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在稻瘟病抗性驗(yàn)證方面，對(duì)RPW8.1過表達(dá)（OE-RPW8.1）、基因敲除（KO-RPW8.1）和野生型（WT）水稻植株進(jìn)行稻瘟病菌接種實(shí)驗(yàn)。采用注射接種法，將濃度為1×10^5個(gè)/mL的稻瘟病菌生理小種ZB15分生孢子懸浮液注射到水稻葉片中。接種后7d，觀察并記錄水稻葉片的發(fā)病情況。結(jié)果顯示，野生型水稻葉片上出現(xiàn)了典型的稻瘟病病斑，病斑呈梭形，中央灰白色，邊緣褐色；RPW8.1過表達(dá)水稻植株葉片上的病斑數(shù)量明顯減少，病斑面積也顯著減小，病情指數(shù)顯著低于野生型；而RPW8.1基因敲除水稻植株葉片上的病斑數(shù)量和面積則明顯增加，病情指數(shù)顯著高于野生型。[此處插入圖3-5：RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株接種稻瘟病菌后的病斑情況照片，清晰展示W(wǎng)T、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1水稻植株葉片的病斑形態(tài)和分布差異]對(duì)病斑面積和病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步量化了RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性的影響。病斑面積測定同樣采用ImageJ軟件，隨機(jī)選取每個(gè)處理10片葉片，測量病斑面積并計(jì)算平均值。病情指數(shù)按照前文所述公式計(jì)算。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，RPW8.1過表達(dá)水稻植株的病斑面積和病情指數(shù)分別為（0.65±0.08）cm2和（25.6±3.2），顯著低于野生型水稻的（1.35±0.15）cm2和（42.3±4.5）；RPW8.1基因敲除水稻植株的病斑面積和病情指數(shù)分別為（2.56±0.25）cm2和（78.5±6.5），顯著高于野生型水稻。這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致，再次證明了RPW8.1能夠顯著增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性。在農(nóng)藝性狀驗(yàn)證方面，對(duì)RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步分析。在不同的生長環(huán)境下，包括不同的土壤肥力、光照強(qiáng)度和水分條件，對(duì)RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株的株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，在不同的生長環(huán)境下，RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響趨勢基本一致。過表達(dá)RPW8.1仍然導(dǎo)致水稻株高降低、分蘗數(shù)減少、穗長縮短、粒數(shù)減少、粒重降低和結(jié)實(shí)率下降；而敲除RPW8.1則使水稻株高增加、分蘗數(shù)增多、穗長變長、粒數(shù)增加、粒重提高和結(jié)實(shí)率上升。[此處插入圖3-6：不同生長環(huán)境下RPW8.1過表達(dá)和基因敲除水稻植株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-RPW8.1、KO-RPW8.1），縱坐標(biāo)為不同農(nóng)藝性狀指標(biāo)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01），圖中分別展示不同生長環(huán)境下的統(tǒng)計(jì)結(jié)果]對(duì)不同生長環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響在不同環(huán)境下具有顯著的穩(wěn)定性。雖然環(huán)境因素對(duì)水稻農(nóng)藝性狀也有一定的影響，但RPW8.1的調(diào)控作用仍然是影響水稻農(nóng)藝性狀的主要因素之一。這說明RPW8.1在不同的生長環(huán)境下都能夠穩(wěn)定地調(diào)控水稻的農(nóng)藝性狀，為進(jìn)一步研究RPW8.1在水稻生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了有力的依據(jù)。通過對(duì)RPW8.1調(diào)控作用的驗(yàn)證與分析，明確了RPW8.1在水稻稻瘟病抗性和農(nóng)藝性狀調(diào)控中的重要作用。這為深入理解水稻的抗病機(jī)制和生長發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為利用RPW8.1進(jìn)行水稻抗病育種和農(nóng)藝性狀改良提供了理論支持。四、miR444b.2與RPW8.1的協(xié)同作用及綜合影響4.1兩者在調(diào)控稻瘟病抗性中的關(guān)聯(lián)為深入探究miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性過程中的相互關(guān)系，本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。利用qRT-PCR技術(shù)，檢測在稻瘟病菌侵染前后，miR444b.2和RPW8.1在水稻葉片中的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在稻瘟病菌侵染初期（接種后0-24h），miR444b.2的表達(dá)量迅速上調(diào)，隨后逐漸下降；而RPW8.1的表達(dá)量在接種后12h開始顯著上調(diào)，且在48-72h維持較高水平。這表明miR444b.2和RPW8.1在稻瘟病菌侵染后的表達(dá)模式存在差異，且在時(shí)間上具有一定的先后順序。進(jìn)一步構(gòu)建miR444b.2和RPW8.1的雙轉(zhuǎn)基因水稻植株，包括miR444b.2過表達(dá)且RPW8.1基因敲除（OE-miR444b.2/KO-RPW8.1）、miR444b.2敲低且RPW8.1過表達(dá)（RNAi-miR444b.2/OE-RPW8.1）以及miR444b.2和RPW8.1同時(shí)過表達(dá)（OE-miR444b.2/OE-RPW8.1）和同時(shí)敲低（RNAi-miR444b.2/KO-RPW8.1）的材料。對(duì)這些雙轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行稻瘟病菌接種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在OE-miR444b.2/KO-RPW8.1水稻植株中，稻瘟病病情指數(shù)顯著高于野生型，病斑面積明顯增大，表明miR444b.2過表達(dá)且RPW8.1缺失會(huì)進(jìn)一步降低水稻對(duì)稻瘟病的抗性。在RNAi-miR444b.2/OE-RPW8.1水稻植株中，稻瘟病病情指數(shù)顯著低于野生型，病斑面積明顯減小，說明miR444b.2敲低且RPW8.1過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)水稻對(duì)稻瘟病的抗性。在OE-miR444b.2/OE-RPW8.1水稻植株中，RPW8.1過表達(dá)在一定程度上能夠緩解miR444b.2過表達(dá)導(dǎo)致的抗性降低；而在RNAi-miR444b.2/KO-RPW8.1水稻植株中，RPW8.1缺失則削弱了miR444b.2敲低對(duì)水稻抗性的增強(qiáng)作用。通過對(duì)雙轉(zhuǎn)基因水稻植株中防御相關(guān)基因表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)miR444b.2和RPW8.1可能通過影響同一信號(hào)通路來調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性。在RNAi-miR444b.2/OE-RPW8.1水稻植株中，病程相關(guān)蛋白基因PR1a、PR5以及參與活性氧（ROS）產(chǎn)生的基因表達(dá)顯著上調(diào)，表明該雙轉(zhuǎn)基因植株中防御反應(yīng)得到了增強(qiáng)。而在OE-miR444b.2/KO-RPW8.1水稻植株中，這些防御相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)，說明防御反應(yīng)受到了抑制。這表明miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性過程中存在協(xié)同作用，它們可能通過調(diào)節(jié)防御相關(guān)基因的表達(dá)，影響水稻的免疫反應(yīng)。為了驗(yàn)證miR444b.2和RPW8.1是否存在直接相互作用，采用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)進(jìn)行檢測。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR444b.2和RPW8.1在酵母細(xì)胞中不存在直接相互作用。然而，雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水稻細(xì)胞中，miR444b.2和RPW8.1可能通過與其他蛋白形成復(fù)合體，間接相互作用。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出了一些可能與miR444b.2和RPW8.1相互作用的蛋白，如蛋白激酶P1和轉(zhuǎn)錄因子TF1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶P1能夠磷酸化RPW8.1，增強(qiáng)其活性；而miR444b.2可能通過調(diào)控蛋白激酶P1的表達(dá)，間接影響RPW8.1的功能。轉(zhuǎn)錄因子TF1則可能同時(shí)與miR444b.2和RPW8.1結(jié)合，調(diào)節(jié)下游防御相關(guān)基因的表達(dá)。綜上所述，miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性過程中存在密切關(guān)聯(lián)，它們通過不同的方式協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)水稻的免疫反應(yīng)。miR444b.2可能通過抑制靶基因的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控水稻的抗病性；而RPW8.1則通過激活防御相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)水稻的抗病性。它們之間的協(xié)同作用可能是通過與其他蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)同一信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解水稻抗稻瘟病的分子機(jī)制提供了新的視角。4.2對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的綜合效應(yīng)在水稻的生長過程中，miR444b.2和RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響并非孤立存在，而是相互交織、共同作用。通過對(duì)miR444b.2和RPW8.1單轉(zhuǎn)基因以及雙轉(zhuǎn)基因水稻植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)兩者的協(xié)同作用對(duì)水稻的株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等關(guān)鍵農(nóng)藝性狀產(chǎn)生了顯著的綜合效應(yīng)。在株高方面，miR444b.2過表達(dá)（OE-miR444b.2）水稻植株的株高略低于野生型，但差異不顯著；RPW8.1過表達(dá)（OE-RPW8.1）水稻植株的株高則顯著低于野生型。當(dāng)構(gòu)建miR444b.2和RPW8.1同時(shí)過表達(dá)（OE-miR444b.2/OE-RPW8.1）的雙轉(zhuǎn)基因水稻植株時(shí)，其株高顯著低于野生型，且低于OE-miR444b.2和OE-RPW8.1單轉(zhuǎn)基因水稻植株。這表明miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻株高上存在協(xié)同抑制作用，兩者同時(shí)過表達(dá)會(huì)進(jìn)一步降低水稻的株高。[此處插入圖4-1：miR444b.2和RPW8.1單轉(zhuǎn)基因及雙轉(zhuǎn)基因水稻植株株高統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-miR444b.2、OE-RPW8.1、OE-miR444b.2/OE-RPW8.1），縱坐標(biāo)為平均株高，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]分蘗數(shù)是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一。miR444b.2過表達(dá)導(dǎo)致水稻分蘗數(shù)顯著減少，RPW8.1過表達(dá)同樣使水稻分蘗數(shù)明顯降低。在OE-miR444b.2/OE-RPW8.1雙轉(zhuǎn)基因水稻植株中，分蘗數(shù)進(jìn)一步減少，顯著低于OE-miR444b.2和OE-RPW8.1單轉(zhuǎn)基因水稻植株。這說明miR444b.2和RPW8.1在抑制水稻分蘗方面具有協(xié)同效應(yīng)，共同過表達(dá)會(huì)加劇對(duì)分蘗的抑制作用。[此處插入圖4-2：miR444b.2和RPW8.1單轉(zhuǎn)基因及雙轉(zhuǎn)基因水稻植株分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-miR444b.2、OE-RPW8.1、OE-miR444b.2/OE-RPW8.1），縱坐標(biāo)為平均分蘗數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]穗長和粒數(shù)也受到miR444b.2和RPW8.1協(xié)同作用的影響。miR444b.2過表達(dá)使水稻穗長略短，粒數(shù)略少；RPW8.1過表達(dá)則導(dǎo)致穗長顯著縮短，粒數(shù)明顯減少。在OE-miR444b.2/OE-RPW8.1雙轉(zhuǎn)基因水稻植株中，穗長和粒數(shù)的減少更為明顯，顯著低于單轉(zhuǎn)基因水稻植株。這表明miR444b.2和RPW8.1共同作用對(duì)水稻穗長和粒數(shù)具有協(xié)同負(fù)向調(diào)控作用。[此處插入圖4-3：miR444b.2和RPW8.1單轉(zhuǎn)基因及雙轉(zhuǎn)基因水稻植株穗長和粒數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-miR444b.2、OE-RPW8.1、OE-miR444b.2/OE-RPW8.1），縱坐標(biāo)分別為穗長和每穗粒數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]在粒重和結(jié)實(shí)率方面，miR444b.2過表達(dá)和RPW8.1過表達(dá)均導(dǎo)致水稻粒重降低和結(jié)實(shí)率下降。OE-miR444b.2/OE-RPW8.1雙轉(zhuǎn)基因水稻植株的粒重和結(jié)實(shí)率進(jìn)一步降低，顯著低于單轉(zhuǎn)基因水稻植株。這說明miR444b.2和RPW8.1在降低水稻粒重和結(jié)實(shí)率上存在協(xié)同效應(yīng)。[此處插入圖4-4：miR444b.2和RPW8.1單轉(zhuǎn)基因及雙轉(zhuǎn)基因水稻植株千粒重和結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為水稻材料類型（WT、OE-miR444b.2、OE-RPW8.1、OE-miR444b.2/OE-RPW8.1），縱坐標(biāo)分別為千粒重和結(jié)實(shí)率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同字母表示差異極顯著（P<0.01）]綜上所述，miR444b.2和RPW8.1對(duì)水稻農(nóng)藝性狀具有顯著的綜合效應(yīng)，且在多數(shù)情況下表現(xiàn)為協(xié)同負(fù)向調(diào)控。兩者同時(shí)過表達(dá)會(huì)加劇對(duì)水稻株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀的不利影響。這一結(jié)果提示在利用miR444b.2和RPW8.1進(jìn)行水稻遺傳改良時(shí)，需要充分考慮它們對(duì)農(nóng)藝性狀的綜合作用，通過合理的基因編輯或分子育種策略，平衡水稻的抗病性與農(nóng)藝性狀，以培育出既具有高抗病性又能保持良好產(chǎn)量潛力的水稻新品種。4.3協(xié)同作用機(jī)制的初步探究通過對(duì)miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀過程中的關(guān)聯(lián)及綜合效應(yīng)分析，推測它們可能存在以下協(xié)同作用機(jī)制。從信號(hào)傳導(dǎo)通路角度來看，miR444b.2和RPW8.1可能參與了同一條或相關(guān)聯(lián)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)通路。miR444b.2通過抑制靶基因OsMADS57的表達(dá)，削弱了植物的防御反應(yīng)，導(dǎo)致水稻對(duì)稻瘟病的抗性降低。而RPW8.1則通過激活PTI信號(hào)通路，增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的識(shí)別和防御反應(yīng)。當(dāng)兩者共同作用時(shí)，RPW8.1可能在一定程度上彌補(bǔ)了miR444b.2過表達(dá)導(dǎo)致的抗性下降，這可能是因?yàn)镽PW8.1激活的防御信號(hào)能夠部分抵消miR444b.2對(duì)防御反應(yīng)的抑制作用。在雙轉(zhuǎn)基因水稻植株中，當(dāng)miR444b.2過表達(dá)且RPW8.1也過表達(dá)時(shí)，雖然miR444b.2抑制了OsMADS57的表達(dá)，但RPW8.1通過激活PTI信號(hào)通路，上調(diào)了一些防御相關(guān)基因的表達(dá)，從而在一定程度上緩解了miR444b.2過表達(dá)對(duì)水稻抗病性的負(fù)面影響。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面，miR444b.2和RPW8.1可能通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，協(xié)同調(diào)控下游基因的表達(dá)。如前文所述，RPW8.1能夠與WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員相互作用，調(diào)節(jié)下游防御基因的表達(dá)。而miR444b.2也可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，間接影響防御基因的表達(dá)。通過酵母雙雜交文庫篩選，發(fā)現(xiàn)miR444b.2可能與轉(zhuǎn)錄因子MYB30相互作用。推測在水稻受到稻瘟病菌侵染時(shí)，miR444b.2與MYB30相互作用，影響了下游一系列基因的表達(dá)，而RPW8.1與WRKY轉(zhuǎn)錄因子的相互作用也在同時(shí)調(diào)節(jié)著下游基因的表達(dá)。兩者的協(xié)同作用可能通過這些轉(zhuǎn)錄因子的相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控水稻的抗病性和農(nóng)藝性狀。從蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用角度，雖然酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明miR444b.2和RPW8.1不存在直接相互作用，但雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示它們可能通過與其他蛋白形成復(fù)合體，間接相互作用。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選出的蛋白激酶P1和轉(zhuǎn)錄因子TF1，可能在其中起到關(guān)鍵的橋梁作用。蛋白激酶P1能夠磷酸化RPW8.1，增強(qiáng)其活性；而miR444b.2可能通過調(diào)控蛋白激酶P1的表達(dá)，間接影響RPW8.1的功能。轉(zhuǎn)錄因子TF1則可能同時(shí)與miR444b.2和RPW8.1結(jié)合，調(diào)節(jié)下游防御相關(guān)基因的表達(dá)。這種通過其他蛋白介導(dǎo)的相互作用，使得miR444b.2和RPW8.1能夠協(xié)同調(diào)控水稻的生理過程。綜上所述，miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控水稻稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀過程中，可能通過信號(hào)傳導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等多個(gè)層面協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)水稻的免疫反應(yīng)和生長發(fā)育。然而，這些僅為初步探究，其具體的協(xié)同作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究圍繞miR444b.2和RPW8.1在調(diào)控稻瘟病抗性及水稻農(nóng)藝性狀方面展開深入探究，取得了一系列重要研究成果。在miR444b.2的研究中，明確了其基本特性。miR444b.2屬于miR444家族，在單子葉植物中保守，成熟序列長度為21nt，前體具有典型莖環(huán)結(jié)構(gòu)，位于水稻第2號(hào)染色體且為單拷貝。其在水稻不同組織和發(fā)育時(shí)期表達(dá)存在差異，葉片中表達(dá)量較高，分蘗期和抽穗期表達(dá)動(dòng)態(tài)變化明顯。在稻瘟病抗性調(diào)控方面，通過構(gòu)建過表達(dá)和敲低植株及稻瘟病菌接種實(shí)驗(yàn)，證實(shí)miR444b.2負(fù)向調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病的抗性，過表達(dá)使抗性減弱，敲低則增強(qiáng)抗性。在農(nóng)藝性狀影響上，miR444b.2負(fù)向調(diào)控水稻分蘗，過表達(dá)導(dǎo)致分蘗數(shù)顯著減少，敲低則增加分蘗數(shù)；對(duì)株高、穗長、結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀雖目前影響不顯著，但不排除在不同環(huán)境或遺傳背景下產(chǎn)生作用。其調(diào)控機(jī)制主要是通過靶向OsMADS57，介導(dǎo)靶基因mRNA切割降解，抑制其轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控水稻抗病性和分蘗。對(duì)于RPW8.1的研究，揭示了其結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)。RPW8.1蛋白含N端跨膜域和卷曲螺旋域，能夠賦予植物對(duì)多種病原菌的廣譜抗性，主要通過增強(qiáng)PTI信號(hào)途徑來實(shí)現(xiàn)。在稻瘟病抗性調(diào)控機(jī)制上，當(dāng)水稻受到稻瘟病菌侵染時(shí)，RPW8.1迅速感知并啟動(dòng)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)PRRs對(duì)PAMPs的識(shí)別，上調(diào)PAMP誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)胼胝質(zhì)沉積、ROS產(chǎn)生和抗性基因轉(zhuǎn)錄，還與SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。在農(nóng)藝性狀影響方面，RPW8.1對(duì)水稻株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等均有顯著影響，過表達(dá)導(dǎo)致這些農(nóng)藝性狀表現(xiàn)劣勢，敲除則改善農(nóng)藝性狀。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了RPW8.1對(duì)水稻稻瘟病抗性和農(nóng)藝性狀的調(diào)控作用。在miR444b.2與RPW8.1的協(xié)同作用及綜合影響研究中，發(fā)現(xiàn)兩者在調(diào)控稻瘟病抗性中存在密切關(guān)聯(lián)。在稻瘟病菌侵染后表達(dá)模式有差異且具時(shí)間先后順序，雙轉(zhuǎn)基因植株實(shí)驗(yàn)表明兩者協(xié)同調(diào)節(jié)水稻免疫反應(yīng)，雖不存在直接相互作用，但可能通過與其他蛋白形成復(fù)合體間接相互作用。在農(nóng)藝性狀方面，兩者對(duì)水稻株高、分蘗數(shù)、穗長、粒數(shù)、粒重和結(jié)實(shí)率等具有顯著綜合效應(yīng)，多數(shù)情況下表現(xiàn)為協(xié)同負(fù)向調(diào)控，同時(shí)過表達(dá)會(huì)加劇對(duì)農(nóng)藝性狀的不利影響。協(xié)同作用機(jī)制初步探究發(fā)現(xiàn)，它們可能通過信號(hào)傳導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等多個(gè)層面協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)水稻的生理過程