生化制品檢測(cè)技術(shù)三磷酸腺苷的檢測(cè)21三磷酸腺苷的工藝路線（三）氧化磷酸化法

1．工藝路線

氧化磷酸化方法制備ATP的工藝流程如下。三磷酸腺苷的工藝路線（三）（1）氧化反應(yīng)（2）分離純化（3）精制2．工藝過(guò)程三磷酸腺苷的工藝路線（三）（1）氧化反應(yīng)：在葡萄糖氧化成二氧化碳的過(guò)程中，能量釋放，使AMP轉(zhuǎn)化成ATP。酵母中的腺苷酸激酶，幾乎可以定量地把AMP變成ATP，理論轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，實(shí)際轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%。反應(yīng)步驟為：三磷酸腺苷的工藝路線（三）取AMP（含85%以上）50g用2L水溶解，必要時(shí)用濃氫氧化鈉溶液調(diào)至全溶。另取磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）184.8g，磷酸二氫鉀57.5g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）17.5g，溶于5L自來(lái)水。兩液混合后，投入離心甩干的新鮮酵母1.8～2kg及葡萄糖175g，在30～32℃下緩慢攪拌，發(fā)酵起泡。每30min抽樣l次，用電泳法（或測(cè)無(wú)機(jī)磷法）觀察轉(zhuǎn)化情況，約2h，部分AMP轉(zhuǎn)化成ADP或ATP時(shí)，提高溫度至37℃，至AMP斑點(diǎn)消失為止，全程4～6h。然后將反應(yīng)液冷至15℃左右，加入40%三氯醋酸500mL，用鹽酸調(diào)pH至2，尼龍布過(guò)濾，去酵母菌體和沉淀物，留上清液。（2）分離純化：在上清液中加入顆?；钚蕴?，于pH2下緩慢攪動(dòng)2h，吸附ATP。傾去清液后，用pH2的水洗滌活性炭，洗去酵母殘余后裝柱。再用pH2的水洗至澄清，用氨水:水:95%乙醇＝4:6:100的混合液洗脫ATP，流速30mL/min。將洗脫液置于冰浴中，用鹽酸調(diào)pH至3.8，加3～4倍量95%乙醇，在5～10℃靜置6～8h，傾去清液，沉淀即為去氨后的ATP粗品。將粗品溶于1.5L蒸餾水中，加硅藻土50g，攪拌15min，布氏漏斗過(guò)濾，取清液。清液調(diào)pH至3，上717陰離子交換樹(shù)脂柱（100g樹(shù)脂可吸附10～20gATP），飽和后用pH3、0.03mol/L氯化鈉液洗柱，去ADP（回收）和雜質(zhì)。再用pH3.8、1mol/L氯化鈉液洗脫。（3）精制：洗脫液加硅藻土25g，攪拌15min，抽濾，清液pH調(diào)至3.5，加3～4倍量95%乙醇，置冰箱過(guò)夜。次日濾晶、洗滌、干燥（同前）。按AMP重量計(jì)算得率100%～120%，含量80%左右。三磷酸腺苷的工藝路線（三）演示完畢，感謝聆