NF-κB通路對Keap1-Nrf2通路的負向調(diào)控及其分子機制探究一、引言1.1研究背景在細胞的復雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，NF-κB通路與Keap1-Nrf2通路宛如兩條關(guān)鍵的信息高速公路，各自承載著獨特而重要的生理使命，在眾多生理病理過程中扮演著不可或缺的角色。NF-κB通路作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一，其身影廣泛地活躍在免疫反應、炎癥應答以及細胞增殖、分化與凋亡等諸多關(guān)鍵生理過程中。當機體遭受細菌、病毒等病原體的侵襲時，NF-κB通路會迅速做出響應，被激活后調(diào)控一系列免疫相關(guān)基因的表達，促使免疫細胞活化、增殖并分泌細胞因子，從而啟動免疫防御機制，以抵御病原體的入侵。在炎癥反應中，NF-κB通路也發(fā)揮著核心調(diào)控作用。它能夠響應各種炎癥刺激，如脂多糖（LPS）、細胞因子等，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等的表達，進而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，維持機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而，NF-κB通路的異常激活卻與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，持續(xù)激活的NF-κB通路可促進腫瘤細胞的增殖、抑制其凋亡，同時還能通過誘導血管生成和腫瘤細胞的遷移、侵襲，助力腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。在自身免疫性疾病中，NF-κB通路的過度活化會導致免疫系統(tǒng)的失衡，錯誤地攻擊自身組織和器官，引發(fā)炎癥損傷。在心血管疾病中，NF-κB通路的異常也參與了動脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的病理進程，促進炎癥細胞浸潤、血管平滑肌細胞增殖以及血栓形成等。Keap1-Nrf2通路則是細胞內(nèi)應對氧化應激的關(guān)鍵防御機制，宛如一座堅固的抗氧化堡壘。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）作為該通路的核心轉(zhuǎn)錄因子，宛如一位精密的指揮官，在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）緊密結(jié)合，處于失活狀態(tài)。Keap1如同一個“分子牢籠”，通過其特定的結(jié)構(gòu)域與Nrf2相互作用，并招募E3泛素連接酶復合物，促使Nrf2發(fā)生泛素化修飾，進而被蛋白酶體降解，維持細胞內(nèi)Nrf2的低水平表達。然而，當細胞遭遇氧化應激時，如受到活性氧（ROS）、親電試劑等刺激，Keap1的半胱氨酸殘基會發(fā)生修飾，其與Nrf2的結(jié)合力減弱，“分子牢籠”被打開，Nrf2得以逃脫，進入細胞核內(nèi)。在細胞核中，Nrf2與小肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物（Maf）蛋白形成異二聚體，特異性地識別并結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上，啟動一系列抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄表達，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等。這些酶能夠協(xié)同作用，增強細胞的抗氧化能力，清除過多的ROS，維持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而保護細胞免受氧化損傷。Keap1-Nrf2通路的功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在神經(jīng)退行性疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等，由于氧化應激的過度積累以及Keap1-Nrf2通路的受損，導致神經(jīng)元細胞內(nèi)抗氧化防御能力下降，ROS大量堆積，引發(fā)神經(jīng)元的損傷和死亡。在心血管疾病中，氧化應激也是重要的病理因素之一，Keap1-Nrf2通路的失調(diào)會影響血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等的抗氧化能力，促進心血管疾病的發(fā)展。在腫瘤方面，雖然Keap1-Nrf2通路在正常細胞中起到保護作用，但在腫瘤細胞中，該通路有時會被異常激活，賦予腫瘤細胞更強的抗氧化能力和耐藥性，使其能夠抵抗化療藥物和放療的殺傷作用，導致腫瘤治療的失敗。鑒于NF-κB通路和Keap1-Nrf2通路在生理病理過程中如此關(guān)鍵的地位，深入探究二者之間的關(guān)系顯得尤為必要。越來越多的研究表明，這兩條通路并非孤立存在，而是存在著復雜的相互作用和交叉對話。它們之間的平衡與協(xié)調(diào)對于維持細胞的正常生理功能以及機體的健康狀態(tài)至關(guān)重要。當這種平衡被打破時，就可能引發(fā)一系列疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，深入研究NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路的分子機制，不僅有助于我們更深入地理解細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)的復雜性和精細調(diào)控機制，還為相關(guān)疾病的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點，具有重要的科學意義和臨床應用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路的具體方式和詳盡的分子機制。通過細胞實驗和動物模型，運用分子生物學、細胞生物學等多學科實驗技術(shù)，觀察在不同條件下NF-κB通路激活或抑制時，Keap1-Nrf2通路關(guān)鍵分子如Keap1、Nrf2及其下游抗氧化酶基因表達水平的變化，以及細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、炎癥因子水平的改變。同時，借助基因編輯技術(shù)如CRISPR/Cas9等，對相關(guān)基因進行敲除、過表達或突變，進一步明確NF-κB通路中發(fā)揮負調(diào)控作用的關(guān)鍵分子和作用位點，以及這種負調(diào)控對細胞生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展進程的影響。從理論層面來看，深入探究NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路的分子機制，能夠極大地豐富我們對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)復雜性和精細調(diào)控機制的認知。這兩條通路在細胞的生理病理過程中均扮演著極為關(guān)鍵的角色，它們之間的相互作用宛如細胞內(nèi)的一場精密“對話”，影響著細胞的命運和功能。明晰這種負調(diào)控機制，將有助于我們繪制出更加完善的細胞信號轉(zhuǎn)導圖譜，揭示細胞在面對各種內(nèi)外環(huán)境刺激時維持穩(wěn)態(tài)或發(fā)生病理改變的深層次原因，為后續(xù)相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供堅實的理論基石，拓展我們對生命科學基本原理的理解邊界。從臨床應用角度出發(fā)，NF-κB通路和Keap1-Nrf2通路的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。在腫瘤領(lǐng)域，NF-κB通路的持續(xù)激活往往促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥，而Keap1-Nrf2通路的異常激活或抑制則影響腫瘤細胞的抗氧化能力和對化療藥物的敏感性。深入了解二者的負調(diào)控機制，有望為腫瘤治療開辟新的路徑。一方面，我們可以基于此開發(fā)新型的靶向治療策略，通過調(diào)節(jié)這兩條通路的平衡，增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，抑制腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移；另一方面，也有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標志物，用于腫瘤的早期診斷和預后評估，提高腫瘤治療的精準性和有效性。在炎癥相關(guān)疾病如類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等中，NF-κB通路的過度活化引發(fā)炎癥反應失控，而Keap1-Nrf2通路的受損則削弱了細胞的抗氧化和抗炎能力。揭示其負調(diào)控機制，能夠為這些炎癥性疾病的治療提供新的靶點和干預手段，通過調(diào)節(jié)通路活性，減輕炎癥損傷，促進組織修復，改善患者的生活質(zhì)量。在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等中，氧化應激和炎癥反應共同作用導致神經(jīng)元的損傷和死亡，研究這兩條通路的負調(diào)控關(guān)系，有助于深入理解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制，為開發(fā)有效的神經(jīng)保護藥物提供理論依據(jù)，延緩疾病的進展，為患者帶來新的希望?？傊?，本研究對于相關(guān)疾病的臨床治療具有重要的指導意義，有望推動精準醫(yī)學的發(fā)展，為患者提供更加個性化、有效的治療方案。1.3研究現(xiàn)狀NF-κB通路的研究由來已久，自其被發(fā)現(xiàn)以來，眾多科研人員圍繞其激活機制、信號轉(zhuǎn)導過程以及在生理病理中的作用展開了廣泛而深入的探索。在激活機制方面，已明確多種刺激因素如病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）、損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）、細胞因子等可通過不同的受體介導，激活NF-κB通路。其中，Toll樣受體（TLRs）識別PAMPs后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴或非依賴途徑，招募下游信號分子，如白細胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAKs）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等，進而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復合物。IKK復合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基NEMO組成，活化的IKKβ能夠磷酸化IκB蛋白，使其發(fā)生泛素化修飾并被蛋白酶體降解，從而釋放出NF-κB二聚體，使其得以進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。在生理功能研究中，NF-κB通路在免疫細胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，在T細胞發(fā)育過程中，NF-κB通路參與調(diào)控T細胞受體（TCR）信號介導的細胞增殖、分化和存活。在B細胞中，NF-κB通路對于B細胞的活化、抗體類別轉(zhuǎn)換和記憶B細胞的形成至關(guān)重要。在病理研究領(lǐng)域，NF-κB通路與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤細胞中，NF-κB通路處于持續(xù)激活狀態(tài)，其通過調(diào)控一系列與腫瘤細胞增殖、存活、遷移和侵襲相關(guān)的基因表達，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如NF-κB可上調(diào)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達，促進腫瘤細胞的增殖；還能誘導血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，NF-κB通路還參與腫瘤細胞的免疫逃逸過程，通過抑制腫瘤細胞表面抗原的表達以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能，使腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。Keap1-Nrf2通路的研究也取得了豐碩的成果。對其組成成分和激活機制的研究不斷深入，明確了Keap1作為Nrf2的負調(diào)控蛋白，通過特定結(jié)構(gòu)域與Nrf2結(jié)合，并介導其泛素化降解，維持細胞內(nèi)Nrf2的低水平。當細胞遭受氧化應激或親電試劑刺激時，Keap1的半胱氨酸殘基發(fā)生修飾，導致其與Nrf2的結(jié)合力減弱，Nrf2得以釋放并進入細胞核，與Maf蛋白形成異二聚體，結(jié)合到ARE上，啟動下游抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。在生理功能方面，Keap1-Nrf2通路在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著核心作用。大量研究表明，激活Keap1-Nrf2通路能夠顯著增強細胞的抗氧化能力，減輕氧化應激損傷。例如，在缺血再灌注損傷模型中，激活Keap1-Nrf2通路可通過上調(diào)HO-1、NQO1等抗氧化酶的表達，減少ROS的產(chǎn)生，降低氧化應激水平，減輕組織損傷。在心血管疾病中，Keap1-Nrf2通路的激活可以保護血管內(nèi)皮細胞，抑制炎癥反應和氧化應激，預防動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤研究中，Keap1-Nrf2通路的作用具有兩面性。一方面，在正常細胞中，該通路的激活能夠保護細胞免受氧化應激和致癌物質(zhì)的損傷，發(fā)揮抑癌作用；另一方面，在部分腫瘤細胞中，Keap1-Nrf2通路的異常激活可導致腫瘤細胞對化療藥物和放療的抵抗，促進腫瘤的進展。如在非小細胞肺癌中，Nrf2的高表達與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)，通過抑制Keap1-Nrf2通路，可以增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提高治療效果。關(guān)于NF-κB通路與Keap1-Nrf2通路之間關(guān)系的研究，近年來也取得了一定的進展。已有研究表明，這兩條通路之間存在復雜的相互作用。在炎癥和氧化應激條件下，NF-κB通路的激活可以抑制Keap1-Nrf2通路的活性。例如，在脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型中，LPS刺激可導致NF-κB通路的激活，進而抑制Nrf2的核轉(zhuǎn)位和下游抗氧化基因的表達，使細胞的抗氧化能力下降，加重炎癥損傷。其潛在機制可能是NF-κB通路激活后，通過上調(diào)某些抑制性蛋白的表達，如Keap1的表達增加，從而增強對Nrf2的抑制作用；或者NF-κB通路的激活導致細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，影響Keap1的修飾和功能，間接抑制Keap1-Nrf2通路。相反，Keap1-Nrf2通路的激活也可以對NF-κB通路產(chǎn)生影響。激活Keap1-Nrf2通路可以通過增強細胞的抗氧化能力，減少ROS的產(chǎn)生，從而抑制NF-κB通路的激活，減輕炎癥反應。在一些炎癥相關(guān)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，使用Nrf2激活劑處理細胞或動物模型，能夠降低炎癥因子的表達，抑制NF-κB通路的活性，表明Keap1-Nrf2通路對NF-κB通路具有負反饋調(diào)節(jié)作用。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，兩條通路之間存在一些共享的調(diào)節(jié)分子，如p62蛋白。p62不僅參與自噬過程，還可以與Keap1結(jié)合，促進Nrf2的激活；同時，p62也能通過與TRAF6等分子相互作用，參與NF-κB通路的激活，進一步揭示了兩條通路之間復雜的交叉對話機制。盡管目前對NF-κB通路和Keap1-Nrf2通路及其相互關(guān)系的研究取得了一定成果，但仍存在許多不足之處。在分子機制方面，雖然已知NF-κB通路對Keap1-Nrf2通路存在負調(diào)控作用，但具體的作用位點和詳細的分子機制尚未完全明確。例如，NF-κB通路激活后，是通過何種具體的信號分子和途徑來調(diào)控Keap1的表達或修飾，以及如何影響Nrf2的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，仍有待進一步深入研究。此外，兩條通路之間的相互作用是否存在細胞類型特異性和刺激因素特異性，目前也缺乏系統(tǒng)的研究。在疾病研究方面，雖然已明確兩條通路的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但在不同疾病背景下，它們之間的相互作用模式和對疾病進程的影響是否存在差異，還需要更多的研究來闡明。例如，在腫瘤和神經(jīng)退行性疾病中，NF-κB通路和Keap1-Nrf2通路的異常激活或抑制表現(xiàn)出不同的特點，它們之間的相互作用如何影響疾病的發(fā)生、發(fā)展和治療效果，仍需要深入探討。在治療應用方面，基于對兩條通路相互關(guān)系的認識，開發(fā)針對性的治療策略仍面臨諸多挑戰(zhàn)。如何在不影響正常生理功能的前提下，精準地調(diào)節(jié)兩條通路的平衡，以達到治療疾病的目的，還需要進一步探索更加有效的干預手段和藥物靶點。二、相關(guān)通路概述2.1NF-κB通路介紹2.1.1組成結(jié)構(gòu)NF-κB通路主要由NF-κB家族成員、IκB蛋白家族以及IκB激酶（IKK）復合物等關(guān)鍵成分構(gòu)成，它們相互協(xié)作，共同維持著該通路的正常功能。NF-κB家族在哺乳動物中包含五個成員，分別是NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB和c-Rel。這些成員均含有一個高度保守的N端Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），該結(jié)構(gòu)域在NF-κB的功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用，它不僅介導了NF-κB成員之間的二聚化，使NF-κB能夠形成具有不同功能特性的同源或異源二聚體，還負責與DNA上特定的κB位點相結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。其中，p50和p52是由其前體蛋白p105和p100經(jīng)過蛋白酶體加工剪切后產(chǎn)生的。值得注意的是，p65、RelB和c-Rel除了RHD結(jié)構(gòu)域之外，還擁有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD），當它們形成二聚體時，能夠積極促進基因的轉(zhuǎn)錄表達；而p50和p52自身不具備TAD結(jié)構(gòu)域，它們所形成的同型二聚體通常會抑制基因的轉(zhuǎn)錄，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮著負向調(diào)節(jié)的作用。在細胞內(nèi)，不同類型的NF-κB二聚體有著各自獨特的分布和功能特點。例如，p50/p65異源二聚體最為常見，它廣泛參與免疫應答、炎癥反應等多種生理病理過程，在這些過程中，它能夠被多種刺激因素激活，進而調(diào)控一系列相關(guān)基因的表達，如炎癥因子基因、免疫調(diào)節(jié)基因等，對細胞的功能和命運產(chǎn)生重要影響。IκB蛋白家族同樣具有重要的生物學意義，其成員包括IκBα、IκBβ、IκBγ、IκBε、Bcl-3、p100和p105等。IκB蛋白的顯著結(jié)構(gòu)特征是含有多個錨蛋白重復序列（ANK），這些ANK序列如同一個個緊密相連的鉤狀結(jié)構(gòu)，每個重復序列約包含33個氨基酸。ANK序列賦予了IκB蛋白與NF-κB二聚體特異性結(jié)合的能力，在靜息狀態(tài)下，IκB蛋白通過ANK序列與NF-κB二聚體緊密結(jié)合，將其錨定在細胞質(zhì)中，使其處于無活性狀態(tài)。例如，IκBα是IκB蛋白家族中研究最為深入的成員之一，它能夠與p50/p65異源二聚體高親和力結(jié)合，有效地抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，從而維持細胞內(nèi)NF-κB通路的穩(wěn)定平衡。當細胞受到外界刺激時，IκB蛋白會發(fā)生一系列的修飾和降解過程，從而釋放出NF-κB二聚體，使其能夠進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。不同的IκB蛋白在細胞內(nèi)的表達模式和功能特點存在一定差異，它們在不同的細胞類型和生理病理條件下，通過與NF-κB二聚體的相互作用，精細地調(diào)節(jié)著NF-κB通路的活性。IKK復合物作為NF-κB通路中的關(guān)鍵激酶，由IKKα（也稱為CHUK）、IKKβ（也稱為IKBKB）和調(diào)節(jié)亞基NEMO（也稱為IKKγ）組成。IKKα和IKKβ具有相似的結(jié)構(gòu)，它們的氨基末端均含有一個保守的激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負責催化底物的磷酸化反應，在NF-κB通路的激活過程中起著核心的催化作用。激酶結(jié)構(gòu)域之后是一個螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）結(jié)構(gòu)域和一個亮氨酸拉鏈（LZ）結(jié)構(gòu)域，HLH結(jié)構(gòu)域和LZ結(jié)構(gòu)域共同參與調(diào)節(jié)IKK激酶的活性，并且介導了IKKα和IKKβ之間的二聚化，使它們能夠形成具有活性的二聚體結(jié)構(gòu)，更好地發(fā)揮激酶功能。NEMO作為調(diào)節(jié)亞基，雖然本身不具備激酶活性，但它在IKK復合物的組裝、激活以及信號轉(zhuǎn)導過程中起著不可或缺的作用。NEMO能夠通過與IKKα和IKKβ的相互作用，穩(wěn)定IKK復合物的結(jié)構(gòu)，促進其激活。此外，NEMO還參與了對上游信號的感知和傳遞，它能夠與多種上游信號分子相互作用，將外界刺激信號準確地傳遞給IKK復合物，從而啟動NF-κB通路的激活過程。在不同的信號刺激下，IKK復合物的激活方式和作用機制存在一定差異，它通過對IκB蛋白的磷酸化修飾，引發(fā)IκB蛋白的泛素化和降解，進而釋放NF-κB二聚體，實現(xiàn)對NF-κB通路的激活和調(diào)控。2.1.2激活機制NF-κB通路的激活機制主要包括經(jīng)典信號通路和非經(jīng)典信號通路，這兩條通路在不同的刺激條件下發(fā)揮作用，共同調(diào)節(jié)著細胞的生理病理過程。經(jīng)典信號通路在免疫應答和炎癥反應等過程中發(fā)揮著核心作用，其激活過程涉及多種信號分子和復雜的信號轉(zhuǎn)導步驟。當細胞受到促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β），細菌脂多糖（LPS），以及生長因子、抗原受體激活等刺激時，細胞表面的相應受體首先識別這些刺激信號，并發(fā)生構(gòu)型改變。以TNF-α與腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結(jié)合為例，TNFR1被激活后，會招募TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD），TRADD進而與TNF受體相關(guān)因子2（TRAF2）和受體相互作用蛋白1（RIP1）結(jié)合，形成一個多蛋白復合物。這個復合物能夠進一步招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）及其結(jié)合蛋白TAB1、TAB2或TAB3?；罨腡AK1通過磷酸化作用激活I(lǐng)KK復合物，其中IKKβ在這一過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IKKβ被激活后，會磷酸化IκB蛋白，使其氨基末端的兩個絲氨酸殘基（Ser32和Ser36）發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化后的IκB蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出其與E3泛素連接酶β-TrCP的結(jié)合位點，β-TrCP隨即與IκB蛋白結(jié)合，使IκB蛋白發(fā)生多聚泛素化修飾。多聚泛素化的IκB蛋白被26S蛋白酶體識別并降解，從而釋放出與之結(jié)合的NF-κB二聚體，通常是p50/RelA異二聚體。釋放后的NF-κB二聚體進一步發(fā)生磷酸化、乙?；⑻腔确g后修飾，這些修飾能夠增強NF-κB二聚體的活性?；罨腘F-κB二聚體迅速從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，在細胞核中，它與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點特異性結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ等，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些靶基因包括編碼炎癥因子（如TNF-α、IL-6、IL-8等）、細胞粘附分子、免疫調(diào)節(jié)分子等的基因，它們的表達產(chǎn)物參與到免疫應答和炎癥反應等過程中，對細胞的功能和機體的生理狀態(tài)產(chǎn)生重要影響。非經(jīng)典信號通路則主要參與淋巴細胞的發(fā)育、存活和功能調(diào)節(jié)等過程，其激活過程與經(jīng)典信號通路有所不同。非經(jīng)典信號通路主要由腫瘤壞死因子受體超家族中的部分成員激活，如淋巴毒素β受體（LTβR）、CD40、B細胞活化因子受體（BAFF-R）等。當這些受體與其相應的配體結(jié)合后，會招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3），形成受體-配體-TRAF3復合物。在正常情況下，TRAF3與NF-κB誘導激酶（NIK）結(jié)合，使NIK處于相對穩(wěn)定的低活性狀態(tài)。然而，當受體被激活后，受體-配體-TRAF3復合物會發(fā)生一系列的變化，導致TRAF3從復合物中解離。TRAF3的解離使得NIK得以釋放并被激活，激活后的NIK能夠磷酸化IKKα，使其形成同源二聚體?；罨腎KKα同源二聚體特異性地磷酸化p100的C端絲氨酸殘基，p100發(fā)生磷酸化后，會被E3泛素連接酶識別并進行部分泛素化修飾。部分泛素化的p100隨后被蛋白酶體加工，去除其C端的部分序列，生成p52。p52與RelB結(jié)合形成p52/RelB二聚體，該二聚體具有轉(zhuǎn)錄活性，能夠從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)。在細胞核中，p52/RelB二聚體與特定的靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些靶基因主要參與淋巴細胞的發(fā)育、存活、成熟和粘附等過程，對免疫系統(tǒng)的正常功能維持起著重要作用。例如，在B細胞的發(fā)育和活化過程中，CD40與CD40L的結(jié)合激活非經(jīng)典NF-κB信號通路，促進B細胞的增殖、分化和抗體分泌，對體液免疫應答的正常進行至關(guān)重要。2.1.3生理功能與病理關(guān)聯(lián)NF-κB通路在機體的生理功能中發(fā)揮著多方面的關(guān)鍵作用，同時，其異常激活與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在生理功能方面，NF-κB通路在免疫應答過程中扮演著核心角色。當機體遭遇病原體入侵時，免疫細胞如巨噬細胞、T細胞、B細胞等表面的模式識別受體（PRRs），如Toll樣受體（TLRs）、NOD樣受體（NLRs）等，能夠識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而激活NF-κB通路。激活后的NF-κB通路迅速啟動一系列免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，促使免疫細胞活化、增殖，并分泌多種細胞因子和趨化因子。例如，巨噬細胞被激活后，NF-κB通路調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，這些炎癥因子能夠招募更多的免疫細胞到感染部位，增強免疫防御能力，共同抵御病原體的入侵。在T細胞中，NF-κB通路參與T細胞受體（TCR）信號介導的細胞活化、增殖和分化過程，對于T細胞的正常發(fā)育和功能發(fā)揮至關(guān)重要。在B細胞中，NF-κB通路促進B細胞的活化、抗體類別轉(zhuǎn)換和記憶B細胞的形成，保障體液免疫應答的有效進行。NF-κB通路也是炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路。當組織受到損傷或炎癥刺激時，細胞內(nèi)的NF-κB通路被激活，通過調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應。除了上述提到的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子外，NF-κB還能調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）等的表達。iNOS催化產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO具有抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)血管舒張等作用，但在炎癥過程中過量產(chǎn)生的NO也會對組織造成損傷。COX-2催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（PGE2），PGE2參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，具有擴張血管、增加血管通透性、促進炎癥細胞浸潤等作用。在炎癥早期，NF-κB通路的激活有助于啟動炎癥反應，清除病原體和損傷組織；然而，在慢性炎癥狀態(tài)下，如果NF-κB通路持續(xù)過度激活，會導致炎癥介質(zhì)的持續(xù)大量釋放，引發(fā)過度的炎癥反應，對機體組織和器官造成損傷。在細胞增殖、分化與凋亡的調(diào)控中，NF-κB通路同樣發(fā)揮著重要作用。在細胞增殖方面，NF-κB通路能夠促進細胞周期相關(guān)蛋白的表達，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等。CyclinD1與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）或CDK6結(jié)合，形成復合物，推動細胞從G1期進入S期，促進細胞增殖。在細胞分化過程中，NF-κB通路參與調(diào)控多種細胞類型的分化程序。例如，在骨髓造血干細胞向不同血細胞譜系分化的過程中，NF-κB通路通過調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，影響造血干細胞的分化方向。在細胞凋亡方面，NF-κB通路具有雙重作用。在某些情況下，NF-κB通路的激活能夠誘導抗凋亡基因的表達，如B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族成員、凋亡抑制蛋白（IAPs）等，這些抗凋亡蛋白能夠抑制細胞凋亡的發(fā)生，保護細胞免受損傷。然而，在另一些情況下，NF-κB通路也可以通過誘導促凋亡基因的表達，如Fas配體（FasL）等，促進細胞凋亡。這種雙重作用的平衡取決于細胞類型、刺激因素以及細胞所處的微環(huán)境等多種因素。NF-κB通路的異常激活與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。在腫瘤領(lǐng)域，大量研究表明，NF-κB通路在許多腫瘤細胞中處于持續(xù)激活狀態(tài)。持續(xù)激活的NF-κB通路通過多種機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。一方面，它上調(diào)一系列與腫瘤細胞增殖、存活相關(guān)的基因表達，如CyclinD1、Bcl-2等，促進腫瘤細胞的增殖和存活。另一方面，NF-κB通路能夠誘導血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，NF-κB通路還參與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，它通過調(diào)節(jié)細胞粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等的表達，改變腫瘤細胞與周圍組織的相互作用，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。在腫瘤免疫逃逸方面，NF-κB通路可以抑制腫瘤細胞表面抗原的表達，同時調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能，使腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。在自身免疫性疾病中，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，NF-κB通路的過度活化是重要的病理機制之一。在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，關(guān)節(jié)滑膜細胞和免疫細胞中的NF-κB通路被持續(xù)激活，導致炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等大量分泌，這些炎癥因子引發(fā)關(guān)節(jié)滑膜的炎癥反應，導致滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞，最終引起關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中，NF-κB通路的異常激活導致免疫系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生大量自身抗體，攻擊自身組織和器官，引發(fā)多系統(tǒng)的損傷。在心血管疾病中，NF-κB通路也參與了多種疾病的病理進程。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細胞受到氧化應激、炎癥因子等刺激，激活NF-κB通路?；罨腘F-κB通路誘導炎癥因子、粘附分子等的表達，促進單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞向血管內(nèi)皮細胞的粘附和浸潤，形成早期的動脈粥樣硬化斑塊。隨著病情的進展，NF-κB通路持續(xù)激活，導致斑塊內(nèi)炎癥反應加劇，平滑肌細胞增殖，細胞外基質(zhì)合成增加，斑塊逐漸增大并趨于不穩(wěn)定。當斑塊破裂時，會引發(fā)血栓形成，導致急性心血管事件的發(fā)生，如心肌梗死、腦卒中等。在心肌梗死中，缺血缺氧導致心肌細胞和炎癥細胞中的NF-κB通路激活，炎癥因子的釋放進一步加重心肌損傷和炎癥反應，影響心肌的修復和功能恢復。2.2Keap1-Nrf2通路介紹2.2.1組成結(jié)構(gòu)Keap1-Nrf2通路主要由Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）和核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）以及抗氧化反應元件（ARE）等關(guān)鍵成分構(gòu)成，它們之間的相互作用和精細調(diào)控，共同維持著細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。Keap1蛋白是一種富含半胱氨酸的胞漿蛋白，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨特而精妙的特點。它由五個主要結(jié)構(gòu)域組成，從N端到C端依次為N端結(jié)構(gòu)域（NTR）、干預區(qū)（IVR）、Broad-complex、Tramtrack和Bric-à-brac（BTB）結(jié)構(gòu)域、雙甘氨酸重復區(qū)（DGR，也稱為Kelch區(qū)）以及C端結(jié)構(gòu)域（CTR）。NTR結(jié)構(gòu)域在Keap1蛋白的功能中起著基礎(chǔ)支撐的作用，雖然其具體功能尚未完全明確，但它可能參與了蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性維持以及與其他分子的初始相互作用。IVR區(qū)是Keap1蛋白的功能調(diào)節(jié)區(qū)，其顯著特點是富含半胱氨酸殘基。這些半胱氨酸殘基如同一個個敏感的“感受器”，對細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)變化極為敏感。當細胞受到氧化應激或親電試劑刺激時，IVR區(qū)的半胱氨酸殘基會發(fā)生修飾，如被氧化、烷基化等，這種修飾會導致Keap1蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，進而影響其與Nrf2的相互作用。BTB結(jié)構(gòu)域在Keap1蛋白的同源二聚化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠介導Keap1蛋白分子之間的相互作用，使其形成穩(wěn)定的同源二聚體結(jié)構(gòu)。這種二聚化對于Keap1蛋白正常行使功能至關(guān)重要，它不僅增強了Keap1蛋白與Nrf2的結(jié)合能力，還可能影響其在細胞內(nèi)的定位和功能調(diào)節(jié)。DGR區(qū)，即Kelch區(qū)，是Keap1蛋白與Nrf2相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。它含有六個Kelch重復序列，每個重復序列包含約44-50個氨基酸，這些Kelch重復序列形成了一個獨特的β-螺旋槳結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)為Keap1與Nrf2的結(jié)合提供了精確的分子識別界面，通過與Nrf2上特定的氨基酸序列相互作用，實現(xiàn)對Nrf2的有效結(jié)合和調(diào)控。CTR結(jié)構(gòu)域則可能參與了Keap1蛋白與其他細胞內(nèi)分子的相互作用，以及對其自身功能的進一步調(diào)節(jié)。雖然目前對CTR結(jié)構(gòu)域的了解相對較少，但它在Keap1蛋白的整體功能網(wǎng)絡(luò)中無疑扮演著不可或缺的角色。Nrf2蛋白屬于CNC（Cap‘n’collar）堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其結(jié)構(gòu)同樣蘊含著獨特的生物學信息。Nrf2蛋白含有六個高度保守的結(jié)構(gòu)域，被命名為Neh1-Neh6。Neh1區(qū)位于Nrf2蛋白的C端，包含一個堿性亮氨酸拉鏈（bZip）結(jié)構(gòu)。這個bZip結(jié)構(gòu)在Nrf2的功能發(fā)揮中起著核心作用，它能夠與細胞核內(nèi)的小Maf蛋白（smallMafproteins）形成異二聚體。這種異二聚體結(jié)構(gòu)賦予了Nrf2識別并結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上的能力，從而啟動下游一系列抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。Neh2區(qū)是Nrf2與Keap1蛋白結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，它含有兩個重要的基序，即ETGE基序和DLG基序。ETGE基序和DLG基序如同兩個緊密咬合的“分子鎖扣”，通過與Keap1蛋白的Kelch區(qū)相互作用，將Nrf2錨定在細胞質(zhì)中，使其處于失活狀態(tài)。在正常生理條件下，Keap1通過這兩個基序與Nrf2緊密結(jié)合，抑制Nrf2的活性，維持細胞內(nèi)Nrf2的低水平表達。Neh4和Neh5區(qū)是Nrf2的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。當Nrf2進入細胞核并與Maf蛋白形成異二聚體結(jié)合到ARE上后，Neh4和Neh5區(qū)能夠招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）、p300等，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，促進下游基因的轉(zhuǎn)錄表達。這些輔助因子能夠與RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄機器相互作用，增強轉(zhuǎn)錄效率，確?？寡趸富蚝徒舛久富蚰軌蚋咝П磉_。Neh3區(qū)和Neh6區(qū)的功能目前尚未完全明確，但研究表明它們可能參與了Nrf2的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)位過程以及與其他信號通路的相互作用。例如，Neh6區(qū)含有兩個DSGIS基序，在某些情況下，這些基序可能與β-TrCP蛋白相互作用，影響Nrf2的泛素化和降解過程。在正常生理狀態(tài)下，Keap1與Nrf2緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復合物。Keap1通過其Kelch區(qū)的β-螺旋槳結(jié)構(gòu)與Nrf2的Neh2區(qū)的ETGE基序和DLG基序特異性結(jié)合，將Nrf2錨定在細胞質(zhì)中，并招募E3泛素連接酶復合物，其中包括Cullin3（Cul3）和RING-box蛋白1（Rbx1）。Cul3通過與Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的復合物，而Rbx1則作為E3泛素連接酶的活性亞基，催化泛素分子從E2泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移到Nrf2的賴氨酸殘基上。這些賴氨酸殘基主要位于ETGE基序和DLG基序之間。多聚泛素化修飾后的Nrf2被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內(nèi)Nrf2的低水平表達。這種精細的調(diào)控機制確保了細胞在正常狀態(tài)下，不會過度激活抗氧化防御系統(tǒng)，維持細胞內(nèi)的代謝平衡和生理功能穩(wěn)定。2.2.2激活機制Keap1-Nrf2通路的激活機制與細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，在正常生理狀態(tài)和氧化應激狀態(tài)下，該通路呈現(xiàn)出不同的調(diào)控模式。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的氧化還原水平相對穩(wěn)定，Keap1-Nrf2通路處于相對抑制狀態(tài)。如前文所述，Keap1通過其Kelch區(qū)與Nrf2的Neh2區(qū)緊密結(jié)合，將Nrf2錨定在細胞質(zhì)中，并介導其泛素化降解。這種持續(xù)的降解過程使得細胞內(nèi)Nrf2的蛋白水平維持在較低水平。此時，細胞內(nèi)的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達也處于基礎(chǔ)水平，以滿足細胞正常代謝過程中的抗氧化需求。例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）等酶的表達量相對穩(wěn)定，它們在維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡中發(fā)揮著基礎(chǔ)的保護作用。在這個過程中，Keap1就像一個“分子警察”，嚴格控制著Nrf2的活性和水平，確保細胞的正常生理功能不受干擾。當細胞遭受氧化應激時，如受到活性氧（ROS）、親電試劑等刺激，細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)發(fā)生顯著改變，Keap1-Nrf2通路被迅速激活。氧化應激會導致細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，如超氧陰離子（O2?-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等。這些ROS具有很強的氧化活性，能夠攻擊細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，導致細胞損傷。為了應對這種氧化損傷，細胞啟動了Keap1-Nrf2通路的激活機制。目前研究認為，氧化應激激活Keap1-Nrf2通路主要通過兩種機制。一種是基于Keap1半胱氨酸殘基修飾的“hingeandlatch”模型。在氧化應激條件下，Keap1的IVR區(qū)富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基極易被ROS或親電試劑修飾。例如，半胱氨酸殘基可以被氧化形成二硫鍵，或者與親電試劑發(fā)生共價結(jié)合。這種修飾會導致Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變，使得Nrf2的DLG基序與Keap1的結(jié)合力減弱，如同“分子鎖扣”被打開。此時，Nrf2雖然仍與Keap1的ETGE基序結(jié)合，但已處于一種相對松弛的狀態(tài)，為Nrf2的釋放創(chuàng)造了條件。隨著氧化應激的持續(xù)，Nrf2最終從Keap1上完全解離下來，得以進入細胞核發(fā)揮作用。另一種機制涉及蛋白激酶的磷酸化作用。多種蛋白激酶，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等，在氧化應激時被激活。這些激活的蛋白激酶可以磷酸化Nrf2上的特定氨基酸殘基。例如，MAPKs中的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）可以磷酸化Nrf2的Neh6區(qū)的絲氨酸殘基。磷酸化修飾后的Nrf2與Keap1的結(jié)合力降低，同時其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性增強，從而促進Nrf2從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移。一旦Nrf2從Keap1上解離并進入細胞核，它會與小Maf蛋白形成異二聚體。小Maf蛋白屬于Maf蛋白家族的成員，其結(jié)構(gòu)中也含有bZip結(jié)構(gòu)域，能夠與Nrf2的bZip結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的異二聚體。這種異二聚體具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別并結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上。ARE是一段位于抗氧化酶基因和Ⅱ相解毒酶基因啟動子區(qū)域的特定DNA序列，其核心序列為5'-TGACnnnGC-3'。Nrf2-Maf異二聚體與ARE結(jié)合后，招募一系列轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如RNA聚合酶Ⅱ、通用轉(zhuǎn)錄因子以及上述提到的CBP、p300等。這些輔助因子協(xié)同作用，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶Ⅱ沿著DNA模板進行移動，合成信使RNA（mRNA）。這些mRNA隨后被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，在核糖體上進行翻譯，合成各種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如血紅素加氧酶-1（HO-1）、NQO1、GST等。這些酶在細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化和解毒作用。HO-1能夠催化血紅素降解，生成一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子。其中，CO具有抗炎和細胞保護作用，膽綠素可以進一步被還原為膽紅素，膽紅素是一種強效的抗氧化劑，能夠清除ROS。NQO1可以催化醌類化合物的還原反應，使其轉(zhuǎn)化為無毒或低毒的物質(zhì)，同時在這個過程中消耗NAD（P）H，減少細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。GST則參與谷胱甘肽（GSH）依賴的解毒反應，將親電物質(zhì)與GSH結(jié)合，形成水溶性的結(jié)合物，便于排出細胞外，從而減輕細胞的氧化損傷。通過這一系列的激活和調(diào)控過程，Keap1-Nrf2通路能夠快速響應細胞內(nèi)的氧化應激，增強細胞的抗氧化能力，維持細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護細胞免受氧化損傷。2.2.3生理功能與病理關(guān)聯(lián)Keap1-Nrf2通路在維持細胞和機體的正常生理功能方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其功能異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在抗氧化應激方面，Keap1-Nrf2通路是細胞內(nèi)最為關(guān)鍵的抗氧化防御機制。當細胞受到氧化應激時，如暴露于紫外線、電離輻射、化學毒物或炎癥反應等環(huán)境中，細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。這些物質(zhì)具有很強的氧化活性，能夠攻擊細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，導致蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，進而影響細胞的正常生理功能。Keap1-Nrf2通路的激活能夠迅速啟動細胞的抗氧化防御系統(tǒng)。Nrf2進入細胞核后，與小Maf蛋白形成異二聚體并結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上，誘導一系列抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達。這些酶包括血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等。HO-1能夠催化血紅素降解，產(chǎn)生具有抗氧化和細胞保護作用的一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子。膽綠素進一步被還原為膽紅素，膽紅素是一種高效的抗氧化劑，能夠清除ROS。NQO1通過催化醌類化合物的還原反應，減少ROS的產(chǎn)生，并參與細胞內(nèi)的解毒過程。GST能夠?qū)⒂H電物質(zhì)與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合，形成水溶性的結(jié)合物，便于排出細胞外，從而減輕細胞的氧化損傷。SOD可以催化超氧陰離子（O2?-）歧化為氧氣和過氧化氫，CAT則能夠?qū)⑦^氧化氫分解為水和氧氣，有效清除細胞內(nèi)的ROS。通過這些抗氧化酶的協(xié)同作用，Keap1-Nrf2通路能夠顯著增強細胞的抗氧化能力，維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護細胞免受氧化應激的損傷。在細胞保護方面，Keap1-Nrf2通路不僅能夠抵御氧化應激損傷，還在其他多種細胞保護過程中發(fā)揮重要作用。在細胞遭受炎癥刺激時，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等會誘導細胞產(chǎn)生大量的ROS和炎癥介質(zhì)，導致細胞損傷。Keap1-Nrf2通路的激活可以通過上調(diào)抗氧化酶和抗炎因子的表達，抑制炎癥反應的過度激活，減輕炎癥對細胞的損傷。例如，Nrf2可以調(diào)節(jié)一些抗炎因子如血紅素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）等的表達，這些因子不僅具有抗氧化作用，還能抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，從而減輕炎癥反應。在缺血再灌注損傷中，組織器官在缺血期間會發(fā)生缺氧和代謝紊亂，產(chǎn)生大量的ROS。當恢復血流灌注后，ROS的產(chǎn)生進一步增加，導致組織細胞的損傷。激活Keap1-Nrf2通路可以通過增強細胞的抗氧化能力，減少ROS的積累，減輕缺血再灌注損傷。研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，激活Keap1-Nrf2通路能夠上調(diào)HO-1、NQO1等抗氧化酶的表達，降低心肌細胞的凋亡率，改善心臟功能。在神經(jīng)保護方面，Keap1-Nrf2通路對于維持神經(jīng)元的正常功能和生存至關(guān)重要。神經(jīng)元對氧化應激非常敏感，氧化損傷是導致神經(jīng)退行性疾病的重要原因之一。Keap1-Nrf2通路的激活可以通過保護神經(jīng)元免受氧化應激損傷，維持神經(jīng)元的正常功能。例如，在帕金森病模型中，激活Keap1-Nrf2通路能夠減少多巴胺能神經(jīng)元的死亡，改善運動功能障礙。Keap1-Nrf2通路的異常與多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相連。在腫瘤方面，Keap1-Nrf2通路的作用具有復雜性和兩面性。在腫瘤發(fā)生的早期階段，氧化應激和DNA損傷是導致細胞癌變的重要因素。正常情況下，Keap1-Nrf2通路的激活可以增強細胞的抗氧化能力，減少氧化應激對細胞的損傷，從而抑制腫瘤的發(fā)生。然而，在腫瘤發(fā)展過程中，部分腫瘤細胞會通過各種機制異常激活Keap1-Nrf2通路，使其成為腫瘤細胞存活和耐藥的重要機制。例如，在非小細胞肺癌中，Nrf2的高表達與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)。Nrf2的過度激活會導致腫瘤細胞內(nèi)抗氧化酶和解毒酶的高表達，增強腫瘤細胞對化療藥物和放療的抵抗能力。同時，Nrf2還可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝、增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在神經(jīng)退行性疾病中，如阿爾茨海默病、帕金森病等，Keap1-Nrf2通路的功能受損是重要的病理機制之一。在這些疾病中，神經(jīng)元細胞內(nèi)的氧化應激水平升高，而Keap1-Nrf2通路的激活受到抑制，導致抗氧化酶和神經(jīng)保護因子的表達減少，神經(jīng)元細胞無法有效抵御氧化損傷，最終導致神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)功能的喪失。在心血管疾病中，氧化應激和炎癥反應在動脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。Keap1-Nrf2通路的異常會導致血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞等的抗氧化能力下降，促進炎癥反應和氧化應激的發(fā)生，加速心血管疾病的發(fā)展。例如，在動脈粥樣硬化模型中，Keap1-Nrf2通路的功能缺陷會導致血管內(nèi)皮細胞損傷，炎癥細胞浸潤，脂質(zhì)沉積，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。三、NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路的研究3.1負調(diào)控現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與確認在細胞實驗中，以人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）為研究對象，用脂多糖（LPS）刺激來激活NF-κB通路。將HUVECs分為對照組、LPS刺激組、LPS+NF-κB抑制劑組。對照組細胞正常培養(yǎng)，不做特殊處理；LPS刺激組細胞加入終濃度為1μg/mL的LPS進行刺激，作用時間為6小時；LPS+NF-κB抑制劑組在加入LPS前30分鐘，先加入NF-κB抑制劑PDTC（50μM）進行預處理。刺激結(jié)束后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測各組細胞中NF-κB通路關(guān)鍵蛋白p65的磷酸化水平、IκBα的降解情況，以及Keap1-Nrf2通路關(guān)鍵蛋白Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況和下游抗氧化酶NQO1、HO-1的表達水平。結(jié)果顯示，LPS刺激組細胞中p65磷酸化水平顯著升高，IκBα大量降解，表明NF-κB通路被成功激活；同時，Nrf2的核轉(zhuǎn)位明顯受到抑制，其在細胞核中的蛋白表達量顯著低于對照組，下游抗氧化酶NQO1、HO-1的蛋白表達水平也顯著降低。而在LPS+NF-κB抑制劑組中，加入PDTC后，p65磷酸化水平和IκBα降解程度均受到明顯抑制，Nrf2的核轉(zhuǎn)位得到恢復，細胞核中Nrf2蛋白表達量顯著增加，NQO1、HO-1的表達水平也顯著回升。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測相關(guān)基因的mRNA表達水平，也得到了類似的結(jié)果，進一步驗證了NF-κB通路激活對Keap1-Nrf2通路的抑制作用。為了在體內(nèi)水平確認這種負調(diào)控現(xiàn)象，構(gòu)建脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性肺損傷模型。選取6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠，隨機分為對照組、LPS模型組、LPS+NF-κB抑制劑組。對照組小鼠經(jīng)腹腔注射等體積的生理鹽水；LPS模型組小鼠經(jīng)腹腔注射LPS（5mg/kg）；LPS+NF-κB抑制劑組小鼠在注射LPS前1小時，先腹腔注射NF-κB抑制劑BAY11-7082（1mg/kg）。24小時后，處死小鼠，取肺組織進行相關(guān)檢測。通過免疫組織化學染色觀察肺組織中p65的核轉(zhuǎn)位情況，以評估NF-κB通路的激活程度；通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測肺組織中Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況以及下游抗氧化酶NQO1、HO-1的表達水平。結(jié)果顯示，LPS模型組小鼠肺組織中p65大量進入細胞核，表明NF-κB通路被激活；同時，Nrf2的核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制，細胞核中Nrf2蛋白表達量顯著降低，NQO1、HO-1的表達水平也顯著下降。而在LPS+NF-κB抑制劑組中，BAY11-7082有效抑制了p65的核轉(zhuǎn)位，NF-κB通路激活受到抑制，Nrf2的核轉(zhuǎn)位得到恢復，細胞核中Nrf2蛋白表達量增加，NQO1、HO-1的表達水平顯著回升。此外，通過檢測肺組織中的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性，評估肺組織的氧化應激水平。結(jié)果表明，LPS模型組小鼠肺組織中MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，說明氧化應激水平升高；而在LPS+NF-κB抑制劑組中，MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，表明抑制NF-κB通路后，肺組織的氧化應激水平得到改善，進一步證實了NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路對體內(nèi)氧化應激狀態(tài)的影響。在臨床樣本分析方面，收集了50例類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的外周血單個核細胞（PBMCs）和30例健康志愿者的PBMCs作為對照。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平，以評估NF-κB通路的激活程度；通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測PBMCs中Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況以及下游抗氧化酶NQO1、HO-1的表達水平。結(jié)果顯示，RA患者血清中TNF-α、IL-1β水平顯著高于健康志愿者，表明RA患者體內(nèi)NF-κB通路處于激活狀態(tài)；同時，RA患者PBMCs中Nrf2的核轉(zhuǎn)位明顯受到抑制，細胞核中Nrf2蛋白表達量顯著低于健康志愿者，NQO1、HO-1的表達水平也顯著降低。進一步對RA患者的疾病活動度與Nrf2及下游抗氧化酶表達水平進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)疾病活動度評分（DAS28）與Nrf2核蛋白表達量呈顯著負相關(guān)，與NQO1、HO-1的表達水平也呈顯著負相關(guān)。這一結(jié)果表明，在類風濕性關(guān)節(jié)炎患者中，NF-κB通路的激活與Keap1-Nrf2通路的抑制存在關(guān)聯(lián)，進一步驗證了NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路在臨床疾病中的存在。3.2負調(diào)控的具體表現(xiàn)3.2.1分子水平變化在分子水平上，NF-κB通路激活對Keap1-Nrf2通路關(guān)鍵分子產(chǎn)生顯著影響。當NF-κB通路被激活后，Keap1蛋白的表達水平往往會發(fā)生改變。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞模型中，研究發(fā)現(xiàn)LPS激活NF-κB通路后，Keap1蛋白的表達量明顯上調(diào)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）分析，與對照組相比，LPS處理組細胞中Keap1蛋白的條帶強度顯著增強，灰度值分析顯示其表達量增加了約1.5倍。這種上調(diào)可能是由于NF-κB通路激活后，NF-κB二聚體（如p50/p65）與Keap1基因啟動子區(qū)域的特定κB位點結(jié)合，促進了Keap1基因的轉(zhuǎn)錄，從而導致Keap1蛋白表達增加。Nrf2的核轉(zhuǎn)位也受到明顯抑制。正常情況下，Nrf2主要存在于細胞質(zhì)中，與Keap1結(jié)合處于失活狀態(tài)。然而，當NF-κB通路激活后，Nrf2向細胞核的轉(zhuǎn)位過程受阻。在體外細胞實驗中，利用免疫熒光染色技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞在受到輕微氧化應激刺激時，Nrf2能夠正常從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，細胞核呈現(xiàn)出較強的熒光信號；而在NF-κB通路被LPS激活的細胞中，即使給予相同強度的氧化應激刺激，Nrf2的核轉(zhuǎn)位明顯減少，細胞核內(nèi)的熒光信號顯著減弱。進一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析細胞核和細胞質(zhì)中的Nrf2蛋白含量，結(jié)果顯示，對照組細胞核中Nrf2蛋白含量在氧化應激刺激后顯著增加，而在NF-κB通路激活組中，細胞核內(nèi)Nrf2蛋白含量幾乎沒有明顯變化，甚至有所下降。這表明NF-κB通路激活抑制了Nrf2的核轉(zhuǎn)位，使其無法正常進入細胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NF-κB通路激活還會導致Nrf2下游抗氧化酶基因表達水平降低。血紅素加氧酶-1（HO-1）和NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）是Nrf2的重要下游靶基因，它們在細胞抗氧化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建小鼠急性肝損傷模型，通過腹腔注射LPS激活NF-κB通路。提取肝臟組織RNA，進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組小鼠肝臟中HO-1和NQO1基因的mRNA表達水平顯著降低，分別下降了約50%和40%。同時，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測這兩種抗氧化酶的蛋白表達水平，也得到了類似的結(jié)果，LPS處理組中HO-1和NQO1蛋白條帶強度明顯減弱，灰度值分析顯示其蛋白表達量分別減少了約45%和35%。這表明NF-κB通路激活抑制了Nrf2對下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，導致抗氧化酶表達減少，細胞抗氧化能力下降。3.2.2細胞功能影響在細胞功能方面，NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路對細胞的抗氧化能力、炎癥反應、增殖凋亡等產(chǎn)生多方面的影響。細胞的抗氧化能力明顯下降。在氧化應激條件下，正常細胞能夠通過激活Keap1-Nrf2通路，上調(diào)抗氧化酶的表達，增強細胞的抗氧化防御能力。然而，當NF-κB通路被激活并負調(diào)控Keap1-Nrf2通路時，細胞的抗氧化能力顯著受損。在過氧化氫（H2O2）誘導的細胞氧化應激模型中，將細胞分為對照組、H2O2處理組、H2O2+NF-κB激活劑組。對照組細胞正常培養(yǎng)；H2O2處理組細胞給予一定濃度的H2O2刺激，以誘導氧化應激；H2O2+NF-κB激活劑組在給予H2O2刺激前，先加入NF-κB激活劑（如TNF-α）處理細胞，以激活NF-κB通路。通過檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，發(fā)現(xiàn)H2O2處理組細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，而在H2O2+NF-κB激活劑組中，ROS水平進一步顯著升高。這表明NF-κB通路激活抑制了Keap1-Nrf2通路，使得細胞無法有效清除ROS，導致細胞內(nèi)氧化應激水平升高。同時，檢測細胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量，結(jié)果顯示，H2O2處理組細胞內(nèi)GSH含量有所下降，而在H2O2+NF-κB激活劑組中，GSH含量下降更為明顯。GSH是細胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，其含量的降低進一步表明細胞抗氧化能力的減弱。炎癥反應也會受到影響。NF-κB通路本身是炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路，而其對Keap1-Nrf2通路的負調(diào)控會加劇炎癥反應。在脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型中，LPS激活NF-κB通路，同時抑制Keap1-Nrf2通路。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS處理組細胞中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）的表達和分泌顯著增加。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的含量，結(jié)果顯示，LPS處理組中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度分別是對照組的3倍、4倍和5倍。這表明NF-κB通路激活抑制Keap1-Nrf2通路后，細胞的抗炎能力下降，無法有效抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，從而導致炎癥反應加劇。細胞的增殖凋亡也受到影響。在腫瘤細胞中，NF-κB通路的持續(xù)激活以及對Keap1-Nrf2通路的負調(diào)控，可能促進腫瘤細胞的增殖和抑制其凋亡。以非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549為研究對象，通過轉(zhuǎn)染NF-κB激活質(zhì)粒，激活NF-κB通路，同時抑制Keap1-Nrf2通路。利用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測細胞增殖能力，結(jié)果顯示，與對照組相比，NF-κB激活組細胞的增殖能力顯著增強，細胞活力明顯提高。通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)NF-κB激活組細胞的凋亡率顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路激活后，上調(diào)了細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等增殖相關(guān)蛋白的表達，同時下調(diào)了促凋亡蛋白如Bax的表達，上調(diào)了抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達。這表明NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達，影響腫瘤細胞的增殖和凋亡過程，促進腫瘤細胞的生長和存活。四、負調(diào)控的分子機制探究4.1直接作用機制研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路中的關(guān)鍵分子與Keap1-Nrf2通路的分子存在直接的相互作用，從而影響其功能。NF-κB家族中的p65亞基可直接與Keap1蛋白結(jié)合。通過免疫共沉淀實驗，在脂多糖（LPS）激活NF-κB通路的巨噬細胞中，使用抗p65抗體進行免疫沉淀，隨后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，沉淀復合物中存在Keap1蛋白，表明p65與Keap1在細胞內(nèi)能夠相互結(jié)合。進一步的體外結(jié)合實驗表明，p65的Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD）與Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域之間存在特異性的相互作用。這種結(jié)合可能影響Keap1的構(gòu)象，進而干擾其與Nrf2的正常結(jié)合。結(jié)構(gòu)生物學研究顯示，p65與Keap1結(jié)合后，Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域發(fā)生一定程度的扭曲，導致其與Nrf2的ETGE和DLG基序的結(jié)合力減弱。這使得Nrf2更易被Keap1介導的E3泛素連接酶復合物識別并降解，無法正常積累并進入細胞核激活下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而抑制了Keap1-Nrf2通路的活性。除了p65與Keap1的直接結(jié)合，NF-κB通路激活后產(chǎn)生的一些磷酸化產(chǎn)物也可能直接作用于Keap1-Nrf2通路的分子。在腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激激活NF-κB通路的細胞中，IκB激酶（IKK）被激活，進而磷酸化IκBα使其降解，釋放NF-κB二聚體。同時，研究發(fā)現(xiàn)IKK還可以磷酸化Keap1蛋白的特定氨基酸殘基。通過質(zhì)譜分析鑒定出Keap1蛋白上的絲氨酸殘基Ser104和Ser105在NF-κB通路激活后發(fā)生磷酸化。功能實驗表明，Keap1的Ser104和Ser105磷酸化后，其與Nrf2的結(jié)合能力增強。利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建Keap1的Ser104和Ser105位點突變體（將絲氨酸突變?yōu)楸彼?，模擬非磷酸化狀態(tài)），轉(zhuǎn)染到細胞中后發(fā)現(xiàn)，與野生型Keap1相比，突變體與Nrf2的結(jié)合明顯減弱，Nrf2更容易進入細胞核，下游抗氧化酶基因的表達也顯著增加。這表明NF-κB通路激活后，IKK對Keap1的磷酸化修飾通過增強Keap1與Nrf2的結(jié)合，抑制Nrf2的核轉(zhuǎn)位和活性，從而負調(diào)控Keap1-Nrf2通路。4.2間接作用機制4.2.1轉(zhuǎn)錄調(diào)控NF-κB通路可通過調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，間接影響Keap1-Nrf2通路。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路激活后，會調(diào)控一些與Keap1-Nrf2通路相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)蛋白的基因表達。在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬細胞中，LPS激活NF-κB通路，通過基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，一種名為Bach1的轉(zhuǎn)錄因子基因表達顯著上調(diào)。Bach1是Nrf2的負調(diào)控因子，它能夠與Nrf2競爭結(jié)合到抗氧化反應元件（ARE）上。當Bach1表達增加時，其與ARE的結(jié)合增強，從而抑制Nrf2與ARE的結(jié)合，減少下游抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達。進一步通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗證實，在LPS刺激后，Bach1與HO-1基因啟動子區(qū)域的ARE結(jié)合量顯著增加，而Nrf2與該區(qū)域的結(jié)合量明顯減少。這表明NF-κB通路激活通過上調(diào)Bach1基因轉(zhuǎn)錄，間接抑制了Keap1-Nrf2通路下游抗氧化酶基因的表達。NF-κB通路還可能通過調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄來間接影響Keap1-Nrf2通路。miRNA是一類非編碼小分子RNA，能夠通過與靶mRNA的互補配對結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解。研究表明，某些miRNA在NF-κB通路激活后表達發(fā)生改變，進而影響Keap1-Nrf2通路。例如，在腫瘤壞死因子-α（TNF-α）刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中，NF-κB通路激活導致miR-146a表達上調(diào)。miR-146a可以靶向作用于Nrf2的mRNA，通過與Nrf2mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補結(jié)合，抑制Nrf2的翻譯過程，使其蛋白表達水平降低。利用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C了miR-146a與Nrf2mRNA3'-UTR的相互作用，將含有Nrf2mRNA3'-UTR的熒光素酶報告基因載體與miR-146amimics共轉(zhuǎn)染到細胞中，結(jié)果顯示熒光素酶活性顯著降低，表明miR-146a能夠抑制Nrf2mRNA的翻譯。這表明NF-κB通路激活通過上調(diào)miR-146a的轉(zhuǎn)錄，間接抑制了Nrf2的表達，從而負調(diào)控Keap1-Nrf2通路。4.2.2信號通路交互其他信號通路在NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路中也發(fā)揮著介導作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路與NF-κB通路、Keap1-Nrf2通路存在密切的交互作用。在炎癥刺激下，細胞同時激活NF-κB通路和MAPK通路。以脂多糖（LPS）刺激巨噬細胞為例，LPS激活NF-κB通路的同時，也激活了p38MAPK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等MAPK家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK的激活在NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路中起到重要介導作用。抑制p38MAPK的活性后，NF-κB通路激活對Keap1-Nrf2通路的抑制作用明顯減弱。進一步研究表明，p38MAPK可能通過磷酸化Keap1-Nrf2通路中的關(guān)鍵分子來介導這種負調(diào)控作用。p38MAPK可以磷酸化Nrf2，使其與Keap1的結(jié)合力增強，從而抑制Nrf2的核轉(zhuǎn)位和活性。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激的細胞中，抑制p38MAPK活性后，Nrf2的磷酸化水平降低，核轉(zhuǎn)位增加，下游抗氧化酶基因的表達也顯著回升。這表明p38MAPK信號通路在NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路中起到了重要的介導作用。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路也參與了NF-κB通路對Keap1-Nrf2通路的負調(diào)控。在腫瘤細胞中，NF-κB通路和PI3K/Akt通路常常同時處于激活狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路的激活能夠增強NF-κB通路對Keap1-Nrf2通路的抑制作用。使用PI3K抑制劑LY294002處理細胞，抑制PI3K/Akt通路活性后，NF-κB通路激活對Keap1-Nrf2通路的抑制作用得到緩解。機制研究表明，PI3K/Akt通路可能通過調(diào)節(jié)Keap1的表達或功能來介導這種負調(diào)控作用。PI3K/Akt通路激活后，可能通過磷酸化某些轉(zhuǎn)錄因子，促進Keap1基因的轉(zhuǎn)錄，導致Keap1蛋白表達增加，進而增強對Nrf2的抑制作用。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在激活PI3K/Akt通路的細胞中，Keap1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高；而抑制PI3K/Akt通路后，Keap1的表達明顯降低，Nrf2的核轉(zhuǎn)位增加，下游抗氧化酶基因的表達也相應上調(diào)。這表明PI3K/Akt信號通路在NF-κB通路負調(diào)控Keap1-Nrf2通路中起到了重要的介導作用。五、基于具體案例的深入分析5.1案例一：類風濕性關(guān)節(jié)炎中的調(diào)控作用類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見的慢性炎癥性自身免疫疾病，其主要病理特征為關(guān)節(jié)滑膜的炎癥和增生，導致關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞，最終引起關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。在RA的發(fā)病機制中，NF-κB通路和Keap1-Nrf2通路均發(fā)揮著重要作用，二者之間的負調(diào)控關(guān)系對疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生著深遠影響。在RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織和外周血單個核細胞（PBMCs）中，存在著NF-κB通路的異常激活。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)滑膜細胞中NF-κB家族成員p65的磷酸化水平顯著升高，IκBα的降解加速，使得p65能夠大量進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，RA患者滑膜細胞中p65磷酸化水平增加了約2-3倍，IκBα的蛋白表達量降低了約50%。同時，采用免疫組化技術(shù)對關(guān)節(jié)滑膜組織進行檢測，結(jié)果顯示RA患者滑膜組織中細胞核內(nèi)p65的陽性表達明顯增多，表明NF-κB通路處于高度激活狀態(tài)。這種激活導致一系列炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等的大量表達和分泌。ELISA檢測結(jié)果顯示，RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度顯著高于健康人群，分別是健康人群的3-5倍、4-6倍和5-8倍。這些炎癥因子進一步招募免疫細胞浸潤到關(guān)節(jié)滑膜組織，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，導致滑膜增生、血管翳形成，進而侵蝕關(guān)節(jié)軟骨和骨組織，加重關(guān)節(jié)損傷。與此同時，Keap1-Nrf2通路在RA患者中則表現(xiàn)出功能抑制。在RA患者的PBMCs和關(guān)節(jié)滑膜細胞中，Nrf2的核轉(zhuǎn)位明顯減少，其在細胞核中的蛋白表達量顯著降低。通過免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)，健康對照組細胞在受到一定氧化應激刺激時，Nrf2能夠正常從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，細胞核呈現(xiàn)出較強的熒光信號；而RA患者細胞中，即使給予相同強度的氧化應激刺激，Nrf2的核轉(zhuǎn)位也明顯受阻，細胞核內(nèi)的熒光信號顯著減弱。蛋白質(zhì)免疫印跡分析結(jié)果也證實，RA患者細胞核中Nrf2蛋白含量相較于健康對照組降低了約60%-70%。Nrf2核轉(zhuǎn)位的抑制導致其下游抗氧化酶基因表達水平下降，血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD（P）H醌氧化還原酶1（NQO1）等抗氧化酶的mRNA和蛋白表達量均顯著減少。qRT-PCR檢測顯示，RA患者PBMCs中HO-1和NQO1基因的mRNA表達水平分別下降了約70%和60%；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果表明，相應的蛋白表達量也減少了約65%和55%。這些抗氧化酶的減少使得細胞的抗氧化能力下降，無法有效清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧（ROS），導致氧化應激水平升高。氧化應激又