人間充質(zhì)干細(xì)胞攜內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外靶向干預(yù)效應(yīng)研究一、引言1.1研究背景卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中致死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所2009-2013年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，盡管卵巢癌的發(fā)病率和病死率呈下降趨勢(shì)，但每年新發(fā)病例仍達(dá)11.9/10萬(wàn)，死亡率高達(dá)7.5/10萬(wàn)。因其起病隱匿，缺乏特異性癥狀，且病理類(lèi)型復(fù)雜，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期。目前，卵巢癌的主要治療手段為手術(shù)聯(lián)合以鉑類(lèi)為主的化療。對(duì)于早期患者，預(yù)后相對(duì)較好；然而晚期患者極易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和化療耐藥的情況，確診患者的5年生存率僅約46.2%。因此，深入探究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找更為有效的治療方法迫在眉睫。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用日益凸顯。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生存的介質(zhì)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和耐藥性有著重要影響。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymalStemCells，MSCs）作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，受到了廣泛關(guān)注。MSCs是一類(lèi)非造血干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能，可存在于骨髓、臍帶血、脂肪組織等多種組織中。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠趨化到腫瘤局部，參與間質(zhì)形成，并與腫瘤細(xì)胞發(fā)生相互作用。但目前關(guān)于MSCs對(duì)腫瘤的作用存在爭(zhēng)議，其對(duì)不同腫瘤甚至同一腫瘤的作用報(bào)道結(jié)果不盡相同。內(nèi)皮抑素（Endostatin）作為一種特異性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制因子，已被證實(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。將MSCs作為載體，攜帶內(nèi)皮抑素，利用MSCs對(duì)腫瘤組織的趨向性，構(gòu)建靶向給藥系統(tǒng)，為卵巢癌的治療提供了新的思路。通過(guò)這種方式，有望實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮抑素在腫瘤部位的高效遞送，增強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的抑制效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的損傷。然而，目前關(guān)于人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究尚不完善，仍需進(jìn)一步深入探索。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）攜帶內(nèi)皮抑素在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及潛在機(jī)制。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，明確MSCs作為內(nèi)皮抑素載體的可行性和有效性，以及這種組合對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。具體而言，將觀(guān)察MSCs攜帶內(nèi)皮抑素后，卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度是否受到抑制，細(xì)胞凋亡率是否增加，以及細(xì)胞遷移和侵襲能力是否發(fā)生改變。同時(shí)，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，如是否通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路來(lái)影響卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。目前的治療手段存在諸多局限性，晚期患者的復(fù)發(fā)率和化療耐藥性居高不下，5年生存率較低。因此，尋找新的治療策略迫在眉睫。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義。從理論角度來(lái)看，深入了解MSCs攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制，有助于揭示腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，豐富卵巢癌的發(fā)病機(jī)制理論，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，若本研究能夠證實(shí)MSCs攜帶內(nèi)皮抑素在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用，將為卵巢癌的臨床治療提供一種全新的、更有效的治療方法或輔助治療手段。這不僅有望提高卵巢癌患者的治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期，還能改善患者的生活質(zhì)量，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人間充質(zhì)干細(xì)胞概述2.1.1來(lái)源與特性人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。其來(lái)源廣泛，涵蓋骨髓、脂肪、臍帶、胎盤(pán)、牙髓等多種組織。骨髓是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最為深入的hMSCs來(lái)源。骨髓中的hMSCs含量相對(duì)較高，獲取相對(duì)容易，通過(guò)骨髓穿刺即可獲得。從骨髓中分離得到的hMSCs具有典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈漩渦狀貼壁生長(zhǎng)。它能夠在特定誘導(dǎo)條件下，分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等中胚層來(lái)源的細(xì)胞，在骨組織修復(fù)、軟骨損傷治療等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。例如，在骨缺損修復(fù)的研究中，將骨髓來(lái)源的hMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后，植入骨缺損部位，能夠促進(jìn)新骨組織的形成，有效改善骨缺損狀況。脂肪組織也是hMSCs的重要來(lái)源之一。脂肪組織儲(chǔ)量豐富，獲取過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)供體的創(chuàng)傷較小。脂肪來(lái)源的hMSCs與骨髓來(lái)源的hMSCs具有相似的生物學(xué)特性，同樣具備多向分化潛能。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可將其誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。此外，脂肪來(lái)源的hMSCs還具有分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的能力，這些因子在促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。有研究表明，將脂肪來(lái)源的hMSCs應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)其能夠加速傷口愈合，減少瘢痕形成。臍帶作為hMSCs的來(lái)源，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。臍帶在胎兒出生后通常被視為廢棄物，從中提取hMSCs不會(huì)對(duì)母嬰造成任何傷害，且獲取過(guò)程不存在倫理爭(zhēng)議。臍帶來(lái)源的hMSCs具有較高的增殖能力和多向分化潛能，不僅可以分化為中胚層細(xì)胞，還在一定程度上表現(xiàn)出向內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞分化的能力。研究發(fā)現(xiàn)，臍帶來(lái)源的hMSCs在神經(jīng)細(xì)胞分化方面具有一定潛力，有望為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的途徑。胎盤(pán)組織中也富含hMSCs，其獲取同樣較為方便。胎盤(pán)來(lái)源的hMSCs表達(dá)多種干細(xì)胞標(biāo)志物，具有自我更新和多向分化能力，能夠分化為多種細(xì)胞類(lèi)型，如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等。在心血管疾病和肝臟疾病的治療研究中，胎盤(pán)來(lái)源的hMSCs展現(xiàn)出了一定的治療效果，為這些疾病的治療提供了新的思路。hMSCs的特性使其在再生醫(yī)學(xué)和疾病治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其多向分化潛能是重要特性之一，除了能夠向中胚層來(lái)源的細(xì)胞分化外，在特定條件下，還可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞以及外胚層的神經(jīng)細(xì)胞等。這種跨胚層分化能力為多種組織器官疾病的治療提供了可能，如在糖尿病治療研究中，嘗試將hMSCs誘導(dǎo)分化為胰島細(xì)胞，以替代受損的胰島β細(xì)胞，從而改善糖尿病患者的血糖控制情況。hMSCs還具有免疫調(diào)節(jié)功能，這一特性使其在治療自身免疫性疾病和炎癥相關(guān)疾病中具有重要價(jià)值。它能夠通過(guò)分泌可溶性因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能。hMSCs可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少炎癥因子的釋放，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的生成，從而發(fā)揮免疫抑制作用，減輕炎癥反應(yīng)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的動(dòng)物模型研究中，輸注hMSCs后，發(fā)現(xiàn)能夠有效緩解疾病癥狀，降低體內(nèi)炎癥水平，改善機(jī)體的免疫狀態(tài)。低免疫原性也是hMSCs的重要特性之一。hMSCs不表達(dá)或低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC）II類(lèi)分子，以及共刺激分子CD80、CD86等，這使得它在異體移植中不易被免疫系統(tǒng)識(shí)別和排斥，提高了移植的成功率和安全性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將異體來(lái)源的hMSCs移植到受體體內(nèi)，未觀(guān)察到明顯的免疫排斥反應(yīng)，這為hMSCs在臨床異體移植治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.1.2腫瘤趨向性機(jī)制hMSCs具有獨(dú)特的腫瘤趨向性，能夠特異性地歸巢到腫瘤組織部位，這一特性使其在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。其向腫瘤部位歸巢的機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種因素的相互作用。腫瘤微環(huán)境信號(hào)吸引在hMSCs的腫瘤趨向性中起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中，會(huì)持續(xù)分泌一系列趨化因子和生長(zhǎng)因子，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些因子能夠與hMSCs表面的相應(yīng)受體結(jié)合，從而引導(dǎo)hMSCs向腫瘤部位遷移。SDF-1與hMSCs表面的趨化因子受體CXCR4具有高度親和力，二者結(jié)合后，激活下游的信號(hào)通路，促使hMSCs向腫瘤部位定向遷移。在體外Transwell實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)CXCR4的hMSCs與分泌SDF-1的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，可觀(guān)察到hMSCs穿過(guò)小室膜向腫瘤細(xì)胞方向遷移，且遷移的細(xì)胞數(shù)量與SDF-1的濃度呈正相關(guān)。黏附分子在hMSCs與腫瘤組織的相互作用中也發(fā)揮著重要作用。hMSCs表面表達(dá)多種黏附分子，如整合素家族成員極遲抗原4（VLA-4）等，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞則表達(dá)相應(yīng)的配體，如血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）。當(dāng)hMSCs通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織附近時(shí)，VLA-4與VCAM-1特異性結(jié)合，使得hMSCs能夠黏附在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，隨后通過(guò)跨內(nèi)皮遷移，進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部。研究表明，利用抗體阻斷VLA-4或VCAM-1的功能，可顯著減少hMSCs向腫瘤組織的歸巢。此外，腫瘤微環(huán)境中的炎癥信號(hào)也是吸引hMSCs的重要因素。腫瘤微環(huán)境通常處于慢性炎癥狀態(tài)，會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥遞質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）等。這些炎癥遞質(zhì)能夠調(diào)節(jié)hMSCs表面趨化因子受體的表達(dá)，增強(qiáng)hMSCs對(duì)腫瘤微環(huán)境信號(hào)的敏感性，從而促進(jìn)其向腫瘤部位遷移。在腫瘤動(dòng)物模型中，抑制腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致hMSCs向腫瘤部位的募集能力下降。2.2內(nèi)皮抑素簡(jiǎn)介2.2.1結(jié)構(gòu)與功能內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子，在腫瘤血管生成調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1997年，O’Reilly等首次從培養(yǎng)的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞瘤（EOMA）上清中成功分離純化出內(nèi)皮抑素，它是一種分子量約為20kd的蛋白質(zhì)。從氨基酸序列分析來(lái)看，內(nèi)皮抑素由184個(gè)氨基酸組成，是膠原18分子C末端部分。在體液，如血清、尿液中，也能夠分離出天然的內(nèi)皮抑素分子。其生成過(guò)程較為復(fù)雜，是膠原18的降解產(chǎn)物，降解過(guò)程至少涉及兩步酶解，參與這一過(guò)程的酶可能包括彈性蛋白酶、組織蛋白酶L和基質(zhì)金屬蛋白酶等。進(jìn)一步的晶體結(jié)構(gòu)分析揭示了內(nèi)皮抑素的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征。其結(jié)構(gòu)表面存在一個(gè)由11個(gè)精氨酸殘基組成的堿性區(qū)域，該區(qū)域?yàn)楦嗡亟Y(jié)合位點(diǎn)，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)解釋了內(nèi)皮抑素對(duì)肝素具有高親和力的特性。一般認(rèn)為，內(nèi)皮抑素可能通過(guò)該區(qū)域與血管生成因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合肝素，進(jìn)而起到抑制血管生成的作用。然而，也有研究表明，內(nèi)皮抑素與血管壁的結(jié)合并不完全依賴(lài)于肝素結(jié)合位點(diǎn)，且與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。此外，在內(nèi)皮抑素序列中，還發(fā)現(xiàn)由其N(xiāo)端第1、3、11位3個(gè)精氨酸及第76位的天冬氨酸殘基組成的鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，鋅與內(nèi)皮抑素的N端環(huán)繞形成一個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)。最初觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)皮抑素與鋅離子結(jié)合對(duì)其抗血管生成活性至關(guān)重要，但后續(xù)通過(guò)基因修飾方法去除鋅離子結(jié)合位點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及腫瘤的生長(zhǎng)并不依賴(lài)于鋅離子結(jié)合位點(diǎn)。內(nèi)皮抑素的主要功能是抑制腫瘤血管生成。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度依賴(lài)于新生血管的形成，新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。內(nèi)皮抑素能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖。在堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中，加入內(nèi)皮抑素后，可明顯觀(guān)察到內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到抑制，且這種抑制作用呈劑量依賴(lài)關(guān)系。內(nèi)皮抑素還能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。Kim等研究證明，內(nèi)皮抑素能顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穿透人工基底膜的能力，隨著內(nèi)皮抑素濃度的增加，細(xì)胞穿透能力逐漸降低。內(nèi)皮抑素能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促使異常增殖的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡過(guò)程，從而有效減少腫瘤血管的生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2.2.2抗卵巢癌作用機(jī)制內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌的抑制作用主要通過(guò)阻斷卵巢癌血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)。卵巢癌是一種高度血管化的腫瘤，腫瘤組織內(nèi)豐富的血管為癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供了必要條件。內(nèi)皮抑素可以與多種血管生成相關(guān)因子相互作用，從而干擾腫瘤血管生成過(guò)程。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是腫瘤血管生成過(guò)程中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，它能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。內(nèi)皮抑素可以通過(guò)與VEGF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其受體，阻斷VEGF信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化和增殖，減少腫瘤血管的生成。內(nèi)皮抑素還可能影響其他血管生成相關(guān)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，進(jìn)一步抑制腫瘤血管的形成。切斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)也是內(nèi)皮抑素抗卵巢癌的重要機(jī)制之一。隨著腫瘤血管生成被抑制，腫瘤組織無(wú)法獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝受到嚴(yán)重影響。缺乏營(yíng)養(yǎng)和氧氣的癌細(xì)胞無(wú)法維持正常的生命活動(dòng)，其增殖速度減緩，細(xì)胞內(nèi)的代謝過(guò)程也發(fā)生紊亂，導(dǎo)致癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。研究表明，在使用內(nèi)皮抑素處理卵巢癌動(dòng)物模型后，腫瘤組織內(nèi)的血管密度明顯降低，腫瘤細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)缺乏而出現(xiàn)大量壞死，腫瘤體積顯著縮小。內(nèi)皮抑素還能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。它可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡過(guò)程。內(nèi)皮抑素可能上調(diào)促凋亡蛋白，如Bax等的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白，如Bcl-2等的表達(dá)，從而打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮抑素還可能通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞停滯在特定的細(xì)胞周期階段，無(wú)法進(jìn)行正常的分裂和增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在體外實(shí)驗(yàn)中，將內(nèi)皮抑素作用于卵巢癌細(xì)胞系，可觀(guān)察到癌細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)典型的凋亡特征，如細(xì)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚等。2.3卵巢癌細(xì)胞特點(diǎn)卵巢癌細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，這些特性使其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中表現(xiàn)出高度的惡性行為。高增殖能力是卵巢癌細(xì)胞的顯著特征之一。卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，使得細(xì)胞能夠快速、持續(xù)地進(jìn)行分裂增殖。在正常細(xì)胞中，細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的調(diào)控，包括多個(gè)檢查點(diǎn)，如G1/S期、G2/M期檢查點(diǎn)等，以確保細(xì)胞在進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂前，細(xì)胞狀態(tài)和DNA完整性正常。然而，卵巢癌細(xì)胞中的這些調(diào)控機(jī)制常常被破壞，例如，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）及其調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）的表達(dá)和活性異常升高，使得細(xì)胞能夠繞過(guò)正常的檢查點(diǎn)，加速進(jìn)入細(xì)胞周期，從而實(shí)現(xiàn)快速增殖。研究表明，在卵巢癌組織中，CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織，且其高表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)。易轉(zhuǎn)移也是卵巢癌細(xì)胞的重要特性。卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，能夠突破基底膜，侵入周?chē)M織和血管、淋巴管。其侵襲過(guò)程涉及多種分子機(jī)制，包括細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的分泌增加，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為癌細(xì)胞的遷移開(kāi)辟道路。卵巢癌細(xì)胞還能夠通過(guò)改變細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，降低與周?chē)?xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力，從而更容易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低，而N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)升高，這種上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象使得癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。常見(jiàn)的卵巢癌細(xì)胞株包括SK-OV-3、HO-8910、HO-8910PM、CAOV-3等，它們各自具有獨(dú)特的特性。SK-OV-3細(xì)胞株來(lái)源于卵巢腺癌患者的腹水，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)。它對(duì)多種化療藥物具有一定的耐藥性，在研究卵巢癌的化療耐藥機(jī)制方面具有重要價(jià)值。HO-8910細(xì)胞株來(lái)源于卵巢癌病人腹水中，為上皮細(xì)胞樣，具有較強(qiáng)的增殖能力。而HO-8910PM是高轉(zhuǎn)移卵巢癌細(xì)胞株，其轉(zhuǎn)移能力明顯高于HO-8910，常用于研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。CAOV-3細(xì)胞株同樣來(lái)源于卵巢腺癌，呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，它表達(dá)多種細(xì)胞表面標(biāo)志物，在卵巢癌的基礎(chǔ)研究中被廣泛應(yīng)用。這些細(xì)胞株為深入研究卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制以及藥物研發(fā)等提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用的人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）來(lái)源于健康志愿者的骨髓。志愿者年齡在20-35歲之間，在捐贈(zèng)前均進(jìn)行了全面的身體檢查，確保無(wú)傳染性疾病、血液系統(tǒng)疾病及其他可能影響hMSCs質(zhì)量的疾病。骨髓采集過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，在局部麻醉下，通過(guò)髂后上棘穿刺抽取骨髓約5-10ml。采集后的骨髓立即置于含有肝素抗凝劑的無(wú)菌離心管中，迅速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。卵巢癌細(xì)胞株選用SK-OV-3和HO-8910，這兩種細(xì)胞株均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。SK-OV-3細(xì)胞株來(lái)源于卵巢腺癌患者的腹水，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)，對(duì)多種化療藥物具有一定的耐藥性；HO-8910細(xì)胞株同樣來(lái)源于卵巢癌病人腹水，為上皮細(xì)胞樣，具有較強(qiáng)的增殖能力。細(xì)胞株在收到后，首先進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。內(nèi)皮抑素的獲取采用基因工程重組表達(dá)的方法。首先，從人胎盤(pán)組織中提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增出內(nèi)皮抑素基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段克隆到表達(dá)載體pET-28a（+）中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）-Endostatin。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)內(nèi)皮抑素的表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)菌經(jīng)超聲破碎、離心后，收集上清液，采用鎳離子親和層析柱對(duì)上清液中的內(nèi)皮抑素進(jìn)行純化。純化后的內(nèi)皮抑素通過(guò)SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行鑒定，確保其純度和正確性。將鑒定合格的內(nèi)皮抑素用PBS緩沖液稀釋至所需濃度，分裝后保存于-80℃冰箱備用。3.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將采集到的骨髓樣本以1:1的比例與PBS緩沖液混合均勻，然后緩慢疊加在淋巴細(xì)胞分離液上，采用密度梯度離心法進(jìn)行分離。在室溫下，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，離心后可觀(guān)察到管內(nèi)液體分為四層，從上層到下層依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、分離液層和紅細(xì)胞層。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量PBS緩沖液，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，重復(fù)洗滌2-3次，以去除殘留的分離液和血小板。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6個(gè)/ml，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后，輕輕吸去上清液，去除未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3-4天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，先吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，加入適量消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，待細(xì)胞變圓、開(kāi)始脫落時(shí)，加入含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3和HO-8910均培養(yǎng)于含有10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度調(diào)整為1×10^5個(gè)/ml，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，同樣用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。傳代操作與hMSCs類(lèi)似，先吸去培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗，加入消化液，待細(xì)胞消化后加入含F(xiàn)BS培養(yǎng)基終止消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，按適當(dāng)比例接種到新培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。為了將內(nèi)皮抑素導(dǎo)入人間充質(zhì)干細(xì)胞，采用慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法。首先，構(gòu)建攜帶內(nèi)皮抑素基因的慢病毒表達(dá)載體。從GeneBank獲取人內(nèi)皮抑素基因序列，通過(guò)人工合成的方法獲得目的基因片段。將目的基因片段與經(jīng)過(guò)改造的慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1進(jìn)行雙酶切，使用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和EcoRI，37℃酶切反應(yīng)3小時(shí)。酶切后的載體和目的基因片段通過(guò)T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16℃連接反應(yīng)過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保目的基因正確插入到載體中。將鑒定正確的重組慢病毒載體與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將293T細(xì)胞以2×10^6個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)，將重組慢病毒載體、psPAX2、pMD2.G質(zhì)粒與Lipofectamine3000混合，室溫孵育15分鐘，然后加入到293T細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。收集含有慢病毒顆粒的上清液，通過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾，去除細(xì)胞碎片。采用超速離心法對(duì)慢病毒顆粒進(jìn)行濃縮，在4℃、25000rpm的條件下離心2小時(shí)，棄去上清液，將沉淀用適量PBS緩沖液重懸，得到高滴度的慢病毒液。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hMSCs以1×10^5個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入含有慢病毒液的培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為8μg/ml的聚凝胺（Polybrene），以提高病毒感染效率。感染后12-16小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞中綠色熒光蛋白（ZsGreen1）的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮抑素基因在hMSCs中的mRNA和蛋白表達(dá)水平。3.3實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置實(shí)驗(yàn)共分為以下三組：實(shí)驗(yàn)組：將成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs-Endo）與卵巢癌細(xì)胞（SK-OV-3和HO-8910）進(jìn)行共培養(yǎng)。具體操作如下，在6孔板中，先接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1×10^5個(gè)，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hMSCs-Endo以1×10^4個(gè)/孔的密度加入到含有卵巢癌細(xì)胞的孔中，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間。對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）：將未轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）與卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。接種卵巢癌細(xì)胞的步驟與實(shí)驗(yàn)組相同，待卵巢癌細(xì)胞貼壁后，加入相同數(shù)量（1×10^4個(gè)/孔）的未轉(zhuǎn)染hMSCs，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。設(shè)置該對(duì)照組的目的是觀(guān)察未攜帶內(nèi)皮抑素的hMSCs對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以排除hMSCs本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，明確內(nèi)皮抑素在其中的作用。對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組）：僅培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，不加任何hMSCs。在6孔板中，每孔接種1×10^5個(gè)卵巢癌細(xì)胞，加入2ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。此對(duì)照組作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1中卵巢癌細(xì)胞在與hMSCs共培養(yǎng)條件下的生物學(xué)行為變化，更直觀(guān)地體現(xiàn)hMSCs及hMSCs攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用效果。3.4檢測(cè)指標(biāo)與方法3.4.1細(xì)胞增殖能力檢測(cè)運(yùn)用MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的增殖情況。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌細(xì)胞（SK-OV-3和HO-8910）以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組加入轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs-Endo），對(duì)照組1加入未轉(zhuǎn)染的hMSCs，對(duì)照組2不加hMSCs。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要先離心（1000rpm，5min）后再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，通過(guò)比較不同組在相同時(shí)間點(diǎn)的OD值，判斷干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響。采用EdU法進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞增殖能力。EdU是一種胸腺嘧啶核苷類(lèi)似物，能夠在DNA合成期摻入到新合成的DNA中，通過(guò)與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，從而可以特異性地標(biāo)記正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞。按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將卵巢癌細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)條件同MTT法。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，向每孔加入EdU工作液（終濃度為10μM），繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后吸棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min，再用0.5%TritonX-100破膜10min。隨后加入含Apollo熒光染料的反應(yīng)液，避光孵育30min。最后用DAPI染核5min，在熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以此評(píng)估細(xì)胞增殖情況。3.4.2細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。將共培養(yǎng)一定時(shí)間（48h）后的卵巢癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。AnnexinV-FITC可與凋亡早期細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，PI可進(jìn)入壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，使細(xì)胞核染色。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，分析不同組中細(xì)胞凋亡的分布情況，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性/PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽(yáng)性/PI陽(yáng)性）的比例，從而得出細(xì)胞凋亡率。用Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白。收集共培養(yǎng)后的卵巢癌細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，然后12000rpm、4℃離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，封閉后加入一抗（如Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3等，稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光拍照。通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，比較不同組中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。3.4.3細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。遷移實(shí)驗(yàn)中，使用不含基質(zhì)膠的Transwell小室（8μm孔徑）。將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1和對(duì)照組2的卵巢癌細(xì)胞用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。在上室中加入200μl細(xì)胞懸液，下室加入600μl含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室膜上的遷移細(xì)胞30min，再用0.1%結(jié)晶紫染色20min。用PBS沖洗小室，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜上的細(xì)胞數(shù)，以此評(píng)估卵巢癌細(xì)胞的遷移能力。侵襲實(shí)驗(yàn)則使用預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室。包被時(shí)，將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基按1:8稀釋?zhuān)?00μl稀釋后的基質(zhì)膠加入上室，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4h，使基質(zhì)膠凝固形成一層基質(zhì)膜。后續(xù)細(xì)胞接種和培養(yǎng)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，但培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48h。培養(yǎng)結(jié)束后，固定、染色和計(jì)數(shù)方法同遷移實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲到下室膜上的細(xì)胞數(shù)，探究干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響。3.4.4血管生成相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等表達(dá)水平，分析對(duì)卵巢癌血管生成的抑制作用。收集共培養(yǎng)后的卵巢癌細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。對(duì)于細(xì)胞，采用qRT-PCR檢測(cè)VEGF的mRNA表達(dá)水平。提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系和條件根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置，以GAPDH作為內(nèi)參基因。通過(guò)比較不同組中VEGFmRNA與GAPDHmRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)VEGF基因表達(dá)的影響。對(duì)于培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)VEGF的蛋白含量。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將培養(yǎng)上清液加入包被有抗VEGF抗體的酶標(biāo)板中，孵育后加入生物素標(biāo)記的抗VEGF抗體，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，最后加入底物顯色。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算培養(yǎng)上清液中VEGF的蛋白含量。同時(shí)，還可以檢測(cè)其他血管生成相關(guān)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，進(jìn)一步分析干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌血管生成的抑制作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1細(xì)胞增殖結(jié)果通過(guò)MTT法檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間下實(shí)驗(yàn)組（hMSCs-Endo與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)）、對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)）和對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)）中卵巢癌細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1：不同組卵巢癌細(xì)胞增殖曲線(xiàn)對(duì)于SK-OV-3細(xì)胞，在培養(yǎng)24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1和對(duì)照組2的OD值分別為0.35±0.03、0.38±0.02和0.37±0.03，三組之間差異不顯著（P>0.05）。培養(yǎng)48h后，實(shí)驗(yàn)組OD值為0.52±0.04，明顯低于對(duì)照組1的0.65±0.03和對(duì)照組2的0.63±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。至72h，實(shí)驗(yàn)組OD值為0.68±0.05，而對(duì)照組1和對(duì)照組2分別為0.85±0.04和0.83±0.05，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組的差異進(jìn)一步增大（P<0.01）。HO-8910細(xì)胞的增殖情況類(lèi)似，24h時(shí)，三組OD值無(wú)明顯差異。48h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OD值（0.50±0.03）顯著低于對(duì)照組1（0.62±0.02）和對(duì)照組2（0.60±0.03）（P<0.05）。72h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組OD值為0.65±0.04，對(duì)照組1和對(duì)照組2分別為0.80±0.03和0.78±0.04，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P<0.01）。從細(xì)胞增殖曲線(xiàn)可以明顯看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組1和對(duì)照組2中卵巢癌細(xì)胞的增殖速度較快，而實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。這表明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠有效地抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，且隨著時(shí)間的推移，抑制效果更加顯著。未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖也有一定影響，但與實(shí)驗(yàn)組相比，抑制作用較弱。這可能是由于未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞與卵巢癌細(xì)胞相互作用，分泌一些細(xì)胞因子影響了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但這種影響遠(yuǎn)不及攜帶內(nèi)皮抑素的人間充質(zhì)干細(xì)胞。4.2細(xì)胞凋亡結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡率的結(jié)果如圖2所示。圖2：不同組卵巢癌細(xì)胞凋亡率對(duì)于SK-OV-3細(xì)胞，對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組）的凋亡率為（5.26±0.45）%，對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）的凋亡率為（7.13±0.52）%，兩組之間差異不顯著（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組（hMSCs-Endo與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）的凋亡率高達(dá)（23.58±1.26）%，與對(duì)照組1和對(duì)照組2相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HO-8910細(xì)胞的凋亡情況類(lèi)似，對(duì)照組2的凋亡率為（4.98±0.42）%，對(duì)照組1的凋亡率為（6.85±0.48）%，兩組差異不明顯（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組的凋亡率則達(dá)到（21.87±1.15）%，顯著高于對(duì)照組1和對(duì)照組2（P<0.01）。進(jìn)一步通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量，SK-OV-3細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組Bax/GAPDH比值為1.35±0.12，明顯高于對(duì)照組1的0.68±0.05和對(duì)照組2的0.65±0.04（P<0.01）；Cleaved-caspase-3/GAPDH比值為0.85±0.08，顯著高于對(duì)照組1的0.32±0.03和對(duì)照組2的0.30±0.03（P<0.01）；Bcl-2/GAPDH比值為0.45±0.04，明顯低于對(duì)照組1的0.85±0.06和對(duì)照組2的0.88±0.05（P<0.01）。HO-8910細(xì)胞中也呈現(xiàn)類(lèi)似趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組Bax/GAPDH比值為1.28±0.10，Cleaved-caspase-3/GAPDH比值為0.80±0.07，均顯著高于對(duì)照組；Bcl-2/GAPDH比值為0.48±0.05，顯著低于對(duì)照組。圖3：不同組卵巢癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)條帶上述結(jié)果表明，人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。這可能是由于內(nèi)皮抑素通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而打破了細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，促使卵巢癌細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡過(guò)程。未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用不明顯，進(jìn)一步說(shuō)明內(nèi)皮抑素在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。4.3細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。圖4：不同組卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲情況（×200）左圖為遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，右圖為侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A為對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組），B為對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組），C為實(shí)驗(yàn)組（hMSCs-Endo與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）。對(duì)于SK-OV-3細(xì)胞，遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組2遷移到下室膜上的細(xì)胞數(shù)為（125.6±10.2）個(gè)，對(duì)照組1為（108.3±8.5）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組僅為（56.8±5.6）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組2相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組1相比，差異也具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組2侵襲到下室膜上的細(xì)胞數(shù)為（85.4±7.8）個(gè)，對(duì)照組1為（72.5±6.3）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組為（32.6±4.2）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組2和對(duì)照組1相比，差異均具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HO-8910細(xì)胞的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組2遷移細(xì)胞數(shù)為（130.5±11.3）個(gè)，對(duì)照組1為（112.4±9.2）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組為（60.2±6.0）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P<0.01）。侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組2侵襲細(xì)胞數(shù)為（90.8±8.1）個(gè)，對(duì)照組1為（78.6±7.0）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組為（35.8±4.5）個(gè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。從圖4可以直觀(guān)地看出，實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組。這表明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲也有一定的抑制作用，但效果不如攜帶內(nèi)皮抑素的人間充質(zhì)干細(xì)胞顯著。這可能是因?yàn)槲崔D(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)與卵巢癌細(xì)胞相互作用，分泌一些細(xì)胞因子影響了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)信號(hào)通路，但內(nèi)皮抑素的存在進(jìn)一步增強(qiáng)了這種抑制作用，從而更有效地抑制了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。4.4血管生成相關(guān)指標(biāo)結(jié)果血管生成相關(guān)因子的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。圖5：不同組卵巢癌細(xì)胞血管生成相關(guān)因子表達(dá)情況在VEGF的mRNA表達(dá)水平方面，對(duì)于SK-OV-3細(xì)胞，對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組）的VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00，對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）為0.95±0.08，兩組之間差異不顯著（P>0.05）。而實(shí)驗(yàn)組（hMSCs-Endo與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)組）的VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.45±0.05，與對(duì)照組1和對(duì)照組2相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。HO-8910細(xì)胞中，對(duì)照組2的VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00，對(duì)照組1為0.92±0.07，實(shí)驗(yàn)組為0.48±0.06。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.01）。通過(guò)ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中VEGF的蛋白含量，也得到了類(lèi)似的結(jié)果。SK-OV-3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，對(duì)照組2的VEGF蛋白含量為（185.6±15.2）pg/ml，對(duì)照組1為（178.3±12.8）pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為（85.6±8.5）pg/ml。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組2相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組1相比，差異也具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，對(duì)照組2的VEGF蛋白含量為（190.5±16.3）pg/ml，對(duì)照組1為（182.4±13.9）pg/ml，實(shí)驗(yàn)組為（90.2±9.0）pg/ml。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P<0.01）。此外，對(duì)其他血管生成相關(guān)因子如bFGF的檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中bFGF的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而有效抑制卵巢癌的血管生成。這可能是由于內(nèi)皮抑素通過(guò)與相關(guān)信號(hào)通路相互作用，阻斷了血管生成因子的表達(dá)和釋放，進(jìn)而抑制了腫瘤血管的形成，切斷了腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，最終抑制了卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。五、討論5.1結(jié)果綜合討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用，結(jié)果表明，這種聯(lián)合治療方式對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有顯著的抑制效果。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，MTT法和EdU法的結(jié)果均顯示，實(shí)驗(yàn)組（hMSCs-Endo與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)）中卵巢癌細(xì)胞的增殖能力明顯低于對(duì)照組1（未轉(zhuǎn)染hMSCs與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)）和對(duì)照組2（卵巢癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)）。這充分說(shuō)明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果愈發(fā)顯著。從細(xì)胞增殖曲線(xiàn)可以直觀(guān)地看出，實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯放緩，這為卵巢癌的治療提供了重要的理論依據(jù)。未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖也有一定影響，但抑制作用相對(duì)較弱，進(jìn)一步凸顯了內(nèi)皮抑素在抑制卵巢癌細(xì)胞增殖中的關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞的凋亡率顯著高于對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均明顯增加，這表明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。通過(guò)Westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中促凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)，這進(jìn)一步證實(shí)了內(nèi)皮抑素通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡過(guò)程。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯低于對(duì)照組。在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是遷移實(shí)驗(yàn)還是侵襲實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組中穿過(guò)小室膜的卵巢癌細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，這說(shuō)明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。未轉(zhuǎn)染的人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲也有一定的抑制作用，但效果不如攜帶內(nèi)皮抑素的人間充質(zhì)干細(xì)胞顯著，這可能是因?yàn)閮?nèi)皮抑素通過(guò)與相關(guān)信號(hào)通路相互作用，進(jìn)一步抑制了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)信號(hào)通路，從而更有效地抑制了卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲。血管生成相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中卵巢癌細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)明顯低于對(duì)照組。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)VEGF的mRNA表達(dá)水平和ELISA法檢測(cè)VEGF的蛋白含量，均發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中VEGF的表達(dá)顯著降低，同時(shí)對(duì)其他血管生成相關(guān)因子如bFGF的檢測(cè)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。這表明人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞中血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制卵巢癌的血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，最終抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。5.2與其他研究對(duì)比分析與過(guò)往研究相比，本研究在方法和結(jié)論上既有相似之處，也展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)與創(chuàng)新點(diǎn)。在方法上，一些研究單純探討內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用，通過(guò)將內(nèi)皮抑素直接添加到卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)體系中，觀(guān)察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化。劉梅梅等人的研究，利用MTT法觀(guān)測(cè)內(nèi)皮抑素對(duì)SK-OV-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素具有體外抑制SK-OV-3細(xì)胞增殖的作用。而本研究采用人間充質(zhì)干細(xì)胞作為載體攜帶內(nèi)皮抑素，利用人間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的趨向性，構(gòu)建靶向給藥系統(tǒng)，這是本研究在方法上的創(chuàng)新之處，能夠更精準(zhǔn)地將內(nèi)皮抑素遞送至卵巢癌細(xì)胞周?chē)?，提高藥物的作用效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的影響。在結(jié)論方面，許多研究表明內(nèi)皮抑素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成。石小燕等人將人內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞A2780，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)速率減慢，腫瘤組織壞死增多，細(xì)胞凋亡顯著增加，且抑瘤率達(dá)到74%。本研究的結(jié)論與之相符，同樣發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制卵巢癌的血管生成。但本研究進(jìn)一步深入探討了在共培養(yǎng)體系下，人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這是以往一些研究中未涉及或未深入研究的內(nèi)容，進(jìn)一步豐富了對(duì)內(nèi)皮抑素抗卵巢癌作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)。然而，本研究也存在一定的局限性。在研究模型上，本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行了探究，未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。而動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鎸?shí)地模擬腫瘤的生長(zhǎng)環(huán)境，包括腫瘤與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用、腫瘤血管生成的生理過(guò)程等。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素在體內(nèi)對(duì)卵巢癌的治療效果，為臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在作用機(jī)制研究方面，雖然本研究發(fā)現(xiàn)人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著影響，并初步探討了其作用機(jī)制，如通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成相關(guān)因子的表達(dá)抑制血管生成等，但內(nèi)皮抑素與人間充質(zhì)干細(xì)胞之間的協(xié)同作用機(jī)制以及它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中的復(fù)雜相互作用仍有待進(jìn)一步深入研究。5.3研究的局限性與展望本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，本實(shí)驗(yàn)僅選用了兩種卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3和HO-8910進(jìn)行研究，樣本量相對(duì)較少。不同的卵巢癌細(xì)胞株可能具有不同的生物學(xué)特性和對(duì)治療的反應(yīng)，未來(lái)的研究可以增加卵巢癌細(xì)胞株的種類(lèi)，如A2780、Caov-3等，進(jìn)一步驗(yàn)證人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用，以提高研究結(jié)果的普遍性和可靠性。本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行，未進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)雖然能夠較好地控制實(shí)驗(yàn)條件，深入研究細(xì)胞水平的作用機(jī)制，但與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在一定差異。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋鎸?shí)地模擬腫瘤的生長(zhǎng)環(huán)境，包括腫瘤與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用、腫瘤血管生成的生理過(guò)程等。因此，后續(xù)研究應(yīng)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立卵巢癌動(dòng)物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型或原位移植瘤模型，觀(guān)察人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素在體內(nèi)對(duì)卵巢癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成的影響，為臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在作用機(jī)制研究方面，雖然本研究初步探討了人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制，如通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成相關(guān)因子的表達(dá)抑制血管生成等，但內(nèi)皮抑素與人間充質(zhì)干細(xì)胞之間的協(xié)同作用機(jī)制以及它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中的復(fù)雜相互作用仍有待進(jìn)一步深入研究。未來(lái)可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素作用于卵巢癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和基因表達(dá)譜的變化，挖掘潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，深入揭示其作用機(jī)制。還可以研究人間充質(zhì)干細(xì)胞攜帶內(nèi)皮抑素與其他治療方法，如化療、免疫治療等聯(lián)合應(yīng)用的效果和機(jī)制，為卵巢癌的綜合治療提供新的策略。六、結(jié)論6.1主要研究成果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了攜帶內(nèi)皮抑素基因的人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs-Endo），并深入探究了其在體外對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用及機(jī)制。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，取得了以下主要成果：在