6親和層析技術(shù)1親和層析的操作方式和步驟2洗脫3親和吸附劑_第1頁
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文檔簡介

6、親和層析技術(shù)

（1）親和層析的操作方式和步驟（2）洗脫（3）親和吸附劑的再生方法（4）影響親和層析的因素

（1）親和層析的操作方式和步驟操作步驟裝柱用合適的緩沖液進行平衡。樣品上柱用平衡緩沖液洗滌柱床除去雜蛋白用洗脫劑進行洗脫。2、洗脫按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)

按洗脫機理專一性洗脫（specificelution）非專一性洗脫（nonspecificelution）添加劑：乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積非專一性洗脫非專一性洗脫是一種應(yīng)用較為廣泛的洗脫技術(shù)，它主要借助于改變緩沖液的pH、離子強度、介電常數(shù)或溫度等以使與固定配體結(jié)合的生物大分子的構(gòu)象發(fā)生變化，降低其親和力。使用較廣泛的是提高溶液的離子強度。通常在洗脫液中加入NaCl，有時也可用NH4Cl或Tris-HCl提高溶液的離子強度。專一性洗脫在下列情況下非專一洗脫很難分離：（1）配體帶有電荷，由于離子交換作用，雜蛋白也能同時被吸附。（2）配體本身對幾種生物大分子都具有親和力。解決辦法：使用專一性洗脫，即使用游離配體配制專一性洗脫劑。恒定洗脫分步洗脫(c)梯度洗脫（3）親和吸附劑的再生方法用2mol/LKCl-6mol/L尿素洗滌用非專一的蛋白酶保溫過夜聯(lián)合使用以上方法（4）影響親和層析的因素①樣品體積和流速的影響樣品體積影響不大流速不宜過快②溫度對親和層析的影響親和力隨著溫度的升高而降低，必須嚴(yán)格地控制

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