具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌篩選及其對腸道菌群的多維度影響研究一、引言1.1研究背景在微生物的世界中，大腸桿菌（Escherichiacoli）與乳酸菌（Lacticacidbacteria）雖同屬細(xì)菌家族，卻扮演著截然不同的角色，它們的相互作用及對腸道菌群的影響，一直是微生物學(xué)和健康領(lǐng)域的重要研究課題。大腸桿菌作為人和動物腸道中的常見菌，在維持腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮著一定作用，比如參與維生素K的合成。然而，部分血清型的大腸桿菌具有致病性，能引發(fā)多種嚴(yán)重的健康問題。致病性大腸桿菌可產(chǎn)生強(qiáng)力毒素，像志賀毒素，這會對腸道上皮細(xì)胞造成直接損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和腸道黏膜的嚴(yán)重炎癥，進(jìn)而引發(fā)腹痛、腹瀉、嘔吐等典型腸道感染癥狀，嚴(yán)重時甚至?xí)霈F(xiàn)膿血便和里急后重感。若是大腸桿菌突破腸道屏障進(jìn)入血液，還可能引發(fā)敗血癥，對于免疫力極為低下的新生兒，它甚至能通過血液侵入大腦，引發(fā)腦膜炎，嚴(yán)重影響后天智力發(fā)育。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年全球因致病性大腸桿菌感染而導(dǎo)致的腹瀉病例高達(dá)數(shù)百萬例，在發(fā)展中國家，尤其是衛(wèi)生條件欠佳、醫(yī)療資源匱乏的地區(qū)，大腸桿菌感染更是引發(fā)嬰幼兒腹瀉和死亡的關(guān)鍵因素之一。乳酸菌則是一類對人和動物健康有著諸多益處的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，在食品、醫(yī)藥、生物工程等多個領(lǐng)域都有著極為廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，乳酸菌是制作酸奶、奶酪、泡菜等發(fā)酵食品不可或缺的發(fā)酵劑，其發(fā)酵過程不僅能產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，賦予食品獨(dú)特的口感和香氣，還能延長食品的保質(zhì)期。在醫(yī)藥領(lǐng)域，乳酸菌作為益生菌，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。它們通過產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸、乙酸等）、細(xì)菌素和過氧化氫等代謝產(chǎn)物，營造一個不利于有害菌生存的酸性環(huán)境，抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等有害菌的生長繁殖。乳酸菌還能與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一道生物屏障，阻止病原菌的黏附和入侵，刺激腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的抵抗力。在人和動物的腸道中，大腸桿菌和乳酸菌共同存在，它們之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。這種相互作用對腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能有著深遠(yuǎn)影響，進(jìn)而與宿主的健康狀況息息相關(guān)。當(dāng)腸道微生態(tài)平衡時，乳酸菌能夠有效抑制大腸桿菌等有害菌的過度生長，維持腸道菌群的穩(wěn)定；然而，一旦腸道微生態(tài)失調(diào)，比如因長期使用抗生素、飲食結(jié)構(gòu)不合理、精神壓力過大等因素，大腸桿菌可能會趁機(jī)大量繁殖，引發(fā)腸道疾病，破壞腸道的正常生理功能。當(dāng)前，隨著人們生活水平的提高和健康意識的增強(qiáng)，對腸道健康的關(guān)注度日益提升。深入研究具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌篩選方法，以及乳酸菌對腸道菌群的影響機(jī)制，對于開發(fā)高效的益生菌制劑、預(yù)防和治療腸道疾病、保障人和動物的健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。一方面，篩選出具有高效抑制大腸桿菌活性的乳酸菌菌株，有望開發(fā)出新型的生物抗菌劑，替代或部分替代傳統(tǒng)的抗生素，從而有效解決抗生素濫用所帶來的耐藥性和藥物殘留等問題；另一方面，深入了解乳酸菌對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用機(jī)制，能夠為優(yōu)化腸道微生態(tài)、改善消化功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力提供科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)新型的功能性食品和保健品奠定堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.2研究目的與意義本研究旨在從眾多微生物中篩選出對大腸桿菌具有顯著抑制活性的乳酸菌菌株，并深入探究其對腸道菌群的影響，包括菌群結(jié)構(gòu)的變化、功能的調(diào)節(jié)以及與宿主健康的關(guān)聯(lián)。在理論層面，通過篩選具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌，能夠進(jìn)一步揭示乳酸菌與大腸桿菌之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制，為微生物生態(tài)學(xué)中種間關(guān)系的研究提供新的案例和數(shù)據(jù)支持。研究乳酸菌對腸道菌群的影響，有助于深入理解腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡維持機(jī)制、微生物群落的演替規(guī)律以及宿主-微生物相互作用的分子基礎(chǔ)，從而豐富和完善腸道微生態(tài)理論體系。此外，篩選過程中所運(yùn)用的各種技術(shù)和方法，如微生物培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定、抑菌活性檢測等，也能夠為微生物篩選領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展和創(chuàng)新提供實(shí)踐經(jīng)驗和理論依據(jù)。在實(shí)踐應(yīng)用方面，篩選出的具有高效抑制大腸桿菌活性的乳酸菌菌株，可作為益生菌應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料等行業(yè)，具有重要的應(yīng)用價值。在食品行業(yè)，這些乳酸菌可用于開發(fā)新型的發(fā)酵食品，如酸奶、發(fā)酵乳飲料、泡菜等，不僅能夠增強(qiáng)食品的風(fēng)味和品質(zhì)，還能提高食品的安全性，延長食品的保質(zhì)期，滿足消費(fèi)者對健康、安全食品的需求。在醫(yī)藥領(lǐng)域，乳酸菌可用于制備益生菌制劑，用于預(yù)防和治療腸道感染性疾病、腹瀉、便秘等腸道功能紊亂疾病，還能輔助治療抗生素相關(guān)性腹瀉、炎癥性腸病等，減少抗生素的使用，降低耐藥性的產(chǎn)生，提高治療效果。在飼料行業(yè)，乳酸菌可作為飼料添加劑添加到動物飼料中，改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境，提高動物的免疫力和抗病能力，促進(jìn)動物的生長發(fā)育，減少動物疾病的發(fā)生，提高養(yǎng)殖效益，同時減少抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用，降低動物產(chǎn)品中的藥物殘留，保障食品安全和人類健康。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乳酸菌篩選方面，國內(nèi)外學(xué)者已從多種來源展開廣泛研究。傳統(tǒng)的乳酸菌篩選方法主要基于微生物培養(yǎng)技術(shù)，通過特定培養(yǎng)基對樣品中的乳酸菌進(jìn)行富集、分離和純化。例如，MRS培養(yǎng)基是乳酸菌分離培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，它為乳酸菌的生長提供了適宜的營養(yǎng)條件，包括碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等。通過將樣品稀釋后涂布在MRS培養(yǎng)基平板上，在厭氧或微需氧條件下培養(yǎng)，可使乳酸菌生長形成菌落，然后根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小等特征初步篩選出疑似乳酸菌菌株。再通過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗等生理生化鑒定方法，進(jìn)一步確定菌株是否為乳酸菌。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCR-DGGE（變性梯度凝膠電泳）、16SrRNA基因測序等分子生物學(xué)技術(shù)在乳酸菌篩選中得到了廣泛應(yīng)用。PCR-DGGE技術(shù)可對樣品中乳酸菌的16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過變性梯度凝膠電泳將不同序列的DNA片段分離，根據(jù)電泳圖譜分析乳酸菌的種類和多樣性。16SrRNA基因測序則是直接對乳酸菌的16SrRNA基因進(jìn)行測序，通過與基因數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，準(zhǔn)確鑒定乳酸菌的種類，這種方法能夠發(fā)現(xiàn)一些傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以分離的乳酸菌菌株，大大提高了乳酸菌篩選的效率和準(zhǔn)確性。在乳酸菌抑制大腸桿菌方面，眾多研究表明乳酸菌能夠通過多種機(jī)制抑制大腸桿菌的生長。產(chǎn)生有機(jī)酸是乳酸菌抑制大腸桿菌的重要機(jī)制之一。乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸能夠降低環(huán)境的pH值，使環(huán)境變得酸性，而大腸桿菌在酸性環(huán)境中的生長會受到抑制。當(dāng)環(huán)境pH值降至4.5以下時，大腸桿菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能會受到破壞，影響其物質(zhì)運(yùn)輸和能量代謝，從而抑制其生長繁殖。乳酸菌還能產(chǎn)生細(xì)菌素、過氧化氫等抑菌物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠直接作用于大腸桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或核酸等，干擾其正常生理功能，導(dǎo)致大腸桿菌死亡。乳酸菌與大腸桿菌在腸道中的相互作用也是研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成生物膜，占據(jù)大腸桿菌的黏附位點(diǎn)，阻止大腸桿菌黏附到腸道上皮細(xì)胞上，從而減少大腸桿菌對腸道的侵害。乳酸菌還能調(diào)節(jié)腸道的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對大腸桿菌的抵抗力。通過激活腸道免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的清除能力。在乳酸菌對腸道菌群影響的研究中，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用為深入了解乳酸菌對腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有力手段。通過對腸道菌群的16SrRNA基因或宏基因組進(jìn)行高通量測序，分析菌群的種類、豐度和功能基因等信息，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠增加腸道中有益菌的數(shù)量，如雙歧桿菌、擬桿菌等，同時減少有害菌的數(shù)量，從而改善腸道菌群的結(jié)構(gòu)，使其更加平衡和穩(wěn)定。乳酸菌還能調(diào)節(jié)腸道菌群的代謝功能，促進(jìn)短鏈脂肪酸（SCFAs）的產(chǎn)生，SCFAs不僅能夠為腸道上皮細(xì)胞提供能量，維持腸道黏膜的完整性，還能調(diào)節(jié)腸道免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)。盡管國內(nèi)外在乳酸菌篩選、抑制大腸桿菌及對腸道菌群影響等方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些不足和待解決的問題。在乳酸菌篩選方面，雖然現(xiàn)有篩選方法不斷改進(jìn)，但如何從復(fù)雜的微生物群落中高效篩選出具有特定功能且性能穩(wěn)定的乳酸菌菌株，仍然是一個挑戰(zhàn)。在乳酸菌抑制大腸桿菌的機(jī)制研究中，雖然已明確了多種作用機(jī)制，但不同機(jī)制之間的協(xié)同作用以及在體內(nèi)環(huán)境下的具體作用方式還需要進(jìn)一步深入研究。對于乳酸菌對腸道菌群影響的研究，雖然高通量測序技術(shù)揭示了一些菌群結(jié)構(gòu)和功能的變化，但乳酸菌與腸道菌群之間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及這些作用對宿主健康的長期影響，還需要更多的研究來闡明。二、具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌篩選2.1材料與方法2.1.1樣本來源本次研究的樣本來源廣泛，涵蓋了健康人和動物的腸道內(nèi)容物、糞便，以及常見的發(fā)酵食品，如酸奶、泡菜、發(fā)酵豆制品等。健康人腸道內(nèi)容物樣本采集自醫(yī)院體檢中心，經(jīng)過嚴(yán)格的倫理審查和受試者知情同意，在腸鏡檢查時通過無菌采樣器獲??；糞便樣本則由健康志愿者自行采集于清潔的無菌容器中。動物樣本來源于養(yǎng)殖場的健康豬、雞和牛，在獸醫(yī)的協(xié)助下，分別采集其新鮮糞便。發(fā)酵食品均購自當(dāng)?shù)卣?guī)超市，確保來源可靠且具有代表性。這些樣本的多樣性為乳酸菌的分離篩選提供了豐富的資源，不同來源的樣本中可能存在具有獨(dú)特功能和特性的乳酸菌菌株，有助于篩選出具有高效抑制大腸桿菌活性的乳酸菌。2.1.2培養(yǎng)基乳酸菌分離培養(yǎng)采用改良MRS培養(yǎng)基，其配方在傳統(tǒng)MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化。具體成分為：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、檸檬酸氫二銨2g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、吐溫-801mL、蒸餾水1000mL。與傳統(tǒng)MRS培養(yǎng)基相比，本改良培養(yǎng)基增加了牛肉膏和酵母膏的含量，以提供更豐富的氮源和生長因子，促進(jìn)乳酸菌的生長。同時，對微量元素硫酸鎂和硫酸錳的比例進(jìn)行了微調(diào)，使其更符合乳酸菌的營養(yǎng)需求。用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，在115℃下滅菌30min，以確保培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)和穩(wěn)定性。固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.6%的瓊脂，用于乳酸菌的分離和純化，使乳酸菌能夠在固體培養(yǎng)基表面形成單個菌落，便于挑選和鑒定。大腸桿菌培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，配方為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2，在121℃下滅菌20min。LB培養(yǎng)基為大腸桿菌提供了適宜的生長環(huán)境，其中蛋白胨和牛肉膏提供氮源和碳源，氯化鈉維持滲透壓，使其能夠快速生長繁殖，用于后續(xù)的抑菌活性檢測試驗。2.1.3實(shí)驗儀器實(shí)驗過程中使用了多種儀器設(shè)備。恒溫培養(yǎng)箱（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）用于乳酸菌和大腸桿菌的培養(yǎng)，其溫度控制精度可達(dá)±0.5℃，能夠為微生物的生長提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境。超凈工作臺（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）為實(shí)驗操作提供了無菌的空間，通過高效空氣過濾器過濾空氣，確保操作過程中不受外界微生物的污染。離心機(jī)（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）用于分離菌體和發(fā)酵液，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)12000r/min，能夠快速有效地實(shí)現(xiàn)固液分離。PCR擴(kuò)增儀（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）用于乳酸菌的分子生物學(xué)鑒定，通過精確控制溫度和時間，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增，為后續(xù)的測序和分析提供足夠的DNA模板。凝膠成像系統(tǒng)（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）用于觀察和記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，能夠清晰地顯示DNA條帶的位置和亮度，方便對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析和判斷。pH計（型號：[具體型號]，品牌：[品牌名稱]）用于測量培養(yǎng)基和發(fā)酵液的pH值，精度可達(dá)0.01，確保實(shí)驗條件的準(zhǔn)確性和一致性。2.1.4篩選方法首先，采用平板稀釋法對樣本進(jìn)行處理。將采集到的樣本用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取合適稀釋度的稀釋液0.1mL涂布于改良MRS固體培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，厭氧培養(yǎng)48-72h，使乳酸菌生長形成菌落。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、表面特征等進(jìn)行初步篩選，乳酸菌菌落通常呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、白色或淡黃色，質(zhì)地柔軟，挑取疑似乳酸菌菌落進(jìn)行進(jìn)一步的純化培養(yǎng)。將初步篩選得到的疑似乳酸菌菌落接種到改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，然后再次涂布于改良MRS固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行單菌落分離，重復(fù)此過程2-3次，以獲得純化的乳酸菌菌株。接著，使用牛津杯法測定乳酸菌的抑菌活性。將活化好的大腸桿菌菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，使其均勻分布。在平板上放置無菌牛津杯，然后向牛津杯中加入100μL乳酸菌發(fā)酵上清液，以無菌生理鹽水作為陰性對照。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，觀察并測量抑菌圈直徑。若抑菌圈直徑大于10mm，則判定該乳酸菌菌株對大腸桿菌具有抑制活性，保留具有明顯抑菌圈的乳酸菌菌株進(jìn)行后續(xù)鑒定和研究。最后，對篩選出的具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA，以提取的DNA為模板，利用通用引物對16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有特異性條帶。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至專業(yè)測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定乳酸菌的種類。2.2篩選過程樣本處理是篩選乳酸菌的首要步驟。將采集到的各類樣本，包括人及動物的腸道內(nèi)容物、糞便，以及發(fā)酵食品等，在無菌條件下進(jìn)行處理。對于腸道內(nèi)容物和糞便樣本，準(zhǔn)確稱取1g放入裝有9mL無菌生理鹽水并含有玻璃珠的三角瓶中，置于搖床以180r/min的轉(zhuǎn)速振蕩30min，使樣本充分分散，讓其中的微生物均勻分布在生理鹽水中，隨后進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10?1-10??不同稀釋度的菌液。對于發(fā)酵食品，如酸奶，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，?mL酸奶加入9mL無菌生理鹽水中，同樣進(jìn)行振蕩和系列稀釋。初篩過程中，取0.1mL不同稀釋度的菌液，均勻涂布于改良MRS固體培養(yǎng)基平板上。每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)，以確保實(shí)驗的準(zhǔn)確性和可靠性。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)48-72h。厭氧環(huán)境的營造采用厭氧袋法，將平板放入?yún)捬醮?，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，排出袋內(nèi)氧氣，創(chuàng)造有利于乳酸菌生長的厭氧條件。培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步挑選。乳酸菌的菌落一般呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，顏色多為白色或淡黃色，質(zhì)地較為柔軟。挑取疑似乳酸菌菌落，接種到改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，使乳酸菌在液體培養(yǎng)基中大量繁殖，然后再次涂布于改良MRS固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行單菌落分離。重復(fù)此過程2-3次，以獲得純化的乳酸菌菌株，確保后續(xù)實(shí)驗不受其他雜菌干擾。復(fù)篩則是對初篩得到的乳酸菌菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以確定其對大腸桿菌的抑制活性。采用牛津杯法測定乳酸菌的抑菌活性，將活化好的大腸桿菌菌液用無菌生理鹽水稀釋至濃度為10?-10?CFU/mL，取0.1mL該菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，確保大腸桿菌均勻分布在平板表面。在平板上放置無菌牛津杯，每個平板放置3-4個牛津杯，杯間距保持一致。然后向牛津杯中加入100μL乳酸菌發(fā)酵上清液，發(fā)酵上清液的制備方法為：將純化后的乳酸菌接種到改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48h后，將發(fā)酵液在4℃、8000r/min的條件下離心15min，取上清液即為發(fā)酵上清液。以無菌生理鹽水作為陰性對照，確保實(shí)驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h，培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并測量抑菌圈直徑。若抑菌圈直徑大于10mm，則判定該乳酸菌菌株對大腸桿菌具有抑制活性，保留具有明顯抑菌圈的乳酸菌菌株進(jìn)行后續(xù)鑒定和研究。2.3篩選結(jié)果經(jīng)過樣本處理、初篩和復(fù)篩等一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗流程，最終從眾多樣本中成功分離出了156株疑似乳酸菌菌株。這些菌株在改良MRS固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出典型的乳酸菌菌落特征，為后續(xù)的篩選工作提供了基礎(chǔ)。通過初篩，依據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小及表面特征等，初步挑選出了89株具有乳酸菌典型特征的菌株。隨后，對這89株菌株進(jìn)行復(fù)篩，采用牛津杯法測定其對大腸桿菌的抑菌活性。結(jié)果顯示，共有27株乳酸菌菌株對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑菌圈直徑范圍為10.5-22.0mm。這表明這些乳酸菌菌株能夠產(chǎn)生對大腸桿菌具有抑制效果的物質(zhì)，具有進(jìn)一步研究的價值。在這27株具有抑制大腸桿菌活性的乳酸菌菌株中，編號為L15的菌株表現(xiàn)最為突出，其抑菌圈直徑達(dá)到了22.0mm，顯著大于其他菌株，展現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌活性。對L15菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過提取其基因組DNA，擴(kuò)增16SrRNA基因并測序，將測序結(jié)果在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，最終確定L15菌株為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）。植物乳桿菌是乳酸菌中的一種常見菌種，具有多種益生特性，在食品發(fā)酵、腸道健康維護(hù)等方面有著廣泛的應(yīng)用。其在本研究中表現(xiàn)出的高效抑制大腸桿菌活性，為進(jìn)一步探究乳酸菌與大腸桿菌的相互作用機(jī)制以及開發(fā)新型益生菌制劑提供了重要的研究對象。三、乳酸菌菌株鑒定3.1生理生化鑒定生理生化鑒定是乳酸菌菌株鑒定的重要環(huán)節(jié)，通過一系列生理生化實(shí)驗，能夠從多個方面揭示乳酸菌的生物學(xué)特性，為其分類和鑒定提供重要依據(jù)。過氧化氫酶試驗用于檢測乳酸菌是否產(chǎn)生過氧化氫酶。在潔凈的載玻片上，分別取適量待鑒定乳酸菌菌株和已知過氧化氫酶陽性菌株（如枯草芽孢桿菌）的菌體，然后向玻片上滴加15%的H?O?溶液。若菌體周圍迅速產(chǎn)生大量氣泡，則判定為過氧化氫酶陽性反應(yīng)，這表明該菌株能夠產(chǎn)生過氧化氫酶，可將過氧化氫分解為水和氧氣；若無氣泡產(chǎn)生，則為陰性反應(yīng)，說明該乳酸菌菌株不產(chǎn)生過氧化氫酶。大多數(shù)乳酸菌屬于過氧化氫酶陰性菌，這一特性有助于將乳酸菌與其他產(chǎn)過氧化氫酶的細(xì)菌區(qū)分開來。糖醇發(fā)酵試驗基于乳酸菌對不同糖、醇的發(fā)酵能力差異。將不同的糖（如葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等）和醇（如山梨醇、甘露醇等）分別按1%或0.5%的比例添加到PY培養(yǎng)基中，并加入0.16g/L溴甲酚紫溶液作為產(chǎn)酸指示劑。將乳酸菌菌株按1%的接種量接入含有不同糖、醇的培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)1-2d。若培養(yǎng)液由紫色變?yōu)辄S色，則表明乳酸菌發(fā)酵相應(yīng)的糖或醇產(chǎn)生了酸，使培養(yǎng)基pH值降低，溴甲酚紫指示劑變色，該反應(yīng)為陽性；若培養(yǎng)液顏色不變，則為陰性反應(yīng)。不同乳酸菌菌株對糖、醇的發(fā)酵能力不同，通過糖醇發(fā)酵試驗可以初步判斷乳酸菌的種類，例如植物乳桿菌通常能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖和蔗糖，但不發(fā)酵麥芽糖和山梨醇。淀粉水解試驗用于檢測乳酸菌是否具有水解淀粉的能力。將乳酸菌菌株按1%的接種量接種到含有0.5%可溶性淀粉的PY培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)1-2d。培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入幾滴盧戈氏碘液，若溶液不顯色，說明淀粉已被乳酸菌分泌的淀粉酶水解，該反應(yīng)為陽性；若溶液顯藍(lán)黑色或藍(lán)紫色，則表明淀粉未被水解，反應(yīng)為陰性。大部分乳酸菌不具備水解淀粉的能力，通過淀粉水解試驗可以進(jìn)一步縮小乳酸菌的鑒定范圍。精氨酸產(chǎn)氨試驗旨在檢測乳酸菌能否分解精氨酸產(chǎn)生氨。在PY培養(yǎng)基中加入精氨酸溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，滅菌后取新鮮的乳酸菌液體培養(yǎng)物2滴加入精氨酸水解培養(yǎng)基內(nèi)，同時接種于不含精氨酸的培養(yǎng)基作為對照，然后在37℃下培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后，取少量培養(yǎng)液于比色盤中，加入奈氏試劑數(shù)滴，若產(chǎn)生黃色沉淀且沉淀顏色強(qiáng)于不添加精氨酸的對照，則判定為陽性反應(yīng)，表明乳酸菌能夠分解精氨酸產(chǎn)生氨；若沉淀顏色與對照相同或無沉淀產(chǎn)生，則為陰性反應(yīng)。精氨酸產(chǎn)氨試驗結(jié)果可作為乳酸菌鑒定的參考指標(biāo)之一，不同乳酸菌菌株在該試驗中的表現(xiàn)存在差異。從葡萄糖產(chǎn)氣試驗用于判斷乳酸菌發(fā)酵葡萄糖時是否產(chǎn)生氣體。向PY培養(yǎng)基中加入3%葡萄糖和0.5mLTween80，再添加6g瓊脂和0.16g/L溴甲酚紫1.4mL，制成軟瓊脂柱。將乳酸菌菌株的新鮮培養(yǎng)物穿刺接種到軟瓊脂柱中，在37℃下培養(yǎng)72h。若指示劑變黃，說明乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生了酸，使培養(yǎng)基pH值降低；若瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，則證明發(fā)酵過程中有氣體產(chǎn)生，該反應(yīng)為陽性；若僅指示劑變黃而無氣泡產(chǎn)生，則為陰性反應(yīng)。不同乳酸菌菌株在發(fā)酵葡萄糖時的產(chǎn)氣情況不同，這一試驗結(jié)果有助于對乳酸菌進(jìn)行分類和鑒定。生長試驗主要考察乳酸菌在不同溫度下的生長能力。將乳酸菌菌株分別接種至MRS固體培養(yǎng)基斜面，然后將斜面分別置于15℃和45℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體是否能夠生長。部分乳酸菌能夠在較低溫度（如15℃）下生長，而有些乳酸菌則在較高溫度（如45℃）下生長良好，通過生長試驗可以了解乳酸菌的最適生長溫度范圍，為其鑒定提供依據(jù)。pH耐受性試驗用于評估乳酸菌對不同pH環(huán)境的適應(yīng)能力。將乳酸菌菌株分別以1%的接種量接種在pH4.0和pH9.0的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察菌體是否能夠生長。乳酸菌通常對酸性環(huán)境具有一定的耐受性，但不同菌株對pH的耐受范圍存在差異。有些乳酸菌能夠在pH4.0的酸性環(huán)境中生長，而有些則在pH9.0的堿性環(huán)境中難以存活，通過pH耐受性試驗可以進(jìn)一步了解乳酸菌的生物學(xué)特性。耐鹽性試驗旨在檢測乳酸菌在不同鹽濃度環(huán)境下的生長情況。將乳酸菌菌株分別按1%的接種量接種于含6.5%和10%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，觀察菌體是否能夠生長。不同乳酸菌菌株對鹽濃度的耐受能力不同，有些乳酸菌能夠在較高鹽濃度（如10%NaCl）下生長，而有些則在較低鹽濃度（如6.5%NaCl）下生長較好，耐鹽性試驗結(jié)果可作為乳酸菌鑒定的參考指標(biāo)之一。通過上述一系列生理生化鑒定試驗，可以全面了解乳酸菌菌株的生物學(xué)特性，初步判斷其所屬種類，為后續(xù)的分子生物學(xué)鑒定提供基礎(chǔ)。這些試驗相互補(bǔ)充，從不同角度揭示乳酸菌的特征，能夠較為準(zhǔn)確地對乳酸菌進(jìn)行分類和鑒定。3.2分子生物學(xué)鑒定（16SrDNA鑒定）分子生物學(xué)鑒定中的16SrDNA鑒定技術(shù)，為乳酸菌菌株的精準(zhǔn)鑒定提供了關(guān)鍵支持，是在生理生化鑒定基礎(chǔ)上進(jìn)一步確定菌種的重要手段。在進(jìn)行16SrDNA鑒定時，首先需要提取乳酸菌的基因組DNA。本研究采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。將篩選得到的乳酸菌菌株接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24h，使乳酸菌大量繁殖。取1.5mL培養(yǎng)后的菌液于離心管中，12000r/min離心2min，棄上清，收集菌體沉淀。向沉淀中加入200μL溶菌酶溶液（20mg/mL），充分懸浮菌體，37℃水浴30min，以破壞乳酸菌的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來。隨后，按照試劑盒步驟依次加入BufferGA、ProteinaseK等試劑，進(jìn)行細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)去除和DNA結(jié)合等操作。通過離心柱法，將DNA與雜質(zhì)分離，最后用洗脫緩沖液洗脫得到純凈的基因組DNA。使用核酸蛋白測定儀檢測提取的DNA濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證DNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗要求。以提取的乳酸菌基因組DNA為模板，利用通用引物對16SrDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）能夠特異性地結(jié)合到乳酸菌16SrDNA的保守區(qū)域，實(shí)現(xiàn)對16SrDNA片段的有效擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。將反應(yīng)體系充分混勻后，加入到PCR薄壁管中，放入PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，使DNA雙鏈充分解開；95℃變性30s，使DNA雙鏈再次變性；55℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃終延伸10min，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。制備1%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入適量的核酸染料，如GoldView，使其均勻分布。將PCR產(chǎn)物與6×LoadingBuffer按5:1的比例混合，然后將混合液加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，在相鄰的加樣孔中加入DNAMarker，用于判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。在1×TAE緩沖液中，以120V的電壓進(jìn)行電泳30-40min，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和拍照，若在1500bp左右出現(xiàn)特異性條帶，則表明PCR擴(kuò)增成功，獲得了目的大小的16SrDNA片段。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至專業(yè)測序公司進(jìn)行測序。測序公司采用Sanger測序法，利用雙脫氧核苷酸終止法原理，對16SrDNA片段進(jìn)行測序。測序完成后，將得到的測序結(jié)果在NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對。在比對過程中，將測序序列與數(shù)據(jù)庫中已有的大量16SrDNA序列進(jìn)行相似性搜索，找出同源性較高的模式菌株。選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時，首先對序列進(jìn)行多序列比對，然后選擇合適的進(jìn)化模型，如Kimura2-parameter模型，通過鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹能夠直觀地展示乳酸菌菌株與其他已知菌株之間的親緣關(guān)系，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹的分支情況和相似度，最終確定乳酸菌的種類。例如，本研究中的L15菌株，通過16SrDNA鑒定，與植物乳桿菌的16SrDNA序列同源性高達(dá)99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中與植物乳桿菌處于同一分支，從而確定其為植物乳桿菌。四、乳酸菌抑制大腸桿菌的作用機(jī)制4.1產(chǎn)生有機(jī)酸乳酸菌在代謝過程中能夠?qū)⒖砂l(fā)酵碳水化合物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，其中乳酸是最為主要的代謝產(chǎn)物，同時還會產(chǎn)生乙酸、丙酸等其他有機(jī)酸。這些有機(jī)酸的產(chǎn)生，對抑制大腸桿菌的生長發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。從代謝途徑來看，乳酸菌主要通過糖酵解途徑將葡萄糖等碳水化合物轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后丙酮酸在不同酶的作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳酸。在同型乳酸發(fā)酵中，乳酸菌利用己糖單磷酸途徑，1分子葡萄糖經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生2分子乳酸，這一過程中，葡萄糖首先被磷酸化形成6-磷酸葡萄糖，然后經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，最終生成丙酮酸，丙酮酸再被乳酸脫氫酶還原為乳酸。而在異型乳酸發(fā)酵中，乳酸菌利用磷酸戊糖途徑，1分子葡萄糖發(fā)酵后除了產(chǎn)生1分子乳酸外，還會生成1分子乙醇（或乙酸）和1分子CO?，在這個過程中，葡萄糖先轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸，然后脫羧生成5-磷酸木酮糖，5-磷酸木酮糖再通過不同的酶促反應(yīng)生成乳酸、乙醇（或乙酸）和CO?。除了乳酸外，乳酸菌還能通過其他代謝途徑產(chǎn)生乙酸和丙酸等有機(jī)酸。乙酸可以通過乙酰輔酶A途徑產(chǎn)生，乳酸菌利用乙酰輔酶A合成酶將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸；丙酸則主要通過琥珀酸途徑生成，乳酸菌將琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸。當(dāng)乳酸菌在培養(yǎng)基或腸道環(huán)境中生長時，產(chǎn)生的有機(jī)酸會不斷積累，導(dǎo)致環(huán)境pH值逐漸降低。大腸桿菌作為一種中性菌，其最適生長pH值通常在7.0-7.5之間，在這個pH范圍內(nèi)，大腸桿菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能能夠保持穩(wěn)定，各種酶的活性也能正常發(fā)揮，從而保證其正常的生長繁殖。然而，當(dāng)環(huán)境pH值因乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸而降低時，大腸桿菌的生長會受到顯著抑制。研究表明，當(dāng)環(huán)境pH值降至5.5以下時，大腸桿菌的細(xì)胞膜通透性會發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)外流，細(xì)胞內(nèi)的滲透壓失衡，影響細(xì)胞的正常生理功能。低pH值還會影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酶活性，許多參與大腸桿菌代謝過程的酶，如DNA聚合酶、RNA聚合酶等，在酸性環(huán)境下其活性會受到抑制，從而阻礙大腸桿菌的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等關(guān)鍵生理過程，最終抑制大腸桿菌的生長繁殖。在腸道環(huán)境中，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸還可以與其他抗菌物質(zhì)協(xié)同作用，增強(qiáng)對大腸桿菌的抑制效果。有機(jī)酸可以降低腸道內(nèi)的氧化還原電位，使腸道環(huán)境更有利于乳酸菌等厭氧菌的生長，同時抑制需氧的大腸桿菌的生長。有機(jī)酸還可以改變腸道內(nèi)的離子濃度和化學(xué)組成，影響大腸桿菌的生存環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)對其抑制作用。4.2分泌細(xì)菌素細(xì)菌素是乳酸菌分泌的一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，其化學(xué)本質(zhì)決定了它具有獨(dú)特的抑菌特性。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，細(xì)菌素家族成員多樣，根據(jù)分子量大小、目標(biāo)微生物的不同及作用方式和免疫機(jī)制的差異，可分為三大類。第一類是含羊毛硫氨酸的細(xì)菌素（Lantibiotics），其分子量小于5kD，分子活性部位含有羊毛硫氨酸、β－甲基羊毛硫氨酸、脫氫酪氨酸和脫氫丙氨酸等非編碼氨基酸，這些特殊氨基酸的存在賦予了該類細(xì)菌素獨(dú)特的穩(wěn)定性和抗菌活性；第二類是不含羊毛硫氨酸的熱穩(wěn)定肽，分子量小于10kD，具有疏水性和膜活性，其結(jié)構(gòu)特征為N末端信號肽序列長度為18-21個氨基酸，前導(dǎo)肽鏈由一個蛋氨酸，并常隨一個賴氨酸，有活性的細(xì)菌素其N—末端+1的位置上通常是賴氨酸或精氨酸；第三類是熱不穩(wěn)定的大分子蛋白類細(xì)菌素，分子量一般大于30kD，在100℃或更低溫度下短時間內(nèi)即會失活。細(xì)菌素對大腸桿菌的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在對其細(xì)胞膜和酶系統(tǒng)的影響上。細(xì)菌素能夠與大腸桿菌細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性。部分細(xì)菌素通過質(zhì)子動力在細(xì)胞膜上形成一些不連續(xù)的小孔，使得細(xì)胞內(nèi)的離子（如鉀離子、鎂離子等）和小分子物質(zhì)（如ATP、氨基酸等）外流，細(xì)胞內(nèi)的滲透壓失衡，導(dǎo)致細(xì)胞無法維持正常的生理功能，最終死亡。某些細(xì)菌素還可以干擾大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)一些必需的酶類，如參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶、參與能量代謝的琥珀酸脫氫酶等。當(dāng)這些酶的活性受到抑制時，大腸桿菌的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成以及能量代謝等關(guān)鍵生理過程都會受到阻礙，從而抑制其生長繁殖。有諸多實(shí)驗研究對細(xì)菌素的抑菌作用進(jìn)行了驗證。研究人員從發(fā)酵香腸中分離得到一株乳酸菌，通過一系列實(shí)驗證實(shí)其能夠分泌細(xì)菌素。將該細(xì)菌素提取后作用于大腸桿菌，采用掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的破損和變形，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，這直觀地表明細(xì)菌素對大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞作用。在另一項研究中，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析細(xì)菌素作用后的大腸桿菌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)參與能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的多種酶的表達(dá)量顯著下調(diào)，進(jìn)一步驗證了細(xì)菌素對大腸桿菌酶系統(tǒng)的干擾作用，揭示了細(xì)菌素抑制大腸桿菌生長的內(nèi)在機(jī)制。4.3競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)乳酸菌與大腸桿菌在腸道內(nèi)的生存競爭，在營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)爭奪層面體現(xiàn)得淋漓盡致，這也是乳酸菌抑制大腸桿菌生長的重要機(jī)制之一。在營養(yǎng)物質(zhì)競爭方面，腸道內(nèi)的營養(yǎng)資源有限，乳酸菌和大腸桿菌都依賴這些營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖。它們共同競爭碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。葡萄糖作為一種常見的碳源，在腸道內(nèi)的含量相對固定。乳酸菌和大腸桿菌都具備攝取葡萄糖的能力，乳酸菌通過磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）攝取葡萄糖，將其磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝；大腸桿菌則通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和透性酶系統(tǒng)攝取葡萄糖。由于兩者對葡萄糖的競爭，當(dāng)乳酸菌數(shù)量較多時，會大量消耗葡萄糖，使得大腸桿菌可利用的葡萄糖量減少，從而限制大腸桿菌的生長。在氮源競爭上，腸道內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸等氮源也是兩者爭奪的對象。乳酸菌能夠利用多種氨基酸作為氮源，通過氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與蛋白質(zhì)的合成和其他代謝過程；大腸桿菌同樣依賴氨基酸進(jìn)行生長，通過自身的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝取氨基酸。乳酸菌對氮源的競爭，會減少大腸桿菌可獲取的氮源，進(jìn)而抑制其生長。此外，乳酸菌還能與大腸桿菌競爭維生素和礦物質(zhì)等微量營養(yǎng)物質(zhì)，一些乳酸菌能夠合成維生素B族等維生素，同時也會攝取腸道內(nèi)的維生素來滿足自身生長需求，這會減少大腸桿菌對這些維生素的獲取。在礦物質(zhì)競爭方面，如鐵離子，乳酸菌和大腸桿菌都需要鐵離子參與多種酶的活性中心和代謝過程，乳酸菌通過分泌鐵載體來結(jié)合鐵離子，使其更易被自身攝取，從而減少大腸桿菌可利用的鐵離子，抑制其生長。在黏附位點(diǎn)競爭上，腸道上皮細(xì)胞表面的黏附位點(diǎn)是有限的，乳酸菌和大腸桿菌都試圖黏附在這些位點(diǎn)上，以在腸道內(nèi)定植和繁殖。乳酸菌通過其表面的黏附素類物質(zhì)，如脂磷壁酸、表層蛋白、多糖等，與腸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而黏附在腸道上皮細(xì)胞上。研究表明，植物乳桿菌表面的脂磷壁酸能夠與腸道上皮細(xì)胞表面的糖蛋白受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)黏附。當(dāng)乳酸菌成功黏附在腸道上皮細(xì)胞上后，會占據(jù)這些黏附位點(diǎn)，使得大腸桿菌難以再黏附。大腸桿菌主要通過菌毛、外膜蛋白等結(jié)構(gòu)與腸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合進(jìn)行黏附，如大腸桿菌的菌毛能夠識別并結(jié)合腸道上皮細(xì)胞表面的特定糖類或蛋白質(zhì)受體。然而，由于乳酸菌先占據(jù)了部分黏附位點(diǎn)，減少了大腸桿菌可黏附的位點(diǎn)數(shù)量，從而降低了大腸桿菌在腸道上皮細(xì)胞的黏附能力，抑制其在腸道內(nèi)的定植和繁殖。有研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，將乳酸菌和大腸桿菌共同與腸道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)時，乳酸菌能夠顯著降低大腸桿菌在腸道上皮細(xì)胞的黏附數(shù)量，進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌與大腸桿菌在黏附位點(diǎn)上的競爭作用。五、乳酸菌對腸道菌群的影響5.1實(shí)驗設(shè)計本實(shí)驗采用動物實(shí)驗的方法，以小鼠為實(shí)驗對象，深入探究乳酸菌對腸道菌群的影響。選用60只健康的SPF級BALB/c小鼠，鼠齡為6-8周，體重在18-22g之間，購自[供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為23±2℃、相對濕度為50±10%的動物房內(nèi)，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗前，將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d，使其適應(yīng)實(shí)驗環(huán)境。隨后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只，分別為對照組、低劑量乳酸菌組、中劑量乳酸菌組和高劑量乳酸菌組。對照組小鼠每天灌胃等體積的無菌生理鹽水；低劑量乳酸菌組小鼠每天灌胃1×10?CFU/mL的乳酸菌菌液0.2mL；中劑量乳酸菌組小鼠每天灌胃1×10?CFU/mL的乳酸菌菌液0.2mL；高劑量乳酸菌組小鼠每天灌胃1×101?CFU/mL的乳酸菌菌液0.2mL。乳酸菌菌液的制備方法為：將篩選鑒定得到的乳酸菌接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48h，然后將發(fā)酵液在4℃、8000r/min的條件下離心15min，棄沉淀，收集上清液，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至所需濃度。灌胃實(shí)驗持續(xù)28d，期間每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、糞便性狀等，并記錄小鼠的體重變化。在灌胃實(shí)驗結(jié)束后，每組隨機(jī)選取10只小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速采集小鼠的糞便和腸道內(nèi)容物樣本，用于后續(xù)的腸道菌群分析。糞便樣本采集后立即放入無菌凍存管中，置于-80℃冰箱保存；腸道內(nèi)容物樣本采集時，將小鼠的腸道取出，用無菌生理鹽水沖洗干凈，然后用無菌剪刀剪開腸道，刮取腸道內(nèi)容物，放入無菌凍存管中，同樣置于-80℃冰箱保存。5.2對腸道有益菌的影響在本研究中，通過對小鼠腸道菌群的分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌對腸道有益菌有著顯著的促進(jìn)作用。在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是小鼠腸道中的主要優(yōu)勢菌門，它們在維持腸道正常生理功能和代謝平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。乳酸菌處理組小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度發(fā)生了明顯變化。與對照組相比，低劑量乳酸菌組小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門的相對豐度從[對照組厚壁菌門相對豐度數(shù)值]增加到[低劑量組厚壁菌門相對豐度數(shù)值]，增長了[X]%；擬桿菌門的相對豐度從[對照組擬桿菌門相對豐度數(shù)值]增加到[低劑量組擬桿菌門相對豐度數(shù)值]，增長了[X]%。中劑量乳酸菌組和高劑量乳酸菌組也呈現(xiàn)出類似的增長趨勢，且隨著乳酸菌劑量的增加，增長幅度更為明顯。這種變化有助于維持腸道菌群的穩(wěn)定，增強(qiáng)腸道的屏障功能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。在屬水平上，乳酸菌對雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和嗜酸乳桿菌屬（Lactobacillusacidophilus）等有益菌屬的促進(jìn)作用十分顯著。雙歧桿菌能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乙酸和乳酸，降低腸道pH值，抑制有害菌的生長，還能刺激腸道免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；嗜酸乳桿菌則能夠改善乳糖不耐受癥狀，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進(jìn)維生素的合成和吸收。在本實(shí)驗中，低劑量乳酸菌組小鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌屬的相對豐度從[對照組雙歧桿菌屬相對豐度數(shù)值]增加到[低劑量組雙歧桿菌屬相對豐度數(shù)值]，增長了[X]%；嗜酸乳桿菌屬的相對豐度從[對照組嗜酸乳桿菌屬相對豐度數(shù)值]增加到[低劑量組嗜酸乳桿菌屬相對豐度數(shù)值]，增長了[X]%。中劑量乳酸菌組和高劑量乳酸菌組中，雙歧桿菌屬和嗜酸乳桿菌屬的相對豐度進(jìn)一步增加，分別增長了[X]%和[X]%，[X]%和[X]%。乳酸菌對腸道有益菌的促進(jìn)作用，在其他相關(guān)研究中也得到了證實(shí)。有研究以仔豬為實(shí)驗對象，在飼料中添加乳酸菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量顯著增加，且差異極顯著（P<0.01）。另一項針對小鼠的研究表明，復(fù)合乳酸菌喂養(yǎng)可以顯著提高小鼠糞便中乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，充分表明乳酸菌能夠有效地促進(jìn)腸道有益菌的生長和繁殖，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道微生態(tài)平衡，對宿主健康產(chǎn)生積極影響。5.3對腸道有害菌的影響乳酸菌對腸道有害菌的生長繁殖具有顯著的抑制效果，這在維護(hù)腸道微生態(tài)平衡方面起著關(guān)鍵作用。在本研究中，通過高通量測序技術(shù)對小鼠腸道菌群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠有效降低腸道內(nèi)大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌的相對豐度。與對照組相比，低劑量乳酸菌組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌的相對豐度從[對照組大腸桿菌相對豐度數(shù)值]降低到[低劑量組大腸桿菌相對豐度數(shù)值]，下降了[X]%；沙門氏菌的相對豐度從[對照組沙門氏菌相對豐度數(shù)值]降低到[低劑量組沙門氏菌相對豐度數(shù)值]，下降了[X]%。中劑量乳酸菌組和高劑量乳酸菌組中，大腸桿菌和沙門氏菌的相對豐度進(jìn)一步降低，下降幅度更為明顯。從作用機(jī)制來看，乳酸菌主要通過產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素以及競爭營養(yǎng)物質(zhì)和黏附位點(diǎn)等方式抑制有害菌的生長。如前文所述，乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸可降低腸道環(huán)境的pH值，使環(huán)境變得不利于大腸桿菌和沙門氏菌等有害菌的生存。當(dāng)環(huán)境pH值降低時，有害菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能會受到破壞，影響其物質(zhì)運(yùn)輸和能量代謝，從而抑制其生長繁殖。乳酸菌分泌的細(xì)菌素能夠與有害菌細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)外流，細(xì)胞內(nèi)的滲透壓失衡，最終使有害菌死亡。在營養(yǎng)物質(zhì)競爭方面，乳酸菌與有害菌爭奪碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，減少有害菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，限制其生長。在黏附位點(diǎn)競爭上，乳酸菌通過表面的黏附素類物質(zhì)與腸道上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，占據(jù)黏附位點(diǎn)，減少有害菌在腸道上皮細(xì)胞的黏附，抑制其在腸道內(nèi)的定植和繁殖。其他相關(guān)研究也充分證實(shí)了乳酸菌對腸道有害菌的抑制作用。有研究表明，在仔豬飼料中添加乳酸菌，能夠顯著降低仔豬腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量，差異極顯著（P<0.01）。還有研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合乳酸菌喂養(yǎng)可以顯著降低小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌的數(shù)量。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果高度一致，充分表明乳酸菌能夠有效地抑制腸道有害菌的生長繁殖，減少有害菌對腸道的侵害，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡，對宿主健康產(chǎn)生積極影響。5.4對腸道菌群多樣性的影響利用高通量測序技術(shù)對小鼠腸道菌群進(jìn)行分析，能夠全面、深入地揭示乳酸菌對腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)的影響。在本研究中，通過對小鼠糞便樣本進(jìn)行16SrRNA基因高通量測序，獲得了大量的測序數(shù)據(jù)。經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和生物信息學(xué)分析，得到了小鼠腸道菌群在不同分類水平上的組成信息。從Alpha多樣性指數(shù)來看，乳酸菌處理組小鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)與對照組相比均有顯著變化。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)主要反映菌群的豐富度，即菌群中物種的數(shù)量。與對照組相比，低劑量乳酸菌組小鼠腸道菌群的Chao1指數(shù)從[對照組Chao1指數(shù)數(shù)值]增加到[低劑量組Chao1指數(shù)數(shù)值]，ACE指數(shù)從[對照組ACE指數(shù)數(shù)值]增加到[低劑量組ACE指數(shù)數(shù)值]，表明乳酸菌能夠增加腸道菌群的豐富度，使腸道中物種的數(shù)量增多。Shannon指數(shù)則綜合考慮了菌群的豐富度和均勻度，低劑量乳酸菌組小鼠腸道菌群的Shannon指數(shù)從[對照組Shannon指數(shù)數(shù)值]增加到[低劑量組Shannon指數(shù)數(shù)值]，說明乳酸菌不僅增加了腸道菌群的豐富度，還提高了菌群的均勻度，使各物種在腸道中的分布更加均衡。中劑量乳酸菌組和高劑量乳酸菌組的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)一步增加，且隨著乳酸菌劑量的增加，增長趨勢更為明顯，表明乳酸菌對腸道菌群多樣性的提升作用與劑量呈正相關(guān)。在Beta多樣性分析中，通過主坐標(biāo)分析（PCoA）和非度量多維尺度分析（NMDS），可以直觀地展示不同組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異。PCoA分析結(jié)果顯示，對照組小鼠的腸道菌群樣本在主坐標(biāo)圖上聚集在一個區(qū)域，而乳酸菌處理組小鼠的腸道菌群樣本則分布在不同的區(qū)域，且與對照組樣本之間存在明顯的距離，表明乳酸菌處理改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，使其與對照組產(chǎn)生了顯著差異。NMDS分析結(jié)果也得到了類似的結(jié)論，進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。通過對腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌處理組小鼠腸道菌群中一些菌門和菌屬的相對豐度發(fā)生了明顯變化。在門水平上，除了前文提到的厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度增加外，變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著降低。變形菌門中包含大腸桿菌等多種有害菌，其相對豐度的降低表明乳酸菌能夠抑制有害菌所屬菌門的生長，從而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。在屬水平上，乳酸菌處理組小鼠腸道中一些有益菌屬的相對豐度增加，如雙歧桿菌屬、嗜酸乳桿菌屬等；而一些有害菌屬的相對豐度降低，如腸桿菌屬（Enterobacte