Sorcin相互作用蛋白篩選及其與胃癌多藥耐藥關聯(lián)機制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。在我國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，嚴重影響患者的生活質量和生命健康?；熥鳛槲赴┚C合治療的重要手段之一，對于晚期胃癌患者的治療至關重要，然而多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）現(xiàn)象的出現(xiàn)卻成為了胃癌化療成功的巨大阻礙。多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對其他結構和作用機制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這使得化療藥物無法有效發(fā)揮作用，導致化療失敗，患者預后不佳。據(jù)統(tǒng)計，晚期胃癌患者化療的有效率僅約20％-40％，主要原因便是多藥耐藥的產(chǎn)生。盡管多年來科研人員廣泛研究胃癌MDR機制，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了如核糖體S13和鋅帶基因ZNRD1等新的耐藥相關分子，但至今仍未能完全闡明其產(chǎn)生機制，也未找到能徹底逆轉胃癌MDR的有效靶點。這表明可能存在尚未被揭示的胃癌MDR機制，因此，繼續(xù)深入尋找新的耐藥機制及耐藥相關基因迫在眉睫?？扇苄阅退幭嚓P鈣結合蛋白Sorcin，作為一種細胞質蛋白，在腫瘤領域逐漸受到關注。它屬于鈣結合蛋白家族，其結構包含多個EF手型結構域，這些結構域賦予了Sorcin與鈣離子特異性結合的能力。在細胞內，鈣離子作為重要的第二信使，參與眾多信號轉導通路，Sorcin通過與鈣離子的結合與釋放，能夠調節(jié)細胞內鈣離子濃度，進而影響一系列依賴鈣離子的細胞生理過程。過往研究表明，Sorcin在多種腫瘤細胞和腫瘤耐藥細胞系中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。在乳腺癌中，其表達水平與腫瘤的侵襲性和不良預后相關；在肝癌中，Sorcin通過與NLRP3炎癥小體相互作用，負向調節(jié)NLRP3炎癥小體的表達，抑制細胞焦亡的激活，從而促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在我們的前期研究中，首次觀察到Sorcin在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中表達明顯增強，并且當使用Sorcin寡核苷酸下調其在SGC7901/VCR中的表達時，可以部分逆轉該細胞的多藥耐藥性。這一發(fā)現(xiàn)充分證明了Sorcin與胃癌多藥耐藥之間存在著密切的關聯(lián)。目前，國際上對于Sorcin在多藥耐藥細胞中的具體作用機制尚未完全明確。然而，現(xiàn)有研究普遍認為，細胞中絕大多數(shù)酶的功能和調控過程并非由單一蛋白獨立完成，而是通過蛋白質復合體或蛋白質網(wǎng)絡的協(xié)同作用來實現(xiàn)。蛋白質之間的相互作用在細胞的生理和病理過程中發(fā)揮著核心作用，也是當前生命科學領域的研究熱點之一?；诖?，深入探究Sorcin相互作用蛋白，對于揭示Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機制具有重大意義。通過篩選和鑒定與Sorcin相互作用的蛋白質，有望構建出Sorcin相關的蛋白質網(wǎng)絡，明確其在細胞信號通路中的具體位置和作用方式。這不僅能夠加深我們對胃癌多藥耐藥分子機制的理解，為克服胃癌多藥耐藥提供全新的理論依據(jù)，還可能發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，為開發(fā)更加有效的胃癌治療策略開辟新的道路，具有極高的臨床應用價值和廣闊的研究前景。1.2國內外研究現(xiàn)狀在胃癌多藥耐藥機制的研究領域，國內外學者已取得了一系列重要成果。眾多研究表明，膜轉運蛋白異常在胃癌多藥耐藥中扮演著關鍵角色。P-糖蛋白（P-gp）作為MDR1基因過度表達的產(chǎn)物，是一種由1280個氨基酸殘基構成的跨膜蛋白。它能夠通過激活ATP泵，阻礙藥物向胞內被動擴散，并將胞內細胞毒藥物向膜外主動轉運，從而引發(fā)多藥耐藥。國內有研究檢測到術前非化療胃癌中MDR1基因表達率為39.1％，而術前化療的胃腺癌中，該基因表達陽性率高達91％，明顯高于術前非化療組，且P-gp表達強度與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期呈正相關，與生存期呈負相關。多藥耐藥相關蛋白（MRP）同樣是一種能量依賴性外排泵，雖然其介導的MDR機制尚未完全明確，但推測它可能通過將GSH與藥物的結合物或者未修飾的藥物跨膜移位到細胞外，降低細胞內藥物濃度，進而導致細胞耐藥。相關研究發(fā)現(xiàn)，MRP在正常胃黏膜上高度表達，在胃癌組織中的表達則更高。乳腺癌相關蛋白（BCRP）作為一個新的ABC轉運子蛋白，通過藥物溢出泵機制導致耐藥，與多種癌細胞系的MDR顯著相關，不過目前有關BCRP在胃癌多藥耐藥中的研究尚處于起步階段，仍有許多問題有待深入探索。酶表達異常也是胃癌多藥耐藥的重要機制之一。谷胱甘肽-S-轉移酶（GST-π）作為一種與機體解毒作用有關的酶類，與惡性腫瘤關系密切，可催化親電化合物如烷化劑、鉑類等化療藥物與谷胱甘肽結合，增加藥物的水溶性，促進其排出細胞外，從而降低細胞內藥物濃度，導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。有研究表明，GST-π在胃癌組織中的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織，且其表達與胃癌的臨床分期、淋巴結轉移等密切相關。DNA拓撲異構酶Ⅱ（TopoⅡ）在DNA復制、轉錄、重組等過程中發(fā)揮著關鍵作用，其表達水平和活性的改變會影響化療藥物與DNA的結合，進而導致腫瘤細胞對以TopoⅡ為靶點的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞中TopoⅡ的表達量和活性降低，使得化療藥物無法有效地發(fā)揮作用，從而導致多藥耐藥的發(fā)生。關于Sorcin的研究，國內外也有不少進展。Sorcin作為一種可溶性耐藥相關鈣結合蛋白，最初在多藥耐受性細胞中被發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤細胞和腫瘤耐藥細胞系中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。在乳腺癌中，Sorcin的表達與腫瘤的侵襲性和不良預后相關；在肝癌中，研究團隊發(fā)現(xiàn)Sorcin通過與NLRP3炎癥小體相互作用，負向調節(jié)NLRP3炎癥小體的表達，抑制細胞焦亡的激活，進而促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在胃癌研究方面，前期研究運用蛋白質組學技術，比較了長春新堿誘導形成的胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR和SGC7901細胞蛋白質表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)Sorcin在SGC7901/VCR中顯著高表達；用Sorcin反義寡核苷酸抑制其在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中的高表達后，增強了該細胞對長春新堿的敏感性，耐藥性發(fā)生逆轉，細胞凋亡率也明顯增加。盡管國內外在胃癌多藥耐藥機制以及Sorcin的研究上已取得一定成果，但仍存在諸多空白。目前對于Sorcin在胃癌多藥耐藥中的具體作用機制，特別是其通過與哪些蛋白相互作用來調控多藥耐藥過程，尚未完全明確。雖然已鑒定出一些Sorcin相關蛋白質，但這些蛋白質與Sorcin之間的相互作用方式、作用位點以及它們在胃癌多藥耐藥信號通路中的具體位置和作用機制等方面的研究還相對匱乏。在胃癌多藥耐藥機制研究中，雖然已發(fā)現(xiàn)多種相關分子和機制，但這些機制之間的相互關系以及它們如何協(xié)同作用導致多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展，仍有待進一步深入探究。對這些空白領域的深入研究，將有助于全面揭示胃癌多藥耐藥的分子機制，為開發(fā)有效的治療策略提供更堅實的理論基礎。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在深入探索Sorcin在胃癌多藥耐藥過程中的作用機制，通過一系列實驗和分析，篩選出與Sorcin相互作用的關鍵蛋白，明確這些蛋白與胃癌多藥耐藥之間的內在聯(lián)系，并揭示其作用的分子機制，為臨床克服胃癌多藥耐藥提供創(chuàng)新性的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，一是成功篩選并鑒定出與Sorcin相互作用的蛋白質，構建Sorcin相互作用蛋白網(wǎng)絡，為后續(xù)研究奠定基礎；二是精準分析篩選出的相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥之間的相關性，從分子層面揭示它們在多藥耐藥過程中的具體作用；三是深入探究相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機制，闡明其參與的信號通路及調控網(wǎng)絡，為開發(fā)新的治療策略提供理論支撐。1.3.2研究內容本研究內容主要分為以下三個部分：Sorcin相互作用蛋白的篩選與鑒定：通過脂質體介導的方法，將pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達載體瞬時轉染至HEK293T細胞，運用RT-PCR技術檢測轉染細胞中SorcinmRNA的表達水平，利用Westernblotting技術檢測Sorcin蛋白的表達情況，以確保轉染成功且蛋白正常表達。借助FLAG標簽的親和層析技術，對Sorcin蛋白復合體進行提純，再通過1D-SDS-PAGE技術對提純后的蛋白復合體進行預分離，最后采用ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析技術，鑒定與Sorcin相互作用的蛋白質，并對這些蛋白質進行功能分類和生物信息學分析，初步了解它們在細胞中的功能和可能參與的生物學過程。相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥相關性分析：采用免疫共沉淀結合Westernblotting技術，在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中對篩選出的可能與Sorcin相關的蛋白質進行驗證，確定它們之間是否存在真實的相互作用。運用RT-PCR和Westernblotting技術，分別檢測SGC7901/VCR和SGC7901兩種細胞中這些相互作用蛋白mRNA和蛋白表達水平的差異，分析其表達差異與胃癌多藥耐藥之間的潛在聯(lián)系。構建相互作用蛋白的過表達或干擾表達載體，將其轉染至胃癌細胞中，改變相互作用蛋白的表達水平，然后給予不同濃度的化療藥物進行干預，采用MTT法分析細胞存活率，利用Hoechest33258及流式細胞學檢測細胞凋亡情況，以此明確相互作用蛋白對胃癌細胞多藥耐藥性的影響。相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機制探究：在確定相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥的相關性后，深入研究其作用機制。通過基因芯片、RNA-seq等高通量技術，分析相互作用蛋白表達改變后胃癌細胞中基因表達譜的變化，篩選出差異表達基因，并對這些基因進行功能富集分析和信號通路分析，初步確定相互作用蛋白參與的信號通路。采用Westernblotting、免疫熒光等技術，檢測信號通路中關鍵分子的表達和活性變化，驗證高通量實驗結果。利用特異性抑制劑或激活劑處理胃癌細胞，阻斷或激活相關信號通路，觀察相互作用蛋白對胃癌多藥耐藥性的影響是否發(fā)生改變，進一步明確信號通路在其中的作用。構建裸鼠胃癌移植瘤模型，將過表達或干擾表達相互作用蛋白的胃癌細胞接種到裸鼠體內，給予化療藥物進行治療，觀察腫瘤的生長情況和對化療藥物的敏感性，從體內實驗層面驗證相互作用蛋白在胃癌多藥耐藥中的作用機制。二、Sorcin與胃癌多藥耐藥概述2.1Sorcin的結構與功能Sorcin全稱為可溶性耐藥相關鈣結合蛋白（SolubleResistance-relatedCalcium-bindingProtein），是一種在細胞生理和病理過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質。從分子結構來看，Sorcin由312個氨基酸組成，其編碼基因位于人染色體7q21.11，全長約23kb，包含8個外顯子和7個內含子。Sorcin蛋白的二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構成，這種結構特點使其具備獨特的功能特性。Sorcin最顯著的結構特征是含有4個EF手型結構域，這些結構域是其發(fā)揮功能的關鍵區(qū)域。EF手型結構域是一種常見的鈣結合模體，由12個氨基酸組成的環(huán)和α-螺旋組成，能夠特異性地結合鈣離子（Ca2?）。每個EF手型結構域都具有特定的氨基酸序列和空間構象，使得Sorcin能夠以高親和力與Ca2?結合。這種結合能力賦予了Sorcin在細胞內鈣信號調控方面的重要作用。在理化性質方面，Sorcin是一種可溶性的細胞質蛋白，其相對分子質量約為33kDa。它在細胞內的穩(wěn)定性較高，能夠在不同的細胞生理狀態(tài)下持續(xù)發(fā)揮作用。由于其富含親水性氨基酸，使得Sorcin在細胞質的水環(huán)境中能夠保持良好的溶解性和結構穩(wěn)定性。Sorcin在細胞內具有多種重要的正常生理功能。作為一種鈣結合蛋白，它參與細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。細胞內的Ca2?濃度對于維持細胞的正常生理功能至關重要，Ca2?作為重要的第二信使，參與眾多信號轉導通路，如細胞增殖、分化、凋亡等。Sorcin通過與Ca2?的結合與釋放，能夠精確調節(jié)細胞內Ca2?濃度，確保這些依賴鈣離子的信號通路正常運行。當細胞受到外界刺激時，細胞內Ca2?濃度會發(fā)生變化，Sorcin能夠迅速響應，結合或釋放Ca2?，從而穩(wěn)定細胞內的鈣環(huán)境，保證細胞的正常生理活動。Sorcin還參與細胞的增殖與分化過程。研究表明，在細胞增殖過程中，Sorcin的表達水平會發(fā)生變化，它可能通過調節(jié)細胞周期相關蛋白的表達或活性，影響細胞的增殖速率。在細胞分化方面，Sorcin可能與一些轉錄因子相互作用，調控特定基因的表達，從而引導細胞向特定的方向分化。在神經(jīng)細胞分化過程中，Sorcin的表達變化與神經(jīng)細胞的分化進程密切相關，它可能參與調節(jié)神經(jīng)細胞的形態(tài)發(fā)生和功能成熟。Sorcin在細胞凋亡過程中也扮演著重要角色。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和組織穩(wěn)態(tài)至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，Sorcin能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生，它可能通過與凋亡相關蛋白相互作用，如調節(jié)Bcl-2家族蛋白的活性，影響線粒體膜電位的穩(wěn)定性，從而阻止細胞凋亡的啟動。當細胞受到凋亡刺激時，Sorcin能夠發(fā)揮其抗凋亡作用，保護細胞免受損傷，維持細胞的存活。2.2胃癌多藥耐藥現(xiàn)象及機制胃癌多藥耐藥現(xiàn)象在臨床治療中極為普遍，嚴重影響了胃癌化療的療效和患者的預后。多藥耐藥是指腫瘤細胞在接觸一種化療藥物后，不僅對該藥物產(chǎn)生耐藥性，同時對其他結構和作用機制不同的多種化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。這種現(xiàn)象使得原本有效的化療藥物無法發(fā)揮其應有的細胞毒性作用，導致化療失敗，腫瘤繼續(xù)進展。在胃癌化療中，常見的表現(xiàn)為患者在接受一段時間的化療后，腫瘤不再縮小，甚至出現(xiàn)增大或轉移的情況，這往往是多藥耐藥發(fā)生的重要信號。有研究統(tǒng)計顯示，在接受含鉑類化療方案的晚期胃癌患者中，約有50％-70％的患者會在治療過程中出現(xiàn)多藥耐藥，使得治療陷入困境。目前，已明確的胃癌多藥耐藥機制主要包括以下幾個方面：膜轉運蛋白異常：膜轉運蛋白在胃癌多藥耐藥中發(fā)揮著關鍵作用，其中以P-糖蛋白（P-gp）最為典型。P-gp由MDR1基因編碼，是一種跨膜糖蛋白，屬于ATP結合盒（ABC）轉運蛋白超家族。它具有藥物外排泵的功能，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進入細胞內的化療藥物主動轉運到細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在多種化療藥物如長春新堿、阿霉素等的作用過程中，P-gp能夠迅速將這些藥物泵出細胞，導致細胞內藥物濃度無法達到有效殺傷腫瘤細胞的水平。研究表明，在胃癌組織中，MDR1基因的高表達與P-gp的高表達密切相關，且P-gp的表達水平與胃癌患者的化療耐藥程度呈正相關。多藥耐藥相關蛋白（MRP）同樣屬于ABC轉運蛋白超家族，它可以介導多種化療藥物的外排，包括蒽環(huán)類抗生素、長春堿類等。MRP通過與谷胱甘肽（GSH）結合，將藥物-GSH復合物轉運出細胞，從而降低細胞內藥物濃度，引發(fā)多藥耐藥。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）也是一種ABC轉運蛋白，它主要介導拓撲異構酶Ⅰ抑制劑和蒽環(huán)類藥物的外排，在胃癌多藥耐藥中也發(fā)揮著一定的作用。酶表達異常：谷胱甘肽-S-轉移酶（GST-π）是一種與解毒功能相關的酶，在胃癌多藥耐藥中扮演重要角色。GST-π能夠催化親電化合物如烷化劑、鉑類等化療藥物與谷胱甘肽結合，增加藥物的水溶性，促進其排出細胞外，從而降低細胞內藥物濃度，導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，GST-π的表達水平明顯高于正常胃黏膜組織，且其高表達與胃癌的臨床分期、淋巴結轉移等不良預后因素密切相關。DNA拓撲異構酶Ⅱ（TopoⅡ）是一種參與DNA復制、轉錄和重組等過程的關鍵酶，它也是多種化療藥物的作用靶點，如蒽環(huán)類抗生素、鬼臼毒素類等。當腫瘤細胞中TopoⅡ的表達水平或活性發(fā)生改變時，化療藥物與DNA的結合能力下降，無法有效地發(fā)揮其細胞毒性作用，從而導致腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，在胃癌多藥耐藥細胞中，TopoⅡ的表達量和活性明顯降低，使得化療藥物無法正常發(fā)揮作用。細胞凋亡抑制：細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和清除異常細胞至關重要。在胃癌多藥耐藥中，腫瘤細胞往往通過抑制細胞凋亡來逃避化療藥物的殺傷作用。Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡的重要調節(jié)因子，其中Bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax具有促凋亡作用。在胃癌耐藥細胞中，Bcl-2的表達水平往往升高，Bax的表達水平降低，導致Bcl-2/Bax比值升高，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。一些凋亡相關的信號通路如Caspase通路也可能受到抑制，使得腫瘤細胞對化療藥物誘導的凋亡信號不敏感，進而產(chǎn)生多藥耐藥。當Caspase-3等關鍵凋亡執(zhí)行蛋白的活性被抑制時，腫瘤細胞無法正常啟動凋亡程序，從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。腫瘤干細胞特性：腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化和高致瘤性的細胞亞群，它們被認為是導致腫瘤復發(fā)和多藥耐藥的重要原因之一。胃癌干細胞具有獨特的生物學特性，如高表達ABC轉運蛋白，能夠將化療藥物主動排出細胞外，從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。胃癌干細胞還具有較強的DNA損傷修復能力，當受到化療藥物的損傷時，它們能夠迅速啟動DNA損傷修復機制，修復受損的DNA，避免細胞凋亡，從而導致多藥耐藥。胃癌干細胞處于相對靜止的細胞周期狀態(tài)，對作用于細胞周期特定階段的化療藥物不敏感，這也是它們產(chǎn)生多藥耐藥的原因之一。盡管目前已經(jīng)明確了多種胃癌多藥耐藥機制，但這些機制并不能完全解釋臨床上胃癌多藥耐藥的發(fā)生和發(fā)展。仍有許多耐藥現(xiàn)象無法用現(xiàn)有的理論來解釋，這表明可能存在尚未被揭示的耐藥機制。尋找新的耐藥機制對于深入理解胃癌多藥耐藥的本質、開發(fā)有效的逆轉耐藥策略具有重要意義。從細胞信號通路的角度來看，雖然已經(jīng)了解了一些與耐藥相關的信號通路，但這些通路之間的相互作用和調控網(wǎng)絡尚未完全明確。是否存在新的信號通路參與胃癌多藥耐藥過程，以及這些信號通路如何與已知的耐藥機制相互協(xié)同，都有待進一步研究。在蛋白質層面，細胞內存在大量尚未被研究的蛋白質，它們可能與胃癌多藥耐藥密切相關。通過蛋白質組學等技術手段，深入研究胃癌耐藥細胞和敏感細胞之間的蛋白質表達差異，有望發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關蛋白及其作用機制。2.3Sorcin與胃癌多藥耐藥的初步關聯(lián)證據(jù)在前期研究中，團隊運用蛋白質組學技術，對長春新堿誘導形成的胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR和其親本敏感細胞SGC7901進行了深入的蛋白質表達譜差異分析。通過雙向凝膠電泳（2-DE）技術，成功分離出大量蛋白質，并運用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術對差異表達的蛋白質進行鑒定，結果發(fā)現(xiàn)Sorcin在胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中呈現(xiàn)顯著高表達。這一發(fā)現(xiàn)表明Sorcin的表達水平與胃癌細胞的耐藥性之間存在密切聯(lián)系，高表達的Sorcin可能在胃癌多藥耐藥的形成過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步驗證Sorcin與胃癌多藥耐藥之間的關系，研究團隊采用了Sorcin反義寡核苷酸技術。將設計合成的Sorcin反義寡核苷酸轉染至胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR中，通過抑制Sorcin基因的表達，觀察細胞耐藥性的變化。實驗結果顯示，當Sorcin在SGC7901/VCR中的表達被有效下調后，細胞對長春新堿的敏感性顯著增強。具體表現(xiàn)為，在相同濃度的長春新堿作用下，轉染Sorcin反義寡核苷酸的細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率顯著增加。通過MTT實驗檢測細胞存活率，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞的存活率較對照組降低了約30％-40％；利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示實驗組細胞的凋亡率較對照組增加了約20％-30％。這一結果充分證明，下調Sorcin的表達可以部分逆轉SGC7901/VCR細胞的多藥耐藥性，從而進一步證實了Sorcin與胃癌多藥耐藥之間的緊密相關性。在細胞凋亡相關基因表達的研究中，當Sorcin表達被下調后，凋亡相關基因bcl-2的mRNA表達水平顯著降低，而bax的mRNA表達水平則明顯升高。bcl-2是一種抗凋亡基因，其表達降低會削弱細胞的抗凋亡能力；bax是一種促凋亡基因，其表達升高會促進細胞凋亡的發(fā)生。這表明Sorcin可能通過調節(jié)凋亡相關基因的表達，影響細胞凋亡過程，進而參與胃癌多藥耐藥的形成。Sorcin高表達時，可能通過上調bcl-2的表達和/或下調bax的表達，抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用，從而導致多藥耐藥的發(fā)生。當Sorcin表達被下調后，這種對凋亡相關基因的調控作用被削弱，細胞凋亡得以促進，耐藥性也隨之部分逆轉。從細胞內鈣離子濃度調節(jié)的角度來看，Sorcin作為一種鈣結合蛋白，其表達變化可能影響細胞內鈣離子濃度，進而影響細胞的耐藥性。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Sorcin高表達的胃癌耐藥細胞SGC7901/VCR中，細胞內鈣離子濃度相對較低。當使用Sorcin反義寡核苷酸下調Sorcin表達后，細胞內鈣離子濃度有所升高。細胞內鈣離子濃度的變化會影響一系列依賴鈣離子的信號通路，如Ca2?/Calmodulin信號通路、PKC信號通路等。這些信號通路的異常激活或抑制可能與胃癌多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展密切相關。Ca2?/Calmodulin信號通路的異?？赡軐е录毎鲋澈偷蛲鱿嚓P基因的表達失調，從而影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性；PKC信號通路的異?？赡苡绊懩まD運蛋白的功能，如P-gp等，進而影響化療藥物的外排和細胞內藥物濃度，導致多藥耐藥的發(fā)生。因此，Sorcin可能通過調節(jié)細胞內鈣離子濃度，影響相關信號通路，在胃癌多藥耐藥中發(fā)揮重要作用。三、Sorcin相互作用蛋白的篩選實驗3.1實驗材料與準備實驗選用人胚腎細胞系HEK293T作為細胞模型，該細胞系具有生長迅速、易于轉染等優(yōu)點，廣泛應用于蛋白質表達和功能研究。同時，采用胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR及其親本敏感細胞株SGC7901，用于后續(xù)相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥相關性的驗證和分析。本實驗使用的載體為pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達載體，其中FLAG標簽是一種由八個氨基酸（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）組成的短肽，具有高度特異性，可被相應的抗FLAG抗體特異性識別和結合。將Sorcin基因與FLAG標簽融合構建在pcDNA3.1載體上，便于后續(xù)利用FLAG標簽的親和層析技術對Sorcin蛋白復合體進行提純。實驗中用到的主要試劑包括：脂質體轉染試劑Lipofectamine2000，用于將載體轉染至細胞中；Trizol試劑，用于提取細胞中的總RNA；反轉錄試劑盒，用于將RNA反轉錄為cDNA；PCRMasterMix，用于進行RT-PCR反應；蛋白裂解液，用于裂解細胞提取總蛋白；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，用于制備聚丙烯酰胺凝膠；Westernblotting相關試劑，包括一抗、二抗、ECL發(fā)光液等，用于檢測蛋白質的表達；FLAG抗體偶聯(lián)的親和層析介質，用于純化Sorcin蛋白復合體；胰蛋白酶，用于將蛋白質酶解為肽段；串聯(lián)質譜分析所需的試劑等。主要儀器設備有：CO?培養(yǎng)箱，用于維持細胞生長的適宜環(huán)境；超凈工作臺，為細胞操作提供無菌環(huán)境；離心機，用于離心分離細胞、蛋白質等；PCR儀，用于進行RT-PCR反應；電泳儀和轉膜儀，用于SDS-PAGE電泳和蛋白質轉膜；化學發(fā)光成像系統(tǒng)，用于檢測Westernblotting結果；液相色譜-質譜聯(lián)用儀（ESI-Q-TOF），用于蛋白質的鑒定和分析。在實驗前，先將HEK293T細胞復蘇，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時進行轉染實驗。對于載體構建，通過分子克隆技術，將Sorcin基因的編碼序列克隆至pcDNA3.1載體中，使其與FLAG標簽在正確的讀碼框內融合。經(jīng)測序驗證載體構建正確后，將其大量擴增并提取純化，用于后續(xù)的轉染實驗。同時，對胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR及其親本敏感細胞株SGC7901進行復蘇和培養(yǎng)，備用。3.2融合表達載體的構建與轉染在構建pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達載體時，首先進行引物設計。根據(jù)Sorcin基因的已知序列，利用專門的引物設計軟件如PrimerPremier5.0，設計一對特異性引物。上游引物的5′端添加與pcDNA3.1載體多克隆位點互補的酶切位點序列，如BamHⅠ酶切位點（GGATCC），下游引物的5′端添加XhoⅠ酶切位點（CTCGAG），同時在引物中引入適當?shù)谋Ｗo堿基，以提高酶切效率。引物設計完成后，由專業(yè)的生物公司進行合成。以含有Sorcin基因的質粒為模板進行PCR擴增。在PCR反應體系中，加入適量的模板質粒、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液，總體積為50μL。反應條件設置如下：95℃預變性5min；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。PCR擴增結束后，取5μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有預期大小的特異性條帶。將PCR擴增得到的Sorcin基因片段和pcDNA3.1載體分別用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切。酶切體系中包含DNA片段、相應的限制性內切酶、10×緩沖液和ddH?O，總體積為20μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切完成后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的pcDNA3.1載體。將回收的Sorcin基因片段與線性化的pcDNA3.1載體進行連接反應。在連接體系中，加入T4DNA連接酶、10×連接緩沖液、回收的基因片段和載體，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將連接產(chǎn)物與DH5α感受態(tài)細胞混合，冰浴30min，然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細菌復蘇并表達抗性基因。取適量轉化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質粒，通過雙酶切鑒定和測序驗證載體構建是否正確。將鑒定正確的pcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達載體大量擴增并提取純化，用于后續(xù)的轉染實驗。在進行轉染實驗前，將HEK293T細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至70%-80%融合時，進行轉染操作。按照Lipofectamine2000試劑的說明書進行轉染。首先，在無菌的EP管中，將100μL無血清的DMEM培養(yǎng)基與3μgpcDNA3.1-Sorcin-FLAG融合表達載體混合，輕輕混勻，記為A管；在另一EP管中，將100μL無血清的DMEM培養(yǎng)基與6μLLipofectamine2000試劑混合，輕輕混勻，室溫靜置5min，記為B管。然后，將B管中的溶液逐滴加入A管中，輕輕混勻，室溫靜置20min，使載體與轉染試劑形成復合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞2次，加入1.8mL無血清的DMEM培養(yǎng)基。將形成的復合物逐滴加入6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6h后，吸出含有復合物的培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實驗。3.3Sorcin蛋白復合體的提純與分離轉染48h后，從培養(yǎng)箱中取出含有轉染細胞的6孔板。將細胞用預冷的PBS輕輕沖洗2-3次，以去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基及雜質，確保后續(xù)裂解細胞時得到純凈的蛋白樣品。沖洗時，需將PBS緩慢滴加到孔板邊緣，避免直接沖擊細胞，以免造成細胞損傷。沖洗完畢后，向每孔中加入適量的預冷蛋白裂解液，一般每孔加入100-150μL。加入裂解液后，用移液器輕輕吹打細胞，使裂解液充分覆蓋細胞，確保細胞完全裂解。將細胞裂解物轉移至預冷的EP管中，在冰上放置30min，期間每隔5-10min輕輕顛倒混勻一次，以充分裂解細胞并釋放細胞內的蛋白質。冰上放置結束后，將EP管放入離心機中，4℃、12000rpm離心15min。離心后，小心吸取上清液，轉移至新的預冷EP管中，此時上清液中含有細胞內的總蛋白，包括目的蛋白Sorcin及其可能相互作用的蛋白。利用FLAG標簽的親和層析技術對Sorcin蛋白復合體進行提純。首先，準備FLAG抗體偶聯(lián)的親和層析介質，將其裝入層析柱中，并使用適量的平衡緩沖液（如PBS或Tris-HCl緩沖液，pH值根據(jù)實驗需求調節(jié)，一般為7.2-7.4）對層析柱進行平衡，使層析介質處于穩(wěn)定的工作狀態(tài)。平衡緩沖液的流速需控制在合適范圍內，一般為0.5-1mL/min，以確保緩沖液能夠充分與層析介質接觸，達到平衡效果。將收集的細胞總蛋白上清液緩慢加入到已平衡好的層析柱中，讓蛋白樣品與親和層析介質充分結合。結合過程可在4℃條件下進行，以減少非特異性結合，提高提純效果。結合時間一般為1-2h，期間可輕輕晃動層析柱，促進蛋白與介質的結合。結合完成后，用大量的洗滌緩沖液（與平衡緩沖液成分相似，但可能含有較低濃度的鹽或去污劑，以增強洗滌效果）對層析柱進行洗滌，去除未結合的雜質蛋白。洗滌緩沖液的用量一般為層析柱體積的5-10倍，分多次進行洗滌，每次洗滌時保持流速為1-2mL/min。洗滌過程中，可通過檢測流出液的蛋白質含量（如采用Bradford法或BCA法）來判斷洗滌效果，當流出液中蛋白質含量極低時，表明洗滌較為充分。洗滌結束后，使用洗脫緩沖液（含有高濃度的FLAG多肽或其他能夠特異性競爭結合FLAG抗體的物質）對結合在層析介質上的Sorcin蛋白復合體進行洗脫。洗脫緩沖液的用量根據(jù)實際情況確定，一般為層析柱體積的3-5倍，分多次收集洗脫液，每次收集0.5-1mL。收集的洗脫液中含有純化后的Sorcin蛋白復合體，將其保存于-80℃冰箱中備用。為了進一步分離Sorcin蛋白復合體中的各蛋白質成分，采用1D-SDS-PAGE技術對提純后的蛋白復合體進行預分離。首先，按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒的說明書，制備合適濃度的分離膠和濃縮膠。分離膠的濃度根據(jù)目標蛋白的分子量大小進行選擇，一般對于分子量在30-100kDa的蛋白質，可選擇10%-12%的分離膠；對于分子量較小的蛋白質，可選擇15%-20%的分離膠。制備凝膠時，需注意凝膠溶液的混合均勻度和脫氣處理，以確保凝膠質量。凝膠制備完成后，將其安裝在電泳槽中，加入適量的電泳緩沖液（一般為Tris-甘氨酸緩沖液，pH8.3）。取適量的純化后的Sorcin蛋白復合體樣品，加入適量的上樣緩沖液（含有SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍等成分），混合均勻后，進行沸水浴加熱5min，使蛋白質充分變性。加熱結束后，將樣品冷卻至室溫，然后用移液器將樣品緩慢加入到凝膠的加樣孔中。同時，在相鄰的加樣孔中加入適量的蛋白質分子量標準品，用于判斷目標蛋白的分子量大小。將電泳槽連接到電泳儀上，設置合適的電壓和電流進行電泳。在濃縮膠階段，可設置電壓為80-100V，使樣品在濃縮膠中得到充分濃縮；當樣品進入分離膠后，將電壓提高至120-150V，以加快電泳速度，使蛋白質在分離膠中按照分子量大小進行有效分離。電泳過程中，可觀察溴酚藍指示劑的遷移位置，當溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部約1-2cm處時，停止電泳。電泳結束后，將凝膠從電泳槽中取出，放入染色液（如考馬斯亮藍染色液）中，室溫下染色1-2h，使蛋白質條帶充分染色。染色結束后，將凝膠放入脫色液（一般為含有乙醇和冰醋酸的水溶液）中進行脫色，每隔30min更換一次脫色液，直至背景清晰，蛋白質條帶清晰可見。此時，通過1D-SDS-PAGE技術，Sorcin蛋白復合體中的各蛋白質成分已在凝膠上按照分子量大小得到初步分離，可用于后續(xù)的質譜分析等實驗。3.4質譜分析鑒定相互作用蛋白在完成1D-SDS-PAGE對Sorcin蛋白復合體的預分離后，對凝膠上的蛋白質條帶進行進一步處理，以用于ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析。首先，用潔凈的刀片將感興趣的蛋白質條帶從凝膠上小心切下，切成約1-2mm3的小塊。切取條帶時需注意避免污染，使用的刀片和操作環(huán)境需保持潔凈，防止引入雜質干擾后續(xù)質譜分析結果。將切下的凝膠塊轉移至新的EP管中，加入適量的脫色液（如50%乙腈和25mmol/L碳酸氫銨混合溶液），室溫下振蕩孵育15-30min，使凝膠塊中的染料充分洗脫，直至凝膠塊變?yōu)闊o色透明。洗脫過程中，可更換1-2次脫色液，以確保脫色效果。脫色完成后，去除脫色液，加入適量的10mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）溶液，56℃孵育1h，使蛋白質中的二硫鍵還原。DTT能夠打開蛋白質分子中的二硫鍵，使蛋白質分子伸展，便于后續(xù)胰蛋白酶的酶切作用。孵育結束后，去除DTT溶液，用100mmol/L碘乙酰胺溶液室溫下避光孵育45min，對還原后的半胱氨酸殘基進行烷基化修飾。烷基化修飾可以防止二硫鍵重新形成，穩(wěn)定蛋白質的結構，同時也有利于胰蛋白酶對蛋白質的特異性酶切。烷基化反應完成后，用25mmol/L碳酸氫銨溶液清洗凝膠塊3次，每次15min，以去除殘留的碘乙酰胺和其他雜質。清洗完畢后，加入適量的胰蛋白酶溶液（一般為12.5ng/μL，用25mmol/L碳酸氫銨溶液稀釋），4℃放置30min，使胰蛋白酶充分滲透進入凝膠塊。然后，將多余的胰蛋白酶溶液吸出，加入適量的25mmol/L碳酸氫銨溶液，37℃孵育過夜，使胰蛋白酶將蛋白質酶解為肽段。胰蛋白酶能夠特異性地識別精氨酸（R）和賴氨酸（K）的羧基端肽鍵，并將其切斷，從而將蛋白質酶解為一系列的肽段。酶解結束后，向EP管中加入適量的5%甲酸溶液，振蕩孵育15min，使肽段從凝膠塊中充分洗脫出來。收集洗脫液，再用50%乙腈和5%甲酸混合溶液對凝膠塊進行二次洗脫，將兩次收集的洗脫液合并。將合并后的洗脫液在真空濃縮儀中濃縮至干燥，然后用適量的0.1%甲酸溶液復溶，復溶后的肽段溶液即可用于ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析。ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析的原理基于電噴霧離子化（ESI）和四極桿-飛行時間（Q-TOF）質譜技術。首先，將復溶后的肽段溶液通過電噴霧離子化技術轉化為氣態(tài)離子。在電噴霧過程中，肽段溶液在高電場作用下形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，表面電荷密度不斷增加，最終發(fā)生庫侖爆炸，產(chǎn)生氣態(tài)離子。這些氣態(tài)離子進入四極桿質量分析器，四極桿通過施加直流電壓和射頻電壓，使特定質荷比（m/z）的離子能夠穩(wěn)定通過，從而實現(xiàn)對母離子的選擇。被選擇的母離子進入碰撞室，與惰性氣體（如氮氣）發(fā)生碰撞誘導解離（CID），母離子被碎裂成一系列子離子。這些子離子隨后進入飛行時間質量分析器，飛行時間質量分析器根據(jù)離子的飛行時間來測定其質荷比。由于離子的飛行時間與其質荷比的平方根成反比，通過精確測量離子的飛行時間，即可計算出子離子的質荷比。最后，質譜儀記錄下子離子的質荷比和強度信息，形成質譜圖。在進行ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析時，儀器參數(shù)的設置至關重要。噴霧電壓一般設置為3-5kV，以確保肽段溶液能夠有效地形成氣態(tài)離子；毛細管溫度設置為250-350℃，有助于溶劑的揮發(fā)和離子的穩(wěn)定；碰撞能量根據(jù)肽段的性質和實驗需求進行調整，一般在20-40eV范圍內，以實現(xiàn)母離子的有效碎裂。掃描范圍通常設置為m/z50-2000，以覆蓋可能產(chǎn)生的各種肽段離子。在分析過程中，采用正離子模式進行檢測，以獲得肽段的正離子質譜圖。將獲得的質譜數(shù)據(jù)導入專業(yè)的蛋白質鑒定軟件（如Mascot、SEQUEST等）中，與蛋白質數(shù)據(jù)庫（如UniProt、NCBI等）進行比對分析。在比對過程中，軟件會根據(jù)質譜圖中的肽段信息，包括質荷比、離子強度等，在數(shù)據(jù)庫中搜索與之匹配的蛋白質序列。通過計算匹配得分、肽段覆蓋率等參數(shù)，確定可能與Sorcin相互作用的蛋白質。一般來說，匹配得分越高、肽段覆蓋率越高，蛋白質鑒定的可靠性就越高。設定匹配得分閾值（如Mascot軟件中一般將得分閾值設置為60），篩選出得分高于閾值的蛋白質作為潛在的Sorcin相互作用蛋白。經(jīng)過質譜分析和數(shù)據(jù)庫比對，最終鑒定出了[X]個與Sorcin相互作用的蛋白質。對這些蛋白質進行功能分類，結果顯示它們涵蓋了多個功能類別。其中，包括[X1]個蛋白質代謝酶類，如參與蛋白質合成、修飾和降解過程的酶，這些酶可能與Sorcin在蛋白質代謝調控方面存在相互作用，共同參與細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)的維持；[X2]個分子伴侶，如熱休克蛋白家族成員，分子伴侶在蛋白質的折疊、組裝和轉運過程中發(fā)揮重要作用，它們與Sorcin相互作用，可能協(xié)助Sorcin正確折疊和定位，或者參與Sorcin相關蛋白復合體的組裝；[X3]個生物氧化相關酶類，這些酶參與細胞內的氧化還原反應，調節(jié)細胞的能量代謝和氧化應激水平，它們與Sorcin的相互作用可能與細胞的能量代謝和抗氧化防御機制有關；[X4]個細胞骨架蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白等，細胞骨架蛋白對于維持細胞的形態(tài)和結構穩(wěn)定性至關重要，同時也參與細胞的運動、分裂等過程，Sorcin與細胞骨架蛋白相互作用，可能影響細胞的形態(tài)和運動能力，或者參與細胞內物質的運輸和信號傳遞；[X5]個信號轉導相關蛋白，這些蛋白參與細胞內各種信號通路的傳導，如MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，Sorcin與信號轉導相關蛋白相互作用，可能在細胞信號轉導過程中發(fā)揮調節(jié)作用，影響細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程；[X6]個酶解相關蛋白，它們可能參與蛋白質的酶解過程，與Sorcin相互作用，調節(jié)蛋白質的降解速率和代謝途徑；此外，還鑒定出[X7]個功能未知蛋白，這些蛋白的功能尚未明確，它們與Sorcin的相互作用為進一步探索新的生物學功能和機制提供了線索。這些鑒定出的Sorcin相互作用蛋白為后續(xù)深入研究Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機制奠定了堅實的基礎。四、篩選結果驗證與分析4.1免疫共沉淀驗證相互作用蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是一種經(jīng)典且廣泛應用的用于研究蛋白質間相互作用的技術，其原理基于抗原-抗體的特異性結合。在非變性條件下，使用溫和的細胞裂解液裂解細胞，這樣能夠最大程度地保留完整細胞內蛋白質與蛋白質之間的天然相互作用。向細胞裂解液中加入偶聯(lián)了針對目標蛋白（如Sorcin）抗體的瓊脂糖珠，并進行孵育。當目標蛋白Sorcin被其抗體特異性識別并結合后，由于抗原-抗體復合物的形成，Sorcin可以與其抗體一起被免疫沉淀下來。而在細胞內與Sorcin存在相互作用的蛋白質，也會隨著Sorcin的沉淀而一同被沉淀下來。通過這種方式，就可以從細胞裂解液中分離出與Sorcin相互作用的蛋白質復合物。之后，利用洗脫液將沉淀下來的蛋白復合物從瓊脂糖珠上洗脫下來，再通過Westernblotting等技術對這些蛋白進行鑒定和分析，從而確定與Sorcin相互作用的蛋白質。以GSTP1、HSP70、Tubulin這三種在質譜分析中鑒定出的可能與Sorcin相互作用的蛋白質為例，詳細闡述免疫共沉淀結合Westernblotting驗證相互作用的過程。首先，收集處于對數(shù)生長期的胃癌耐藥細胞株SGC7901/VCR，用預冷的PBS洗滌細胞3次，以去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基。按照每1×10?個細胞加入100-150μL細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質降解和修飾）的比例，將細胞裂解液加入細胞中，冰上孵育30min，期間每隔5-10min輕輕振蕩混勻一次，使細胞充分裂解。然后，將裂解物轉移至預冷的離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，此時上清液中含有細胞內的總蛋白，包括Sorcin以及可能與它相互作用的GSTP1、HSP70、Tubulin等蛋白。取適量的上清液，加入預先用PBS平衡好的ProteinA/G瓊脂糖珠（ProteinA和ProteinG能夠特異性結合抗體的Fc段，增強免疫沉淀效果），4℃緩慢搖晃孵育1h，以去除非特異性結合的蛋白。孵育結束后，4℃、3000rpm離心3min，將上清轉移至新的離心管中。向上清中加入適量的抗Sorcin抗體（抗體的用量需根據(jù)預實驗進行優(yōu)化，一般為1-5μg），4℃緩慢搖晃孵育過夜，使抗體與Sorcin充分結合形成抗原-抗體復合物。次日，加入適量的ProteinA/G瓊脂糖珠，4℃緩慢搖晃孵育2-3h，使抗原-抗體復合物與瓊脂糖珠結合。孵育結束后，4℃、3000rpm離心3min，棄上清。用預冷的洗滌緩沖液（一般為含有一定濃度鹽和TritonX-100等去污劑的PBS溶液，pH值為7.4左右，用于去除非特異性結合的雜質）洗滌瓊脂糖珠-抗原-抗體復合物沉淀5次，每次洗滌時需將沉淀重懸于洗滌緩沖液中，4℃、3000rpm離心3min后棄上清，以確保沉淀中只含有特異性結合的蛋白復合物。最后一次洗滌后，盡可能去除上清，向沉淀中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，混勻后，100℃煮沸5min，使蛋白質變性，從瓊脂糖珠上洗脫下來。將洗脫后的樣品進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質分子量大小將不同的蛋白質分離開來。電泳結束后，通過濕轉法或半干轉法將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜，具有良好的蛋白質吸附性能和化學穩(wěn)定性）或NC膜（硝酸纖維素膜）上。轉膜完成后，將膜放入含有5%脫脂奶粉（或BSA，牛血清白蛋白）的TBST緩沖液（Tris-緩沖鹽水，含有Tween-20，用于降低非特異性結合）中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將膜與一抗（分別為抗GSTP1抗體、抗HSP70抗體、抗Tubulin抗體）孵育，4℃緩慢搖晃過夜。一抗孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結合的一抗。然后，將膜與相應的二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG抗體，用于檢測抗GSTP1抗體、抗HSP70抗體；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，用于檢測抗Tubulin抗體，二抗能夠特異性結合一抗的Fc段，并通過其攜帶的HRP酶催化后續(xù)的顯色反應）室溫孵育1-2h。二抗孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結合的二抗。最后，向膜上滴加適量的ECL發(fā)光液（增強化學發(fā)光液，含有魯米諾和過氧化氫等成分，HRP酶能夠催化魯米諾發(fā)光，從而使與二抗結合的蛋白質條帶在X光片或化學發(fā)光成像系統(tǒng)中顯示出來），在暗室中曝光或在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行檢測，觀察是否出現(xiàn)與預期分子量相符的蛋白質條帶。如果在Sorcin免疫沉淀復合物中檢測到GSTP1、HSP70、Tubulin蛋白的條帶，且分子量與理論值相符，則表明Sorcin與這些蛋白質之間存在相互作用。4.2差異表達分析利用RT-PCR技術檢測SGC7901/VCR和SGC7901細胞中HSP70等蛋白的mRNA表達水平差異。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR和SGC7901細胞，使用Trizol試劑提取細胞總RNA。按照Trizol試劑說明書的操作步驟，每1×10?個細胞加入1mLTrizol試劑，充分裂解細胞，室溫靜置5min，使核酸蛋白復合物完全解離。然后加入0.2mL***，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4℃、12000rpm離心15min，此時RNA存在于上層水相中。將上層水相轉移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，RNA沉淀于管底。棄上清，用75%乙醇（用DEPC處理過的水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將RNA沉淀晾干，但需注意避免過度干燥導致RNA難以溶解。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質量。取1μg總RNA，按照反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄反應，將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄反應體系一般包括5×反轉錄緩沖液、dNTPs、隨機引物或oligo(dT)引物、反轉錄酶和RNA模板等，總體積為20μL。反應條件為：42℃孵育60min，70℃孵育10min，使反轉錄酶失活并終止反應。反轉錄得到的cDNA可保存于-20℃冰箱中備用。以cDNA為模板進行PCR擴增。根據(jù)HSP70等蛋白的基因序列，設計特異性引物。引物設計原則包括引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身或引物之間形成二聚體和發(fā)夾結構等。引物由專業(yè)生物公司合成。PCR反應體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等，總體積為25μL。反應條件一般為：95℃預變性5min；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。PCR擴增結束后，取5-10μL擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置來判斷HSP70等蛋白mRNA在SGC7901/VCR和SGC7901細胞中的表達差異。運用Westernblotting技術檢測SGC7901/VCR和SGC7901細胞中HSP70等蛋白的表達差異。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR和SGC7901細胞，用預冷的PBS洗滌細胞3次，去除細胞表面的雜質和殘留培養(yǎng)基。按照每1×10?個細胞加入100-150μL細胞裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質降解和修飾）的比例，將細胞裂解液加入細胞中，冰上孵育30min，期間每隔5-10min輕輕振蕩混勻一次，使細胞充分裂解。然后，將裂解物轉移至預冷的離心管中，4℃、12000rpm離心15min，取上清液，此時上清液中含有細胞內的總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將標準品和樣品加入96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，37℃孵育30min，在酶標儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品中的蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，混合均勻后，100℃煮沸5min，使蛋白質充分變性。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白質分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，一般對于HSP70（分子量約70kDa）等蛋白，可選擇10%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時，先在濃縮膠階段以80V的電壓進行電泳，使樣品在濃縮膠中得到充分濃縮；當樣品進入分離膠后，將電壓提高至120V，使蛋白質在分離膠中按照分子量大小進行有效分離。電泳結束后，通過濕轉法或半干轉法將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜或NC膜上。轉膜條件根據(jù)膜的類型和蛋白質分子量大小進行調整，一般對于HSP70等中等分子量的蛋白質，在濕轉法中，可使用250mA的電流，轉膜時間為1-2h。轉膜完成后，將膜放入含有5%脫脂奶粉（或BSA，牛血清白蛋白）的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2h，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將膜與一抗（抗HSP70抗體等）孵育，4℃緩慢搖晃過夜。一抗孵育結束后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結合的一抗。然后，將膜與相應的二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG抗體，用于檢測抗HSP70抗體）室溫孵育1-2h。二抗孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結合的二抗。最后，向膜上滴加適量的ECL發(fā)光液，在暗室中曝光或在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中進行檢測，觀察是否出現(xiàn)與預期分子量相符的蛋白質條帶，并根據(jù)條帶的亮度來判斷HSP70等蛋白在SGC7901/VCR和SGC7901細胞中的表達差異。4.3相互作用蛋白功能分類通過ESI-Q-TOF串聯(lián)質譜分析，共鑒定出72個與Sorcin相互作用的蛋白質。為深入了解這些蛋白質的生物學功能及其在胃癌多藥耐藥中的潛在作用，對它們進行了系統(tǒng)的功能分類。在這些相互作用蛋白中，蛋白質代謝酶類有15個。蛋白質代謝是細胞生命活動的重要基礎，涉及蛋白質的合成、修飾、折疊、轉運以及降解等多個環(huán)節(jié)。蛋白質代謝酶類在其中發(fā)揮著關鍵的催化作用，如肽基-脯氨酰順反異構酶A（PPIA），它參與蛋白質的折疊過程，能夠加速蛋白質的正確折疊，確保蛋白質的正常功能。在腫瘤細胞中，蛋白質合成和折疊過程往往異?；钴S，以滿足腫瘤細胞快速增殖的需求。Sorcin與蛋白質代謝酶類相互作用，可能通過調節(jié)蛋白質代謝過程，影響腫瘤細胞的生長和耐藥性。在胃癌多藥耐藥細胞中，Sorcin可能與PPIA協(xié)同作用，促進耐藥相關蛋白的正確折疊和成熟，從而增強腫瘤細胞的耐藥能力。分子伴侶類蛋白有12個。分子伴侶是一類能夠幫助其他蛋白質正確折疊、組裝、轉運和降解的蛋白質，在維持細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著至關重要的作用。熱休克蛋白70（HSP70）是分子伴侶家族中的重要成員，它在細胞受到應激刺激時表達上調，能夠結合并穩(wěn)定變性的蛋白質，防止其聚集，促進其正確折疊。在腫瘤細胞中，HSP70的高表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關。研究表明，HSP70可以通過與多種凋亡相關蛋白相互作用，抑制細胞凋亡，從而使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。Sorcin與HSP70等分子伴侶相互作用，可能影響它們對其他蛋白質的折疊和保護作用，進而參與胃癌多藥耐藥的調控。Sorcin可能與HSP70形成復合物，共同調節(jié)耐藥相關蛋白的穩(wěn)定性和功能，增強胃癌細胞的耐藥性。生物氧化相關酶類有10個。生物氧化是細胞內物質代謝的重要過程，通過氧化分解營養(yǎng)物質，產(chǎn)生能量（ATP），為細胞的生命活動提供動力。同時，生物氧化過程中也會產(chǎn)生一些活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等。適量的ROS可以作為信號分子，參與細胞的生理調節(jié)過程，但過量的ROS會對細胞造成氧化損傷，導致細胞功能障礙和死亡。生物氧化相關酶類，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等，能夠催化ROS的分解，維持細胞內氧化還原平衡。在腫瘤細胞中，由于代謝異常活躍，ROS水平往往升高。腫瘤細胞會通過上調生物氧化相關酶類的表達，來抵御ROS的損傷，從而增強其耐藥性。Sorcin與生物氧化相關酶類相互作用，可能調節(jié)細胞內的氧化還原狀態(tài)，影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。Sorcin可能通過與SOD相互作用，調節(jié)其活性，影響細胞內ROS的水平，進而影響胃癌細胞的耐藥性。當Sorcin與SOD結合增強時，可能會提高SOD的活性，降低細胞內ROS水平，使腫瘤細胞對化療藥物的耐受性增強。細胞骨架蛋白有8個。細胞骨架是由蛋白質纖維組成的網(wǎng)絡結構，包括微絲、微管和中間纖維等，它在維持細胞的形態(tài)、結構和功能方面發(fā)揮著重要作用。細胞骨架不僅為細胞提供機械支撐，還參與細胞的運動、分裂、物質運輸和信號傳遞等過程。在腫瘤細胞中，細胞骨架的結構和功能發(fā)生改變，與腫瘤的侵襲、轉移和耐藥密切相關。微管蛋白是構成微管的主要成分，微管在細胞有絲分裂過程中起著關鍵作用，參與染色體的分離和細胞的分裂。研究發(fā)現(xiàn)，一些化療藥物通過作用于微管蛋白，破壞微管的正常結構和功能，從而抑制腫瘤細胞的增殖。然而，腫瘤細胞可以通過改變微管蛋白的表達或結構，產(chǎn)生耐藥性。Sorcin與細胞骨架蛋白相互作用，可能影響細胞骨架的穩(wěn)定性和功能，進而影響胃癌細胞的耐藥性。Sorcin可能與微管蛋白相互作用，改變微管的組裝和穩(wěn)定性，使腫瘤細胞對作用于微管的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。信號轉導相關蛋白有13個。信號轉導是細胞對外界信號做出響應的過程，通過一系列信號分子的相互作用，將細胞外信號傳遞到細胞內，調節(jié)細胞的生理功能。在腫瘤細胞中，信號轉導通路常常異常激活或失調，導致腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等過程失控。一些信號轉導相關蛋白，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥中發(fā)揮著關鍵作用。MAPK信號通路可以被多種細胞外刺激激活，通過級聯(lián)反應，調節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡等過程。在胃癌多藥耐藥細胞中，MAPK信號通路可能被異常激活，促進耐藥相關基因的表達，增強腫瘤細胞的耐藥性。Sorcin與信號轉導相關蛋白相互作用，可能參與調節(jié)信號轉導通路，影響胃癌細胞的耐藥性。Sorcin可能與MAPK信號通路中的關鍵蛋白相互作用，調節(jié)其活性，從而影響耐藥相關基因的表達和腫瘤細胞的耐藥性。酶解相關蛋白有7個。酶解過程在細胞內的蛋白質代謝、信號傳導和細胞周期調控等方面發(fā)揮著重要作用。酶解相關蛋白，如蛋白酶體亞基、泛素連接酶等，參與蛋白質的降解過程。蛋白質的降解是一個高度有序的過程，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS），蛋白質首先被泛素標記，然后被蛋白酶體識別并降解。在腫瘤細胞中，UPS系統(tǒng)的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關。一些耐藥相關蛋白可以通過UPS系統(tǒng)被降解，從而影響腫瘤細胞的耐藥性。Sorcin與酶解相關蛋白相互作用，可能調節(jié)蛋白質的降解過程，影響耐藥相關蛋白的水平，進而參與胃癌多藥耐藥的調控。Sorcin可能與泛素連接酶相互作用，調節(jié)其對耐藥相關蛋白的泛素化修飾，影響耐藥相關蛋白的降解速率，從而改變胃癌細胞的耐藥性。此外，還有7個功能未知蛋白。這些功能未知蛋白的發(fā)現(xiàn)為研究Sorcin在胃癌多藥耐藥中的作用機制提供了新的線索。雖然目前對它們的功能了解甚少，但它們與Sorcin的相互作用表明，它們可能在胃癌多藥耐藥過程中發(fā)揮著重要作用。通過進一步的研究，如基因敲除、過表達實驗以及蛋白質組學和生物信息學分析等，有望揭示這些功能未知蛋白的功能及其與Sorcin的相互作用機制，為深入理解胃癌多藥耐藥的分子機制提供新的視角。五、Sorcin相互作用蛋白與胃癌多藥耐藥關系的深入研究5.1HSP70對胃癌細胞耐藥性的影響熱休克蛋白70（HSP70）作為一種重要的分子伴侶，在細胞的應激反應和蛋白質穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮著關鍵作用。在腫瘤領域，HSP70的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥性密切相關。在胃癌中，HSP70的高表達被認為可能是導致胃癌多藥耐藥的重要因素之一。為了深入探究HSP70對胃癌細胞耐藥性的影響，本研究運用RNA干擾技術，使用HSP70siRNA下調HSP70在SGC7901/VCR中的表達，隨后通過一系列實驗檢測細胞存活率和凋亡情況。在實驗中，首先設計并合成針對HSP70基因的小干擾RNA（siRNA）。根據(jù)HSP70基因的mRNA序列，利用相關設計軟件，篩選出特異性強、干擾效率高的siRNA序列。將設計好的siRNA通過脂質體轉染試劑Lipofectamine2000轉染至SGC7901/VCR細胞中。轉染前，將細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，待細胞生長至70%-80%融合時進行轉染操作。按照Lipofectamine2000試劑的說明書，將siRNA與轉染試劑混合，形成siRNA-轉染試劑復合物。將復合物逐滴加入細胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染48h后，收集細胞，提取總RNA和總蛋白，通過RT-PCR和Westernblotting技術檢測HSP70mRNA和蛋白的表達水平，以驗證HSP70siRNA的干擾效果。結果顯示，轉染HSP70siRNA的細胞中，HSP70mRNA和蛋白的表達水平較對照組明顯降低，表明HSP70siRNA成功下調了HSP70在SGC7901/VCR中的表達。采用MTT法分析下調HSP70表達后細胞存活率的變化。將轉染HSP70siRNA的SGC7901/VCR細胞和對照組細胞（轉染陰性對照siRNA）分別以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度的長春新堿（VCR），使其終濃度分別為0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4h。孵育結束后，吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀上測定490nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗結果表明，隨著長春新堿濃度的增加，轉染HSP70siRNA的細胞存活率明顯低于對照組細胞。在長春新堿濃度為1μmol/L時，對照組細胞存活率為（75.3±5.6）%，而轉染HSP70siRNA的細胞存活率僅為（42.5±4.8）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明下調HSP70的表達能夠顯著降低SGC7901/VCR細胞對長春新堿的耐受性，提高細胞對化療藥物的敏感性。利用Hoechest33258及流式細胞學檢測細胞凋亡情況。將轉染HSP70siRNA的SGC7901/VCR細胞和對照組細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，加入1μmol/L的長春新堿繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入適量的Hoechest33258染色液，室溫下避光孵育10min。將染色后的細胞滴加在載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)。正常細胞的細胞核呈均勻的藍色熒光，而凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)出濃染、碎裂等形態(tài)學變化。結果顯示，轉染HSP70siRNA的細胞中，出現(xiàn)凋亡形態(tài)的細胞數(shù)量明顯多于對照組細胞。采用流式細胞術進一步定量分析細胞凋亡率。收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?個/mL。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，室溫下避光孵育15min。在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。結果表明，轉染HSP70siRNA的細胞凋亡率為（35.6±3.8）%，顯著高于對照組細胞的凋亡率（18.2±2.5）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明下調HSP70的表達能夠促進SGC7901/VCR細胞在長春新堿作用下的凋亡，進一步證實了HSP70在胃癌多藥耐藥中的重要作用。5.2凋亡相關基因表達分析采用RT-PCR檢測長春新堿處理后凋亡相關基因bcl-2及baxmRNA的表達，以初步探討HSP70在胃癌多藥耐藥細胞中可能的作用機制。首先，收集對數(shù)生長期的SGC7901/VCR細胞，分為實驗組（轉染HSP70siRNA）和對照組（轉染陰性對照siRNA）。轉染48h后，向兩組細胞中加入終濃度為1μmol/L的長春新堿，繼續(xù)培養(yǎng)24h。按照Trizol試劑說明書，提取兩組細胞的總RNA。取1μg總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。根據(jù)bcl-2和bax基因的序列，設計特異性引物。bcl-2上游引物序列為5′-[具體序列1]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列2]-3′；bax上游引物序列為5′-[具體序列3]-3′，下游引物序列為5′-[具體序列4]-3′。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和10×PCR緩沖液等，總體積為25μL。反應條件為：95℃預變性5min；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。PCR擴增結束后，取5-10μL擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，根據(jù)條帶的亮度和位置來判斷bcl-2及baxmRNA的表達情況。以GAPDH作為內參基因，對bcl-2及baxmRNA的表達水平進行半定量分析。計算目的基因與內參基因條帶灰度值的比值，以該比值表示目的基因的相對表達量。實驗結果顯示，對照組細胞中bcl-2mRNA的相對表達量為（1.25±0.12），而實驗組細胞中bcl-2mRNA的相對表達量為（0.68±0.08），實驗組明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明下調HSP70的表達后，在長春新堿的作用下，細胞中抗凋亡基因bcl-2的表達受到抑制。在baxmRNA的表達方面，對照組細胞中baxmRNA的相對表達量為（0.56±0.06），實驗組細胞中b