肝素鈉提取與其乳膏制備第一頁，共24頁。研究背景肝素鈉的提取分析總結(jié)CONTANTS肝素鈉效價的測定肝素鈉乳膏的制備第二頁，共24頁。研究背景Itwasthebestoftimes,itwastheworstoftimes;itwastheageofwisdom,itwastheageoffoolishness.第三頁，共24頁。肝素鈉

(HeparinSodium

)：從動物結(jié)締組織的肥大細胞提取的鈉鹽,，屬粘多糖類物質(zhì)。天然抗凝血物質(zhì),被廣泛用于治療血栓塞、暴發(fā)性流腦、敗血癥等疾病。從生物學角度來講,肝素鈉是一種含硫酸脂的氨基葡萄糖、艾杜糖醛酸和葡萄糖酸的生物活性物質(zhì)。在機體內(nèi)它與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物存在于肥大細胞中,可被蛋白酶解離出來,它在溶液中呈強電荷的聚陰離子狀態(tài),與強堿性D208陰離子樹脂有較強的親和力,易被吸附而分離。研究背景肝素鈉結(jié)構(gòu)式第四頁，共24頁。

臨床上肝素鈉的常見劑型包括注射劑和乳膏劑。乳膏劑是外用法給藥的劑型之一，通過皮膚、孔竅、經(jīng)絡(luò)及病變局部等部位治療疾病，避免了胃腸道的破壞與肝首過效應(yīng)，減少血藥濃度峰谷變化，已成為克服藥物副作用的有效用藥途徑之一。肝素鈉乳膏劑（HeparinsodiumCream）常用于早期凍瘡、皸裂、潰瘍、濕疹及淺表性靜脈炎和軟組織損傷。

工藝現(xiàn)狀：以豬小腸粘膜提取肝素鈉為主；

生產(chǎn)得率較低,且混有大量有害物質(zhì),不利于臨床應(yīng)用；需大量進口,價格昂貴。研究背景第五頁，共24頁。肝素鈉的提取Itwasthebestoftimes,itwastheworstoftimes;itwastheageofwisdom,itwastheageoffoolishness.第六頁，共24頁。實驗方法：1.原料采集及酶解吸附2.離子交換吸附2.1D208樹脂預(yù)處理2.2吸附與洗脫靜態(tài)吸附：將上述樹脂加入到已處理好的酶解液中，混勻，調(diào)節(jié)pH至8.5，置于混合器上攪拌過夜吸附。線性洗脫：裝填靜態(tài)吸附后的樹脂，按下表配置洗脫液。靜態(tài)洗脫：取動態(tài)洗脫的樹脂于燒杯，加入4mol/LNacl溶液，攪拌吸附30min，取上清液，留樣。3.肝素鈉的精制試劑體積（ml）重量（g）3%Nacl1002.93mol/LNacl10017.50.5mol/LNacl250.74mol/LNacl20046.8肝素鈉的提取第七頁，共24頁。實驗結(jié)果：1.離子交換吸附

肝素鈉洗脫曲線圖在肝素鈉動態(tài)洗脫曲線圖中有一峰谷，代表洗脫出來的是雜質(zhì)峰，在此之前和之后分別有一個持續(xù)平衡的吸光度范圍，其吸光值為，由此可判斷A=0.513為儀器在220nm處可顯示的最大吸光度。第二個下降區(qū)吸光度由0.513下降至0.086，表示樹脂上的物質(zhì)逐漸洗脫完全。肝素鈉的提取第八頁，共24頁。在第二個穩(wěn)定吸光度區(qū)（）收集洗脫液與加入乙醇后對比，呈現(xiàn)明顯的渾濁，見圖3。其原因可能是由于肝素鈉是一種多糖，加入乙醇后通過降低水溶液的介電常數(shù)脫水，從而產(chǎn)生沉淀分離。在反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)：加熱會使渾濁溶液澄清，而冷凍會增加沉淀析出量，所以反應(yīng)受到溫度的影響；當然反應(yīng)過程中乙醇濃度增大時，沉淀析出量也會增加。處洗脫液加入乙醇前（左）和加入乙醇后（右）對比圖2.肝素鈉的精制白色略黃肝素鈉粉末，共0.0131g肝素鈉成品肝素鈉的提取第九頁，共24頁。肝素鈉的效價測定Itwasthebestoftimes,itwastheworstoftimes;itwastheageofwisdom,itwastheageoffoolishness.第十頁，共24頁。實驗方法：1.效價測定按下表處理標準品、樣品及成品：肝素鈉溶液濃度（u/mL）血漿（mL）肝素稀釋液（mL）1%Cacl2溶液（mL）空白-0.25-0.05標準品0.9690.250.20.051.140.250.20.051.3410.250.20.05樣品1號稀釋10倍0.250.20.05樣品2號稀釋10倍0.250.20.05成品0.000026g/mL0.1250.10.025先加入血漿，置37±0.5℃恒溫水浴保溫5min；取出后加入肝素鈉溶液，然后迅速加入1%Cacl2溶液，37±0.5℃恒溫水浴保溫3min。肝素鈉的效價測定第十一頁，共24頁。2.紫外吸收測定用純水將紫外檢測儀校零（220nm、280nm）,按下表配置溶液測定。

肝素鈉溶液稀釋倍數(shù)吸光倍數(shù)220nm樣品1號1000.05A樣品2號1000.05A成品51A280nm樣品1號500.05A樣品2號500.05A成品500.05A肝素鈉的效價測定第十二頁，共24頁。實驗結(jié)果：1.肝素鈉的效價測定標準品效價測定中，0.969U/mL標準品管血清出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，以此管為參照。樣品1號、2號管血漿均出現(xiàn)半凝固狀態(tài)。樣品效價：0.969U/mL×10=9.69U/mL。成品效價：0.969U/mL÷0.000026g/mL=37.27U/mg。效價測定半凝固點圖（從右至左依次為標準品0.969U/mL、樣品1號、樣品2號、成品）肝素鈉的效價測定第十三頁，共24頁。實驗結(jié)果：2.肝素鈉紫外吸收測定于220nm處測定肝素鈉吸光度，280nm處測定殘留蛋白吸光度，結(jié)果見下表。蛋白質(zhì)由于含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其分子內(nèi)部存在共軛雙鍵，在280nm處有一特征吸收峰，但因肽鍵的存在，在220nm處也有一吸收峰，故對肝素鈉的紫外測定存在干擾。

肝素鈉溶液吸光度

220nm樣品1號0.1410.705樣品2號0.1190.595成品0.2561.28280nm樣品1號0.1810.4525樣品2號0.1530.3575成品0.4851.2125肝素鈉的效價測定第十四頁，共24頁。肝素鈉乳膏的制備Itwasthebestoftimes,itwastheworstoftimes;itwastheageofwisdom,itwastheageoffoolishness.第十五頁，共24頁。實驗方法1.乳膏的制備處方：肝素鈉7.9mg液體石蠟11mL硬脂酸1.5g蜂蠟2.4g石蠟2.6g硼砂0.1g純水3.3mL

按處方精密稱取液體石蠟、石蠟、硬脂酸、蜂蠟在水浴上加熱融化，并保持溫度90℃，得油相備用。按處方量稱取肝素鈉、硼砂溶解于純水中，并保持溫度90℃，得水相備用。先將油相2/5緩慢加入水相中，邊加邊攪拌至初乳形成。將初乳緩慢滴加至油相中，室溫下迅速攪拌，至溫度下降至室溫，既得肝素鈉油包水型乳劑。肝素鈉乳膏的制備第十六頁，共24頁。實驗方法2.乳膏的顯微觀察取30%甘油一滴于載玻片上，用玻璃棒蘸取實驗樣品少量，取少量蘇丹紅顆粒染色，涂勻，40/0.65倍鏡下觀察。3.質(zhì)量評價外觀、感受、酸堿度、焰色反應(yīng)、效價測定穩(wěn)定性試驗：將乳膏分裝于3個塑料燒杯中。1號杯置于室溫，2號杯置于55℃培養(yǎng)箱中，3號杯置于-15℃冰箱中。24小時后觀察。肝素鈉乳膏的制備第十七頁，共24頁。實驗結(jié)果1.肝素鈉乳膏顯微觀察肝素鈉乳膏未經(jīng)染色時呈現(xiàn)晶塊狀，染色后可明顯觀察到小顆粒狀油球，表明乳膏出現(xiàn)了一定的均勻狀態(tài)，其原理是蘇丹紅Ⅲ在脂類物質(zhì)中的溶解度大于在溶劑中的溶解度，當接觸脂質(zhì)類時，進入脂類內(nèi)部呈色。肝素鈉乳膏（未染色）顯微觀察肝素鈉乳膏（染色）顯微觀察肝素鈉乳膏的制備第十八頁，共24頁。實驗結(jié)果2.肝素鈉乳膏質(zhì)量評價性狀：乳白色肝素鈉乳膏，十分粘稠，細膩無顆粒。酸堿度：pH=7.37焰色反應(yīng)：火焰呈黃色肝素鈉乳膏肝素鈉乳膏焰色反應(yīng)肝素鈉乳膏的制備第十九頁，共24頁。實驗結(jié)果2.肝素鈉乳膏質(zhì)量評價效價測定：稀釋0,1,10,20倍數(shù)后進行效價測定，每管都出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，以未稀釋管計算效價：4.845U/g×17.72595g=85.88U

穩(wěn)定性實驗：24小時后，分別觀察耐熱、常溫、耐寒條件下肝素鈉乳膏狀態(tài)，可明顯觀察到耐熱試驗中肝素鈉乳膏油水分層。肝素鈉乳膏效價測定（從左至右依次為稀釋0、1、10、20倍數(shù)）肝素鈉穩(wěn)定性實驗肝素鈉乳膏的制備第二十頁，共24頁。討論與分析Itwasthebestoftimes,itwastheworstoftimes;itwastheageofwisdom,itwastheageoffoolishness.第二十一頁，共24頁。1.工藝流程腸粘膜必須新鮮,由于粘膜污染有許多微生物,長時間保存會發(fā)酵產(chǎn)生肝素酶,分解肝素鈉。酶解一方面使肝素釋放，另一方面又要除去大量雜蛋白，以防大分子雜質(zhì)堵塞樹脂孔徑而影響對肝素分子的吸附。pH略大一方面有利于增大肝素離子化程度，以便于最大程度吸附；另一方面不會對官能團離子化產(chǎn)生大的影響，吸附率下降可能與樣品中雜質(zhì)離子化增大后競爭吸附有關(guān)。乙醇沉淀時,必須在攪拌的同時逐漸加入乙醇,以避免局部乙醇濃度突然增高,而且最好是用預(yù)冷過的乙醇,否則就會使肝素鈉的部分空間構(gòu)象受到破壞,從而降低其活性。