T/SSFSXXXX—2024

食品中馬克斯克魯維酵母的定性檢驗

PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了食品中馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）的定性檢驗方法（PCR法）。

本文件適用于含馬克斯克魯維酵母的發(fā)酵乳、飲料、干酪、乳粉及發(fā)酵劑等產(chǎn)品中馬克斯克魯維酵

母的定性檢驗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.35食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

馬克斯克魯維酵母Kluyveromycesmarxianus

屬于子囊菌門、酵母菌亞門、酵母綱、酵母目、酵母科、克魯維屬。菌體呈橢圓形、卵形或結(jié)腸形，

好氧或兼性厭氧的異養(yǎng)型單細胞真核生物。

聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR

模板DNA先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的兩條

引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以

四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）為底物，使退火引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一

循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)。

縮略詞

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）。

Taq酶：從水生棲熱菌ThermusAquaticus中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶。

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）。

bp：堿基對（basepair）。

ITS：內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribedspacer）。

4儀器和設(shè)備

除微生物實驗常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

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電子天平：感量：0.001g。

PCR擴增儀。

高速臺式冷凍離心機：0~20000r/min。

紫外凝膠成像儀。

電泳裝置：包括電泳槽及電泳儀。

微量可調(diào)移液器及相應(yīng)可調(diào)吸頭。

恒溫水浴鍋：37℃±2℃和70℃±2℃。

微波爐。

超凈工作臺。

高壓滅菌鍋。

渦旋振蕩儀。

冰箱：2℃~8℃、-30℃~-20℃。

5試劑和材料

除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純或符合生化試劑，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水，

試劑如不做特別說明的均為常溫保存。

0.1mol/L磷酸鈉緩沖液：見附錄A.1.1。

1.2mol/L山梨醇緩沖液：見附錄A.1.2。

20%檸檬酸三鈉溶液：見附錄A.1.3。

1mol/L氫氧化鈉溶液：見附錄A.1.4。

1×TAE緩沖液：見附錄A.1.5。

無菌超純水或無菌雙蒸水。

PCR混合試劑：包括ExTaqDNA聚合酶、dNTPs混合液、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、引物，于-

20℃保存。

DNA分子量標記物（MarkerDL2000），于4℃保存。

電泳上樣緩沖液，于4℃保存。

商品化的酶法破壁酵母基因組DNA提取試劑盒（內(nèi)含緩沖液GA及GB，蛋白酶K，漂洗液GD及

PW，洗脫液TE）。

溶壁酶（10U/μL），于-20℃保存。

無水乙醇。

1%瓊脂糖凝膠：見附錄A.1.6。

4SGreen染料，于4℃保存。

無菌離心管：包括1.5mL、2.0mL、15.0mL。

無菌PCR反應(yīng)管。

乳酸克魯維酵母CICC32402T菌株或其他等效參考菌株。

馬克斯克魯維酵母CGMCC10060菌株或其他等效參考菌株。

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6檢驗原則及程序

采用馬克斯克魯維酵母的特異性引物對不同樣品DNA進行PCR擴增，從而從種水平定性檢驗馬克斯

克魯維酵母。

對不同樣品進行前處理后，提取待檢測樣本的基因組DNA，并對ITS目標序列進行擴增，將擴增產(chǎn)物

進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對馬克斯克魯維酵母檢驗程序見圖1。

圖1不同樣品中馬克斯克魯維酵母檢驗程序

7操作步驟

樣品前處理

按照GB4789.35中6.1規(guī)定的方法將待測樣品制備成1：10的樣品勻液。

7.1.1發(fā)酵乳及飲料前處理

采用移液器以無菌操作吸取發(fā)酵乳及飲料勻液5mL至無菌離心管中，加入1mL20%的檸檬酸三鈉

及50μL1mol/L的氫氧化鈉。充分振蕩反復(fù)吹打保證混合均勻，靜置10min。4℃、9000r/min離心10

min，將上清吸除干凈后留取沉淀物備用。

7.1.2發(fā)酵劑及乳粉前處理

采用移液器以無菌操作吸取發(fā)酵劑及乳粉勻液500μL至離心管中，添加100μL20%的檸檬酸三

鈉及50μL1mol/L的氫氧化鈉。充分振蕩反復(fù)吹打混合混勻，靜置10min。4℃、12000r/min離心

10min，將上清吸除干凈后留取沉淀物備用。

7.1.3干酪前處理

采用移液器以無菌操作吸取干酪勻液1mL至離心管中，添加200μL20%的檸檬酸三鈉及100μL1

mol/L的氫氧化鈉。充分振蕩反復(fù)吹打混合混勻，靜置10min。4℃、12000r/min離心10min，將上清

吸除干凈后沉淀留取備用。

酵母基因組DNA提取

7.2.1在上述沉淀中加入600μL由0.1mol/L磷酸鈉緩沖液配置的山梨醇buffer，約100U溶壁

酶，充分混勻。30℃處理1h。4000r/min離心10min，棄上清收集沉淀。

3

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7.2.2加入200μL緩沖液GA重懸沉淀，加入20μLProteinaseK溶液充分混勻，加入220μL緩

沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置20min。

7.2.3加220μL無水乙醇，充分顛倒混勻。轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心30s。加入漂洗液

洗滌兩次。

7.2.4選取50μL70℃水浴加熱后的洗脫液洗脫兩次?；虿捎镁哂邢嗤Ч拿阜ㄆ票诨蚪MDNA

提取方法進行DNA提取。

PCR反應(yīng)

7.3.1PCR反應(yīng)體系:采用針對馬克斯克魯維酵母設(shè)計的特異性引物（附錄B中表B.1）進行PCR擴增。

7.3.2PCR反應(yīng)程序：PCR反應(yīng)體系和參數(shù)見附錄B中表B.2和B.3。反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具

體情況或不同反應(yīng)總體積進行適當(dāng)調(diào)整。

7.3.3PCR質(zhì)量控制

每個PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置三個平行試驗，同時應(yīng)設(shè)置空白對照、陽性對照及陰性對照：

陽性對照：馬克斯克魯維酵母CGMCC10060菌株或等效參考菌株DNA為模板。

陰性對照：乳酸克魯維酵母CICC32402T菌株或等效參考菌株DNA為模板。

空白對照：無菌雙蒸水為模板。

陽性對照及陰性對照菌株選用生長至對數(shù)期的菌株，DNA提取流程同7.2。

PCR結(jié)果驗證

7.4.1使用1×TAE緩沖液配置2%瓊脂糖凝膠并添加1‰4SGreen染料。放于電泳槽中。

7.4.2將1×TAE緩沖液倒入電泳槽中完全沒過膠。

7.4.3吸取5μLPCR擴增產(chǎn)物與1μL電泳上樣緩沖液，混勻后在凝膠孔中點樣。

7.4.4在點樣孔中加入5μLDL2000Marker。

7.4.5恒壓120V電泳20min~30min。

8結(jié)果判斷與表述

結(jié)果判斷

PCR結(jié)果需同時滿足下述條件才可被視為有效：

（1）三份平行結(jié)果一致（均出現(xiàn)或未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增條帶）；

（2）空白及陰性對照未擴增到條帶；

（3）陽性對照出現(xiàn)目的片段。

若上述條件有一項不符合者，結(jié)果無效。

結(jié)果表述

根據(jù)上述片段瓊脂糖凝膠電泳的有效結(jié)果，若三份平行樣本均可擴增得到與陽性對照位置一致的

的片段，則認為在該樣品中可檢出馬克斯克魯維酵母菌；若三份平行樣本未擴增得到與陽性對照位置一

致的的片段，則認為在該檢樣單位中未檢出馬克斯克魯維酵母。

檢測結(jié)果表述為：檢樣單位中檢出或未檢出馬克斯克魯維酵母。

9檢出限

本文件適用的檢出限為：發(fā)酵乳及飲料：2×102CFU/g；發(fā)酵劑及乳粉：2×103CFU/g；干酪：1×

103CFU/g。

4

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附錄A

（資料性）

馬克斯克魯維酵母PCR檢測方法所用試劑配制

A.1培養(yǎng)基及試劑

A.1.10.1mol/L磷酸鈉緩沖液

A.1.1.1成分

0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液14.2g/L

0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液15.6g/L

A.1.1.2制法

77.4mL0.1mol/L磷酸氫二鈉加入22.6mL0.1mol/L磷酸二氫鈉，混勻備用。

A.1.21.2mol/L山梨醇緩沖液

稱取山梨醇218.60g，溶解于1000mL0.1mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.4），混勻備用。

A.1.320%檸檬酸三鈉

20%檸檬酸三鈉溶液：稱取檸檬酸三鈉20.0g，溶解于100mL蒸餾水，混勻備用。

A.1.41mol/L氫氧化鈉溶液

稱取氫氧化鈉4g，溶解于100mL蒸餾水，混勻備用。

A.1.51×TAE緩沖液

取50×TAE緩沖液20mL，加入980mL蒸餾水，混勻備用。

A.1.61%瓊脂糖凝膠

稱取瓊脂糖0.5g于50mL1×TAE緩沖液中，用微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解。帶溶液冷卻至60℃

左右時，加入1‰4SGreen核酸染料，輕輕搖勻后倒入制膠模具，備用。

5

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附錄B

（資料性）

馬克斯克魯維酵母PCR檢測方法參照表

B.1馬克斯克魯維酵母PCR檢測方法的各參照表信息參見表B.1、B.2、B.3。

表B.1馬克斯克魯維酵母PCR檢測的引物信息

引物名稱引物序列擴增長度/bp

正向引物KM-F5’-CTGGGGGAATCGTCTGAACAAG-3

545

反向引物KM-R5’-CTATGAGTCTCTATGACCCAAGC-3’

表B.2馬克斯克魯維酵母PCR檢測的反應(yīng)體系

試劑終濃度加入體積/μL

10×PCR緩沖液（含Mg2+）1×5

2.5mmol/LdNTPs0.2mmol/L4

ExTaqDNA聚合酶0.05U/μL0.5

10μmol/L正向引物0.4μmol/L2

10μmol/L反向引物0.4μmol/L2

DNA模板-4.0~8.0

ddH2O-28.5~32.5

總體積-50

注：反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)反應(yīng)的總體積進行適當(dāng)調(diào)整。

表B.3馬克斯克魯維酵母PCR檢測的反應(yīng)參數(shù)

預(yù)變形擴增循環(huán)數(shù)后延伸

95℃,5min95℃,30s;60℃,30s;72℃,45s4072℃,10min

注：PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)PCR擴增儀型號進行適當(dāng)調(diào)整。

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附錄C

（資料性）

馬克斯克魯維酵母的PCR圖

a注：M—DL2000Marker；1—空白對照；2—陽性對照（545bp）；3—陰性對照。

圖C.1馬克斯克魯維酵母的PCR圖

7

ICS67.100.10

CCSX16

上海市食品學(xué)會團體標準

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食品中馬克斯克魯維酵母的定性檢驗

PCR法

Qualitativedeterminationof—Kluyveromycesmarxianus

PCRmethodforfood

（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

上海市食品學(xué)會發(fā)布

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食品中馬克斯克魯維酵母的定性檢驗

PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了食品中馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）的定性檢驗方法（PCR法）。

本文件適用于含馬克斯克魯維酵母的發(fā)酵乳、飲料、干酪、乳粉及發(fā)酵劑等產(chǎn)品中馬克斯克魯維酵

母的定性檢驗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.35食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

馬克斯克魯維酵母Kluyveromycesmarxianus

屬于子囊菌門、酵母菌亞門、酵母綱、酵母目、酵母科、克魯維屬。菌體呈橢圓形、卵形或結(jié)腸形，

好氧或兼性厭氧的異養(yǎng)型單細胞真核生物。

聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR

模板DNA先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計的兩條

引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以

四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）為底物，使退火引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一

循環(huán)，使位于兩段已知序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)。

縮略詞

DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）。

PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction）。

Taq酶：從水生棲熱菌ThermusAquaticus中分離出的具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶。

dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）。

bp：堿基對（basepair）。

ITS：內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribedspacer）。

4儀器和設(shè)備

除微生物實驗常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

1

T/SSFSXXXX—2024

電子天平：感量：0.001g。

PCR擴增儀。

高速臺式冷凍離心機：0~20000r/min。

紫外凝膠成像儀。

電泳裝置：包括電泳槽及電泳儀。

微量可調(diào)移液器及相應(yīng)可調(diào)吸頭。

恒溫水浴鍋：37℃±2℃和70℃±2℃。

微波爐。

超凈工作臺。

高壓滅菌鍋。

渦旋振蕩儀。

冰箱：2℃~8℃、-30℃~-20℃。

5試劑和材料

除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純或符合生化試劑，實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水，

試劑如不做特別說明的均為常溫保存。

0.1mol/L磷酸鈉緩沖液：見附錄A.1.1。

1.2mol/L山梨醇緩沖液：見附錄A.1.2。

20%檸檬酸三鈉溶液：見附錄A.1.3。

1mol/L氫氧化鈉溶液：見附錄A.1.4。

1×TAE緩沖液：見附錄A.1.5。

無菌超純水或無菌雙蒸水。

PCR混合試劑：包括ExTaqDNA聚合酶、dNTPs混合液、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、引物，于-

20℃保存。

DNA分子量標記物（MarkerDL2000），于4℃保存。

電泳上樣緩沖液，于4℃保存。

商品化的酶法破壁酵母基因組DNA提取試劑盒（內(nèi)含緩沖液GA及GB，蛋白酶K，漂洗液GD及

PW，洗脫液TE）。

溶壁酶（10U/μL），于-20℃保存。

無水乙醇。

1%瓊脂糖凝膠：見附錄A.1.6。

4SGreen染料，于4℃保存。

無菌離心管：包括1.5mL、2.0mL、15.0mL。

無菌PCR反應(yīng)管。

乳酸克魯維酵母CICC32402T菌株或其他等效參考菌株。

馬克斯