健脾散結(jié)方對(duì)胃癌NLRP3/caspase-1表達(dá)調(diào)控及抗腫瘤機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)108.9萬，位居全球癌癥發(fā)病譜第5位；死亡病例數(shù)為76.9萬，位列癌癥死亡原因第4位。在我國(guó)，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，由于人口基數(shù)大，我國(guó)胃癌新發(fā)病例和死亡病例數(shù)均占全球的約44%，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。早期胃癌患者經(jīng)手術(shù)治療后5年生存率可達(dá)90%以上，但臨床上多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，5年生存率僅為20%-30%。目前，胃癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療對(duì)患者身體創(chuàng)傷較大，且術(shù)后容易出現(xiàn)并發(fā)癥；化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量；放療同樣會(huì)引起局部組織損傷等副作用；靶向治療和免疫治療雖然為部分患者帶來了新的希望，但存在靶點(diǎn)突變、耐藥性以及高昂的治療費(fèi)用等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。NLRP3（NOD-likereceptorfamily,pyrindomaincontaining3）/caspase-1信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，逐漸成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。NLRP3是一種模式識(shí)別受體，可識(shí)別多種內(nèi)源性和外源性危險(xiǎn)信號(hào)，如細(xì)菌毒素、病毒核酸、尿酸結(jié)晶、活性氧（ROS）等。當(dāng)NLRP3被激活后，會(huì)與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）以及caspase-1前體結(jié)合，形成NLRP3炎性小體。caspase-1是NLRP3炎性小體的關(guān)鍵效應(yīng)分子，被激活后可將無活性的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）前體切割為具有生物活性的IL-1β和IL-18，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)。越來越多的研究表明，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸密切相關(guān)。在胃癌組織中，NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平異常改變，并且與胃癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，其高表達(dá)與胃癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示NLRP3可能作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。同時(shí)，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的激活可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制其凋亡。通過抑制NLRP3炎性小體的形成或阻斷caspase-1的活性，能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。然而，目前針對(duì)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的靶向治療研究仍處于探索階段，尚未有成熟的藥物應(yīng)用于臨床。中醫(yī)藥在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其通過多靶點(diǎn)、多途徑的作用方式，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，減輕放化療的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量和生存率。健脾散結(jié)方是中醫(yī)治療胃癌的經(jīng)典方劑之一，由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、薏苡仁、浙貝母、莪術(shù)、白花蛇舌草等多味中藥組成。該方以健脾益氣為基礎(chǔ)，輔以散結(jié)消腫、清熱解毒之法，符合中醫(yī)對(duì)胃癌“本虛標(biāo)實(shí)”病機(jī)的認(rèn)識(shí)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，健脾散結(jié)方中的多種中藥成分具有明確的抗腫瘤活性。黃芪中的黃芪多糖可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用；黨參含有多種皂苷和多糖，能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯等成分可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤血管生成；浙貝母中的貝母生物堿具有明顯的抗腫瘤活性，能夠抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。臨床研究也證實(shí)，健脾散結(jié)方聯(lián)合化療治療胃癌，可顯著提高患者的臨床療效，降低腫瘤標(biāo)志物水平，改善患者的生活質(zhì)量和免疫功能。然而，健脾散結(jié)方發(fā)揮抗腫瘤作用的具體分子機(jī)制尚未完全明確，尤其是其與NLRP3/caspase-1信號(hào)通路之間的關(guān)系，目前鮮見報(bào)道。本研究旨在從胃癌NLRP3/caspase-1的表達(dá)入手，探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制。通過檢測(cè)胃癌患者血液及裸鼠胃癌移植瘤腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平，觀察健脾散結(jié)方對(duì)其表達(dá)的影響，同時(shí)對(duì)胃癌患者接受健脾散結(jié)方治療后的臨床獲益進(jìn)行評(píng)估，從臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面深入探索健脾散結(jié)方可能的抗腫瘤作用靶點(diǎn)。這不僅有助于進(jìn)一步揭示健脾散結(jié)方治療胃癌的作用機(jī)制，豐富中醫(yī)藥治療腫瘤的理論內(nèi)涵，為中醫(yī)臨床治療胃癌提供更科學(xué)的理論依據(jù)；而且有望為開發(fā)新的胃癌治療策略和藥物提供新思路，提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在從胃癌NLRP3/caspase-1的表達(dá)入手，深入探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制。具體而言，通過臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面，觀察健脾散結(jié)方對(duì)胃癌患者血液及裸鼠胃癌移植瘤腫瘤組織中NLRP3、caspase-1表達(dá)水平的影響，并評(píng)估胃癌患者接受健脾散結(jié)方治療后的臨床獲益情況，從而探索健脾散結(jié)方可能的抗腫瘤作用靶點(diǎn)，為中醫(yī)臨床治療胃癌提供更科學(xué)的理論依據(jù)，為開發(fā)新的胃癌治療策略和藥物提供新思路。在研究過程中，本課題的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是多層面研究，將臨床研究與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，全面深入地探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用。通過檢測(cè)胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平，以及觀察健脾散結(jié)方對(duì)患者臨床癥狀、生活質(zhì)量等方面的影響，能夠直接反映該方在人體中的治療效果；同時(shí)，構(gòu)建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，研究健脾散結(jié)方對(duì)瘤組織中NLRP3、caspase-1表達(dá)的影響以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤機(jī)制，使研究結(jié)果更具說服力。二是探索新的作用機(jī)制，目前關(guān)于健脾散結(jié)方治療胃癌的分子機(jī)制研究較少，尤其是其與NLRP3/caspase-1信號(hào)通路之間的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究從這一全新的角度出發(fā)，深入探究健脾散結(jié)方是否通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用，有望發(fā)現(xiàn)健脾散結(jié)方治療胃癌的新靶點(diǎn)和新機(jī)制，豐富中醫(yī)藥治療腫瘤的理論內(nèi)涵。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1胃癌的研究現(xiàn)狀胃癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種基因和信號(hào)通路的異常改變。目前，手術(shù)切除仍是胃癌的主要治療方法，但對(duì)于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療效果不佳，常需結(jié)合化療、放療、靶向治療和免疫治療等綜合治療手段?；熓俏赴┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括氟尿嘧啶類、鉑類、紫杉類等，然而化療藥物的耐藥性和不良反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用。放療可用于局部晚期胃癌的術(shù)前或術(shù)后輔助治療，以及不可切除胃癌的姑息治療，但放療也存在局部組織損傷等副作用。靶向治療針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定靶點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、療效好的特點(diǎn)，如抗人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）靶向藥物曲妥珠單抗，可顯著提高HER-2陽性胃癌患者的生存率。免疫治療通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細(xì)胞，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，在胃癌治療中也取得了一定的療效。盡管胃癌的治療取得了一定進(jìn)展，但患者的總體生存率仍有待提高，因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。1.3.2NLRP3/caspase-1信號(hào)通路與胃癌的研究現(xiàn)狀近年來，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路與胃癌的關(guān)系受到廣泛關(guān)注。大量研究表明，NLRP3炎性小體在胃癌組織和細(xì)胞中異常激活，其激活機(jī)制涉及多種因素。一方面，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的代謝異?？僧a(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，如ROS、線粒體DNA等，這些信號(hào)可激活NLRP3炎性小體。另一方面，腫瘤微環(huán)境中的炎癥因子、細(xì)菌產(chǎn)物等外源性危險(xiǎn)信號(hào)也可通過模式識(shí)別受體激活NLRP3。NLRP3炎性小體激活后，可通過caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。細(xì)胞焦亡是一種程序性壞死，其特征是細(xì)胞膜破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在胃癌中，NLRP3/caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路還可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，影響胃癌的免疫逃逸。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平與胃癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。1.3.3健脾散結(jié)方治療胃癌的研究現(xiàn)狀健脾散結(jié)方作為中醫(yī)治療胃癌的經(jīng)典方劑，在臨床實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，健脾散結(jié)方中的多種中藥成分具有抗腫瘤作用。黃芪中的黃芪多糖可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力；黨參中的黨參多糖可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡；白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯可抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。臨床研究表明，健脾散結(jié)方聯(lián)合化療或放療治療胃癌，可提高患者的臨床療效，減輕放化療的不良反應(yīng)，改善患者的生活質(zhì)量。一項(xiàng)多中心、隨機(jī)對(duì)照研究顯示，健脾散結(jié)方聯(lián)合FOLFOX4化療方案治療晚期胃癌患者，與單純化療組相比，聯(lián)合治療組的疾病控制率更高，患者的生存質(zhì)量明顯改善。此外，健脾散結(jié)方還可調(diào)節(jié)胃癌患者的免疫功能，提高機(jī)體的抵抗力。然而，目前關(guān)于健脾散結(jié)方治療胃癌的分子機(jī)制研究相對(duì)較少，其作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚未完全明確。1.3.4研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于胃癌的研究已取得了豐碩的成果，對(duì)其發(fā)病機(jī)制和治療方法有了更深入的認(rèn)識(shí)。NLRP3/caspase-1信號(hào)通路作為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在胃癌中的作用也逐漸被揭示。健脾散結(jié)方在胃癌治療中的應(yīng)用也積累了一定的臨床經(jīng)驗(yàn)，顯示出良好的治療效果。然而，仍存在一些不足之處。首先，雖然NLRP3/caspase-1信號(hào)通路與胃癌的關(guān)系已被廣泛研究，但該信號(hào)通路在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，尤其是其與其他信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。其次，健脾散結(jié)方治療胃癌的分子機(jī)制研究相對(duì)滯后，缺乏從細(xì)胞和分子水平上對(duì)其作用機(jī)制的深入探討，這限制了健脾散結(jié)方在臨床中的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。此外，目前的研究多集中在單一中藥成分或方劑對(duì)胃癌的作用，而對(duì)于中藥復(fù)方通過多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用治療胃癌的研究相對(duì)較少。本研究旨在從胃癌NLRP3/caspase-1的表達(dá)入手，探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制，有望彌補(bǔ)上述研究的不足，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。二、胃癌與NLRP3/caspase-1的關(guān)系2.1胃癌的概述胃癌是源自胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)，胃癌的新發(fā)病例數(shù)達(dá)到108.9萬，占所有癌癥新發(fā)病例的5.6%，位居全球癌癥發(fā)病譜的第5位；死亡病例數(shù)為76.9萬，占所有癌癥死亡病例的7.7%，在癌癥死亡原因中位列第4位。在我國(guó)，由于人口基數(shù)龐大以及飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣等因素的影響，胃癌的發(fā)病形勢(shì)更為嚴(yán)峻，新發(fā)病例和死亡病例數(shù)均約占全球的44%。男性的胃癌發(fā)病率普遍高于女性，男女發(fā)病比例約為2:1，且發(fā)病年齡多在50歲以上。胃癌的發(fā)病原因較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一。Hp可通過產(chǎn)生尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A（CagA）等毒力因子，損傷胃黏膜上皮細(xì)胞，引發(fā)慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致胃黏膜萎縮、腸上皮化生和異型增生，最終發(fā)展為胃癌。飲食因素在胃癌的發(fā)病中也起著重要作用。長(zhǎng)期攝入高鹽、腌制、熏烤、油炸等食物，這些食物中富含亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，可增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，吸煙、酗酒、肥胖、遺傳因素等也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。家族中有胃癌患者的人群，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于普通人群，這可能與某些遺傳基因突變或多態(tài)性有關(guān)。胃癌早期通常無明顯癥狀，或僅表現(xiàn)出一些非特異性癥狀，如消化不良、上腹部隱痛、噯氣、反酸等，這些癥狀與胃炎、胃潰瘍等良性疾病相似，容易被忽視。隨著病情的進(jìn)展，患者可出現(xiàn)上腹部疼痛加重、食欲減退、消瘦、乏力、惡心、嘔吐、黑便等癥狀。當(dāng)腫瘤侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，還可出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如侵犯胰腺可引起腰背部疼痛，轉(zhuǎn)移至肝臟可出現(xiàn)黃疸、肝區(qū)疼痛，轉(zhuǎn)移至肺部可出現(xiàn)咳嗽、咯血等。臨床上，根據(jù)腫瘤侵犯胃壁的深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，將胃癌分為不同的分期。早期胃癌是指癌組織局限于胃黏膜層或黏膜下層，無論有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，此時(shí)患者經(jīng)手術(shù)治療后5年生存率較高，可達(dá)90%以上。進(jìn)展期胃癌則是指癌組織侵犯肌層或更深層次，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率相對(duì)較低，僅為20%-30%。不同分期的胃癌治療手段有所不同。早期胃癌主要以手術(shù)治療為主，可根據(jù)患者的具體情況選擇內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（EMR）、內(nèi)鏡下黏膜下剝離術(shù)（ESD）或根治性胃切除術(shù)等。對(duì)于進(jìn)展期胃癌，多采用以手術(shù)為主的綜合治療方案，包括術(shù)前新輔助化療、手術(shù)治療、術(shù)后輔助化療、放療、靶向治療和免疫治療等。術(shù)前新輔助化療可使腫瘤縮小，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除率；術(shù)后輔助化療則可殺滅殘留的腫瘤細(xì)胞，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。放療主要用于局部晚期胃癌的術(shù)前或術(shù)后輔助治療，以及不可切除胃癌的姑息治療，可提高局部控制率，緩解癥狀。靶向治療和免疫治療為晚期胃癌患者提供了新的治療選擇，對(duì)于HER-2陽性的胃癌患者，抗HER-2靶向藥物曲妥珠單抗聯(lián)合化療可顯著提高患者的生存率；PD-1抑制劑等免疫治療藥物在部分晚期胃癌患者中也顯示出一定的療效。2.2NLRP3/caspase-1的生物學(xué)特性NLRP3是NOD樣受體（NLR）家族中的重要成員，其基因定位于人染色體1q44。NLRP3蛋白由3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域組成，從N端到C端依次為熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NACHT）以及富含亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR）。PYD結(jié)構(gòu)域能夠與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，從而招募ASC；NACHT結(jié)構(gòu)域則具有ATP酶活性，在NLRP3炎性小體的組裝和激活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用；LRR結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識(shí)別多種危險(xiǎn)信號(hào)，如病原相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）。這些危險(xiǎn)信號(hào)包括細(xì)菌的脂多糖（LPS）、病毒的雙鏈RNA、尿酸結(jié)晶、二氧化硅顆粒、活性氧（ROS）等。當(dāng)細(xì)胞受到這些危險(xiǎn)信號(hào)刺激時(shí)，LRR結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)信號(hào)，從而引發(fā)NLRP3蛋白的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活NLRP3炎性小體。caspase-1是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，屬于caspase家族。它在細(xì)胞內(nèi)通常以無活性的酶原形式（pro-caspase-1）存在。pro-caspase-1包含一個(gè)N端的原結(jié)構(gòu)域（prodomain）以及兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域p20和p10。在NLRP3炎性小體激活過程中，pro-caspase-1通過其原結(jié)構(gòu)域中的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（CARD）與ASC的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，被招募到NLRP3炎性小體復(fù)合物中。隨后，pro-caspase-1發(fā)生自我剪切，裂解為具有活性的p20和p10亞基，二者組裝形成具有催化活性的caspase-1異源四聚體?；罨腸aspase-1具有高度的底物特異性，主要作用是切割無活性的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）前體，使其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18是重要的促炎細(xì)胞因子，它們被釋放到細(xì)胞外后，能夠招募和激活免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，在機(jī)體的免疫防御和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合體，主要由NLRP3、ASC和caspase-1前體組成。在靜息狀態(tài)下，NLRP3、ASC和pro-caspase-1在細(xì)胞內(nèi)呈分散狀態(tài)存在。當(dāng)細(xì)胞受到PAMPs或DAMPs等危險(xiǎn)信號(hào)刺激時(shí)，首先啟動(dòng)“priming”信號(hào)，如LPS與細(xì)胞膜上的Toll樣受體4（TLR4）結(jié)合，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，上調(diào)NLRP3和pro-IL-1β的表達(dá)。接著，細(xì)胞接受“activating”信號(hào)，如細(xì)胞外ATP與細(xì)胞膜上的P2X7受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)K+外流，或ROS的產(chǎn)生增加等，這些信號(hào)可觸發(fā)NLRP3的激活。激活后的NLRP3發(fā)生寡聚化，其PYD結(jié)構(gòu)域與ASC的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，招募ASC。ASC通過其CARD結(jié)構(gòu)域與pro-caspase-1的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，將pro-caspase-1招募到NLRP3炎性小體復(fù)合物中。在復(fù)合物中，pro-caspase-1發(fā)生自我剪切激活，形成有活性的caspase-1?；罨腸aspase-1一方面切割pro-IL-1β和pro-IL-18，使其成熟并釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)；另一方面，caspase-1還可以切割GasderminD（GSDMD），GSDMD被切割后，其N端結(jié)構(gòu)域能夠在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引發(fā)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一種程序性壞死，具有炎癥性的特點(diǎn)，在宿主防御病原體感染以及炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。NLRP3炎癥小體在免疫和炎癥反應(yīng)中處于核心地位，它不僅能夠識(shí)別和清除病原體，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)；而且在許多疾病狀態(tài)下，如感染性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病以及腫瘤等，NLRP3炎癥小體的異常激活會(huì)導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)，從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展。2.3NLRP3/caspase-1在胃癌中的表達(dá)及作用機(jī)制大量研究表明，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。在胃癌組織中，NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平與正常胃黏膜組織相比存在顯著差異。通過免疫組織化學(xué)、Westernblot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分胃癌組織中NLRP3和caspase-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高。例如，有研究對(duì)100例胃癌患者的癌組織和癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示癌組織中NLRP3蛋白的陽性表達(dá)率為75%，顯著高于癌旁組織的30%；caspase-1蛋白的陽性表達(dá)率為68%，也明顯高于癌旁組織的25%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)。在TNM分期較晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，NLRP3和caspase-1的表達(dá)水平往往更高。一項(xiàng)納入567例胃癌患者的研究表明，NLRP3mRNA高表達(dá)的患者其TNM分期更晚，且更容易出現(xiàn)脈管侵犯，提示NLRP3高表達(dá)可能與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。NLRP3/caspase-1信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制較為復(fù)雜，主要與細(xì)胞焦亡、免疫逃逸以及腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)等過程密切相關(guān)。細(xì)胞焦亡是一種由NLRP3/caspase-1介導(dǎo)的程序性壞死，其特征為細(xì)胞膜破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在胃癌細(xì)胞中，NLRP3炎癥小體的激活可導(dǎo)致caspase-1活化，進(jìn)而切割GasderminD（GSDMD），GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞焦亡的作用具有兩面性。一方面，適度的細(xì)胞焦亡可以激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除；另一方面，過度的細(xì)胞焦亡可能導(dǎo)致炎癥微環(huán)境的形成，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供有利條件。在胃癌中，NLRP3/caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。例如，細(xì)胞焦亡過程中釋放的炎癥因子，如IL-1β和IL-18，可招募和激活免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的功能失調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。此外，IL-1β和IL-18還可以刺激腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。免疫逃逸是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視和殺傷的重要機(jī)制，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路在胃癌的免疫逃逸過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，它們?cè)诳鼓[瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。NLRP3炎癥小體激活后產(chǎn)生的IL-1β和IL-18等炎癥因子，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。在胃癌中，這些炎癥因子可能通過多種途徑抑制免疫細(xì)胞的抗腫瘤活性。例如，IL-1β可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）向M2型極化，M2型TAM具有免疫抑制功能，能夠分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。此外，IL-18還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生，Treg細(xì)胞能夠抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性，進(jìn)一步削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞和分子，影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。除了上述調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能和促進(jìn)血管生成外，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路還可以影響腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）的功能。CAF是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，能夠分泌多種細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體激活后產(chǎn)生的炎癥因子可以刺激CAF分泌更多的MMPs，如MMP-2和MMP-9，這些MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供便利條件。此外，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的代謝產(chǎn)物，如乳酸、腺苷等，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和免疫細(xì)胞的功能。腫瘤細(xì)胞在無氧糖酵解過程中產(chǎn)生大量乳酸，乳酸可以降低腫瘤微環(huán)境的pH值，抑制免疫細(xì)胞的活性，同時(shí)還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。而NLRP3炎癥小體激活后產(chǎn)生的炎癥因子可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞的代謝，進(jìn)一步影響腫瘤微環(huán)境的組成和功能。三、健脾散結(jié)方的研究基礎(chǔ)3.1健脾散結(jié)方的組成與功效健脾散結(jié)方是基于中醫(yī)理論，針對(duì)胃癌“本虛標(biāo)實(shí)”的病機(jī)特點(diǎn)而精心組方的。其藥物組成主要包括黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、薏苡仁、浙貝母、莪術(shù)、白花蛇舌草等多味中藥。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)。它在方中作為君藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪富含黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類等多種成分。其中，黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，從而提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。同時(shí)，黃芪多糖還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。黃芪皂苷則可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，破壞腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位，促使細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。此外，黃芪還能促進(jìn)腫瘤組織的血管正常化，改善腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)化療藥物的療效。黨參為桔?？浦参稂h參、素花黨參或川黨參的干燥根，味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)。它與黃芪相須為用，輔助黃芪增強(qiáng)補(bǔ)氣健脾之力，作為臣藥在方中發(fā)揮重要作用。黨參含有黨參多糖、黨參皂苷、生物堿、黃酮類等多種化學(xué)成分。黨參多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠提高機(jī)體的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化水平，減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)，黨參多糖還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。黨參皂苷能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分化，并且對(duì)化療藥物具有增效減毒作用，可減輕化療藥物對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)。白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖，味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)。茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)。二者配伍，增強(qiáng)健脾益氣、祛濕利水之功，同樣作為臣藥協(xié)助君藥發(fā)揮作用。白術(shù)主要含有揮發(fā)油、白術(shù)內(nèi)酯、多糖等成分。白術(shù)內(nèi)酯可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡以及抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。白術(shù)多糖則能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體的抵抗力。茯苓含有茯苓多糖、三萜類化合物等成分。茯苓多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。它可激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，同時(shí)還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。三萜類化合物則具有明顯的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。薏苡仁為禾本科植物薏苡的干燥成熟種仁，味甘、淡，性涼，歸脾、胃、肺經(jīng)。它在方中起佐藥作用，具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹、排膿、解毒散結(jié)之功效。薏苡仁富含薏苡仁油、薏苡仁多糖、蛋白質(zhì)等成分。薏苡仁油具有抗腫瘤作用，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移等機(jī)制發(fā)揮作用。研究表明，薏苡仁油能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。薏苡仁多糖則具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和活性。浙貝母為百合科植物浙貝母的干燥鱗莖，味苦，性寒，歸肺、心經(jīng)。其在方中亦為佐藥，功效為清熱化痰、止咳、解毒散結(jié)消癰。浙貝母主要含有貝母生物堿、甾體皂苷等成分。貝母生物堿具有顯著的抗腫瘤活性，能夠抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，貝母生物堿可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。同時(shí)，貝母生物堿還能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸肝、脾經(jīng)。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的干燥全草，味微苦、甘，性寒，歸胃、大腸、小腸經(jīng)。二者均為佐藥，莪術(shù)具有破血行氣、消積止痛之功效，白花蛇舌草具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利濕通淋之功效。莪術(shù)主要含有揮發(fā)油、姜黃素類等成分。揮發(fā)油中的莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等成分具有抗腫瘤作用，可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制腫瘤血管生成等機(jī)制發(fā)揮作用。姜黃素類成分則具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。白花蛇舌草含有多種化學(xué)成分，如黃酮類、萜類、甾醇類等。其提取物具有顯著的抗腫瘤活性，能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用。研究表明，白花蛇舌草中的黃酮類成分可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。全方以黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣，培補(bǔ)后天之本，增強(qiáng)機(jī)體的正氣，提高機(jī)體的抗病能力；以薏苡仁、浙貝母、莪術(shù)、白花蛇舌草散結(jié)消腫、清熱解毒，以消除胃癌之“標(biāo)實(shí)”。諸藥合用，共奏健脾、散結(jié)、抗癌之功效。其理論依據(jù)源于中醫(yī)對(duì)胃癌病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，認(rèn)為胃癌的發(fā)生主要是由于脾胃虛弱，運(yùn)化失常，導(dǎo)致痰濕、瘀血、熱毒等病理產(chǎn)物積聚，日久形成癌腫。因此，治療上應(yīng)以健脾益氣為基礎(chǔ)，輔以散結(jié)消腫、清熱解毒之法，標(biāo)本兼治，以達(dá)到扶正祛邪、治療胃癌的目的。3.2健脾散結(jié)方的抗腫瘤研究現(xiàn)狀近年來，健脾散結(jié)方在胃癌治療領(lǐng)域的研究日益受到關(guān)注，大量研究從不同角度揭示了其抗腫瘤的作用及機(jī)制。在單藥研究方面，眾多實(shí)驗(yàn)表明健脾散結(jié)方能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，健脾散結(jié)方含藥血清可明顯抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含藥血清作用后的胃癌細(xì)胞處于G0/G1期的比例顯著增加，而處于S期和G2/M期的比例明顯減少，表明健脾散結(jié)方可能通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制胃癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步研究其凋亡機(jī)制發(fā)現(xiàn)，健脾散結(jié)方含藥血清可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，從而激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。此外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，給予健脾散結(jié)方灌胃治療后，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積和重量明顯減小，腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制。對(duì)瘤組織進(jìn)行病理切片觀察，可見腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞核固縮、碎裂等。在聯(lián)合其他治療手段方面，健脾散結(jié)方展現(xiàn)出了良好的協(xié)同增效作用。臨床研究表明，健脾散結(jié)方聯(lián)合化療治療晚期胃癌，可顯著提高患者的臨床療效。一項(xiàng)多中心、隨機(jī)對(duì)照研究選取了120例晚期胃癌患者，隨機(jī)分為化療組和聯(lián)合治療組，化療組采用FOLFOX4化療方案，聯(lián)合治療組在化療基礎(chǔ)上加用健脾散結(jié)方。結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的疾病控制率明顯高于化療組，患者的中位生存期也顯著延長(zhǎng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組患者的生活質(zhì)量得到明顯改善，化療相關(guān)不良反應(yīng)如惡心、嘔吐、骨髓抑制等的發(fā)生率明顯降低。在免疫調(diào)節(jié)方面，健脾散結(jié)方聯(lián)合化療能夠調(diào)節(jié)患者的免疫功能，提高機(jī)體的抗腫瘤能力。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD4+/CD8+比值明顯升高，NK細(xì)胞活性增強(qiáng)，而化療組則無明顯變化。這表明健脾散結(jié)方與化療聯(lián)合應(yīng)用，可增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。除了聯(lián)合化療，健脾散結(jié)方與靶向治療聯(lián)合應(yīng)用也取得了一定的研究成果。有研究將健脾散結(jié)方聯(lián)合尼妥珠單抗注射液與同步放化療用于治療胃癌患者，與單純放化療聯(lián)合尼妥珠單抗治療組相比，聯(lián)合健脾散結(jié)方的治療組疾病控制率和有效率均顯著提升。聯(lián)合組患者的癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）等腫瘤標(biāo)志物水平顯著下降，T淋巴細(xì)胞亞群以及NK細(xì)胞水平顯著升高，且KPS評(píng)分顯著升高，不良反應(yīng)總發(fā)生率顯著降低。這提示健脾散結(jié)方聯(lián)合靶向治療可增強(qiáng)對(duì)胃癌的治療效果，降低腫瘤標(biāo)志物水平，調(diào)節(jié)免疫功能，同時(shí)減少不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。在作用機(jī)制研究方面，目前認(rèn)為健脾散結(jié)方主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程，以及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤作用。健脾散結(jié)方中的多種中藥成分可通過抑制腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，如PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。黃芪多糖可抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)，健脾散結(jié)方還可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，如上調(diào)Bax、caspase-3等凋亡蛋白，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲方面，健脾散結(jié)方中的浙貝母生物堿等成分可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在免疫調(diào)節(jié)方面，健脾散結(jié)方不僅能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能。黨參多糖可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能；黃芪多糖還可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，使其向具有抗腫瘤活性的M1型巨噬細(xì)胞極化，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。四、實(shí)驗(yàn)研究：健脾散結(jié)方對(duì)胃癌NLRP3/caspase-1表達(dá)的影響4.1臨床研究4.1.1研究對(duì)象與分組本研究選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]就診的胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：經(jīng)胃鏡活檢及病理組織學(xué)檢查確診為胃癌；年齡在18-75歲之間；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究；體力狀況評(píng)分（ECOG）為0-2分；預(yù)計(jì)生存期大于3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；對(duì)健脾散結(jié)方中的藥物成分過敏；近期接受過免疫治療或其他影響NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的藥物治療；妊娠或哺乳期婦女。共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的胃癌患者60例，同時(shí)選取15例同期在我院進(jìn)行健康體檢的志愿者作為健康對(duì)照。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60例胃癌患者分為對(duì)照組和中藥組，每組各30例。對(duì)照組患者給予常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)支持治療，中藥組患者在營(yíng)養(yǎng)支持治療的基礎(chǔ)上，給予健脾散結(jié)方治療。兩組患者在年齡、性別、腫瘤分期、病理類型等一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。健康對(duì)照組的志愿者在年齡、性別等方面與胃癌患者組相匹配。4.1.2治療方案與樣本采集中藥組患者服用健脾散結(jié)方，該方藥物組成如下：黃芪30g、黨參15g、白術(shù)15g、茯苓15g、薏苡仁30g、浙貝母10g、莪術(shù)10g、白花蛇舌草30g。每日1劑，由醫(yī)院中藥房統(tǒng)一煎煮，每劑煎取400ml，分兩次服用，早晚各一次，28天為一個(gè)周期，連續(xù)服用2個(gè)周期。對(duì)照組患者僅給予營(yíng)養(yǎng)支持治療，包括補(bǔ)充足夠的熱量、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，以維持患者的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。在治療期間，對(duì)兩組患者進(jìn)行密切隨訪，觀察患者的癥狀變化、不良反應(yīng)發(fā)生情況等。于治療前及治療2個(gè)周期后，分別采集兩組患者的外周靜脈血5ml，同時(shí)采集健康對(duì)照組志愿者的外周靜脈血5ml。血液樣本采集后，立即置于EDTA抗凝管中，輕輕顛倒混勻，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分離出血清，將血清分裝后保存于-80℃冰箱中待測(cè)。4.1.3檢測(cè)方法與數(shù)據(jù)分析采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)血清中NLRP3、caspase-1的mRNA表達(dá)水平。具體操作步驟如下：使用TRIzol試劑提取血清中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NLRP3引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；caspase-1引物序列為：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)水平。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將包被有特異性抗體的酶標(biāo)板加入血清樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1h，洗滌后加入酶標(biāo)二抗，37℃孵育30min，再次洗滌后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中NLRP3、caspase-1的蛋白濃度。采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.1.4結(jié)果與討論治療前，對(duì)照組和中藥組胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），與健康組比較，兩組胃癌患者NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P<0.05）。治療2個(gè)周期后，中藥組患者血液中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平與臨床分期呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），即臨床分期越高，其表達(dá)水平越低。在臨床癥狀和生活質(zhì)量方面，治療前對(duì)照組和中藥組胃癌患者中醫(yī)證候評(píng)分、生活質(zhì)量評(píng)分（EORTCQLQ-C30量表）、功能狀態(tài)評(píng)分（KPS）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。治療后，兩組間及組內(nèi)中醫(yī)證候積分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），中藥組中醫(yī)證候積分改善更為明顯。治療后中藥組總健康狀況、疲倦、惡心與嘔吐、失眠、食欲喪失等生活質(zhì)量評(píng)分方面改善優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）；對(duì)照組組內(nèi)比較，僅疲倦癥狀有改善（P<0.05），中藥組組內(nèi)比較在總健康狀況、疲倦、惡心與嘔吐、失眠、食欲喪失、便秘等方面均有改善（P<0.05）。治療后中藥組與對(duì)照組的KPS評(píng)分穩(wěn)定率分別是93.33％、86.67％；有效率分別是53.33％、16.67％，中藥組明顯高于對(duì)照組。健脾散結(jié)方能夠上調(diào)胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平，這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。NLRP3/caspase-1信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其異常激活可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和細(xì)胞焦亡等，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫逃逸。在胃癌患者中，NLRP3、caspase-1表達(dá)水平降低，可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力下降，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。健脾散結(jié)方通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路，上調(diào)其表達(dá)水平，可能增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，健脾散結(jié)方還能夠顯著改善胃癌患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量，提高患者的KPS評(píng)分，這表明該方不僅具有抗腫瘤作用，還能夠減輕患者的痛苦，提高患者的生存質(zhì)量。其作用機(jī)制可能與健脾散結(jié)方調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能、改善患者的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、減輕化療藥物的不良反應(yīng)等因素有關(guān)。本研究結(jié)果為健脾散結(jié)方治療胃癌提供了一定的臨床依據(jù)，但仍存在樣本量較小、觀察時(shí)間較短等局限性，未來需要進(jìn)一步開展大樣本、多中心、長(zhǎng)期隨訪的臨床研究，以深入探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制和臨床療效。4.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與胃癌移植瘤模型構(gòu)建選用SPF級(jí)BALB/c裸鼠，鼠齡6-8周，體重18-22g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)單位名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：[具體許可證號(hào)]。裸鼠飼養(yǎng)于無特殊病原體（SPF）環(huán)境的動(dòng)物房?jī)?nèi)，室內(nèi)溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水，飼料和飲水均經(jīng)過高壓滅菌處理。從液氮中取出SGC-7901胃癌細(xì)胞株，迅速放入37℃水浴中快速復(fù)蘇，待細(xì)胞完全融化后，轉(zhuǎn)移至含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×10?/mL。在裸鼠背部皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液（含8×10?個(gè)細(xì)胞），接種后密切觀察裸鼠的狀態(tài)及腫瘤生長(zhǎng)情況。接種后7-10天，可見裸鼠接種部位皮下出現(xiàn)明顯結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，待腫瘤長(zhǎng)至直徑約0.5-1.0cm時(shí)，認(rèn)為造模成功。通過病理組織學(xué)檢查對(duì)移植瘤進(jìn)行鑒定，取部分腫瘤組織，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確認(rèn)腫瘤組織的來源和性質(zhì)。4.2.2分組與給藥方案將造模成功的荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和中藥組，每組各10只。中藥組每天給予健脾散結(jié)方灌胃，劑量為10g/kg（按照成人臨床用量換算），將健脾散結(jié)方藥材用蒸餾水浸泡30min后，煎煮2次，每次30min，合并兩次煎液，濃縮至所需濃度。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)給藥21天。在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。同時(shí)，密切觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等一般情況，如有裸鼠出現(xiàn)死亡或其他異常情況，及時(shí)記錄并分析原因。4.2.3樣本采集與檢測(cè)指標(biāo)在給藥21天后，處死所有裸鼠，迅速取出腫瘤組織。用預(yù)冷的PBS沖洗腫瘤組織，去除表面的血跡和雜質(zhì)，濾紙吸干水分后，稱取腫瘤重量。取部分腫瘤組織，放入液氮中速凍后，保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)的分子生物學(xué)檢測(cè)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的mRNA表達(dá)水平。具體步驟如下：使用TRIzol試劑提取腫瘤組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。NLRP3引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；caspase-1引物序列為：上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為：上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（western-blot）檢測(cè)腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)水平。將腫瘤組織研磨成勻漿，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃下以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，然后分別加入兔抗鼠NLRP3、caspase-1一抗（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算NLRP3、caspase-1的蛋白相對(duì)表達(dá)量。除了上述指標(biāo)外，還檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)，如腫瘤體積、腫瘤重量、腫瘤生長(zhǎng)抑制率等。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組平均瘤重-中藥組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重×100%。通過這些指標(biāo)綜合評(píng)估健脾散結(jié)方對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。4.2.4結(jié)果與討論實(shí)驗(yàn)過程中，與中藥組相比，對(duì)照組荷瘤裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)更為迅速。從腫瘤體積測(cè)量結(jié)果來看，在第10天、14天、21天，兩組皮下瘤體積比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），中藥組瘤體積相對(duì)較小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兩組腫瘤瘤重比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P<0.05），表明健脾散結(jié)方能夠顯著抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長(zhǎng)。在分子水平上，腫瘤組、瘤周組、中藥組組織中NLRP3mRNA表達(dá)分別為：0.0059±0.002、0.0344±0.006、0.0179±0.005；caspase-1mRNA的表達(dá)分別為：0.0265±0.007、0.1233±0.019、0.0609±0.021。腫瘤組、瘤周組、中藥組NLRP3蛋白灰度值分別為：4755.09±1034.24、9944.47±1590.71、6572.16±1259.48；caspase-1蛋白灰度值分別為：2868.79±340.07、5246.83±1189.15、3998.44±506.03。腫瘤組與瘤周組、腫瘤組與中藥組、中藥組與瘤周組NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤組織中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平低于瘤周組織；中藥組NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平高于腫瘤組。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)NLRP3與caspase-1的表達(dá)水平存在正相關(guān)（P<0.001）。健脾散結(jié)方能夠抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)上調(diào)腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)。這可能是因?yàn)榻∑⑸⒔Y(jié)方通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。NLRP3/caspase-1信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其激活后可通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在本研究中，健脾散結(jié)方可能通過上調(diào)NLRP3、caspase-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。此外，健脾散結(jié)方中的多種中藥成分可能通過協(xié)同作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)過程，進(jìn)一步抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，本研究仍存在一定的局限性，如樣本量較小，研究時(shí)間較短等。未來需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)研究時(shí)間，并深入探討健脾散結(jié)方調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的具體分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。五、健脾散結(jié)方抗腫瘤作用機(jī)制探討5.1基于NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的分析通過臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)健脾散結(jié)方能夠上調(diào)胃癌患者血液及裸鼠胃癌移植瘤腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平。這一結(jié)果提示健脾散結(jié)方可能通過激活NLRP3/caspase-1信號(hào)通路來發(fā)揮抗腫瘤作用。在正常生理狀態(tài)下，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，維持機(jī)體的免疫平衡。然而，在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中，多種因素可導(dǎo)致該信號(hào)通路的異常抑制，使得腫瘤細(xì)胞得以逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和殺傷。健脾散結(jié)方中的多種中藥成分可能通過不同途徑調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路，從而恢復(fù)其正常功能。黃芪中的黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視能力，間接影響NLRP3/caspase-1信號(hào)通路。研究表明，黃芪多糖能夠激活巨噬細(xì)胞，使其分泌更多的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些細(xì)胞因子可以作為危險(xiǎn)信號(hào)，激活NLRP3炎性小體，進(jìn)而促進(jìn)caspase-1的活化，增強(qiáng)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的活性。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，影響NLRP3/caspase-1信號(hào)通路。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，而ROS可作為DAMPs激活NLRP3炎性小體。白術(shù)內(nèi)酯具有抗氧化作用，能夠清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低時(shí)，NLRP3炎性小體的激活受到抑制。白術(shù)內(nèi)酯可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，使其維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶瑥亩苊釴LRP3炎性小體的過度激活或抑制，保證NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的正常功能。從細(xì)胞焦亡的角度來看，健脾散結(jié)方上調(diào)NLRP3/caspase-1的表達(dá)可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生焦亡。細(xì)胞焦亡是一種程序性壞死，具有炎癥性的特點(diǎn)。在胃癌中，NLRP3/caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。當(dāng)健脾散結(jié)方上調(diào)NLRP3/caspase-1表達(dá)后，caspase-1被激活，進(jìn)而切割GasderminD（GSDMD）。GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上打孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引發(fā)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡過程中釋放的炎癥因子，如IL-1β和IL-18，可招募和激活免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)可以激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除。IL-1β和IL-18可以激活T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。同時(shí)，細(xì)胞焦亡還可以釋放腫瘤相關(guān)抗原，激活抗原呈遞細(xì)胞，促進(jìn)抗原呈遞和T細(xì)胞的活化，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在免疫調(diào)節(jié)方面，健脾散結(jié)方通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路，可能影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，它們?cè)诳鼓[瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。NLRP3/caspase-1信號(hào)通路激活后產(chǎn)生的IL-1β和IL-18等炎癥因子，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。健脾散結(jié)方上調(diào)NLRP3/caspase-1表達(dá)，增加IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，可能促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）向M1型極化。M1型TAM具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子和活性氧，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-1β和IL-18還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)Th1型細(xì)胞的分化，增強(qiáng)Th1型細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，IL-18還可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。5.2健脾散結(jié)方與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系免疫調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療過程中起著至關(guān)重要的作用。機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，維持機(jī)體的免疫平衡。然而，在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。健脾散結(jié)方作為一種傳統(tǒng)的中藥方劑，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面具有顯著的作用，其通過多種途徑增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視能力，抑制腫瘤的免疫逃逸。健脾散結(jié)方中的黃芪是調(diào)節(jié)免疫功能的重要藥物之一。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分，它能夠顯著增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性。研究表明，黃芪多糖可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增加CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。CD4+T細(xì)胞能夠輔助其他免疫細(xì)胞的活化，增強(qiáng)免疫應(yīng)答；CD8+T細(xì)胞則具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。黃芪多糖還可以激活巨噬細(xì)胞，使其分泌更多的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6等。這些細(xì)胞因子可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和殺傷活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。巨噬細(xì)胞被激活后，能夠吞噬和清除腫瘤細(xì)胞，同時(shí)釋放的細(xì)胞因子還可以招募其他免疫細(xì)胞到腫瘤部位，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。此外，黃芪多糖還可以調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）的活性，NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要成員，具有無需預(yù)先致敏即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。黃芪多糖能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊能力。黨參同樣在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。黨參多糖可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增加抗體的分泌?？贵w可以與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。黨參多糖還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，提高CD4+/CD8+比值。CD4+/CD8+比值的升高表明機(jī)體的免疫功能處于較好的狀態(tài)，能夠更好地應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲。在腫瘤微環(huán)境中，CD4+T細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子，激活CD8+T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)；而CD8+T細(xì)胞則可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞。黨參多糖通過調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，增強(qiáng)了機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，提高了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。白術(shù)和茯苓在健脾散結(jié)方中也對(duì)免疫調(diào)節(jié)起著積極的作用。白術(shù)多糖和茯苓多糖都具有免疫調(diào)節(jié)活性。白術(shù)多糖可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6等。這些細(xì)胞因子可以激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。茯苓多糖則可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性。研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠提高NK細(xì)胞表面活化受體的表達(dá)，增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。此外，茯苓多糖還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的代謝，為免疫細(xì)胞的活化和功能發(fā)揮提供能量支持。健脾散結(jié)方通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路，對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞功能產(chǎn)生影響，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫監(jiān)視、抑制腫瘤免疫逃逸。NLRP3炎性小體激活后產(chǎn)生的IL-1β和IL-18等炎癥因子，可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。在本研究中，健脾散結(jié)方上調(diào)NLRP3/caspase-1表達(dá)，增加IL-1β和IL-18的產(chǎn)生，可能促進(jìn)TAM向M1型極化。M1型TAM具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子和活性氧，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-1β和IL-18還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能，促進(jìn)Th1型細(xì)胞的分化，增強(qiáng)Th1型細(xì)胞分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，IL-18還可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。通過這些作用，健脾散結(jié)方增強(qiáng)了機(jī)體的免疫監(jiān)視能力，使免疫系統(tǒng)能夠更好地識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤的免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。5.3其他可能的抗腫瘤作用機(jī)制除了通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路和免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用外，健脾散結(jié)方還可能通過其他多種途徑抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其潛在作用機(jī)制如下：調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡：健脾散結(jié)方中的多種中藥成分可直接作用于胃癌細(xì)胞，影響其增殖和凋亡相關(guān)信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中的黃芪皂苷能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期有關(guān)。CyclinD1是細(xì)胞周期進(jìn)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞增殖。白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯可通過激活caspase-3、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白酶，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。這種調(diào)節(jié)作用能夠促使胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡達(dá)到新的平衡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。抑制腫瘤血管生成：腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，抑制腫瘤血管生成是抗腫瘤治療的重要策略之一。健脾散結(jié)方中的部分中藥成分具有抑制腫瘤血管生成的作用。莪術(shù)的主要成分莪術(shù)醇能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)，阻斷VEGF/VEGFR信號(hào)通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，減少腫瘤血管生成。茯苓多糖也可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子，如抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）的分泌，間接抑制腫瘤血管生成。通過抑制腫瘤血管生成，健脾散結(jié)方能夠切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，限制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化是一種有效的抗腫瘤策略，可使腫瘤細(xì)胞失去惡性增殖能力，恢復(fù)正常的細(xì)胞功能。研究表明，健脾散結(jié)方中的黨參多糖可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。黨參多糖能夠上調(diào)與細(xì)胞分化相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、細(xì)胞角蛋白（CK）等，使胃癌細(xì)胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變，表現(xiàn)出正常細(xì)胞的特征。此外，薏苡仁中的薏苡仁油也具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用，可使胃癌細(xì)胞的增殖能力下降，分化程度提高。抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移：腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的重要因素，健脾散結(jié)方在抑制胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面也具有潛在作用。浙貝母中的貝母生物堿能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其活性升高與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。貝母生物堿通過抑制MMP-2、MMP-9等的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，白花蛇舌草中的黃酮類成分可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附分子表達(dá)，如降低細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探討了健脾散結(jié)方對(duì)胃癌NLRP3/caspase-1表達(dá)的影響及其抗腫瘤作用機(jī)制，取得了以下主要研究成果。在臨床研究中，選取60例胃癌患者分為對(duì)照組和中藥組，15例健康志愿者作為健康對(duì)照。結(jié)果顯示，治療前胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于健康組。治療2個(gè)周期后，中藥組患者血液中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高。這表明健脾散結(jié)方能夠上調(diào)胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平。同時(shí)，中藥組患者在中醫(yī)證候評(píng)分、生活質(zhì)量評(píng)分（EORTCQLQ-C30量表）、功能狀態(tài)評(píng)分（KPS）等方面均有顯著改善，提示健脾散結(jié)方不僅能調(diào)節(jié)相關(guān)分子表達(dá)，還能提高胃癌患者生活質(zhì)量、改善其臨床癥狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，分為對(duì)照組和中藥組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，中藥組荷瘤裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)更為緩慢，腫瘤體積和重量明顯減小，說明健脾散結(jié)方能夠抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平低于瘤周組織，而中藥組NLRP3、caspase-1mRNA及蛋白表達(dá)水平高于腫瘤組，且NLRP3與caspase-1的表達(dá)水平存在正相關(guān)。這表明健脾散結(jié)方可以上調(diào)裸鼠胃癌移植瘤腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)。綜合臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制可能主要通過調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。健脾散結(jié)方中的多種中藥成分，如黃芪多糖、白術(shù)內(nèi)酯等，可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、氧化還原狀態(tài)等途徑，激活NLRP3炎性小體，促進(jìn)caspase-1的活化，從而增強(qiáng)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的活性。上調(diào)的NLRP3/caspase-1信號(hào)通路可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生焦亡，釋放炎癥因子，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，健脾散結(jié)方還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，如促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M1型極化、調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能、增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性等，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，抑制腫瘤的免疫逃逸。除了調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路和免疫調(diào)節(jié)外，健脾散結(jié)方還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。6.2研究的局限性與不足盡管本研究在探討健脾散結(jié)方對(duì)胃癌NLRP3/caspase-1表達(dá)的影響及其抗腫瘤作用機(jī)制方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性和不足之處。從樣本量角度來看，無論是臨床研究中的60例胃癌患者，還是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的20只荷瘤裸鼠，樣本數(shù)量均相對(duì)較少。較小的樣本量可能導(dǎo)致研究結(jié)果的代表性不足，存在一定的抽樣誤差，無法全面準(zhǔn)確地反映健脾散結(jié)方在胃癌治療中的作用及機(jī)制。在臨床研究中，不同個(gè)體之間存在較大的異質(zhì)性，包括遺傳背景、生活習(xí)慣、基礎(chǔ)疾病等因素，這些因素可能影響健脾散結(jié)方的療效和NLRP3/caspase-1的表達(dá)。較小的樣本量難以充分涵蓋這些個(gè)體差異，從而影響研究結(jié)果的可靠性和普適性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，樣本量不足也可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性較差，難以準(zhǔn)確評(píng)估健脾散結(jié)方對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)及相關(guān)分子表達(dá)的影響。未來研究需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行多中心、大樣本的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以提高研究結(jié)果的可信度和說服力。研究方法方面也存在一定局限。本研究主要采用了臨床觀察和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，雖然能夠從不同層面探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用，但研究方法仍較為單一。在臨床研究中，僅檢測(cè)了胃癌患者血液中NLRP3、caspase-1的表達(dá)水平，未對(duì)腫瘤組織進(jìn)行深入研究。腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)可能與血液中的表達(dá)存在差異，且腫瘤組織中的微環(huán)境更為復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行研究有助于更全面地了解健脾散結(jié)方的作用機(jī)制。此外，本研究未對(duì)健脾散結(jié)方的藥物成分進(jìn)行詳細(xì)分析，無法明確具體是哪些成分在調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路和發(fā)揮抗腫瘤作用中起關(guān)鍵作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅觀察了健脾散結(jié)方對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)及相關(guān)分子表達(dá)的短期影響，未進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪觀察，無法了解健脾散結(jié)方對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的影響。未來研究可以結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)技術(shù)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多種研究方法，從細(xì)胞、分子、代謝等多個(gè)層面深入探討健脾散結(jié)方的抗腫瘤作用機(jī)制。例如，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究健脾散結(jié)方對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的調(diào)控作用；利用代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析健脾散結(jié)方作用后胃癌細(xì)胞或腫瘤組織中代謝物和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，尋找新的作用靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。本研究在作用機(jī)制研究深度上還有待加強(qiáng)。雖然發(fā)現(xiàn)健脾散結(jié)方能夠上調(diào)胃癌患者血液及裸鼠胃癌移植瘤腫瘤組織中NLRP3、caspase-1的表達(dá)，初步探討了其可能的作用機(jī)制，但對(duì)于健脾散結(jié)方調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。例如，健脾散結(jié)方中的中藥成分如何與NLRP3炎性小體的各個(gè)組成部分相互作用，以及如何影響信號(hào)通路中的上下游分子，仍需要進(jìn)一步深入研究。此外，NLRP3/caspase-1信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用，本研究未對(duì)其進(jìn)行深入探討。這些信號(hào)通路之間的交互作用可能共同影響胃癌的發(fā)生發(fā)展和健脾散結(jié)方的抗腫瘤效果。未來研究需要進(jìn)一步深入研究健脾散結(jié)方調(diào)節(jié)NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的分子機(jī)制，以及該信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，為健脾散結(jié)方的臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。6.3未來研究方向展望未來關(guān)于健脾散結(jié)方在胃癌治療領(lǐng)域的研究可從以下幾個(gè)方向展開。首先，在樣本量擴(kuò)充方面，應(yīng)積極開展多中心、大樣本的臨床研究以及大規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。多中心臨床研究能夠納入來自不同地區(qū)、不同醫(yī)療環(huán)境的患者，更全面地反映健脾散結(jié)方在不同人群中的療