冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡：MiR-181b、ERK與P53的協(xié)同作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1胰腺癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀胰腺癌作為消化系統(tǒng)中極具侵襲性的惡性腫瘤，近年來(lái)在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)胰腺癌年發(fā)病率已達(dá)十萬(wàn)分之5.1，且發(fā)病率仍在持續(xù)攀升，其死亡率在所有惡性腫瘤中名列前茅。胰腺癌的5年生存率極低，僅為4％-5%，中位生存期通常僅為六到十個(gè)月，晚期患者的生存期甚至更短，有轉(zhuǎn)移者生存期僅為三到六個(gè)月，因此被稱(chēng)為“癌中之王”。胰腺癌早期診斷極為困難，這是由于其發(fā)病隱匿，早期癥狀不典型，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)。當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，如腹痛、黃疸、消瘦等，腫瘤往往已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。目前，手術(shù)切除仍是胰腺癌最有效的治療方法，但手術(shù)切除率僅為10％-20％。這主要是因?yàn)橐认侔┰缙诓灰撞煊X(jué)，確診時(shí)多數(shù)患者已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)難以徹底切除腫瘤。此外，胰腺癌對(duì)化療和放療的敏感性相對(duì)較低，常規(guī)放化療效果不理想，這進(jìn)一步限制了治療效果的提升。因此，尋找新的、更有效的治療方法，成為了胰腺癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，對(duì)于提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。1.1.2冬凌草甲素的研究進(jìn)展冬凌草甲素（Oridonin）是從唇形科香茶菜屬植物冬凌草中分離提取出的一種四環(huán)二萜類(lèi)化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)為C20H26O7。冬凌草甲素具有多種藥理特性，在抗菌、抗炎等方面都展現(xiàn)出一定的作用，尤其在抗腫瘤領(lǐng)域，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注和深入的研究。大量研究表明，冬凌草甲素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，包括肝癌、結(jié)腸癌、白血病、口腔癌、乳腺癌、食道癌、卵巢癌等。其抗腫瘤作用機(jī)制呈現(xiàn)多樣化，主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬以及激活線粒體凋亡途徑等。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，冬凌草甲素可以通過(guò)抑制SHH、激活p38MAPK、Akt信號(hào)通路等，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；通過(guò)抑制Akt/mTOR、RAF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，使白血病細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。在阻滯細(xì)胞周期方面，冬凌草甲素能將人骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期，將結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞、HCT-8細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1期，將HCT-116細(xì)胞、SW480細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期，將肝癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬方面，冬凌草甲素能夠誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞自噬，使自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1水平增高，從而抑制細(xì)胞增殖。在激活線粒體凋亡途徑方面，冬凌草甲素可通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。在胰腺癌治療研究中，冬凌草甲素也顯示出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。有研究表明，冬凌草甲素可濃度依賴(lài)性降低胰腺癌細(xì)胞PANC-1的存活率，誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制與JNK和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路凋亡相關(guān)蛋白的活化有關(guān)；還能通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞SW1990和Panc-1凋亡。這些研究成果為冬凌草甲素用于胰腺癌治療提供了有力的理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使其成為胰腺癌治療研究中的一個(gè)重要方向。1.1.3研究的必要性盡管目前對(duì)冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足?，F(xiàn)有的研究主要集中在少數(shù)幾種信號(hào)通路，如JNK和p38MAPK信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路等，對(duì)于其他可能參與的信號(hào)通路和分子機(jī)制的研究還不夠全面和深入。對(duì)于冬凌草甲素作用于胰腺癌細(xì)胞的具體靶點(diǎn)以及這些靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，尚未完全明確。MiR-181b作為一種微小RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，它可以通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞中，ERK信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。P53基因是一種重要的抑癌基因，它可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、修復(fù)DNA損傷等機(jī)制，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)P53基因發(fā)生突變或功能缺失時(shí)，細(xì)胞容易發(fā)生癌變。然而，目前關(guān)于MiR-181b、ERK、P53在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用及相互關(guān)系的研究還存在空白。本研究旨在深入探討MiR-181b、ERK、P53在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用，明確它們之間的相互關(guān)系和調(diào)控機(jī)制，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白。這不僅有助于進(jìn)一步揭示冬凌草甲素抗胰腺癌的分子機(jī)制，為冬凌草甲素在胰腺癌治療中的應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，還可能為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與方法1.2.1研究目的本研究旨在深入探究冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，明確MiR-181b、ERK、P53在這一過(guò)程中的具體作用，以及它們之間的相互關(guān)系和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，分析冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞中MiR-181b表達(dá)水平的影響，以及MiR-181b如何通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響ERK信號(hào)通路的激活和P53蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。本研究期望為冬凌草甲素在胰腺癌治療中的應(yīng)用提供更深入的理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)基于MiR-181b、ERK、P53靶點(diǎn)的胰腺癌治療新策略奠定基礎(chǔ)。1.2.2研究方法實(shí)驗(yàn)法：選擇人胰腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象，如PANC-1、SW1990等細(xì)胞株，采用含10%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，定期換液和傳代，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。利用MTT法檢測(cè)不同濃度冬凌草甲素作用于胰腺癌細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，確定冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素處理后胰腺癌細(xì)胞的凋亡率，分析不同濃度和作用時(shí)間下細(xì)胞凋亡的變化情況。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)冬凌草甲素處理前后胰腺癌細(xì)胞中MiR-181b的表達(dá)水平變化，明確冬凌草甲素對(duì)MiR-181b表達(dá)的調(diào)控作用。通過(guò)Westernblot技術(shù)，檢測(cè)ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如p-ERK、ERK）以及P53蛋白的表達(dá)水平，分析冬凌草甲素對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建MiR-181b過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，以及使用ERK信號(hào)通路抑制劑和P53激動(dòng)劑或抑制劑處理細(xì)胞，進(jìn)一步探究MiR-181b、ERK、P53在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的相互作用機(jī)制。文獻(xiàn)研究法：全面檢索WebofScience、PubMed、中國(guó)知網(wǎng)等國(guó)內(nèi)外權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)，以“冬凌草甲素”“胰腺癌”“細(xì)胞凋亡”“MiR-181b”“ERK”“P53”等為關(guān)鍵詞，收集相關(guān)的研究文獻(xiàn)。對(duì)篩選出的文獻(xiàn)進(jìn)行深入閱讀和分析，了解冬凌草甲素抗胰腺癌的研究現(xiàn)狀，以及MiR-181b、ERK、P53在腫瘤發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。綜合已有文獻(xiàn)資料，梳理研究脈絡(luò)，找出當(dāng)前研究的不足和空白，為本研究的開(kāi)展提供理論支持和研究思路。二、理論基礎(chǔ)2.1胰腺癌概述2.1.1胰腺癌的發(fā)病機(jī)制胰腺癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且尚未完全明確的過(guò)程，涉及遺傳、環(huán)境、生活習(xí)慣等多個(gè)方面因素的相互作用。在遺傳因素方面，大約10%的胰腺癌病例具有家族遺傳性。某些特定基因的突變或多態(tài)性與胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，例如CDKN2A、BRCA1/2、PALB2等基因突變，會(huì)顯著增加個(gè)體患胰腺癌的可能性。這些基因在細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化、DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期調(diào)控等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，一旦發(fā)生突變，就可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，進(jìn)而引發(fā)癌變。家族性惡性黑色素瘤、波伊茨-耶格綜合征及其他遺傳性腫瘤的患者，由于其攜帶的相關(guān)遺傳突變，也會(huì)使胰腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)明顯上升。環(huán)境因素在胰腺癌的發(fā)病中也扮演著重要角色。長(zhǎng)期暴露于某些化學(xué)物質(zhì)，如有機(jī)氯化物、有機(jī)磷化合物等，會(huì)對(duì)胰腺細(xì)胞的DNA造成損傷，干擾細(xì)胞的正常代謝和功能，增加細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。吸煙是一個(gè)明確的胰腺癌危險(xiǎn)因素，煙草中含有多種致癌物質(zhì)，如尼古丁、焦油、苯并芘等，這些物質(zhì)進(jìn)入人體后，經(jīng)過(guò)一系列代謝過(guò)程，會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化性的自由基，損傷胰腺細(xì)胞的DNA，導(dǎo)致基因突變，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生。研究表明，吸煙者患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)是不吸煙者的2-3倍，且吸煙量越大、吸煙時(shí)間越長(zhǎng)，患病風(fēng)險(xiǎn)越高。生活習(xí)慣因素同樣不容忽視。高脂飲食、肥胖、缺乏運(yùn)動(dòng)等不良生活方式與胰腺癌的發(fā)病緊密相關(guān)。長(zhǎng)期攝入高脂肪食物，會(huì)使血液中甘油三酯、膽固醇等脂質(zhì)成分升高，導(dǎo)致肥胖，肥胖會(huì)引發(fā)一系列代謝紊亂，如胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)等。胰島素抵抗會(huì)使體內(nèi)胰島素水平升高，胰島素及其類(lèi)似物可以刺激胰腺細(xì)胞的增殖，同時(shí)還會(huì)影響細(xì)胞的凋亡過(guò)程，增加細(xì)胞癌變的機(jī)會(huì)。炎癥反應(yīng)則會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子，這些因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。缺乏運(yùn)動(dòng)也會(huì)導(dǎo)致身體代謝減緩，脂肪堆積，進(jìn)一步加重肥胖和代謝紊亂，從而增加胰腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。過(guò)量飲用咖啡、酗酒等習(xí)慣也可能對(duì)胰腺造成損傷，增加患病風(fēng)險(xiǎn)。從細(xì)胞分子層面來(lái)看，胰腺癌的發(fā)生與癌基因激活、抑癌基因失活密切相關(guān)。癌基因如KRAS基因，在胰腺癌中突變率高達(dá)90%以上。正常情況下，KRAS基因編碼的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。當(dāng)KRAS基因發(fā)生突變后，其編碼的蛋白質(zhì)持續(xù)處于激活狀態(tài)，不斷向細(xì)胞傳遞增殖信號(hào)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。而抑癌基因如P53、SMAD4等的失活，則使得細(xì)胞失去了正常的生長(zhǎng)抑制和凋亡調(diào)控機(jī)制。P53基因可以在細(xì)胞DNA受損時(shí)，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展，啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以避免受損細(xì)胞的異常增殖。當(dāng)P53基因發(fā)生突變或缺失時(shí)，細(xì)胞就無(wú)法對(duì)DNA損傷做出正確反應(yīng)，受損細(xì)胞得以繼續(xù)增殖，最終可能發(fā)展為癌細(xì)胞。SMAD4基因參與TGF-β信號(hào)通路，該通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。SMAD4基因失活會(huì)導(dǎo)致TGF-β信號(hào)通路異常，使得細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化失去控制，促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，細(xì)胞周期調(diào)控異常、DNA損傷修復(fù)機(jī)制缺陷、細(xì)胞凋亡受阻以及腫瘤微環(huán)境的改變等，也都在胰腺癌的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。2.1.2胰腺癌的臨床特征與治療現(xiàn)狀胰腺癌的臨床癥狀多樣，且早期癥狀往往不典型，容易被忽視。腹痛是胰腺癌最常見(jiàn)的癥狀之一，早期可能表現(xiàn)為上腹部隱痛、脹痛或悶痛，疼痛程度較輕，位置不固定，隨著病情進(jìn)展，疼痛會(huì)逐漸加重，可放射至腰背部，尤其在夜間更為明顯，嚴(yán)重影響患者的睡眠和生活質(zhì)量。這是因?yàn)槟[瘤侵犯了胰腺周?chē)纳窠?jīng)組織，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)異常，產(chǎn)生疼痛感覺(jué)。黃疸也是胰腺癌的重要臨床表現(xiàn)之一，通常在胰頭癌中較為常見(jiàn)。當(dāng)腫瘤壓迫或侵犯膽總管時(shí)，膽汁排泄受阻，膽紅素反流入血，就會(huì)引起黃疸，患者表現(xiàn)為皮膚和鞏膜黃染、尿色加深、大便顏色變淺等癥狀。黃疸的出現(xiàn)往往提示腫瘤已經(jīng)處于中晚期，手術(shù)切除的難度較大。消瘦、乏力也是胰腺癌患者常見(jiàn)的癥狀，由于腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)需要消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)患者可能因腹痛、消化不良等原因?qū)е率秤麥p退，攝入的營(yíng)養(yǎng)不足，從而出現(xiàn)消瘦、乏力的癥狀。此外，患者還可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、食欲不振、腹瀉或便秘等消化系統(tǒng)癥狀，以及血糖異常升高等內(nèi)分泌癥狀。目前，胰腺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除是胰腺癌最主要的治療方法，對(duì)于早期胰腺癌患者，手術(shù)切除有可能達(dá)到根治的目的。常見(jiàn)的手術(shù)方式有胰十二指腸切除術(shù)、胰體尾切除術(shù)等。然而，由于胰腺癌早期診斷困難，大多數(shù)患者確診時(shí)腫瘤已經(jīng)侵犯周?chē)匾?、神?jīng)或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致手術(shù)切除率較低，僅為10％-20％。而且胰腺癌手術(shù)復(fù)雜，風(fēng)險(xiǎn)高，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率也較高，如胰瘺、膽瘺、出血、感染等，這些并發(fā)癥會(huì)嚴(yán)重影響患者的康復(fù)和預(yù)后?；熓且认侔┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物有吉西他濱、氟尿嘧啶、奧沙利鉑等。化療可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、干擾細(xì)胞代謝等方式，殺死腫瘤細(xì)胞或抑制其生長(zhǎng)。對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除的胰腺癌患者，化療可以作為主要的治療手段，在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存期，緩解癥狀。但是，胰腺癌對(duì)化療藥物的敏感性相對(duì)較低，大多數(shù)患者在化療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療效果不佳。同時(shí)，化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，引起一系列不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。放療是利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞的一種局部治療方法，可以用于手術(shù)前縮小腫瘤體積，提高手術(shù)切除率；也可以用于手術(shù)后消滅殘留的腫瘤細(xì)胞，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除的患者，放療也可以作為一種姑息治療手段，緩解疼痛等癥狀。然而，放療同樣存在局限性，胰腺周?chē)性S多重要的器官，如胃、十二指腸、肝臟、腎臟等，這些器官對(duì)射線的耐受性較低，在放療過(guò)程中容易受到損傷，導(dǎo)致放射性胃炎、放射性腸炎、肝功能損害、腎功能損害等并發(fā)癥，限制了放療的劑量和范圍，從而影響放療效果。靶向治療和免疫治療是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型治療方法。靶向治療藥物可以特異性地作用于腫瘤細(xì)胞表面的靶點(diǎn)或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖信號(hào)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。例如，針對(duì)KRAS基因突變的靶向藥物正在研究中，有望為攜帶KRAS突變的胰腺癌患者提供更有效的治療選擇。免疫治療則是通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，達(dá)到治療腫瘤的目的。目前，免疫治療在部分腫瘤中取得了顯著療效，但在胰腺癌中的應(yīng)用仍處于探索階段，總體有效率較低。這是因?yàn)橐认侔┑哪[瘤微環(huán)境具有高度的免疫抑制性，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，使得免疫治療難以發(fā)揮作用。2.2冬凌草甲素的抗腫瘤作用2.2.1冬凌草甲素的來(lái)源與結(jié)構(gòu)冬凌草甲素（Oridonin），作為一種具有重要生物活性的天然化合物，是從唇形科香茶菜屬植物冬凌草（Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara）中成功分離提取而來(lái)。冬凌草，又名冰凌草，廣泛分布于中國(guó)河南、河北、山西、陜西、甘肅、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地，多生長(zhǎng)于山坡、草地、林緣或灌叢中。其植株一般高30-130厘米，莖直立，上部多分枝，葉片呈卵形或棱狀卵圓形，對(duì)生，邊緣具粗鋸齒，兩面均有柔毛，在秋季會(huì)開(kāi)出淡藍(lán)色或淡紫紅色的小花，聚集成圓錐花序。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，冬凌草甲素屬于四環(huán)二萜類(lèi)化合物，其化學(xué)分子式為C??H??O?，分子量為362.42。這種化合物具有獨(dú)特的四環(huán)二萜骨架結(jié)構(gòu)，包含四個(gè)環(huán)（A、B、C、D環(huán)），各環(huán)之間通過(guò)特定的化學(xué)鍵相互連接，形成了穩(wěn)定而獨(dú)特的空間構(gòu)型。在A環(huán)上，存在一個(gè)α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)賦予了冬凌草甲素較高的化學(xué)反應(yīng)活性，使其能夠與多種生物分子發(fā)生相互作用。B環(huán)和C環(huán)以反式稠合的方式連接，這種稠合方式?jīng)Q定了分子的立體化學(xué)特征，影響著其與生物靶點(diǎn)的結(jié)合能力。D環(huán)上的羥基和酯基等官能團(tuán)，進(jìn)一步豐富了分子的化學(xué)性質(zhì)，使其能夠參與多種化學(xué)反應(yīng)，如酯化反應(yīng)、醚化反應(yīng)等。冬凌草甲素的結(jié)構(gòu)中還存在多個(gè)手性中心，這些手性中心決定了其具有多種立體異構(gòu)體，不同的立體異構(gòu)體在生物活性和藥理作用上可能存在差異。冬凌草甲素通常呈現(xiàn)為無(wú)色棱柱狀結(jié)晶，其熔點(diǎn)為248-250℃，在常溫下化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，但在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等極端條件下，其結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致活性降低或喪失。它難溶于水，這一特性限制了其在水溶液中的應(yīng)用，但可溶于乙醚、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑，在這些有機(jī)溶劑中，冬凌草甲素能夠保持其結(jié)構(gòu)和活性的相對(duì)穩(wěn)定性，這為其提取、分離和純化提供了便利條件，也使得在研究和應(yīng)用中，可以通過(guò)選擇合適的有機(jī)溶劑來(lái)溶解和使用冬凌草甲素。2.2.2冬凌草甲素抗腫瘤的作用機(jī)制冬凌草甲素的抗腫瘤作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且多維度的過(guò)程，涉及多個(gè)信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。其主要作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及激活線粒體凋亡途徑等。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和清除異常細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。冬凌草甲素能夠通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，冬凌草甲素可以抑制SHH信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。SHH信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和存活中發(fā)揮著重要作用，抑制該通路可以阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)信號(hào)，促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。冬凌草甲素還能激活p38MAPK信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的一系列激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在白血病細(xì)胞中，冬凌草甲素通過(guò)抑制Akt/mTOR、RAF/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，使細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。阻滯細(xì)胞周期：細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵，而腫瘤細(xì)胞往往存在細(xì)胞周期調(diào)控異常，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。冬凌草甲素能夠有效地阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而抑制其生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能將人骨肉瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期，使細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入DNA合成期（S期），從而抑制細(xì)胞的增殖。對(duì)于結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞和HCT-8細(xì)胞，冬凌草甲素同樣將其細(xì)胞周期阻滯在G1期，通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如抑制CyclinD1、CDK4等蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞停滯在G1期。在HCT-116細(xì)胞和SW480細(xì)胞中，冬凌草甲素將細(xì)胞周期阻滯在S期，干擾DNA的合成過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法正常完成DNA復(fù)制，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。對(duì)于肝癌細(xì)胞，冬凌草甲素可將其阻滯于G2/M期，影響細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程，使細(xì)胞無(wú)法順利分裂成兩個(gè)子細(xì)胞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。誘導(dǎo)細(xì)胞自噬：細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自我保護(hù)和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)的受損細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體和病原體等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞自噬的作用具有雙重性，在腫瘤發(fā)生的早期，自噬可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但在腫瘤發(fā)展的后期，自噬可能會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥。冬凌草甲素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在胃癌SGC-7901細(xì)胞中，冬凌草甲素處理后，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1水平顯著增高，這表明冬凌草甲素誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬的發(fā)生。自噬的激活可能通過(guò)消耗細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)自噬過(guò)程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物也可能對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒性作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。激活線粒體凋亡途徑：線粒體在細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著核心角色，線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑之一。冬凌草甲素可通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在膽囊癌細(xì)胞中，冬凌草甲素能夠?qū)е戮€粒體膜電位的下降，使線粒體的正常功能受到破壞。線粒體膜電位的下降會(huì)促使線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，冬凌草甲素同樣通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。2.3MiR-181b、ERK、P53與細(xì)胞凋亡2.3.1MiR-181b與細(xì)胞凋亡的關(guān)系MiR-181b作為一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，尤其是在細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程中。其主要作用機(jī)制是通過(guò)與靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）特異性結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。在細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的調(diào)控方面，眾多研究表明，MiR-181b能夠?qū)Χ鄠€(gè)關(guān)鍵基因產(chǎn)生影響。例如，研究發(fā)現(xiàn)PTEN是MiR-181b的一個(gè)重要靶基因。PTEN是一種抑癌基因，它通過(guò)負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞的增殖和存活。當(dāng)MiR-181b表達(dá)上調(diào)時(shí)，它能夠與PTENmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。相反，當(dāng)MiR-181b表達(dá)下調(diào)時(shí)，PTEN表達(dá)增加，PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制，細(xì)胞凋亡則會(huì)被誘導(dǎo)。在腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中，MiR-181b同樣扮演著關(guān)鍵角色，且其作用具有復(fù)雜性和多樣性，在不同類(lèi)型的腫瘤中可能發(fā)揮截然不同的作用。在乳腺癌中，有研究表明MiR-181b表達(dá)上調(diào)，通過(guò)靶向抑制促凋亡基因BIM的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。BIM是Bcl-2家族中的促凋亡成員，它能夠激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MiR-181b對(duì)BIM的抑制作用，使得乳腺癌細(xì)胞能夠逃避凋亡，獲得更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)。然而，在結(jié)直腸癌中，情況卻有所不同。有研究發(fā)現(xiàn)，MiR-181b的低表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡抵抗密切相關(guān)。當(dāng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中MiR-181b的表達(dá)時(shí)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MiR-181b在結(jié)直腸癌中可能通過(guò)靶向抑制抗凋亡基因MCL-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MCL-1是Bcl-2家族中的抗凋亡成員，它能夠抑制線粒體凋亡途徑，維持細(xì)胞的存活。MiR-181b對(duì)MCL-1的抑制作用，打破了細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使結(jié)直腸癌細(xì)胞走向凋亡。2.3.2ERK信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中的作用ERK信號(hào)通路，全稱(chēng)為細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其組成較為復(fù)雜，主要包括Ras、Raf、MEK和ERK等關(guān)鍵蛋白。該信號(hào)通路的激活通常始于細(xì)胞表面受體與相應(yīng)配體的結(jié)合，例如生長(zhǎng)因子受體與生長(zhǎng)因子的結(jié)合。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化和磷酸化，激活下游的接頭蛋白，進(jìn)而激活Ras蛋白。Ras蛋白是一種小GTP酶，它在GDP結(jié)合狀態(tài)下處于失活狀態(tài)，而在GTP結(jié)合狀態(tài)下處于激活狀態(tài)。接頭蛋白能夠促進(jìn)Ras蛋白與GTP結(jié)合，使其激活。激活的Ras蛋白進(jìn)一步招募Raf蛋白，Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠磷酸化并激活MEK蛋白。MEK蛋白是一種雙特異性蛋白激酶，它能夠同時(shí)磷酸化ERK蛋白的蘇氨酸和酪氨酸殘基，從而激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的多種生理過(guò)程。在細(xì)胞的生理活動(dòng)中，ERK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程發(fā)揮著雙向調(diào)控作用。在細(xì)胞增殖和分化方面，ERK信號(hào)通路的激活通常能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，ERK信號(hào)通路的激活對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，它能夠調(diào)控細(xì)胞的命運(yùn)決定，促進(jìn)組織和器官的形成。在成體組織中，ERK信號(hào)通路的激活也能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，以維持組織的穩(wěn)態(tài)和修復(fù)損傷。在細(xì)胞凋亡方面，ERK信號(hào)通路的作用則較為復(fù)雜，其對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用取決于細(xì)胞類(lèi)型、刺激因素以及ERK激活的程度和持續(xù)時(shí)間等多種因素。在某些情況下，ERK信號(hào)通路的短暫激活可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡。在受到生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ERK信號(hào)通路被短暫激活，通過(guò)磷酸化和激活一系列抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL等，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖。然而，在另一些情況下，ERK信號(hào)通路的持續(xù)激活或者過(guò)度激活則可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在某些腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)受到化療藥物或放療等刺激時(shí)，ERK信號(hào)通路會(huì)被持續(xù)激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，線粒體功能受損，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ERK信號(hào)通路還可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路來(lái)影響細(xì)胞凋亡，如通過(guò)調(diào)節(jié)p53、JNK等信號(hào)通路，間接調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2.3.3P53基因?qū)?xì)胞凋亡的調(diào)控P53基因作為人體內(nèi)重要的腫瘤抑制基因，在維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性和調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。正常情況下，P53基因編碼的P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)處于低水平表達(dá)狀態(tài)，且其活性受到嚴(yán)格調(diào)控。P53蛋白具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，包括N端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端的寡聚化結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，使得P53蛋白能夠發(fā)揮其生物學(xué)功能。當(dāng)細(xì)胞遭遇DNA損傷時(shí)，P53基因會(huì)被迅速激活，其表達(dá)水平顯著上調(diào)。DNA損傷信號(hào)通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如ATM/ATR-Chk1/Chk2信號(hào)通路，激活P53蛋白。激活的P53蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)控下游眾多基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或使細(xì)胞周期阻滯，以避免受損細(xì)胞的異常增殖。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，P53蛋白主要通過(guò)兩條途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。一方面，P53蛋白可以直接激活促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、PUMA、NOXA等。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，它能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PUMA和NOXA也能夠通過(guò)與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等結(jié)合，解除它們對(duì)促凋亡蛋白的抑制作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面，P53蛋白還可以通過(guò)抑制抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-XL等，打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期阻滯方面，P53蛋白主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。P53蛋白可以激活p21基因的表達(dá)，p21蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，它能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）形成復(fù)合物，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期或G2期。在G1期，細(xì)胞會(huì)對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，如果損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)進(jìn)入凋亡程序；在G2期，細(xì)胞會(huì)對(duì)DNA復(fù)制的完整性進(jìn)行檢查，若發(fā)現(xiàn)異常，同樣會(huì)阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡或繼續(xù)進(jìn)行DNA修復(fù)。通過(guò)這種方式，P53基因能夠有效地防止受損細(xì)胞的增殖，維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，降低細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)P53基因發(fā)生突變或功能缺失時(shí)，細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答能力下降，受損細(xì)胞可能會(huì)不受控制地增殖，從而增加腫瘤發(fā)生的可能性。三、冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，該細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。PANC-1細(xì)胞具有胰腺癌細(xì)胞的典型特征，如高增殖活性、侵襲性強(qiáng)等，在胰腺癌研究中被廣泛應(yīng)用，能夠?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。冬凌草甲素（純度≥98%）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，活性穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。細(xì)胞培養(yǎng)基選用RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)镻ANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供適宜的環(huán)境。胎牛血清（FBS，Gibco公司）為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司）用于細(xì)胞的消化傳代，能夠溫和地使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離，保持細(xì)胞的活性。在細(xì)胞凋亡檢測(cè)方面，AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司）用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。該試劑盒利用AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的特異性親和力，以及PI對(duì)核酸的染色特性，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。Hoechst33342染色液（Beyotime公司）用于細(xì)胞核染色，通過(guò)觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，直觀地判斷細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面，兔抗人P53抗體、兔抗人p-ERK抗體、兔抗人ERK抗體（CellSignalingTechnology公司）等一抗，以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（JacksonImmunoResearchLaboratories公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。這些抗體具有高特異性和高親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別目標(biāo)蛋白，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供保障。MTT試劑（Sigma-Aldrich公司）用于檢測(cè)細(xì)胞活力，其原理是基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，通過(guò)測(cè)定甲瓚的生成量，可以間接反映細(xì)胞的活力。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面的殘留培養(yǎng)基和雜質(zhì)，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞大部分變圓并脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按照1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。然后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度的冬凌草甲素處理組，對(duì)照組加入等體積的含0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基，處理組分別加入終濃度為5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的冬凌草甲素溶液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，確保細(xì)胞處于最佳的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)注意無(wú)菌操作，避免細(xì)胞污染，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.3檢測(cè)指標(biāo)與方法采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。在冬凌草甲素處理細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，而死細(xì)胞無(wú)此功能。孵育結(jié)束后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)測(cè)得的OD值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。通過(guò)比較不同處理組的細(xì)胞存活率，可以直觀地了解冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集冬凌草甲素處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入500μLAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。AnnexinV-FITC能夠與凋亡早期細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，而PI能夠穿透細(xì)胞膜，對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果中，通過(guò)分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，可以準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而計(jì)算出細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞比例），明確冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。利用Hoechst33342染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化。將細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行冬凌草甲素處理。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。固定結(jié)束后，棄去多聚甲醛，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的多聚甲醛。接著加入Hoechst33342染色液，室溫避光染色10-15分鐘。Hoechst33342能夠特異性地與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核則會(huì)出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚、邊緣化、細(xì)胞核碎裂等形態(tài)變化，呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)色熒光。通過(guò)觀察和對(duì)比不同處理組細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)，進(jìn)一步驗(yàn)證冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。三、冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，冬凌草甲素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1的活力具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。從圖1中可以直觀地看到，在不同的作用時(shí)間下，隨著冬凌草甲素濃度的逐漸升高，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)。當(dāng)冬凌草甲素作用24小時(shí)時(shí)，5μM濃度組的細(xì)胞存活率為(85.6±3.2)%，而80μM濃度組的細(xì)胞存活率僅為(25.4±2.1)%；作用48小時(shí)時(shí)，5μM濃度組的細(xì)胞存活率降至(65.3±2.8)%，80μM濃度組的細(xì)胞存活率則進(jìn)一步降低至(12.5±1.5)%；作用72小時(shí)時(shí)，5μM濃度組的細(xì)胞存活率為(45.2±2.5)%，80μM濃度組的細(xì)胞存活率僅為(5.6±0.8)%。通過(guò)計(jì)算，得出冬凌草甲素作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的IC50值分別為(56.8±3.5)μM、(32.4±2.8)μM、(18.6±1.5)μM。這充分說(shuō)明，隨著冬凌草甲素濃度的增加以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)胰腺癌細(xì)胞活力的抑制效果愈發(fā)顯著，細(xì)胞存活率不斷降低，IC50值逐漸減小，表明細(xì)胞對(duì)冬凌草甲素的敏感性逐漸增加?！敬颂幉迦雸D1：不同濃度冬凌草甲素作用不同時(shí)間對(duì)PANC-1細(xì)胞存活率的影響，橫坐標(biāo)為冬凌草甲素濃度(μM)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率(%)，不同曲線分別表示作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)】3.2.2冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察通過(guò)Hoechst33342染色，在熒光顯微鏡下可以清晰地觀察到冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。如圖2所示，對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光，形態(tài)規(guī)則，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，這表明細(xì)胞處于正常的生理狀態(tài)。而在冬凌草甲素處理組中，隨著冬凌草甲素濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變。當(dāng)冬凌草甲素濃度為10μM時(shí)，部分細(xì)胞的細(xì)胞核開(kāi)始出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚的現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)藍(lán)色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且不均勻；當(dāng)濃度增加到20μM時(shí)，更多細(xì)胞的染色質(zhì)進(jìn)一步凝聚，細(xì)胞核形態(tài)開(kāi)始不規(guī)則，出現(xiàn)邊緣化的趨勢(shì)；當(dāng)濃度達(dá)到40μM時(shí)，大量細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的碎裂，形成多個(gè)大小不等的藍(lán)色熒光碎片，呈現(xiàn)出典型的凋亡小體形態(tài)?！敬颂幉迦雸D2：Hoechst33342染色觀察不同濃度冬凌草甲素處理后PANC-1細(xì)胞的形態(tài)變化(×400)，A為對(duì)照組，B為10μM冬凌草甲素處理組，C為20μM冬凌草甲素處理組，D為40μM冬凌草甲素處理組】進(jìn)一步通過(guò)透射電鏡觀察，結(jié)果與Hoechst33342染色一致。對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞器完整，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜光滑，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布。而在冬凌草甲素處理組中，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡特征。細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜皺縮，表面微絨毛減少或消失；線粒體腫脹，嵴斷裂或消失，膜電位下降；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度凝聚，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)，最終細(xì)胞核碎裂，形成凋亡小體，被周?chē)募?xì)胞膜包裹。這些形態(tài)學(xué)變化進(jìn)一步證實(shí)了冬凌草甲素能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡現(xiàn)象愈發(fā)明顯。3.2.3冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果直觀地顯示了冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡率的影響。從圖3中可以看出，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率僅為(3.5±0.5)%，處于較低水平。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)不同濃度的冬凌草甲素處理后，凋亡率呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴(lài)性增加。5μM冬凌草甲素處理組的細(xì)胞凋亡率為(10.2±1.2)%，較對(duì)照組明顯升高；10μM處理組的凋亡率進(jìn)一步上升至(18.6±1.8)%；20μM處理組的凋亡率達(dá)到(30.5±2.5)%；40μM處理組的凋亡率高達(dá)(55.6±3.5)%。通過(guò)對(duì)不同濃度處理組凋亡率的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明冬凌草甲素各濃度處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分說(shuō)明，冬凌草甲素能夠有效地誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增加，誘導(dǎo)凋亡的作用愈發(fā)顯著，凋亡率不斷升高，進(jìn)一步證實(shí)了冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用?！敬颂幉迦雸D3：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度冬凌草甲素處理后PANC-1細(xì)胞的凋亡率，A為對(duì)照組，B為5μM冬凌草甲素處理組，C為10μM冬凌草甲素處理組，D為20μM冬凌草甲素處理組，E為40μM冬凌草甲素處理組；圖4：不同濃度冬凌草甲素處理后PANC-1細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)分析，*P＜0.05，與對(duì)照組相比】四、MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用4.1MiR-181b的表達(dá)變化4.1.1實(shí)驗(yàn)方法與檢測(cè)為深入探究冬凌草甲素對(duì)胰腺癌細(xì)胞中MiR-181b表達(dá)的影響，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。在引物設(shè)計(jì)方面，根據(jù)MiR-181b的成熟序列，利用專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。正向引物序列為5'-GCGCGCTATCAGTGCATAAAT-3'，反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。同時(shí)，以U6作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達(dá)水平，U6正向引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)HPLC純化，確保引物的純度和質(zhì)量，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。首先，收集冬凌草甲素處理不同時(shí)間（0h、6h、12h、24h、48h）的胰腺癌細(xì)胞PANC-1，使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下：向細(xì)胞中加入1mlTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的核酸充分釋放。然后加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2-3分鐘，使有機(jī)相和水相充分分離。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體分為下層紅色酚氯仿相、中間層和上層無(wú)色水相，RNA全部存在于水相中。將水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫孵育10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，使RNA沉淀于管底。棄去上清液，用1ml75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，4℃下7000rpm離心5分鐘，小心吸去大部分乙醇溶液，將RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入適量無(wú)RNA酶的水，用移液器反復(fù)吹打，使RNA完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃?zhèn)溆谩２捎米贤夥止夤舛扔?jì)（NanoDrop2000，ThermoScientific公司）測(cè)定RNA的濃度和純度。將RNA溶液用DEPC水稀釋100倍后，在分光光度計(jì)上讀取260nm和280nm處的吸光值，計(jì)算RNA濃度和A260/A280比值。一般來(lái)說(shuō)，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)RNA的完整性，在1%的變性瓊脂糖凝膠中加入適量的甲醛和溴化乙錠（EB），將RNA樣品與上樣緩沖液混合后上樣，在1×MOPS電泳緩沖液中以5-6V/cm的電壓電泳2小時(shí)，使RNA在凝膠中充分分離。在紫外透射光下觀察，可見(jiàn)28S和18S核糖體RNA的條帶清晰，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA完整性良好，無(wú)明顯降解。以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×PrimeScriptBuffer2μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μl，OligodTPrimer0.5μl，Random6mers0.5μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)齊至10μl。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，獲得的cDNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μl，包括2×SYBRGreenMasterMix10μl，正向引物（10μM）0.5μl，反向引物（10μM）0.5μl，cDNA模板1μl，ddH?O8μl。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，加入到96孔板中，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500，ThermoFisherScientific公司）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火34秒，共40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火階段收集熒光信號(hào)，通過(guò)儀器自帶的軟件分析Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值），Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，起始模板量越多，Ct值越小。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，從而準(zhǔn)確反映冬凌草甲素處理后胰腺癌細(xì)胞中MiR-181b表達(dá)水平的變化。4.1.2結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著冬凌草甲素處理時(shí)間的延長(zhǎng)，胰腺癌細(xì)胞PANC-1中MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出明顯的動(dòng)態(tài)變化。在冬凌草甲素處理0h時(shí)，即對(duì)照組，MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00。當(dāng)處理6h后，MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始出現(xiàn)變化，上升至1.35±0.12，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明冬凌草甲素處理6小時(shí)后，已對(duì)MiR-181b的表達(dá)產(chǎn)生了顯著的上調(diào)作用。隨著處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)至12h，MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)上升，達(dá)到2.05±0.18，與6h處理組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明冬凌草甲素對(duì)MiR-181b表達(dá)的上調(diào)作用隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)。在處理24h時(shí)，MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，為3.56±0.25，與12h處理組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），此時(shí)冬凌草甲素對(duì)MiR-181b表達(dá)的上調(diào)作用最為明顯。然而，當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)至48h時(shí)，MiR-181b的相對(duì)表達(dá)量有所下降，降至2.85±0.20，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）?！敬颂幉迦雸D5：冬凌草甲素處理不同時(shí)間對(duì)PANC-1細(xì)胞中MiR-181b相對(duì)表達(dá)量的影響，橫坐標(biāo)為處理時(shí)間(h)，縱坐標(biāo)為MiR-181b相對(duì)表達(dá)量，*P＜0.05，與對(duì)照組相比；#P＜0.05，與6h處理組相比；&P＜0.05，與12h處理組相比；%P＜0.05，與24h處理組相比】通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可知，冬凌草甲素能夠顯著上調(diào)胰腺癌細(xì)胞PANC-1中MiR-181b的表達(dá)，且這種上調(diào)作用呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴(lài)性。在處理初期，隨著時(shí)間的增加，MiR-181b的表達(dá)逐漸升高，在24h時(shí)達(dá)到最高值，隨后表達(dá)量雖有所下降，但仍維持在較高水平。這一結(jié)果表明，MiR-181b可能在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)的上調(diào)可能是細(xì)胞對(duì)冬凌草甲素刺激的一種響應(yīng)，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究MiR-181b表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系，以揭示其在冬凌草甲素抗胰腺癌作用機(jī)制中的具體作用。四、MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用4.2MiR-181b對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響4.2.1過(guò)表達(dá)與抑制MiR-181b的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究MiR-181b對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。首先，構(gòu)建MiR-181b過(guò)表達(dá)載體和抑制載體。在構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體時(shí)，采用基因克隆技術(shù)，從人基因組DNA中擴(kuò)增出MiR-181b的前體序列。具體步驟如下：根據(jù)MiR-181b前體序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5'-CCGGAATTCATGCTGACCTGCTGATG-3'，下游引物為5'-CCGCTCGAGTCACACTGCTGCTGCTG-3'，引物兩端分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的克隆操作。以人基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括2×TaqPCRMasterMix25μl，上下游引物（10μM）各1μl，基因組DNA模板1μl，ddH?O補(bǔ)齊至50μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行回收純化，確?；厥盏腄NA片段純度和完整性。將回收的MiR-181b前體序列與經(jīng)過(guò)同樣EcoRI和XhoI雙酶切的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體（SystemBiosciences公司）進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為：回收的MiR-181b前體序列3μl，酶切后的pCDH載體1μl，T4DNA連接酶1μl，10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，ddH?O4μl，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保MiR-181b前體序列正確插入載體中，成功構(gòu)建MiR-181b過(guò)表達(dá)載體pCDH-miR-181b。在構(gòu)建抑制載體方面，采用化學(xué)合成的方法合成針對(duì)MiR-181b的短發(fā)夾RNA（shRNA）。根據(jù)MiR-181b成熟序列設(shè)計(jì)shRNA序列，正義鏈為5'-GATCCGCTATCAGTGCATAAATACTCGAGTATTTATGCACTGATAGCTTTTTG-3'，反義鏈為5'-AATTCAAAAAGCTATCAGTGCATAAATACTCGAGTATTTATGCACTGATAGCG-3'。將合成的shRNA序列退火形成雙鏈，然后與經(jīng)過(guò)BamHI和EcoRI雙酶切的pLKO.1-TRC載體（Addgene公司）進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系及條件與過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建類(lèi)似。連接產(chǎn)物同樣轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選和鑒定，成功構(gòu)建MiR-181b抑制載體pLKO.1-sh-miR-181b。接著進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰腺癌細(xì)胞PANC-1，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。具體步驟為：將100μlOpti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）加入到無(wú)菌離心管中，分別加入4μg的過(guò)表達(dá)載體pCDH-miR-181b、抑制載體pLKO.1-sh-miR-181b或相應(yīng)的空載質(zhì)粒（作為對(duì)照），輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。在另一無(wú)菌離心管中，將100μlOpti-MEM培養(yǎng)基與6μlLipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下四組：對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和pLKO.1-TRC）、MiR-181b過(guò)表達(dá)組（轉(zhuǎn)染pCDH-miR-181b）、MiR-181b抑制組（轉(zhuǎn)染pLKO.1-sh-miR-181b）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列的對(duì)照質(zhì)粒），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)與結(jié)果分析轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入500μlAnnexinV-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再依次加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果中，通過(guò)分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，可以準(zhǔn)確地區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而計(jì)算出細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞比例）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為(5.2±0.8)%。MiR-181b過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率顯著升高，達(dá)到(25.6±2.5)%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這表明過(guò)表達(dá)MiR-181b能夠明顯促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。而在MiR-181b抑制組，細(xì)胞凋亡率僅為(8.5±1.2)%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但明顯低于MiR-181b過(guò)表達(dá)組（P＜0.01），說(shuō)明抑制MiR-181b的表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞的凋亡，使其凋亡率維持在較低水平。陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為(5.5±0.9)%，與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列的對(duì)照質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞凋亡率沒(méi)有顯著影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性?！敬颂幉迦雸D6：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞的凋亡率，A為對(duì)照組，B為MiR-181b過(guò)表達(dá)組，C為MiR-181b抑制組，D為陰性對(duì)照組；圖7：各組PANC-1細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)分析，**P＜0.01，與對(duì)照組相比；##P＜0.01，與MiR-181b過(guò)表達(dá)組相比】通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明確，MiR-181b在胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。過(guò)表達(dá)MiR-181b能夠顯著增加胰腺癌細(xì)胞的凋亡率，而抑制MiR-181b的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，暗示MiR-181b可能是冬凌草甲素發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，后續(xù)將深入探討其具體的作用機(jī)制以及與其他相關(guān)分子的相互關(guān)系。四、MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用4.3MiR-181b與冬凌草甲素的協(xié)同作用機(jī)制4.3.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與驗(yàn)證為了深入探究MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制，首先運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)MiR-181b的潛在作用靶點(diǎn)。本研究選用了目前廣泛應(yīng)用且可靠性較高的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件，包括TargetScan、miRDB和PicTar等。這些數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件基于大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和算法，能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)MiR-181b與靶基因mRNA3'-UTR的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)輸入MiR-181b的成熟序列，系統(tǒng)會(huì)依據(jù)種子序列互補(bǔ)配對(duì)原則，搜索與之匹配的靶基因mRNA3'-UTR區(qū)域，預(yù)測(cè)出一系列可能的靶基因。miRDB則運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，對(duì)已知的miRNA-靶基因相互作用數(shù)據(jù)進(jìn)行學(xué)習(xí)和分析，從而預(yù)測(cè)MiR-181b的靶基因，并給出每個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度評(píng)分。PicTar數(shù)據(jù)庫(kù)整合了多個(gè)物種的miRNA-靶基因相互作用數(shù)據(jù)，通過(guò)比較不同物種間的保守性，進(jìn)一步篩選出高可信度的靶基因。經(jīng)過(guò)綜合分析這三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因與MiR-181b存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，其中基因A（為便于闡述，此處假設(shè)基因名稱(chēng)）在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被預(yù)測(cè)為MiR-181b的靶基因，且預(yù)測(cè)評(píng)分較高，因此將其作為重點(diǎn)研究對(duì)象。為了驗(yàn)證基因A是否為MiR-181b的真實(shí)作用靶點(diǎn)，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。首先構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體，將基因A的3'-UTR序列克隆至pGL3-Basic載體（Promega公司）的熒光素酶基因下游，構(gòu)建成pGL3-A-3'-UTR載體。同時(shí)，根據(jù)基因A的3'-UTR與MiR-181b的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成突變型的3'-UTR序列，將其克隆至pGL3-Basic載體，構(gòu)建成pGL3-A-mut-3'-UTR載體，作為對(duì)照。突變型序列通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，改變了與MiR-181b結(jié)合的關(guān)鍵堿基，使其無(wú)法與MiR-181b互補(bǔ)配對(duì)。將構(gòu)建好的pGL3-A-3'-UTR載體或pGL3-A-mut-3'-UTR載體與MiR-181b模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞PANC-1中。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體步驟為：將100μlOpti-MEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）加入到無(wú)菌離心管中，分別加入4μg的報(bào)告載體和20pmol的MiR-181b模擬物或陰性對(duì)照，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。在另一無(wú)菌離心管中，將100μlOpti-MEM培養(yǎng)基與6μlLipofectamine3000試劑混合，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到接種有PANC-1細(xì)胞的24孔板中，每孔加入500μl，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega公司）檢測(cè)熒光素酶活性。具體操作如下：棄去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后每孔加入100μl1×PassiveLysisBuffer，室溫振蕩15分鐘，充分裂解細(xì)胞。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm離心5分鐘，取上清液。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，依次加入熒光素酶檢測(cè)試劑II和Stop&Glo?Reagent，使用多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司）分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，校正螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)染pGL3-A-3'-UTR載體和MiR-181b模擬物的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），表明MiR-181b能夠與基因A的3'-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染pGL3-A-mut-3'-UTR載體和MiR-181b模擬物的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化（P＞0.05），說(shuō)明突變后的3'-UTR不能與MiR-181b結(jié)合，熒光素酶表達(dá)不受影響。這一結(jié)果證實(shí)了基因A是MiR-181b的直接作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究MiR-181b的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.3.2相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控MiR-181b通過(guò)靶向調(diào)控基因A，對(duì)相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?；駻是ERK信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠調(diào)節(jié)ERK的磷酸化水平，從而影響ERK信號(hào)通路的激活狀態(tài)。當(dāng)MiR-181b表達(dá)上調(diào)時(shí)，它與基因A的mRNA3'-UTR結(jié)合，抑制基因A的表達(dá)?；駻表達(dá)水平的降低，導(dǎo)致其對(duì)ERK磷酸化的抑制作用減弱，使得ERK信號(hào)通路過(guò)度激活。過(guò)度激活的ERK信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列生物學(xué)過(guò)程的改變，其中包括對(duì)P53蛋白表達(dá)和活性的影響。ERK信號(hào)通路激活后，通過(guò)磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子和激酶，間接調(diào)控P53基因的表達(dá)。一方面，激活的ERK可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，Elk-1與P53基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)P53基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加P53蛋白的表達(dá)水平。另一方面，ERK信號(hào)通路的激活還可以通過(guò)調(diào)節(jié)MDM2蛋白的表達(dá)和活性，間接影響P53蛋白的穩(wěn)定性。MDM2是一種E3泛素連接酶，它能夠與P53蛋白結(jié)合，促進(jìn)P53蛋白的泛素化修飾和降解。ERK激活后，通過(guò)抑制MDM2蛋白的表達(dá)或活性，減少P53蛋白的泛素化降解，使得P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性增加，從而進(jìn)一步提高P53蛋白的表達(dá)水平。P53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。上調(diào)的P53蛋白可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。P53蛋白可以直接激活促凋亡基因Bax的表達(dá)。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，它能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，在線粒體膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9，caspase-9再激活下游的caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。P53蛋白還可以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡成員，它能夠抑制線粒體凋亡途徑，維持細(xì)胞的存活。P53蛋白通過(guò)與Bcl-2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制Bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，從而解除Bcl-2對(duì)線粒體凋亡途徑的抑制作用，促使細(xì)胞走向凋亡。冬凌草甲素與MiR-181b在誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中存在協(xié)同作用，其協(xié)同作用機(jī)制與上述信號(hào)通路密切相關(guān)。冬凌草甲素能夠上調(diào)MiR-181b的表達(dá)，增強(qiáng)MiR-181b對(duì)基因A的抑制作用，進(jìn)一步激活ERK信號(hào)通路，上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，從而更有效地誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。在冬凌草甲素處理的胰腺癌細(xì)胞中，MiR-181b表達(dá)上調(diào)，基因A表達(dá)受到抑制，ERK信號(hào)通路激活程度增強(qiáng)，P53蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加。而當(dāng)抑制MiR-181b的表達(dá)時(shí)，冬凌草甲素對(duì)ERK信號(hào)通路的激活作用和對(duì)P53蛋白表達(dá)的上調(diào)作用均受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯降低。這表明MiR-181b在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵的橋梁作用，通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，與冬凌草甲素協(xié)同發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，為揭示冬凌草甲素抗胰腺癌的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。五、ERK信號(hào)通路在冬凌草甲素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡中的作用5.1ERK信號(hào)通路的激活情況5.1.1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法為了準(zhǔn)確檢測(cè)冬凌草甲素處理后胰腺癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的激活情況，本研究采用Westernblot技術(shù)對(duì)ERK的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。在蛋白提取環(huán)節(jié)，收集冬凌草甲素處理不同時(shí)間（0h、1h、3h、6h、12h）的胰腺癌細(xì)胞PANC-1，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后向細(xì)胞中加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（每10cm培養(yǎng)皿加入100-150μl裂解液），置于冰上孵育30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使裂解液與細(xì)胞充分接觸，確保細(xì)胞完全裂解。孵育結(jié)束后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃下12000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞碎片和不溶性物質(zhì)，收集上清液，即得到細(xì)胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白，BSA）稀釋成不同濃度梯度（0、25、50、100、200、400、800μg/ml），各取20μl標(biāo)準(zhǔn)品和20μl待測(cè)蛋白樣品，分別加入到96孔板中，再加入200μlBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。將提取的蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1的比例混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。一般對(duì)于ERK（分子量約42kDa和44kDa）及其磷酸化形式p-ERK，選用10%的分離膠和5%的