1合成生物第3部分：農(nóng)業(yè)作物抗逆性基因編輯策略本文件規(guī)定了農(nóng)業(yè)作物抗逆性基因編輯策略的技術(shù)要求、試驗(yàn)方法。適用于水稻、小麥、玉米等主要農(nóng)作物的抗逆性基因編輯技術(shù)研發(fā)與應(yīng)用，其他作物可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T3543.3農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程凈度分析GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程發(fā)芽試驗(yàn)GB/T3543.7農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)GB/T5009.124食品中氨基酸的測定GB/T26792高效液相色譜儀GB/T27404實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測GB/T34265Sanger法測序技術(shù)指南GB/T35535大豆、油菜中外源基因成分的測定膜芯片法GB/T37969近紅外光譜定性分析通則GB/T38571植物次生代謝物生物堿的檢測液相色譜-質(zhì)譜法GB/T39917主要農(nóng)作物品種真實(shí)性和純度SSR分子標(biāo)記檢測稻YY/T0588流式細(xì)胞儀YY/T1261HER2基因檢測試劑盒（熒光原位雜交法）YY/T1865BRCA基因突變檢測試劑盒及數(shù)據(jù)庫通用技術(shù)要求（高通量測序法）NY/T2483植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南冰草屬NY/T2745水稻品種真實(shí)性鑒定SNP標(biāo)記法NY/T4021小麥品種真實(shí)性鑒定SNP標(biāo)記法NY/T4022玉米品種真實(shí)性鑒定SNP標(biāo)記法3術(shù)語和定義GB/T27404、GB/T3543.3、GB/T3543.4、GB/T3543.7界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1農(nóng)業(yè)作物抗逆性resistanceofagriculturalcrops農(nóng)業(yè)作物在面對不利環(huán)境條件（干旱、鹽堿、高溫、低溫、病蟲害）時，能夠維持正常生長發(fā)育和產(chǎn)量穩(wěn)定的能力。3.2抗逆性基因編輯reverse-resistancegeneediting通過CRISPR/Cas9技術(shù)定向修飾作物基因組，增強(qiáng)其對干旱、鹽堿、病蟲害等逆境脅迫的耐受性。24技術(shù)要求4.1基因編輯靶點(diǎn)設(shè)計靶序列長度應(yīng)為18bp～23bp（bp表示堿基對GC含量40%～60%(GC表示鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比例)，避免連續(xù)4個以上相同堿基重復(fù)，且需通過生物信息學(xué)工具預(yù)測脫靶風(fēng)險，脫靶概率應(yīng)小于等于0.1%。4.2編輯效率要求基因編輯的效率應(yīng)達(dá)到一定水平，基因編輯效率分級要求見表1要求。其中基因敲除效率大于等于70%；基因插入效率大于等于50%。表1基因編輯效率分級要求ABC4.3安全性檢驗(yàn)抗逆性基因編輯的安全性檢驗(yàn)要求見表2。表2抗逆性基因編輯的安全性檢驗(yàn)注：檢測限（LOD）是指在特定檢測方法中，能夠可靠檢測到目標(biāo)物質(zhì)（如核酸、蛋白、P值是假設(shè)檢驗(yàn)中的概率值，表示觀察到的結(jié)果由隨機(jī)誤差5試驗(yàn)方法5.1基因編輯效率檢測用PCR和測序相結(jié)合的方法檢測基因編輯效率。檢測步驟如下：a）首先，提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，以特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察是否有預(yù)期大小的編輯產(chǎn)物條帶；b）然后，對陽性條帶進(jìn)行測序，比對序列結(jié)果，確定編輯位點(diǎn)和編輯類型（插入、缺失、替換統(tǒng)計編輯植株的數(shù)量和比例；c）計算編輯效率。35.2脫靶效應(yīng)檢測采用全基因組測序技術(shù)對編輯植株進(jìn)行脫靶效應(yīng)檢測。檢測步驟如下：a）首先，提取高質(zhì)量的基因組DNA，構(gòu)建測序文庫，進(jìn)行高通量測序；b）然后，將測序數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對分析，尋找與sgRNA序列具有較高相似性的潛在脫靶位點(diǎn)，并進(jìn)一步驗(yàn)證這些位點(diǎn)是否存在編輯痕跡；c）使用專業(yè)的生物信息學(xué)軟件和工具進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。5.3抗逆性表型試驗(yàn)將編輯后的植株在模擬的逆境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，干旱、鹽堿、高溫、低溫、病蟲害，觀察其生長發(fā)育狀況、形態(tài)特征、生理指標(biāo)等，與