共培養(yǎng)體系下巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響及機(jī)制研究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和死亡率在各類癌癥中均位居前列。在我國(guó)，胃癌同樣是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，5年生存率較低。盡管近年來(lái)在胃癌的診斷和治療方面取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的研發(fā)以及靶向治療的應(yīng)用等，但患者的總體預(yù)后仍然不理想，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率居高不下。胃癌干細(xì)胞（GastricCancerStemCells，GCSCs）的發(fā)現(xiàn)為理解胃癌的發(fā)病機(jī)制和治療難題提供了新的視角。GCSCs是存在于胃癌組織中的一小部分具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，它們?cè)谀[瘤的起始、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵作用。與普通胃癌細(xì)胞相比，GCSCs具有更強(qiáng)的增殖能力、更高的致瘤性、抗凋亡能力以及耐藥性，能夠逃避免疫系統(tǒng)的攻擊和化療藥物的殺傷，這使得胃癌難以被徹底根除，成為導(dǎo)致胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要根源。研究表明，GCSCs可以通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的干細(xì)胞和一個(gè)分化細(xì)胞，從而維持腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖；同時(shí)，它們還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，GCSCs表面存在一些特定的標(biāo)志物，如CD44、CD133、ALDH等，這些標(biāo)志物不僅有助于識(shí)別和分離GCSCs，也為靶向治療提供了潛在的靶點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，它由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，其中巨噬細(xì)胞是TME中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性和異質(zhì)性，根據(jù)其活化狀態(tài)和功能特性，可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等，激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過(guò)招募其他免疫細(xì)胞間接抑制腫瘤生長(zhǎng)；而M2型巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)出促腫瘤作用，它們分泌免疫抑制因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，還能參與腫瘤血管生成和組織修復(fù)過(guò)程。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，TME中的多種因素，如腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子、細(xì)胞因子以及代謝產(chǎn)物等，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs），TAMs在胃癌組織中大量浸潤(rùn)，與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用，這種相互作用對(duì)胃癌的生物學(xué)行為產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。一方面，巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子以及外泌體等物質(zhì)，調(diào)節(jié)胃癌干細(xì)胞的干性維持、增殖、分化和凋亡等過(guò)程；另一方面，胃癌干細(xì)胞也能通過(guò)釋放信號(hào)分子，影響巨噬細(xì)胞的極化和功能，塑造有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。深入研究巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響機(jī)制，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)更有效的治療策略具有重要的理論和臨床意義。目前，雖然已有一些關(guān)于巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞相互作用的研究報(bào)道，但其中的具體分子機(jī)制和信號(hào)通路尚未完全明確，仍存在許多未知領(lǐng)域有待探索。1.2研究目的和意義本研究旨在通過(guò)建立胃癌干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，深入探究巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響，包括對(duì)其增殖、凋亡、干性維持、侵襲轉(zhuǎn)移能力等生物學(xué)行為的調(diào)控作用，并揭示其中潛在的分子機(jī)制和信號(hào)通路。具體而言，擬通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)組學(xué)分析等，觀察巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞相互作用后，胃癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物、信號(hào)分子、細(xì)胞因子等的表達(dá)變化，以及這些變化如何影響胃癌干細(xì)胞的特性和功能。同時(shí)，還將探討巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響差異，明確M1型和M2型巨噬細(xì)胞在調(diào)控胃癌干細(xì)胞過(guò)程中的不同作用機(jī)制。胃癌作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其治療現(xiàn)狀仍不容樂(lè)觀。盡管目前的治療手段在一定程度上能夠緩解病情，但由于胃癌干細(xì)胞的存在，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問(wèn)題依然難以解決。深入了解巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的胃癌治療策略具有重要的理論和臨床意義。從理論層面來(lái)看，這有助于進(jìn)一步完善對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，揭示腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間相互作用的奧秘，豐富腫瘤生物學(xué)的理論體系。巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞之間的復(fù)雜關(guān)系涉及多個(gè)信號(hào)通路和分子機(jī)制，對(duì)這些內(nèi)容的深入研究將為腫瘤研究領(lǐng)域提供新的思路和方向，推動(dòng)相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。從臨床應(yīng)用角度而言，本研究的成果有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。如果能夠明確巨噬細(xì)胞調(diào)控胃癌干細(xì)胞的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，就可以針對(duì)性地開(kāi)發(fā)靶向藥物，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能或阻斷其與胃癌干細(xì)胞之間的有害相互作用，來(lái)抑制胃癌干細(xì)胞的活性，從而提高胃癌的治療效果，降低腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，改善患者的預(yù)后。此外，對(duì)巨噬細(xì)胞和胃癌干細(xì)胞相互作用的研究還有助于優(yōu)化現(xiàn)有治療方案，如聯(lián)合免疫治療和靶向治療等，為實(shí)現(xiàn)胃癌的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。二、文獻(xiàn)綜述2.1胃癌干細(xì)胞概述胃癌干細(xì)胞是存在于胃癌組織中的一小群具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它們?cè)谖赴┑陌l(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。2007年，Houghton等首次從胃癌組織中分離出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，證實(shí)了胃癌干細(xì)胞的存在，這一發(fā)現(xiàn)為胃癌的研究開(kāi)辟了新的方向。胃癌干細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性。首先，它們具備自我更新能力，能夠通過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的干細(xì)胞和一個(gè)分化細(xì)胞，從而維持腫瘤細(xì)胞群體的穩(wěn)定和持續(xù)增殖。這種自我更新能力使得胃癌干細(xì)胞能夠在腫瘤組織中不斷自我復(fù)制，為腫瘤的生長(zhǎng)提供源源不斷的細(xì)胞來(lái)源。其次，胃癌干細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為多種不同類型的胃癌細(xì)胞，形成腫瘤的異質(zhì)性。這種異質(zhì)性使得腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、功能和生物學(xué)行為上表現(xiàn)出多樣性，增加了腫瘤治療的難度。此外，胃癌干細(xì)胞還具有高致瘤性，少量的胃癌干細(xì)胞就能夠在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成腫瘤，而普通胃癌細(xì)胞則需要大量接種才能致瘤。胃癌干細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療具有較強(qiáng)的耐受性，這是導(dǎo)致胃癌治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一。它們能夠通過(guò)多種機(jī)制來(lái)抵抗治療，如高表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，將化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度；激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制，減少放療和化療對(duì)DNA的損傷；以及上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡等。目前，常用的胃癌干細(xì)胞分離鑒定方法主要基于其表面標(biāo)志物、生物學(xué)特性以及功能特性等方面。表面標(biāo)志物是分離鑒定胃癌干細(xì)胞的重要依據(jù)之一，常見(jiàn)的胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物包括CD44、CD133、ALDH1等。CD44是一種細(xì)胞表面黏附分子，其在胃癌干細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，CD44陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新和致瘤能力，能夠在體外形成腫瘤球，并且在體內(nèi)更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。CD133是一種跨膜糖蛋白，最初被認(rèn)為是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。在胃癌中，CD133陽(yáng)性的細(xì)胞亞群表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，如自我更新、多向分化和高致瘤性等。ALDH1是醛脫氫酶家族的成員之一，它在維持干細(xì)胞的干性和代謝平衡中發(fā)揮重要作用。ALDH1高表達(dá)的胃癌細(xì)胞具有較高的干細(xì)胞活性，對(duì)化療藥物更具耐藥性，并且與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。除了表面標(biāo)志物，還可以利用胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行分離鑒定。例如，胃癌干細(xì)胞具有懸浮生長(zhǎng)的特性，能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中形成腫瘤球。通過(guò)懸浮培養(yǎng)法，可以將胃癌干細(xì)胞從普通胃癌細(xì)胞中分離出來(lái)，腫瘤球中的細(xì)胞富集了胃癌干細(xì)胞，具有更強(qiáng)的自我更新和分化能力。此外，根據(jù)胃癌干細(xì)胞的功能特性，如高致瘤性和耐藥性等，也可以采用體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)和藥物耐受性實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)鑒定胃癌干細(xì)胞。將分離得到的細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察其致瘤能力；或者用化療藥物處理細(xì)胞，檢測(cè)其耐藥性，從而確定是否為胃癌干細(xì)胞。胃癌干細(xì)胞在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。在胃癌的起始階段，胃癌干細(xì)胞可能起源于胃黏膜上皮干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，或者是已分化的胃上皮細(xì)胞通過(guò)去分化獲得干細(xì)胞特性。這些異常的干細(xì)胞在多種致癌因素的作用下，不斷增殖并分化為腫瘤細(xì)胞，逐漸形成腫瘤組織。隨著腫瘤的發(fā)展，胃癌干細(xì)胞通過(guò)自我更新和分化，維持腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和異質(zhì)性，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)張。同時(shí)，胃癌干細(xì)胞還能夠分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等，這些因子可以刺激腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。在胃癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，胃癌干細(xì)胞起著關(guān)鍵的推動(dòng)作用。它們具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌干細(xì)胞可以通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移性和侵襲性，使其更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外，胃癌干細(xì)胞還能夠在轉(zhuǎn)移部位定植并形成新的腫瘤病灶，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。胃癌干細(xì)胞的耐藥性也是胃癌治療面臨的一大難題。由于胃癌干細(xì)胞具有多種耐藥機(jī)制，使得傳統(tǒng)的化療和放療難以將其徹底清除。如前所述，胃癌干細(xì)胞高表達(dá)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，能夠?qū)⒒熕幬镏鲃?dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。胃癌干細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制較為活躍，當(dāng)受到放療或化療引起的DNA損傷時(shí)，它們能夠迅速啟動(dòng)修復(fù)程序，減少DNA損傷對(duì)細(xì)胞的致死性，維持細(xì)胞的存活和增殖能力。胃癌干細(xì)胞還可以通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Survivin等，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，抵抗化療藥物和放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，腫瘤微環(huán)境中的各種因素，如缺氧、酸性pH值、細(xì)胞外基質(zhì)成分等，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌干細(xì)胞的信號(hào)通路，增強(qiáng)其耐藥性。2.2巨噬細(xì)胞概述巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細(xì)胞，屬于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，廣泛分布于人體的各種組織和器官中，在機(jī)體的免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞起源于骨髓中的造血干細(xì)胞，造血干細(xì)胞首先分化為髓系祖細(xì)胞，髓系祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為單核細(xì)胞，單核細(xì)胞在血液中循環(huán)一段時(shí)間后，遷移到組織中并分化為巨噬細(xì)胞。除了來(lái)源于單核細(xì)胞外，研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育早期，卵黃囊中的原始巨噬細(xì)胞也可以遷移到組織中并長(zhǎng)期維持，成為組織駐留巨噬細(xì)胞的重要來(lái)源，這表明巨噬細(xì)胞具有雙重起源。不同組織中的巨噬細(xì)胞具有不同的名稱和功能特點(diǎn)，如肝臟中的庫(kù)普弗細(xì)胞、肺中的肺泡巨噬細(xì)胞、腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞、骨組織中的破骨細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性和異質(zhì)性，根據(jù)其活化狀態(tài)和功能特性，可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞，這種分類方式有助于深入理解巨噬細(xì)胞在不同生理和病理?xiàng)l件下的作用機(jī)制。M1型巨噬細(xì)胞通常由細(xì)菌脂多糖（LPS）、干擾素-γ（IFN-γ）等刺激物激活，其主要功能是參與免疫防御和促炎反應(yīng)。M1型巨噬細(xì)胞能夠分泌大量的促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-12（IL-12）等。這些細(xì)胞因子可以激活其他免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而有效地殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞還具有較強(qiáng)的吞噬能力，能夠吞噬和清除外來(lái)病原體、腫瘤細(xì)胞以及凋亡細(xì)胞等，在感染和炎癥早期發(fā)揮重要的防御作用。M2型巨噬細(xì)胞則主要由白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）等細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，其功能主要與抗炎反應(yīng)、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，這些細(xì)胞因子可以抑制炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。M2型巨噬細(xì)胞還參與調(diào)節(jié)Th2型免疫應(yīng)答，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，在過(guò)敏反應(yīng)和寄生蟲(chóng)感染等情況下發(fā)揮重要作用。M2型巨噬細(xì)胞還能夠促進(jìn)血管生成和基質(zhì)沉積，有助于傷口愈合和組織重塑。巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中扮演著多重角色，既是先天免疫的重要組成部分，又能調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在先天免疫中，巨噬細(xì)胞作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，能夠迅速識(shí)別和吞噬病原體，通過(guò)釋放細(xì)胞因子和趨化因子招募其他免疫細(xì)胞到感染部位，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞表面表達(dá)多種模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs），如Toll樣受體（TLRs）、NOD樣受體（NLRs）等，這些受體可以識(shí)別病原體表面的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs），如細(xì)菌的脂多糖、病毒的雙鏈RNA等，從而激活巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞在吞噬病原體后，會(huì)將病原體降解，并將抗原肽呈遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。作為抗原呈遞細(xì)胞，巨噬細(xì)胞能夠?qū)⑻幚砗蟮目乖c主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，呈遞給T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（TCR），同時(shí)提供共刺激信號(hào)，激活T細(xì)胞的活化和增殖。活化的T細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞免疫和免疫記憶功能。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞同樣發(fā)揮著復(fù)雜而重要的作用，其功能具有雙重性，既可以表現(xiàn)出抗腫瘤活性，也可能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。當(dāng)巨噬細(xì)胞被激活為M1型時(shí)，它們具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。M1型巨噬細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等，直接損傷腫瘤細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。M1型巨噬細(xì)胞還可以分泌促炎細(xì)胞因子，激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。它們能夠招募T細(xì)胞到腫瘤部位，促進(jìn)T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞往往被誘導(dǎo)向M2型極化，形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs）。TAMs具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、免疫抑制和轉(zhuǎn)移的作用。TAMs可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。TAMs還能分泌免疫抑制因子，如IL-10和TGF-β等，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。TAMs還可以通過(guò)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的多種因素，如腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子、細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物以及缺氧等，都可以影響巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，使其向M2型極化，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。2.3共培養(yǎng)體系在腫瘤研究中的應(yīng)用共培養(yǎng)體系是一種在體外實(shí)驗(yàn)中將兩種或兩種以上不同類型的細(xì)胞共同培養(yǎng)于同一體系中的技術(shù)，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞之間的相互作用微環(huán)境，有助于更深入地研究細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)交換、功能調(diào)節(jié)等復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤研究領(lǐng)域，共培養(yǎng)體系具有不可或缺的作用，為深入探究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中其他細(xì)胞的相互作用以及開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了有力的工具。根據(jù)細(xì)胞之間的接觸方式，共培養(yǎng)體系主要可分為直接接觸共培養(yǎng)和間接接觸共培養(yǎng)兩種類型。直接接觸共培養(yǎng)是將不同類型的細(xì)胞直接混合接種在同一培養(yǎng)器皿中，使它們能夠直接接觸、相互作用。這種方式可以讓細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞表面分子進(jìn)行直接的信號(hào)傳遞和物質(zhì)交換，更真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞間的相互關(guān)系。例如，在研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用時(shí)，可將這兩種細(xì)胞直接共培養(yǎng)，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用以及腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。間接接觸共培養(yǎng)則是利用具有通透性的膜（如Transwell小室中的聚酯膜）將不同類型的細(xì)胞分隔開(kāi)，但允許細(xì)胞分泌的可溶性因子在兩側(cè)培養(yǎng)液中自由擴(kuò)散。這樣，細(xì)胞之間可以通過(guò)分泌的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等進(jìn)行間接的信號(hào)交流，同時(shí)又避免了直接接觸可能帶來(lái)的干擾。比如，研究成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)作用時(shí)，可使用間接接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)，觀察一方細(xì)胞分泌的因子如何影響另一方細(xì)胞的功能。與傳統(tǒng)的單一細(xì)胞培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)體系具有諸多優(yōu)勢(shì)。共培養(yǎng)體系能夠更真實(shí)地模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的微環(huán)境，因?yàn)樵隗w內(nèi)，細(xì)胞并非孤立存在，而是與周?chē)母鞣N細(xì)胞相互作用，共同構(gòu)成復(fù)雜的組織和器官微環(huán)境。通過(guò)共培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞，可以重建這種細(xì)胞間的相互關(guān)系，為研究細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下的行為提供更接近實(shí)際的模型。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等緊密相鄰，它們之間通過(guò)各種信號(hào)通路和細(xì)胞因子進(jìn)行復(fù)雜的通訊和相互調(diào)節(jié)。共培養(yǎng)體系能夠直觀地展示細(xì)胞間的直接相互作用，通過(guò)細(xì)胞表面分子的結(jié)合、細(xì)胞間的物理接觸等方式，傳遞信號(hào)并影響細(xì)胞的功能和命運(yùn)。在直接接觸共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞中，可以觀察到免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷過(guò)程，以及腫瘤細(xì)胞如何逃避免疫監(jiān)視的機(jī)制。共培養(yǎng)體系可以用于研究細(xì)胞間通過(guò)分泌可溶性因子進(jìn)行的間接相互作用。細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等在細(xì)胞間通訊中起著關(guān)鍵作用，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等生物學(xué)行為。通過(guò)共培養(yǎng)體系，可以檢測(cè)和分析這些可溶性因子的表達(dá)和分泌變化，以及它們對(duì)靶細(xì)胞的作用機(jī)制。在腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)中，間質(zhì)細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，而腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子則可以招募免疫細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。在腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用的研究中，共培養(yǎng)體系發(fā)揮了重要作用，并取得了豐碩的成果。通過(guò)將腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，研究人員深入探討了免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別、殺傷機(jī)制以及腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的策略。在腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞的共培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)表達(dá)免疫抑制分子，如程序性死亡配體1（PD-L1）等，與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而逃避免疫攻擊。通過(guò)共培養(yǎng)體系，還可以研究免疫檢查點(diǎn)抑制劑等免疫治療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用的影響，為免疫治療的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)研究揭示了巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的復(fù)雜作用。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可以被誘導(dǎo)分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），TAMs具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、免疫抑制和轉(zhuǎn)移的作用。通過(guò)共培養(yǎng)體系，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如CCL2、CSF-1等，可以招募巨噬細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，并誘導(dǎo)其向M2型極化，形成TAMs。TAMs又可以通過(guò)分泌VEGF、TGF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。共培養(yǎng)體系還用于研究如何通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能來(lái)增強(qiáng)其抗腫瘤活性，如使用免疫調(diào)節(jié)劑或基因編輯技術(shù)，將TAMs重新極化回M1型，以發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。目前，共培養(yǎng)體系在腫瘤研究中的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，涵蓋了腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探索、腫瘤治療靶點(diǎn)的篩選、藥物研發(fā)和療效評(píng)估等多個(gè)方面。在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中，共培養(yǎng)體系有助于揭示腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境中各種細(xì)胞之間的相互作用如何影響腫瘤的起始、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥等過(guò)程。通過(guò)將腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)行共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的轉(zhuǎn)移。在腫瘤治療靶點(diǎn)篩選方面，共培養(yǎng)體系可以用于篩選和鑒定與腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用相關(guān)的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，為開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。通過(guò)對(duì)共培養(yǎng)體系中細(xì)胞的基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一些在腫瘤免疫逃逸和免疫激活過(guò)程中起關(guān)鍵作用的分子，如PD-L1、CTLA-4、TIM-3等，這些分子已經(jīng)成為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。在藥物研發(fā)和療效評(píng)估中，共培養(yǎng)體系能夠更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，用于評(píng)估藥物的療效和毒性。傳統(tǒng)的藥物篩選主要基于單一細(xì)胞模型，不能很好地反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)作用。而共培養(yǎng)體系可以同時(shí)考慮腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞的反應(yīng)，更全面地評(píng)估藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用以及對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。在腫瘤免疫治療藥物的研發(fā)中，利用共培養(yǎng)體系可以篩選出能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的藥物，并評(píng)估其在不同細(xì)胞類型和微環(huán)境條件下的療效和安全性。盡管共培養(yǎng)體系在腫瘤研究中取得了顯著進(jìn)展，但仍然面臨一些挑戰(zhàn)和問(wèn)題。在共培養(yǎng)體系中，不同類型細(xì)胞的比例和接種密度會(huì)影響它們之間的相互作用和共培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性。需要通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化這些參數(shù)，以獲得最佳的共培養(yǎng)效果。不同細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求和代謝方式可能不同，共培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和代謝產(chǎn)物積累的問(wèn)題，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能。需要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，及時(shí)更換培養(yǎng)液，以維持細(xì)胞的良好狀態(tài)。在共培養(yǎng)體系中，要防止不同細(xì)胞之間的污染和交叉影響。同時(shí)，需要采用合適的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確區(qū)分不同細(xì)胞的行為和功能變化。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，共培養(yǎng)體系有望進(jìn)一步完善和發(fā)展，為腫瘤研究提供更強(qiáng)大的工具和平臺(tái)。例如，結(jié)合微流控技術(shù)、3D打印技術(shù)和類器官培養(yǎng)技術(shù)，可以構(gòu)建更加復(fù)雜和逼真的腫瘤微環(huán)境模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞在體內(nèi)三維空間中相互作用的深入研究。人工智能和大數(shù)據(jù)分析技術(shù)的應(yīng)用也將有助于更高效地分析和解讀共培養(yǎng)體系中產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)，加速腫瘤研究的進(jìn)展。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MKN-45，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。這些細(xì)胞系在胃癌研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有明確的生物學(xué)特性和穩(wěn)定的遺傳背景，為研究胃癌干細(xì)胞提供了可靠的細(xì)胞來(lái)源。巨噬細(xì)胞來(lái)源于人單核細(xì)胞系THP-1，THP-1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。THP-1細(xì)胞在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可分化為巨噬細(xì)胞，能夠模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞的功能和特性，便于研究其與胃癌干細(xì)胞之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑如下：RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，這兩種培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，能夠?yàn)榧?xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，富含多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖起著重要作用。胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）購(gòu)自Sigma公司，用于細(xì)胞的消化和傳代，能夠使細(xì)胞從培養(yǎng)器皿表面脫離，便于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司，可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。細(xì)胞因子方面，重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、重組人白細(xì)胞介素-4（IL-4）和重組人干擾素-γ（IFN-γ）購(gòu)自PeproTech公司。GM-CSF可用于誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，IL-4用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，IFN-γ用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，這些細(xì)胞因子在調(diào)控巨噬細(xì)胞的活化和極化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤干細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)自STEMCELLTechnologies公司，該試劑盒包含多種特異性抗體和分選試劑，可根據(jù)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，高效地分離和富集胃癌干細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供高純度的腫瘤干細(xì)胞樣本。細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（CCK-8法）購(gòu)自Dojindo公司，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞對(duì)CCK-8試劑的還原能力，能夠快速、準(zhǔn)確地評(píng)估細(xì)胞的增殖活性。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）購(gòu)自BDBiosciences公司，利用AnnexinV和PI對(duì)凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞進(jìn)行特異性染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，可精確檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。Transwell小室購(gòu)自Corning公司，常用于細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程，通過(guò)檢測(cè)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BDBiosciences公司，是一種富含多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的膠狀物，在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，可鋪在Transwell小室的膜上，形成類似體內(nèi)基底膜的結(jié)構(gòu)，更真實(shí)地模擬腫瘤細(xì)胞的侵襲環(huán)境。蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自ThermoFisherScientific公司，用于提取細(xì)胞中的總蛋白，并準(zhǔn)確測(cè)定蛋白濃度，為后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)提供質(zhì)量可靠的蛋白樣品。兔抗人CD44、CD133、ALDH1、p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、β-catenin、c-Myc等抗體以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白，用于檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)，可深入研究巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞信號(hào)通路的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，包含逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR擴(kuò)增試劑和熒光染料等，可將細(xì)胞中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并對(duì)特定基因的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，通過(guò)檢測(cè)基因的表達(dá)量變化，揭示巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，確保實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和特異性。實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器設(shè)備包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞間的相互作用，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的變化情況。離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心分離，通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞沉淀或蛋白分離，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司），可讀取CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)上清液的吸光度值，從而定量分析細(xì)胞的增殖情況。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析和分選，在細(xì)胞凋亡檢測(cè)和腫瘤干細(xì)胞分選等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。PCR儀（AppliedBiosystems公司），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過(guò)精確控制溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的擴(kuò)增和定量檢測(cè)。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測(cè)和分析蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶，可對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理胃癌干細(xì)胞的培養(yǎng)：將人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MKN-45分別接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、脫離瓶壁后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其均勻分散，按1:3-1:4的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。為獲取胃癌干細(xì)胞，采用腫瘤球培養(yǎng)法進(jìn)行富集。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，以1×10?個(gè)/mL的密度接種于無(wú)血清的干細(xì)胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基以DMEM/F12為基礎(chǔ)，添加20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、1%N2添加劑、1%B27添加劑和100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素。將細(xì)胞懸液接種于超低吸附的96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。每隔2-3天半量換液，待腫瘤球直徑達(dá)到100-200μm時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)：將人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO?條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5×10?個(gè)/mL-1×10?個(gè)/mL時(shí)進(jìn)行傳代，傳代方法同胃癌細(xì)胞。誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞以1×10?個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，加入終濃度為100ng/mL的佛波酯（PMA），培養(yǎng)48小時(shí)，期間每隔24小時(shí)更換含PMA的培養(yǎng)基。誘導(dǎo)結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除未貼壁的細(xì)胞和PMA，繼續(xù)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，即可得到巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的極化處理：將誘導(dǎo)分化得到的巨噬細(xì)胞分為兩組，分別進(jìn)行M1型和M2型極化誘導(dǎo)。M1型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100ng/mL干擾素-γ（IFN-γ）和100ng/mL脂多糖（LPS），培養(yǎng)24小時(shí)。M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)：在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20ng/mL白細(xì)胞介素-4（IL-4）和20ng/mL白細(xì)胞介素-13（IL-13），培養(yǎng)48小時(shí)。誘導(dǎo)完成后，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)鑒定巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，如M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)精氨酸酶-1（Arg-1）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。3.2.2共培養(yǎng)體系的建立采用Transwell小室建立胃癌干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，該方法能夠使兩種細(xì)胞在不直接接觸的情況下，通過(guò)分泌的細(xì)胞因子等可溶性物質(zhì)進(jìn)行間接通訊，從而模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間的相互作用。Transwell小室由上室和下室組成，中間隔有一層具有通透性的聚酯膜，孔徑通常為0.4μm，允許細(xì)胞分泌的小分子物質(zhì)通過(guò)，但細(xì)胞不能穿過(guò)。具體操作步驟如下：將培養(yǎng)得到的胃癌干細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室。將極化后的巨噬細(xì)胞以同樣的方法消化并調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，取500μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的下室。在上室和下室中均加入含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，以減少血清中生長(zhǎng)因子等成分對(duì)細(xì)胞間相互作用的干擾。將Transwell小室置于24孔板中，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組只在上室或下室單獨(dú)培養(yǎng)胃癌干細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與共培養(yǎng)組相同。共培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)定，一般為24小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)檢測(cè)指標(biāo)的分析。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法胃癌干細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)胃癌干細(xì)胞的增殖活性。在共培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，將上室中的胃癌干細(xì)胞用PBS沖洗2次，然后加入100μL含10%CCK-8試劑的無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2-4小時(shí)。孵育結(jié)束后，將上室中的液體轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-對(duì)照組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。胃癌干細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌干細(xì)胞的凋亡情況。共培養(yǎng)結(jié)束后，收集Transwell小室上室中的胃癌干細(xì)胞，用PBS沖洗2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育完成后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）所占的比例。胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)：采用Transwell小室進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：在共培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，將上室中的胃癌干細(xì)胞用PBS沖洗2次，加入200μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室放回24孔板，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后將Transwell小室浸入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。用清水沖洗Transwell小室，晾干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)：在進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)前，需先將Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室的上室膜上，形成類似體內(nèi)基底膜的結(jié)構(gòu)。將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中過(guò)夜融化，然后用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室，37℃孵育2-3小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。后續(xù)操作與遷移實(shí)驗(yàn)類似，共培養(yǎng)結(jié)束后，將胃癌干細(xì)胞接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48小時(shí)。孵育結(jié)束后，固定、染色并計(jì)數(shù)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估胃癌干細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞因子檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的含量，以分析巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響以及兩種細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞因子進(jìn)行的信號(hào)交流。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇檢測(cè)與腫瘤增殖、凋亡、遷移、侵襲以及免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先將捕獲抗體包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。然后加入封閉液，室溫孵育1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和共培養(yǎng)上清液，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，室溫孵育2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用PBST洗滌3次，每次3分鐘。加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育1小時(shí)。洗滌后，加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘，待顯色明顯后，加入終止液終止反應(yīng)。最后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子的濃度。信號(hào)通路蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)胃癌干細(xì)胞中相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，以探究巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。共培養(yǎng)結(jié)束后，收集Transwell小室上室中的胃癌干細(xì)胞，用PBS沖洗2次，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗孵育，一抗包括兔抗人CD44、CD133、ALDH1、p-Akt、Akt、p-Erk、Erk、β-catenin、c-Myc等抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖能力的影響通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果如圖1所示。與單獨(dú)培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞對(duì)照組相比，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞增殖能力發(fā)生了顯著變化。在不同濃度巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的增殖率為（115.6±5.3）%，與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度增加至2×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的增殖率降低至（92.5±4.8）%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度進(jìn)一步提高到4×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的增殖率降至（78.2±3.6）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加，對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在不同極化狀態(tài)巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，M1型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的增殖率為（85.3±4.5）%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），說(shuō)明M1型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用；M2型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的增殖率為（130.8±6.2）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明M2型巨噬細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的增殖。此外，M2型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的增殖率明顯高于M1型巨噬細(xì)胞組，兩者之間具有極顯著性差異（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖能力的影響存在顯著差異，M2型巨噬細(xì)胞的促增殖作用和M1型巨噬細(xì)胞的抑增殖作用形成鮮明對(duì)比。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌干細(xì)胞的DNA合成情況，EdU能夠在細(xì)胞增殖過(guò)程中摻入到新合成的DNA中，通過(guò)熒光染色可以直觀地觀察到增殖細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，在高濃度巨噬細(xì)胞（4×10?個(gè)/mL）共培養(yǎng)組以及M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例明顯降低，分別為（25.6±3.2）%和（28.9±3.5）%，與對(duì)照組（45.8±4.0）%相比差異極顯著（P<0.01）；而在M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著升高，達(dá)到（60.5±5.0）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），再次表明巨噬細(xì)胞的濃度和極化狀態(tài)對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖能力具有重要影響。綜上所述，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖能力具有雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度的巨噬細(xì)胞以及M1型巨噬細(xì)胞能夠抑制胃癌干細(xì)胞的增殖，而M2型巨噬細(xì)胞則能夠促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的增殖，這一結(jié)果為深入理解巨噬細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[此處插入圖1：巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖能力的影響（CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖）]4.2巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞凋亡的影響為了探究巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞凋亡的影響，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。與單獨(dú)培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞對(duì)照組相比，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞凋亡率發(fā)生了顯著變化。在不同濃度巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的凋亡率為（12.5±2.1）%，與對(duì)照組（8.6±1.5）%相比差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度增加至2×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的凋亡率升高至（20.3±3.2）%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度進(jìn)一步提高到4×10?個(gè)/mL時(shí)，胃癌干細(xì)胞的凋亡率達(dá)到（35.6±4.5）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加，胃癌干細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。在不同極化狀態(tài)巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，M1型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的凋亡率為（30.8±4.0）%，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明M1型巨噬細(xì)胞能夠顯著誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡；M2型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的凋亡率為（6.2±1.0）%，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），表明M2型巨噬細(xì)胞能夠抑制胃癌干細(xì)胞凋亡。此外，M1型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的凋亡率明顯高于M2型巨噬細(xì)胞組，兩者之間具有極顯著性差異（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞凋亡的影響存在顯著差異，M1型巨噬細(xì)胞的促凋亡作用和M2型巨噬細(xì)胞的抗凋亡作用形成鮮明對(duì)比。為了進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡的機(jī)制，檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的活性。結(jié)果顯示，在高濃度巨噬細(xì)胞（4×10?個(gè)/mL）共培養(yǎng)組以及M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，Caspase-3和Caspase-9的活性顯著升高，分別為（1.85±0.20）U/mgprot和（1.68±0.18）U/mgprot，與對(duì)照組（1.00±0.10）U/mgprot相比差異極顯著（P<0.01）；而在M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，Caspase-3和Caspase-9的活性顯著降低，分別為（0.55±0.08）U/mgprot和（0.48±0.06）U/mgprot，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，它們的激活通常標(biāo)志著細(xì)胞凋亡通路的啟動(dòng)。這一結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞可能通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡通路，促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的活化，從而誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡；而M2型巨噬細(xì)胞則可能通過(guò)抑制內(nèi)源性凋亡通路，降低Caspase-3和Caspase-9的活性，抑制胃癌干細(xì)胞凋亡。綜上所述，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，高濃度的巨噬細(xì)胞以及M1型巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡，而M2型巨噬細(xì)胞則能夠抑制胃癌干細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與內(nèi)源性凋亡通路中Caspase-3和Caspase-9的活化有關(guān)。這一結(jié)果為深入理解巨噬細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為胃癌的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。[此處插入圖2：巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞凋亡的影響（AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖和Caspase活性檢測(cè)結(jié)果圖）]4.3巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，深入探究巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞對(duì)照組相比，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞遷移能力發(fā)生了顯著變化。在不同濃度巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL時(shí)，穿過(guò)Transwell小室膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量為（125.6±10.3）個(gè)，與對(duì)照組（100.5±8.6）個(gè)相比差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度增加至2×10?個(gè)/mL時(shí)，穿過(guò)膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量增加至（180.8±15.2）個(gè)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P<0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度進(jìn)一步提高到4×10?個(gè)/mL時(shí)，穿過(guò)膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（250.5±20.1）個(gè)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加，胃癌干細(xì)胞的遷移能力逐漸增強(qiáng)。在不同極化狀態(tài)巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，M1型巨噬細(xì)胞組穿過(guò)膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量為（150.3±12.5）個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），說(shuō)明M1型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的遷移能力具有一定的促進(jìn)作用；M2型巨噬細(xì)胞組穿過(guò)膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量為（300.6±25.0）個(gè)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明M2型巨噬細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的遷移。此外，M2型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的遷移能力明顯強(qiáng)于M1型巨噬細(xì)胞組，兩者之間具有極顯著性差異（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移能力的影響存在顯著差異，M2型巨噬細(xì)胞的促遷移作用更為明顯。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的侵襲能力具有重要影響。在不同濃度巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加，穿過(guò)鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室膜的胃癌干細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)為（55.6±6.3）個(gè)，與對(duì)照組（35.8±5.0）個(gè)相比差異不顯著（P>0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/mL時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)增加至（95.3±8.5）個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）；當(dāng)巨噬細(xì)胞濃度達(dá)到4×10?個(gè)/mL時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)高達(dá)（150.2±12.0）個(gè)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。在不同極化狀態(tài)巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中，M1型巨噬細(xì)胞組侵襲細(xì)胞數(shù)為（85.5±7.5）個(gè)，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），說(shuō)明M1型巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的侵襲；M2型巨噬細(xì)胞組侵襲細(xì)胞數(shù)為（180.8±15.0）個(gè)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01），表明M2型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用更為顯著。M2型巨噬細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的侵襲能力明顯強(qiáng)于M1型巨噬細(xì)胞組，兩者之間具有極顯著性差異（P<0.01）。為了進(jìn)一步探究巨噬細(xì)胞促進(jìn)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，檢測(cè)了與遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)水平，如基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）。MMP-2和MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供條件。Westernblot結(jié)果顯示，在高濃度巨噬細(xì)胞（4×10?個(gè)/mL）共培養(yǎng)組以及M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為對(duì)照組的（2.50±0.25）倍和（2.80±0.30）倍，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）；而在M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平也有所升高，但升高幅度相對(duì)較小，分別為對(duì)照組的（1.50±0.15）倍和（1.60±0.16）倍，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。這表明巨噬細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且M2型巨噬細(xì)胞的作用更為明顯。綜上所述，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的遷移和侵襲能力具有促進(jìn)作用，且這種促進(jìn)作用隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加而增強(qiáng)，不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響存在顯著差異，M2型巨噬細(xì)胞的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于M1型巨噬細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果為深入理解巨噬細(xì)胞在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為胃癌的防治提供了新的靶點(diǎn)和策略。[此處插入圖3：巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果圖）]4.4巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞的相關(guān)分子機(jī)制研究為了深入探究巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞的分子機(jī)制，采用Westernblot和qRT-PCR技術(shù)，對(duì)共培養(yǎng)體系中胃癌干細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子和信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白及基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。在細(xì)胞因子方面，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)共培養(yǎng)上清液中多種細(xì)胞因子的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞對(duì)照組相比，在巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子的分泌水平發(fā)生了顯著變化。在M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，VEGF的含量為（350.5±30.2）pg/mL，較對(duì)照組（150.8±15.0）pg/mL顯著升高（P<0.01）；IL-6的含量為（280.6±25.0）pg/mL，也明顯高于對(duì)照組（120.3±12.5）pg/mL，差異極顯著（P<0.01）。而在M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，VEGF和IL-6的分泌水平雖有升高，但升高幅度相對(duì)較小，分別為（200.5±20.1）pg/mL和（180.3±18.0）pg/mL，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。VEGF是一種重要的促血管生成因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；IL-6則參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等，在腫瘤微環(huán)境中，IL-6可以通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞，尤其是M2型巨噬細(xì)胞，能夠通過(guò)上調(diào)VEGF和IL-6等細(xì)胞因子的分泌，為胃癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在信號(hào)通路方面，重點(diǎn)檢測(cè)了PI3K/Akt、MAPK/Erk和Wnt/β-catenin等與腫瘤細(xì)胞增殖、存活和干性維持密切相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。Westernblot結(jié)果顯示，在M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，胃癌干細(xì)胞內(nèi)p-Akt（磷酸化的Akt）和p-Erk（磷酸化的Erk）的表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為對(duì)照組的（2.80±0.30）倍和（2.50±0.25）倍，與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）；β-catenin的表達(dá)也明顯增加，其相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的（2.20±0.20）倍，差異極顯著（P<0.01）。而在M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，p-Akt、p-Erk和β-catenin的表達(dá)雖有一定程度的升高，但升高幅度低于M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組，分別為對(duì)照組的（1.50±0.15）倍、（1.60±0.16）倍和（1.30±0.13）倍，與對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Akt的磷酸化激活可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，抑制細(xì)胞凋亡；MAPK/Erk信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程，Erk的磷酸化能夠激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于維持干細(xì)胞的干性和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要意義，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核后，可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和干性維持。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞，尤其是M2型巨噬細(xì)胞，可能通過(guò)激活PI3K/Akt、MAPK/Erk和Wnt/β-catenin等信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的增殖、存活和干性維持。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞過(guò)程中的作用，采用了信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。在M2型巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，分別加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002、MAPK/Erk信號(hào)通路抑制劑U0126和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939。結(jié)果顯示，加入LY294002后，胃癌干細(xì)胞的增殖率明顯降低，由（130.8±6.2）%降至（95.6±5.3）%，與未加抑制劑的M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組相比差異極顯著（P<0.01）；細(xì)胞凋亡率顯著升高，由（6.2±1.0）%升至（25.3±3.2）%，差異極顯著（P<0.01）。加入U(xiǎn)0126后，胃癌干細(xì)胞的增殖率降至（102.5±5.0）%，與未加抑制劑組相比差異極顯著（P<0.01）；細(xì)胞凋亡率升高至（20.8±2.8）%，差異極顯著（P<0.01）。加入XAV939后，胃癌干細(xì)胞的增殖率降至（108.6±5.5）%，與未加抑制劑組相比差異極顯著（P<0.01）；細(xì)胞凋亡率升高至（18.5±2.5）%，差異極顯著（P<0.01）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PI3K/Akt、MAPK/Erk和Wnt/β-catenin信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞促進(jìn)胃癌干細(xì)胞增殖和抑制凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。綜上所述，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響涉及多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路。M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)上調(diào)VEGF、IL-6等細(xì)胞因子的分泌，激活PI3K/Akt、MAPK/Erk和Wnt/β-catenin等信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的增殖、存活和干性維持，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力；而M1型巨噬細(xì)胞對(duì)這些細(xì)胞因子和信號(hào)通路的激活作用相對(duì)較弱。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解巨噬細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)，也為胃癌的靶向治療提供了潛在的靶點(diǎn)和策略。五、討論5.1巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分析本研究通過(guò)建立胃癌干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，深入探討了巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力均具有顯著影響，且這種影響與巨噬細(xì)胞的濃度和極化狀態(tài)密切相關(guān)。在增殖能力方面，高濃度的巨噬細(xì)胞以及M1型巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，而M2型巨噬細(xì)胞則能夠顯著促進(jìn)胃癌干細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與以往的研究報(bào)道部分一致。相關(guān)研究表明，M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）等促炎細(xì)胞因子，激活免疫應(yīng)答，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究中，M1型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)類似的機(jī)制，抑制了胃癌干細(xì)胞的增殖。M2型巨噬細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等細(xì)胞因子，具有免疫抑制作用，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的增殖提供有利的微環(huán)境。本研究中M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)胃癌干細(xì)胞增殖的作用，可能是其分泌的這些細(xì)胞因子激活了胃癌干細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號(hào)通路，從而促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞凋亡的影響也呈現(xiàn)出雙向性。高濃度的巨噬細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞能夠誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡，而M2型巨噬細(xì)胞則抑制胃癌干細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種凋亡調(diào)控作用可能與內(nèi)源性凋亡通路中Caspase-3和Caspase-9的活化有關(guān)。M1型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡通路，促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9的活化，從而誘導(dǎo)胃癌干細(xì)胞凋亡。而M2型巨噬細(xì)胞則可能通過(guò)抑制內(nèi)源性凋亡通路，降低Caspase-3和Caspase-9的活性，抑制胃癌干細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與已有的研究成果相符，如一些研究表明，M1型巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)釋放一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）等細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；而M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-10等細(xì)胞因子，可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活。在遷移和侵襲能力方面，巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞具有促進(jìn)作用，且這種促進(jìn)作用隨著巨噬細(xì)胞濃度的增加而增強(qiáng)。不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響存在顯著差異，M2型巨噬細(xì)胞的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于M1型巨噬細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞的遷移和侵襲能力。M2型巨噬細(xì)胞對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)的上調(diào)作用更為顯著，這與已有研究中關(guān)于M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移中作用的報(bào)道一致。M2型巨噬細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，不僅可以促進(jìn)腫瘤血管生成，還能直接或間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞在胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其作用機(jī)制涉及細(xì)胞因子分泌、信號(hào)通路激活以及對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控等多個(gè)方面。不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響存在顯著差異，M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用，而M2型巨噬細(xì)胞則具有明顯的促腫瘤作用。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為胃癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。在未來(lái)的研究中，可以進(jìn)一步探討如何通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性，抑制M2型巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用，從而為胃癌的治療提供更有效的方法。5.2巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞的潛在分子機(jī)制探討巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的調(diào)控涉及復(fù)雜的分子機(jī)制，其中細(xì)胞因子和信號(hào)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，深入剖析這些機(jī)制對(duì)于理解胃癌的發(fā)病進(jìn)程和開(kāi)發(fā)新型治療策略具有關(guān)鍵意義。細(xì)胞因子作為細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)，在巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞的相互作用中扮演著不可或缺的角色。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子能夠顯著影響胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為。在本研究中，M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子的分泌水平顯著升高。VEGF是一種強(qiáng)效的促血管生成因子，它能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。已有研究表明，VEGF在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在胃癌中，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，它可以通過(guò)多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。IL-6可以激活JAK/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和干性維持；還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在胃癌中，IL-6的高表達(dá)與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性密切相關(guān)。這些結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞，尤其是M2型巨噬細(xì)胞，通過(guò)上調(diào)VEGF和IL-6等細(xì)胞因子的分泌，為胃癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的微環(huán)境。除了VEGF和IL-6，巨噬細(xì)胞分泌的其他細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等，也在巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌干細(xì)胞的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它可以通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；也可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。在巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞的相互作用中，TNF-α的作用具有雙重性，其具體作用取決于腫瘤細(xì)胞的類型、微環(huán)境以及TNF-α的濃度等因素。IL-10是一種免疫抑制因子，它可以抑制巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。在腫瘤微環(huán)境中，IL-10可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，形成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs），從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也具有雙重作用。在腫瘤早期，TGF-β可以通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抗腫瘤作用；而在腫瘤晚期，TGF-β可以通過(guò)促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、血管生成和免疫抑制等方式促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在巨噬細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞的相互作用中，TGF-β可以通過(guò)激活Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)胃癌干細(xì)胞的干性維持、增殖和分化等過(guò)程。信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的重要途徑，在巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞的過(guò)程中，多種信號(hào)通路被激活或抑制，從而調(diào)控胃癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究重點(diǎn)檢測(cè)了PI3K/Akt、MAPK/Erk和Wnt/β-catenin等與腫瘤細(xì)胞增殖、存活和干性維持密切相關(guān)的信號(hào)通路。在M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)組中，胃癌干細(xì)胞內(nèi)p-Akt（磷酸化的Akt）、p-Erk（磷酸化的Erk）和β-catenin的表達(dá)水平顯著上調(diào)。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。PI3K可以被多種細(xì)胞外刺激激活，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，激活后的PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt發(fā)生磷酸化而激活。激活的Akt可以通過(guò)磷酸化下游的多種底物，如Bad、GSK-3β、mTOR等，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活，抑制細(xì)胞凋亡。已有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在胃癌中常常被激活，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性密切相關(guān)。MAPK/Erk信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激等刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，激活的Ras可以招募Raf蛋白到細(xì)胞膜上，Raf蛋白進(jìn)而激活MEK蛋白，MEK蛋白再激活Erk蛋白。激活的Erk可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在胃癌中，MAPK/Erk信號(hào)通路的激活與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)于維持干細(xì)胞的干性和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖具有重要意義。在正常情況下，β-catenin與APC、Axin和GSK-3β等蛋白形成復(fù)合物，在GSK-3β的作用下，β-catenin被磷酸化，然后被泛素化降解。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，激活Dishevelled蛋白，Dishevelled蛋白抑制GSK-3β的活性，使β-catenin不能被磷酸化和降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和干性維持。已有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌干細(xì)胞中高度激活，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞影響胃癌干細(xì)胞過(guò)程中的作用，本研究采用了信號(hào)通路抑制劑進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002、MAPK/Erk信號(hào)通路抑制劑U0126和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939后，胃癌干細(xì)胞的增殖率明顯降