[課下鞏固精練卷(五十五)]基因工程的基本工具與基本操作程序________________________________________________________________________知識點較易題中檔題較難題重組DNA技術的基本工具3、49、11、1213、14基因工程的基本操作程序5、68、9、11、1213、14DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增及電泳鑒定1、27、10－一、選擇題：每小題只有一個選項符合題目要求。1.(2024·山東高考)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是()A.整個提取過程中可以不使用離心機B.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中C.鑒定過程中DNA雙螺旋結構不發(fā)生改變D.僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾解析：選A。該實驗涉及實驗材料的研磨、研磨液的獲取、DNA的析出及晾干、DNA的鑒定等4個主要步驟。研磨液的獲取步驟可以使用離心機，但也可用靜置的方式代替；DNA的析出及晾干步驟可以使用離心機，離心后DNA沉在管底，但也可不經(jīng)離心，直接用玻璃棒攪拌后卷起DNA，A正確?！把心ヒ涸?℃冰箱中放置幾分鐘”目的是使研磨液中混雜的少量未被過濾去除掉的組織碎片沉在燒杯底部，以便于后續(xù)步驟將其去除，放置后再搖勻無法達到上述實驗目的，B錯誤。DNA鑒定的實驗條件是“沸水中加熱5min”，在此條件下，DNA已發(fā)生變性，其雙螺旋結構發(fā)生了改變，C錯誤。鑒定DNA時，兩個試管分別為不含DNA的對照組和含DNA的實驗組，對照組加熱后未變藍，可以證明二苯胺加熱不變藍，即可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。2.(2024·黑吉遼高考)關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是()A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來解析：選A。應根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分數(shù)為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液，A正確；凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進度，而不是指示DNA分子的具體位置，B錯誤；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關，在同一電場作用下，DNA片段(帶負電)越長，DNA向正極遷移的速率越慢，C錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。3.若要利用某目的基因(見圖甲)和質(zhì)粒載體(見圖乙)構建重組DNA(見圖丙)，限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點分別是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列敘述正確的是()A.用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體解析：選D。用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，產(chǎn)生相同的黏性末端，用DNA連接酶連接時可能會發(fā)生反向連接，A錯誤；用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因會產(chǎn)生兩種DNA片段，一種含有目的基因，一種不含目的基因，且有目的基因的片段與載體結合時容易發(fā)生反向連接，B錯誤；用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，分別產(chǎn)生不同的黏性末端和平末端，但目的基因插入質(zhì)粒載體后，RNA聚合酶的移動方向與圖丙實線方向相反，C錯誤；用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體，分別產(chǎn)生不同的黏性末端和平末端，防止發(fā)生反向連接，且目的基因插入質(zhì)粒載體后，RNA聚合酶的移動方向與圖丙實線方向相同，D正確。4.表中為常用的限制酶及其識別序列和切割位點，由此推斷以下說法中錯誤的是()限制酶名稱識別序列和切割位點BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGG注：Y為C或T，R為A或G。A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點在識別序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列解析：選D。HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶沿著識別序列的中軸線切口切開，切割后形成平末端，A正確；Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割位點在識別序列的外部，B正確；BamHⅠ限制酶識別GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶識別GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正確；HindⅡ能識別GTCAAC、GTTAAC、GTCGAC、GTTGAC，D錯誤。5.(2025·安徽合肥模擬)科研人員將寒帶地區(qū)海魚中的抗凍基因轉入千禧果細胞中，成功培育出抗凍千禧果。下圖為培育過程中使用的Ti質(zhì)粒示意圖，其中Vir區(qū)的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，下列敘述正確的是()A.構建基因表達載體時，最好選擇限制酶Ⅱ和Ⅲ來切割質(zhì)粒B.利用PCR擴增抗凍基因，需提前檢測抗凍基因的全部堿基序列C.Vir區(qū)的基因活化促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上D.利用含卡那霉素的培養(yǎng)基可篩選出成功導入抗凍基因的千禧果細胞解析：選C。Vir區(qū)的基因活化能促進T-DNA的加工和轉移，是T-DNA轉移整合到受體細胞DNA上必不可少的，使用限制酶Ⅱ會破壞Vir區(qū)的基因，故不能選限制酶Ⅱ，A錯誤；使用PCR技術擴增抗凍基因，只需要知道抗凍基因兩端堿基序列設計引物即可，B錯誤；農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，Ti質(zhì)粒上的T-DNA能轉移到被侵染的細胞并整合到該細胞的染色體DNA上，所以Vir區(qū)基因活化可促進抗凍基因整合到千禧果細胞的染色體DNA上，C正確；培育成功的千禧果細胞中的染色體DNA上整合了T-DNA區(qū)，應用含四環(huán)素的培養(yǎng)基進行篩選，D錯誤。6.(2025·安徽蕪湖模擬)蘇云金桿菌能產(chǎn)生具有殺蟲能力的Bt抗蟲蛋白。下圖是一種轉Bt抗蟲蛋白基因棉花的重組DNA形成過程示意圖，下列敘述錯誤的是()A.可通過設計特異性引物，利用PCR技術特異性獲取和擴增Bt抗蟲蛋白基因B.經(jīng)過①②得到的重組質(zhì)粒，目的基因轉錄的產(chǎn)物可能不同C.取棉花葉片組織與重組Ti質(zhì)粒共培養(yǎng)，經(jīng)組織培養(yǎng)并篩選后可獲得抗蟲棉D.可用相應抗體進行抗原—抗體雜交，檢測Bt抗蟲蛋白基因是否成功表達解析：選C。PCR是一項體外擴增DNA的技術，該技術需要一對引物，可通過設計特異性引物，利用PCR技術特異性獲取和擴增Bt抗蟲蛋白基因，A正確；轉錄是以DNA的一條鏈為模板合成RNA的過程，經(jīng)過①②得到的重組質(zhì)粒，目的基因轉錄的產(chǎn)物可能不同，B正確；受傷葉片傷口處的細胞釋放出的大量酚類物質(zhì)，可吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，因此進行農(nóng)桿菌轉化時選用棉花受傷的葉片與含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，再經(jīng)組織培養(yǎng)并篩選后可獲得抗蟲棉，C錯誤；Bt抗蟲蛋白基因的表達產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，抗原與抗體結合具有特異性，故可用相應抗體進行抗原—抗體雜交，檢測Bt抗蟲蛋白基因是否成功表達，D正確。7.(2025·河南開封模擬)如圖是堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA的簡要步驟。下列說法錯誤的是()A.堿性試劑2可破壞大腸桿菌的細胞膜，從而釋放細胞內(nèi)容物B.試劑3利用了擬核DNA與質(zhì)粒DNA的長度差異，僅使前者沉淀C.①步驟結束后應敞開管蓋，待殘余酒精完全揮發(fā)后再進行②步驟D.可用任意濃度的NaCl溶液替換②步驟所用的水，以溶解質(zhì)粒DNA解析：選D。細胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構成，堿性試劑可導致蛋白質(zhì)變性而破壞細胞膜，A正確；擬核中的DNA較大，試劑3處理后在沉淀中，B正確；①步驟利用了DNA不溶解于酒精的原理，結束后應敞開管蓋，待殘余酒精完全揮發(fā)后再進行②步驟，可提取到質(zhì)粒DNA，C正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，可用2mol/L的NaCl溶液提取，D錯誤。8.轉基因植物中標記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉基因時將目的基因和標記基因分別構建在兩個Ti質(zhì)粒上，通過共轉化得到轉基因植物后讓其自交得到不含標記基因的轉基因個體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標記基因的序列，只留下一個LoxP位點，具體原理如圖。下列說法不正確的是()A.利用分離剔除法時，目的基因和標記基因都應插到Ti質(zhì)粒的T-DNA序列內(nèi)部B.分離剔除時目的基因和標記基因插到植物細胞的同源染色體或非同源染色體上均可成功C.上述重組載體中啟動子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細胞中不能發(fā)揮作用D.經(jīng)重組剔除后的標記基因，因沒有啟動子而無法啟動基因的轉錄解析：選C。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時，目的基因和標記基因都應插到Ti質(zhì)粒的T-DNA序列內(nèi)部，進而成功整合到受體細胞染色體DNA上，A正確；分離剔除時目的基因和標記基因插到植物細胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標記基因的轉基因個體，即均可成功，B正確；重組剔除時，Cre酶基因應該在植物細胞中表達，故上述重組載體中啟動子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細胞中能發(fā)揮作用，C錯誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標記基因沒有啟動子，無法啟動基因的轉錄，D正確。二、選擇題：每小題有一個或多個選項符合題目要求。9.(2025·山東濟南模擬)科學家發(fā)現(xiàn)一種名為Tat－SIRT5－CTM的細胞穿透肽，其可以抑制小膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子的表達，使神經(jīng)元免受損傷。研究者欲通過基因工程來生產(chǎn)Tat－SIRT5－CTM，如圖是采用PCR技術檢測目的基因插入染色體的位置的流程圖。下列說法正確的是()A.Tat－SIRT5－CTM可防止某些疾病造成腦損傷B.可利用抗原—抗體雜交技術檢測穿透肽的表達量C.轉基因技術中目的基因插入染色體的位點通常具有確定性D.Ⅰ過程不能利用不同的限制酶切割，來構建圖中的環(huán)狀DNA解析：選AB。由于Tat－SIRT5－CTM可抑制小膠質(zhì)細胞中炎癥細胞因子的表達，保護神經(jīng)元免受損傷，因此Tat－SIRT5－CTM可防止某些疾病造成腦損傷，A正確；穿透肽本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此可用抗原—抗體雜交技術檢測其表達量，B正確；轉基因技術中目的基因會隨機整合到宿主細胞的染色體上，因此插入的位點通常具有不確定性，C錯誤；有些限制酶切割形成的黏性末端相同，因此Ⅰ過程可以利用不同的限制酶切割，來構建圖中的環(huán)狀DNA，D錯誤。10.融合PCR技術采用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來。其原理如圖所示，據(jù)圖分析正確的是()A.上述過程中使用的引物P2和P3的堿基需要完全互補配對B.設計引物的目的是能夠從其3′端開始連接脫氧核苷酸C.融合PCR的第一步兩條鏈重疊部位可互為另一條鏈的引物D.若融合PCR的第二步獲得128個融合基因，理論上該過程消耗了254個引物解析：選BCD。上述過程中使用的引物P2和P3的堿基不需要完全互補配對，只需要部分堿基互補配對即可，A錯誤；引物為一段核苷酸，與DNA模板鏈結合后，能夠從其3′端開始連接脫氧核苷酸，進行子鏈的合成，B正確；結合圖示可知，融合PCR的第一步兩條鏈重疊部位即互補配對，可互為另一條鏈的引物，C正確；若融合PCR的第二步獲得了128個融合基因，引物數(shù)目和新合成的子鏈數(shù)目相同，即該過程消耗了128×2－2＝254個引物，D正確。三、非選擇題11.某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細菌(B1)的基因組中，構建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結合位置、片段甲替換區(qū)如圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學鍵是________。為保證N基因能在菌株B2中表達，在構建片段甲時，應將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，原因是________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技術可以切割細菌B1基因組中與向?qū)NA結合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G－C和____________________。(3)用引物P1和P2進行PCR可驗證片段甲插入了細菌B1基因組，所用的模板是______________；若用該模板與引物P3和P4進行PCR，實驗結果是____________________。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優(yōu)點是__________________________(答出2點即可)。解析：(1)限制酶切割的化學鍵為磷酸二酯鍵。在構建片段甲時，應將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，保證片段甲含有N基因啟動子、N基因、N基因終止子，使N基因正常表達。(2)RNA的堿基組成有A、U、G、C，DNA的堿基組成為A、T、G、C，向?qū)NA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G－C和C－G、A－T、U－A。(3)用引物P1和P2進行PCR可擴增N基因，驗證片段甲插入了細菌B1基因組，所用的模板是菌株B2的基因組中N基因的兩條鏈；因為P3不能與N基因模板鏈結合，用該模板與引物P3和P4進行PCR，實驗結果是不能擴增出目的產(chǎn)物。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優(yōu)點是不污染環(huán)境、增加土壤養(yǎng)分。答案：(1)磷酸二酯鍵保證片段甲含有N基因啟動子、N基因、N基因終止子(2)C－G、A－T、U－A(3)菌株B2的基因組無法擴增出目的產(chǎn)物(4)不污染環(huán)境、增加土壤養(yǎng)分12.金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動植物中具有金屬結合能力的蛋白質(zhì)，決定該蛋白質(zhì)合成的基因結構如圖1所示，其中A鏈為編碼鏈、B鏈為模板鏈?？蒲腥藛T利用圖2所示質(zhì)粒構建棗樹的MT基因重組DNA分子并導入大腸桿菌細胞，獲得對重金屬鎘(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌?；卮鹣铝袉栴}：注：XhoⅠ、KpnⅠ、PstⅠ為不同限制酶的識別位點；LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化無色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍色，否則菌落為白色；AmpR基因為氨芐青霉素抗性基因。(1)獲取目的基因：提取棗樹細胞的____________，經(jīng)逆轉錄獲得cDNA。為了使PCR擴增后的產(chǎn)物按照正確的方向與已被酶切的載體連接，克隆MT基因時應選擇的引物組合是__________________，并在其________(填“5′”或“3′”)端分別添加限制酶______________的識別序列。(2)構建重組DNA分子：啟動子是____________識別并結合的部位?；蚬こ讨袠嫿ㄓ糜谠松锏谋磉_載體時，常用的啟動子不包括以下哪一項？________。A.噬菌體基因啟動子B.乳酸菌基因啟動子C.大腸桿菌基因啟動子D.棗樹MT基因啟動子(3)導入、篩選和鑒定MT工程菌。①將得到的混合物導入到用________處理的大腸桿菌完成________實驗。②將菌液稀釋并涂布在含X-gal和氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后，隨機挑取________的單菌落可獲得MT工程菌。③欲進一步對MT工程菌進行鑒定，可將挑取出的MT工程菌與____________分別接種至含________的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適宜時間后檢測菌種數(shù)量。解析：(1)PCR過程中，引物與模板鏈的3′端結合，因此應當選擇引物Ⅱ和引物Ⅲ，這樣才能使耐高溫的DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。由題干可知，B鏈為模板鏈，轉錄是沿著模板鏈的3′→5′方向進行的，應將MT基因的左端與啟動子一側連接，由于目的基因中含有PstⅠ的識別序列，不宜選用PstⅠ，同時為了保證MT基因正向連接到質(zhì)粒上，應當在MT基因兩側添加不同的限制酶識別序列，故在引物Ⅱ和引物Ⅲ末端添加的限制酶序列分別是KpnⅠ和XhoⅠ限制酶識別序列。引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾，故限制酶的識別序列應加在引物的5′端。(2)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)。噬菌體是寄生于細菌中的病毒，噬菌體基因啟動子可用于構建原核生物表達載體；乳酸菌和大腸桿菌都是原核生物，它們的啟動子可以用于構建原核生物的表達載體；棗樹MT基因啟動子不適合用于構建原核生物表達載體。(3)①大腸桿菌是原核生物，需要Ca2＋處理，使其處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，完成將基因表達載體導入受體細胞并在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，即轉化。②在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，導入了空白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌都可以形成菌落，但導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌LacZ基因被破壞，不能催化無色物質(zhì)X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)，是白色菌落，故應挑取白色單菌落進行培養(yǎng)。③操作獲得的是對重金屬鎘(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌，因此欲進一步對MT工程菌進行鑒定，可將挑取出的MT工程菌與普通大腸桿菌分別接種到含有(一定濃度的)鎘的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適宜時間后檢測菌種數(shù)量。答案：(1)mRNA引物Ⅱ和引物Ⅲ5′KpnⅠ和XhoⅠ(2)RNA聚合酶D(3)①Ca2＋轉化②白色③普通大腸桿菌(一定濃度的)鎘13.(2024·山東高考)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號途徑調(diào)控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點處插入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉錄產(chǎn)物可引導核酸酶特異性結合基因組上的目標序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結果等如圖所示。(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越______(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有______種。載體信息如圖甲所示，經(jīng)BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5′－________－3′和5′－________－3′。(2)重組載體通過農(nóng)桿菌導入大豆細胞，使用抗生素____________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是________，其中純合的突變植株是________(填序號)。(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發(fā)現(xiàn)其體細胞中只有1條染色體有T-DNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為________，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。解析：(1)利用PCR技術擴增目的基因時，引物越短則與目的基因匹配的特異性越低，可能會擴增出許多非目的基因的區(qū)域。分析BsaⅠ識別序列的特點，黏性末端可能出現(xiàn)四個位置的堿基任一排列，每個位置都可能是A、T、C、G四種堿基中的一種，因此黏性末端最多有44種，即256種。分析BsaⅠ識別序列的特點，結合題圖甲中的堿基序列，限制酶切割的位置如圖所示：限制酶會將解析圖中虛線框內(nèi)的區(qū)域去掉，則載體上保留的黏性末端的序列為5′-GTTT-3′和5′-CAAT-3′。(2)將重組載體導入大豆細胞時會將卡那霉素抗性基因一起導入，因此應使用抗生素卡那霉素篩選植株①～④。通過比較題圖乙中目標序列和突變序列上的堿基差異發(fā)現(xiàn)，若用BamHⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶切割，無法區(qū)分出目標序列和突變序列，因為兩序列上都存在這兩種限制酶的切割位點，只有用SacⅠ限制酶進行切割才能區(qū)分出目標序列和突變序列，因此應選用SacⅠ限制酶。純合的突變植株只含有突變序列，因此可以把PCR產(chǎn)物切成大小不同的兩段，其電泳結果為兩個條帶，如植株④結果所示。純合的非突變體的PCR產(chǎn)物不能被SacⅠ限制酶切開，只有一個條帶，如植株②，雜合的植株既存在目標序列也存在突變序列，會有三個條帶，如植株①和③。(3)實驗中獲得的1株基因L成功突變的純合植株只有1條染色體上有T-DNA插入，則只有一個抗生素抗性基因，假設該基因為H，則該植株的抗性基因組成為HO，該植株自交的子代的基因型及比例為HH∶HO∶OO＝1∶2∶1，其中OO型對抗生素敏感，抗生素敏感植株的比例為1/4。答案：(1)低256GTTTCAAT(2)卡那霉素SacⅠ④(3)1/414.(2024·黑吉遼高考)將天然Ti質(zhì)粒改造成含有Vir基因的輔助質(zhì)粒(輔助T-DNA轉移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭質(zhì)粒，共同轉入農(nóng)桿菌，可提高轉化效率。細菌和棉花對密碼子偏好不同，為提高翻譯效率，增強棉花抗病蟲害能力，進行如下操作?；卮鹣铝袉栴}。注：F1-F3，R1-R3表示引物；T-DNA-LB表示左邊界；T-DNA-RB表示右邊界；Ori表示復制原點；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。(1)從蘇云金桿菌提取DNA時，需加入蛋白酶，其作用是____________________________。提取過程中加入體積分數(shù)為95%的預冷酒精，其目的是__________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