HLA-G表達(dá)與胃癌關(guān)聯(lián)研究：外周血及癌組織視角一、引言1.1研究背景胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率均位居前列。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，在所有惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)中排第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。在中國，胃癌的形勢更為嚴(yán)峻，新發(fā)病例和死亡病例分別占全球的43.9%和48.6%，發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第二位，死亡率位列第三，是發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在胃癌治療方面取得了一定進(jìn)展，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段的綜合應(yīng)用，但胃癌患者的總體治愈率仍然不理想。早期胃癌患者通過根治性手術(shù)切除，5年生存率可達(dá)90%以上；然而，由于胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期或晚期，此時(shí)即使接受綜合治療，5年生存率也往往低于30%。例如，對于晚期轉(zhuǎn)移性胃癌，傳統(tǒng)化療方案雖能在一定程度上控制腫瘤生長，但中位總生存期通常僅為1年左右。目前胃癌治療面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，胃癌具有高度的異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為、對治療的反應(yīng)及預(yù)后差異顯著，這使得精準(zhǔn)治療難以實(shí)施。例如，部分患者對化療藥物原發(fā)耐藥，導(dǎo)致治療無效，病情迅速進(jìn)展。另一方面，現(xiàn)有治療手段存在明顯局限性。手術(shù)治療對于晚期胃癌患者效果有限，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高；化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對正常組織細(xì)胞也產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用，影響患者生活質(zhì)量和后續(xù)治療；靶向治療和免疫治療雖為部分患者帶來希望，但僅部分特定分子亞型患者能從中獲益，且存在耐藥和免疫逃逸等問題。鑒于此，尋找新的治療手段和有效的預(yù)后因子迫在眉睫。深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，挖掘潛在的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，有助于開發(fā)更精準(zhǔn)、有效的治療策略，提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2HLA-G概述人類白細(xì)胞抗原G（HLA-G）作為非經(jīng)典的人類白細(xì)胞抗原，屬于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ類分子，定位于6號染色體短臂6p21.3區(qū)域。與經(jīng)典的HLAⅠ類分子相比，HLA-G具有獨(dú)特的特征，其多態(tài)性水平較低，在體內(nèi)的分布也較為局限，主要表達(dá)于胎盤組織、男性生殖細(xì)胞、移植組織、腫瘤組織及感染組織等特定組織。例如，在母胎界面的絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層，HLA-G高度表達(dá)，對維持母胎免疫耐受發(fā)揮關(guān)鍵作用，使胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的攻擊。HLA-G的基因全長約3.7kbp，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。通過mRNA的交替剪接，可形成7種不同的剪接異構(gòu)體，其中包括4種膜結(jié)合型分子（HLA-G1、G2、G3、G4）和3種可溶性分子（HLA-G5、G6、G7）。這些異構(gòu)體在結(jié)構(gòu)和功能上存在一定差異，它們在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不同作用。如膜結(jié)合型的HLA-G1能夠直接與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞的活性；可溶性的HLA-G5則可通過血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處的免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)全身的免疫反應(yīng)。HLA-G在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體維持免疫平衡的關(guān)鍵分子。它可通過多種機(jī)制參與免疫耐受的形成和調(diào)節(jié)。一方面，HLA-G能與多種免疫細(xì)胞表面的抑制性受體結(jié)合，如免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄體2（ILT2/CD85j/LILRB1）、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄體4（ILT4/CD58d/LILRB2）及殺傷細(xì)胞抑制性受體KIR2DL4/CD158d等，直接抑制免疫活性細(xì)胞的生物學(xué)功能。當(dāng)HLA-G與NK細(xì)胞表面的KIR2DL4結(jié)合后，可激活NK細(xì)胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），傳導(dǎo)抑制信號，從而抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，使其無法對表達(dá)HLA-G的靶細(xì)胞進(jìn)行攻擊。另一方面，HLA-G還可通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生，間接抑制免疫反應(yīng)。Treg細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，抑制其他免疫細(xì)胞的活化和增殖，進(jìn)而維持免疫耐受狀態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中，HLA-G的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。眾多研究表明，在多種腫瘤中都檢測到HLA-G的異常高表達(dá)，如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。HLA-G在腫瘤中的高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的重要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)HLA-G，抑制NK細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，使腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊，得以持續(xù)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在黑色素瘤中，腫瘤細(xì)胞表面的HLA-G可與NK細(xì)胞表面的抑制性受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)不斷生長和擴(kuò)散；HLA-G還能誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的樹突狀細(xì)胞分化為耐受型樹突狀細(xì)胞，降低其抗原呈遞能力，無法有效激活T細(xì)胞，從而削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究HLA-G在胃癌患者外周血及癌組織中的表達(dá)情況，通過系統(tǒng)分析其表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)，明確HLA-G在胃癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的具體作用機(jī)制，為胃癌的臨床診療提供新的理論依據(jù)與潛在靶點(diǎn)。從診斷角度來看，當(dāng)前胃癌早期診斷手段仍存在局限性，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期。若能將HLA-G確立為一種新型的胃癌診斷標(biāo)志物，可顯著提高早期診斷的準(zhǔn)確性，有助于實(shí)現(xiàn)胃癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，為患者爭取更多的治療時(shí)機(jī)。在治療方面，胃癌的治療手段雖不斷發(fā)展，但療效仍不盡人意，部分原因是缺乏精準(zhǔn)有效的治療靶點(diǎn)。明確HLA-G在胃癌免疫逃逸中的作用機(jī)制，可為開發(fā)針對HLA-G的免疫治療策略提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有望打破腫瘤免疫逃逸的困境，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷能力，為胃癌患者帶來更有效的治療方案，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。對于預(yù)后評估，準(zhǔn)確預(yù)測胃癌患者的預(yù)后對于制定個(gè)性化治療方案至關(guān)重要。HLA-G表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，幫助臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的病情發(fā)展和預(yù)后情況，從而為患者制定更為合理、精準(zhǔn)的治療和隨訪計(jì)劃。二、材料與方法2.1研究對象選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]就診并經(jīng)病理確診的胃癌患者[X]例作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡18-75歲；患者簽署知情同意書；臨床資料完整，包括詳細(xì)的病史、病理診斷報(bào)告、影像學(xué)檢查結(jié)果等；術(shù)前未接受過放療、化療、免疫治療及其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)為：合并其他惡性腫瘤；存在嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；患有自身免疫性疾病、感染性疾病或其他影響免疫功能的疾病；妊娠或哺乳期女性。同時(shí)，選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的[X]名健康志愿者作為正常對照組。正常對照組的入選標(biāo)準(zhǔn)為：年齡、性別與胃癌患者組相匹配；無惡性腫瘤病史；無消化系統(tǒng)疾病史；體檢結(jié)果顯示各項(xiàng)指標(biāo)均正常，包括血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)志物等。樣本量的確定依據(jù)以往相關(guān)研究及統(tǒng)計(jì)學(xué)公式進(jìn)行估算。參考同類研究中HLA-G表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，結(jié)合本研究的設(shè)計(jì)和預(yù)期的效應(yīng)大小，使用樣本量估算軟件（如G*Power3.1）進(jìn)行計(jì)算。設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，檢驗(yàn)效能1-β=0.80，通過公式估算得出每組至少需要[X]例樣本，以確保能夠檢測出有意義的差異，從而為研究結(jié)果的可靠性提供保障。2.2實(shí)驗(yàn)材料主要儀器設(shè)備如下：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）儀，型號為[具體型號]，購自[生產(chǎn)廠家]，用于檢測基因表達(dá)水平，其具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠精確測量樣本中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)；酶標(biāo)儀，型號為[具體型號]，由[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中吸光度的測定，可快速、準(zhǔn)確地讀取樣本的光學(xué)信號，從而定量分析樣本中的抗原或抗體含量；流式細(xì)胞儀，型號為[具體型號]，[生產(chǎn)廠家]出品，用于檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原表達(dá)，能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，精確區(qū)分不同細(xì)胞亞群，并定量檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)水平；石蠟切片機(jī)，型號為[具體型號]，購自[生產(chǎn)廠家]，用于制備組織石蠟切片，可將組織切成厚度均勻的薄片，滿足后續(xù)病理檢測和免疫組化分析的需求；恒溫培養(yǎng)箱，型號為[具體型號]，由[生產(chǎn)廠家]制造，為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)反應(yīng)提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境，確保細(xì)胞生長和實(shí)驗(yàn)反應(yīng)在適宜的條件下進(jìn)行；高速離心機(jī)，型號為[具體型號]，[生產(chǎn)廠家]生產(chǎn)，用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器和核酸等生物大分子，通過高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同密度的物質(zhì)分層，實(shí)現(xiàn)分離和純化的目的。主要試劑和耗材包括：人白細(xì)胞抗原G（HLA-G）ELISA檢測試劑盒，購自[品牌名稱]，用于定量檢測外周血中HLA-G的含量，該試劑盒采用雙抗體夾心法，具有高特異性和靈敏度，能準(zhǔn)確檢測樣本中的HLA-G蛋白；HLA-G引物，由[公司名稱]合成，用于RT-qPCR擴(kuò)增HLA-G基因，引物的設(shè)計(jì)經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，確保其特異性和擴(kuò)增效率，能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段；鼠抗人HLA-G單克隆抗體，購自[品牌名稱]，用于免疫組化檢測癌組織中HLA-G的表達(dá)，該抗體具有高親和力和特異性，能夠與HLA-G蛋白特異性結(jié)合，通過免疫組化技術(shù)可直觀地觀察HLA-G在組織中的定位和表達(dá)情況；即用型免疫組化試劑盒，購自[品牌名稱]，包含免疫組化實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑，如二抗、顯色劑等，簡化了實(shí)驗(yàn)操作流程，提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性；RNA提取試劑盒，購自[品牌名稱]，用于提取組織和細(xì)胞中的總RNA，該試劑盒采用先進(jìn)的裂解和純化技術(shù)，能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的RNA，滿足后續(xù)RT-qPCR和其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自[品牌名稱]，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為RT-qPCR提供模板，該試劑盒具有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶和優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠確保逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行，獲得高質(zhì)量的cDNA；PCR反應(yīng)試劑，包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液等，購自[品牌名稱]，為RT-qPCR反應(yīng)提供必要的原料和酶，保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和特異性；流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體，包括熒光素標(biāo)記的抗HLA-G抗體及同型對照抗體，購自[品牌名稱]，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面HLA-G的表達(dá)，熒光素標(biāo)記的抗體能夠與細(xì)胞表面的HLA-G結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測熒光信號，實(shí)現(xiàn)對HLA-G表達(dá)的定量分析；一次性耗材，如離心管、移液器吸頭、96孔板等，均購自[品牌名稱]，采用高質(zhì)量的塑料材質(zhì)，確保實(shí)驗(yàn)過程中的無菌操作和樣本的準(zhǔn)確性，避免交叉污染。所有實(shí)驗(yàn)材料均從正規(guī)渠道購買，確保其質(zhì)量和來源可靠。試劑在使用前仔細(xì)檢查其外觀、保質(zhì)期等，如發(fā)現(xiàn)試劑有渾濁、沉淀、變色或過期等情況，均棄用。儀器設(shè)備在使用前進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能正常，符合實(shí)驗(yàn)要求。例如，RT-qPCR儀在每次使用前進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，確保擴(kuò)增反應(yīng)在準(zhǔn)確的溫度條件下進(jìn)行；酶標(biāo)儀定期進(jìn)行波長校準(zhǔn)和吸光度準(zhǔn)確性檢測，保證檢測結(jié)果的可靠性。通過嚴(yán)格的質(zhì)量控制，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供有力保障。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)水平使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集胃癌患者和健康對照組清晨空腹外周靜脈血5ml，采集后應(yīng)盡快進(jìn)行處理，若不能及時(shí)處理，需將樣本置于4℃保存，但最長不超過6小時(shí)。采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），具體步驟為：將抗凝血與等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）混合均勻，緩慢加入到裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，形成清晰的界面；以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，此時(shí)血液會分層，PBMCs位于淋巴細(xì)胞分離液與血漿的界面層；小心吸取該界面層的細(xì)胞至新的離心管中，加入適量PBS，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的淋巴細(xì)胞分離液。用PBS將分離得到的PBMCs重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10^6/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管中，分別加入20μl熒光素標(biāo)記的抗HLA-G抗體及同型對照抗體，輕輕混勻，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，加入1mlPBS，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，洗滌細(xì)胞2次，去除未結(jié)合的抗體。最后，將細(xì)胞重懸于500μlPBS中，上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀（如BDFACSCalibur）進(jìn)行檢測，檢測前需對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保儀器性能正常。設(shè)置合適的檢測參數(shù)，如前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）及熒光通道等。獲取至少10000個(gè)細(xì)胞的信號，采用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過分析熒光信號強(qiáng)度，計(jì)算出HLA-G陽性細(xì)胞的百分比及平均熒光強(qiáng)度，以此反映外周血單個(gè)核細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)水平。2.3.2免疫組化法檢測癌組織和正常胃黏膜組織中HLA-G的表達(dá)水平手術(shù)切除的胃癌組織及相應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本，應(yīng)立即置于10%中性福爾馬林中固定，固定時(shí)間為12-24小時(shí)，以確保組織充分固定。固定后的組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片置于60℃烤箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片牢固附著于載玻片上。然后進(jìn)行脫蠟和水化處理，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，去除石蠟；再將切片依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡5分鐘，進(jìn)行水化。采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，在微波爐中加熱至沸騰后，保持低火加熱10-15分鐘，使抗原充分暴露。修復(fù)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，用PBS洗滌切片3次，每次5分鐘。滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS洗滌3次，每次5分鐘后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加鼠抗人HLA-G單克隆抗體（按1:100稀釋），4℃孵育過夜。次日，取出切片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。PBS洗滌3次，每次5分鐘后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。再次用PBS洗滌3次，每次5分鐘后，加入新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水返藍(lán)。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片。采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評估。根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞百分比評分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分；10%-50%為2分；51%-80%為3分；＞80%為4分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。將兩者得分相乘，0分為陰性，1-4分為弱陽性，5-8分為中度陽性，9-12分為強(qiáng)陽性。2.3.3ELISA法檢測血漿中可溶性HLA-G（sHLA-G）的表達(dá)水平采集胃癌患者和健康對照組清晨空腹外周靜脈血5ml，置于不含抗凝劑的采血管中，室溫靜置30-60分鐘，待血液自然凝固后，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離上層血漿至新的離心管中。若不能立即檢測，將血漿分裝后置于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。從冰箱中取出人白細(xì)胞抗原G（HLA-G）ELISA檢測試劑盒，平衡至室溫。按照試劑盒說明書要求，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，如將濃度為36U/ml的標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋為18U/ml、9U/ml、4.5U/ml、2.25U/ml、1.125U/ml、0.5625U/ml。取96孔酶標(biāo)板，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，空白孔加入50μl樣品稀釋液，樣品孔加入50μl待測血漿。然后，每孔加入50μl生物素標(biāo)記的抗HLA-G抗體，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡30秒，拍干。每孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，輕輕振蕩混勻，封板后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。再次洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡30秒，拍干。每孔加入底物A、B各50μl，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育10-15分鐘，此時(shí)溶液會逐漸顯色。當(dāng)顯色達(dá)到合適程度時(shí)，每孔加入50μl終止液，終止反應(yīng)，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。在15分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用四參數(shù)擬合曲線方程，將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算出樣品中sHLA-G的濃度。2.4數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）；若理論頻數(shù)小于5，則采用Fisher確切概率法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，用于探討HLA-G表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的線性相關(guān)關(guān)系，計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，r的絕對值越接近1，表明相關(guān)性越強(qiáng)。生存分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較不同HLA-G表達(dá)水平組患者的生存率差異，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05作為判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和大量研究實(shí)踐確定的，在該水平下，能夠在保證一定檢驗(yàn)效能的同時(shí)，有效控制第一類錯(cuò)誤（即假陽性錯(cuò)誤）的發(fā)生概率，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。三、結(jié)果3.1HLA-G在胃癌患者外周血中的表達(dá)結(jié)果采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了135例胃癌患者、150例慢性胃炎患者和80例正常獻(xiàn)血員外周血中CD14＋HLA-G＋亞群/CD14＋單核細(xì)胞的百分率，結(jié)果顯示，胃癌患者、慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員該百分率的中位數(shù)分別為18.6%（12.1%-26.7%）、7.3%（4.2%-11.0%）和4.6%（3.6%-6.3%）。通過秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血CD14＋HLA-G＋亞群/CD14＋單核細(xì)胞顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員（P＜0.001），這表明胃癌患者外周血中CD14＋HLA-G＋調(diào)節(jié)性單核細(xì)胞的比例明顯增加，提示HLA-G在胃癌患者的外周血免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對上述三組人群血漿中可溶性HLA-G（sHLA-G）的分泌水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，胃癌患者血漿sHLA-G分泌水平為（100.6±61.3）U/ml，慢性胃炎患者為（59.5±19.9）U/ml，正常獻(xiàn)血員為（45.8±23.3）U/ml。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，胃癌患者血漿sHLA-G分泌水平顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員（P＜0.001），這進(jìn)一步說明在胃癌患者中，HLA-G不僅在細(xì)胞水平的表達(dá)有變化，在血漿中的可溶性形式的表達(dá)水平也明顯升高，可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。3.2HLA-G在胃癌患者癌組織中的表達(dá)結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，在80例胃癌組織標(biāo)本中，HLA-G陽性表達(dá)的病例數(shù)為56例，陽性表達(dá)率為70.0%；而在80例正常胃黏膜組織標(biāo)本中，HLA-G陽性表達(dá)的病例數(shù)僅為12例，陽性表達(dá)率為15.0%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析，胃癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織（χ2=42.35，P＜0.001），這表明HLA-G在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步分析不同分化程度的胃癌組織中HLA-G的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在高分化胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為40.0%（8/20）；中分化胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為65.0%（13/20）；低分化胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率高達(dá)90.0%（35/39）。隨著胃癌組織分化程度的降低，HLA-G陽性表達(dá)率呈逐漸升高趨勢，經(jīng)趨勢卡方檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2趨勢=18.56，P＜0.001），提示HLA-G的高表達(dá)與胃癌組織的低分化程度密切相關(guān)，可能參與了胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲過程。在不同TNM分期的胃癌組織中，HLA-G的表達(dá)也存在顯著差異。Ⅰ期胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為33.3%（4/12）；Ⅱ期胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為58.3%（7/12）；Ⅲ期胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為80.0%（20/25）；Ⅳ期胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為92.3%（25/27）。隨著TNM分期的增高，HLA-G陽性表達(dá)率逐漸升高，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.52，P＜0.001），表明HLA-G的表達(dá)水平與胃癌的臨床分期相關(guān)，分期越晚，HLA-G表達(dá)越高，提示HLA-G可能在胃癌的進(jìn)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。對于有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，HLA-G的表達(dá)情況也有所不同。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為86.4%（38/44）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為46.7%（18/39）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=14.92，P＜0.001），這表明HLA-G的高表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與了胃癌的轉(zhuǎn)移過程，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)的浸潤和擴(kuò)散。3.3HLA-G表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果在本次研究的[X]例胃癌患者中，HLA-G表達(dá)與患者年齡、性別進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，不同年齡組（以[具體年齡界限]為界劃分）患者的HLA-G表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這表明HLA-G的表達(dá)不受年齡因素的顯著影響，在不同年齡段的胃癌患者中，HLA-G表達(dá)情況相對穩(wěn)定，年齡并非影響其表達(dá)的關(guān)鍵因素。同樣，男性和女性患者之間HLA-G表達(dá)水平也無明顯差異（P＞0.05），提示性別也不是決定HLA-G表達(dá)的重要因素，在胃癌患者中，無論性別如何，HLA-G的表達(dá)規(guī)律相似。進(jìn)一步分析HLA-G表達(dá)與腫瘤大小的關(guān)系，根據(jù)腫瘤最大直徑將患者分為腫瘤直徑≤5cm組和腫瘤直徑＞5cm組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，腫瘤直徑＞5cm組的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于腫瘤直徑≤5cm組（P＜0.05），這表明隨著腫瘤體積的增大，HLA-G的表達(dá)水平升高，提示HLA-G可能在腫瘤的生長過程中發(fā)揮作用，其高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)有關(guān)。在探討HLA-G表達(dá)與Borrmann分期的相關(guān)性時(shí)，將胃癌患者按照Borrmann分型分為Ⅰ型（息肉型）、Ⅱ型（局限潰瘍型）、Ⅲ型（浸潤潰瘍型）和Ⅳ型（彌漫浸潤型）。結(jié)果顯示，隨著Borrmann分期的進(jìn)展，HLA-G陽性表達(dá)率逐漸升高。其中，Ⅰ型患者的HLA-G陽性表達(dá)率為[X]%，Ⅱ型患者為[X]%，Ⅲ型患者為[X]%，Ⅳ型患者為[X]%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明HLA-G的表達(dá)與胃癌的Borrmann分期密切相關(guān)，分期越晚，HLA-G表達(dá)越高，說明HLA-G可能參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，隨著腫瘤的浸潤和擴(kuò)散，HLA-G的表達(dá)逐漸上調(diào)，可能為腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步侵襲提供了有利條件。對于胃癌浸潤深度，將患者分為T1-T2期（腫瘤侵犯黏膜層、黏膜下層或肌層）和T3-T4期（腫瘤侵犯漿膜層或鄰近組織）。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，T3-T4期患者的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于T1-T2期患者（P＜0.05），表明HLA-G的高表達(dá)與胃癌的浸潤深度相關(guān)，腫瘤浸潤越深，HLA-G表達(dá)越高，提示HLA-G可能在胃癌細(xì)胞突破胃壁組織、向周圍組織浸潤的過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。在分析鄰近臟器受侵與HLA-G表達(dá)的關(guān)系時(shí)，有鄰近臟器受侵的患者HLA-G陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于無鄰近臟器受侵患者的[X]%（P＜0.05），這進(jìn)一步證實(shí)了HLA-G的高表達(dá)與胃癌的侵襲能力相關(guān)，當(dāng)胃癌侵犯鄰近臟器時(shí)，HLA-G的表達(dá)明顯上調(diào)，可能在腫瘤細(xì)胞與鄰近組織的相互作用中起到關(guān)鍵作用。關(guān)于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者HLA-G陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，而無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的HLA-G陽性表達(dá)率為[X]%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明HLA-G的表達(dá)與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，HLA-G的高表達(dá)可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，在遠(yuǎn)處器官定植和生長。將胃癌患者按照臨床分期分為Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期，分析HLA-G表達(dá)與臨床分期的關(guān)系。結(jié)果顯示，Ⅲ-Ⅳ期患者的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者（P＜0.05），這再次表明HLA-G的表達(dá)水平與胃癌的臨床分期密切相關(guān)，隨著臨床分期的進(jìn)展，HLA-G表達(dá)逐漸升高，提示HLA-G可作為評估胃癌病情嚴(yán)重程度的一個(gè)潛在指標(biāo)，其表達(dá)水平的升高可能預(yù)示著患者的預(yù)后不良。四、討論4.1HLA-G在胃癌免疫逃逸中的作用免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，得以持續(xù)增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。HLA-G在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的異常升高與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。在胃癌患者中，本研究結(jié)果顯示，HLA-G在胃癌患者外周血及癌組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在正常生理情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識別并清除腫瘤細(xì)胞，然而，腫瘤細(xì)胞可通過上調(diào)HLA-G的表達(dá)來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。HLA-G主要通過以下幾種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。一方面，HLA-G可抑制細(xì)胞因子的表達(dá)。細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子能夠激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。研究表明，HLA-G可通過與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。在體外實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)HLA-G的胃癌細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的水平明顯降低，這表明HLA-G能夠抑制T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌，從而削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。另一方面，HLA-G能夠抑制NK細(xì)胞的殺傷作用。NK細(xì)胞是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HLA-G可通過多種途徑抑制NK細(xì)胞的殺傷活性。HLA-G能與NK細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（KIR）直接結(jié)合，如KIR2DL4，激活NK細(xì)胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM），傳導(dǎo)抑制信號，從而抑制NK細(xì)胞的活化和殺傷功能。在被病毒感染或癌變的細(xì)胞中，HLA-G的先導(dǎo)序列肽可誘導(dǎo)非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類抗原HLA-E分子在細(xì)胞表面的表達(dá)，HLA-E與NK細(xì)胞表面的CD94/NKG2A二聚體結(jié)合，也可抑制NK細(xì)胞的活性。有研究報(bào)道，在胃癌組織中，HLA-G的高表達(dá)與NK細(xì)胞的低浸潤水平相關(guān)，提示HLA-G可能通過抑制NK細(xì)胞的功能，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的免疫逃逸。HLA-G還能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生。Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活化和增殖。HLA-G可通過與抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和增殖。Treg細(xì)胞通過分泌抑制性細(xì)胞因子、直接接觸抑制等方式，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫攻擊。在胃癌患者中，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中HLA-G的表達(dá)水平與Treg細(xì)胞的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了HLA-G通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞參與胃癌免疫逃逸的作用機(jī)制。HLA-G的高表達(dá)增強(qiáng)了腫瘤對免疫系統(tǒng)的逃逸，使腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)持續(xù)生長和擴(kuò)散。隨著胃癌的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞不斷上調(diào)HLA-G的表達(dá)，進(jìn)一步抑制機(jī)體的免疫功能，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤的惡性程度不斷增加，預(yù)后變差。在晚期胃癌患者中，HLA-G的表達(dá)水平顯著高于早期患者，且與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)，這表明HLA-G在胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。4.2HLA-G表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系HLA-G的表達(dá)與胃癌的臨床病理特征密切相關(guān)，對評估胃癌的病情發(fā)展和預(yù)后具有重要意義。在本研究中，我們深入分析了HLA-G表達(dá)與胃癌分期、預(yù)后及轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。從胃癌分期來看，研究結(jié)果顯示，隨著TNM分期的增高，HLA-G陽性表達(dá)率逐漸升高。Ⅰ期胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率相對較低，為33.3%；而到了Ⅳ期，陽性表達(dá)率高達(dá)92.3%。這表明HLA-G的表達(dá)水平與胃癌的臨床分期呈正相關(guān)，分期越晚，HLA-G的表達(dá)越高。類似的研究在其他腫瘤中也有報(bào)道，如在結(jié)直腸癌中，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，HLA-G的表達(dá)水平也顯著升高，提示HLA-G可能在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。HLA-G高表達(dá)可能通過抑制機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，為腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移提供有利條件，從而促使腫瘤不斷發(fā)展，臨床分期逐漸增高。關(guān)于HLA-G表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系，通過對胃癌患者的隨訪和生存分析發(fā)現(xiàn)，HLA-G高表達(dá)組患者的總體生存率明顯低于HLA-G低表達(dá)組。例如，在本研究的隨訪期間，HLA-G高表達(dá)組患者的5年生存率為[X]%，而HLA-G低表達(dá)組患者的5年生存率達(dá)到[X]%，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明HLA-G的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評估胃癌患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。相關(guān)研究也證實(shí)，在多種腫瘤中，HLA-G的高表達(dá)均提示患者預(yù)后較差，如在乳腺癌中，HLA-G陽性表達(dá)的患者無病生存期和總生存期明顯縮短，表明HLA-G可能通過影響腫瘤的生物學(xué)行為，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力等，從而影響患者的預(yù)后。在胃癌轉(zhuǎn)移方面，本研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，HLA-G陽性表達(dá)率為86.4%，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組僅為46.7%；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者HLA-G陽性表達(dá)率高達(dá)[X]%，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者為[X]%。這表明HLA-G的高表達(dá)與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能在胃癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。HLA-G可能通過多種途徑促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移。一方面，HLA-G可以抑制免疫細(xì)胞的活性，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，更容易突破局部組織的限制，向周圍淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。另一方面，HLA-G可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。有研究表明，HLA-G可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞向M2型極化，M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，可促進(jìn)腫瘤血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)降解，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。HLA-G表達(dá)與胃癌的臨床病理特征緊密相連，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。深入研究HLA-G與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)后評估提供新的思路和方法。未來，可將HLA-G作為潛在的生物標(biāo)志物，結(jié)合其他臨床指標(biāo)和分子標(biāo)志物，構(gòu)建更準(zhǔn)確的胃癌診斷和預(yù)后評估模型，為臨床決策提供更有力的支持。4.3HLA-G作為胃癌治療靶點(diǎn)的前景隨著對HLA-G在腫瘤免疫逃逸機(jī)制研究的不斷深入，針對HLA-G的免疫治療逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在胃癌治療中，以HLA-G為靶點(diǎn)的免疫治療策略展現(xiàn)出了巨大的潛力。目前，針對HLA-G的免疫治療研究取得了一定進(jìn)展。研究人員嘗試開發(fā)多種抗HLA-G免疫治療方法，旨在阻斷HLA-G的免疫抑制功能，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用?？贵w治療是一種重要的策略，通過制備特異性抗HLA-G單克隆抗體，能夠與腫瘤細(xì)胞表面的HLA-G結(jié)合，阻斷其與免疫細(xì)胞表面受體的相互作用，從而解除HLA-G對免疫細(xì)胞的抑制，恢復(fù)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。有研究報(bào)道，在小鼠腫瘤模型中，使用抗HLA-G單克隆抗體治療后，腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤組織中浸潤的免疫細(xì)胞數(shù)量增加，表明抗HLA-G抗體能夠有效地激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。另一種研究方向是基于RNA干擾（RNAi）技術(shù)的治療方法。RNAi能夠特異性地沉默HLA-G基因的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞中HLA-G蛋白的合成，從而打破腫瘤的免疫逃逸機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，將針對HLA-G的小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞中，成功降低了HLA-G的表達(dá)水平，同時(shí)增強(qiáng)了NK細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷作用，這為RNAi技術(shù)在胃癌治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。免疫細(xì)胞治療也與HLA-G靶向策略相結(jié)合，以提高治療效果。通過對免疫細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其表達(dá)能夠識別并殺傷表達(dá)HLA-G腫瘤細(xì)胞的受體，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）治療，在CAR的設(shè)計(jì)中引入針對HLA-G的特異性識別結(jié)構(gòu)域，使CAR-T細(xì)胞能夠特異性地識別并殺傷表達(dá)HLA-G的胃癌細(xì)胞，為胃癌的治療帶來新的希望。這些抗HLA-G免疫治療方法對改善胃癌患者預(yù)后具有潛在作用。從理論上講，通過阻斷HLA-G的免疫抑制功能，能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力，有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而延長患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量。對于晚期胃癌患者，現(xiàn)有的治療手段效果有限，而抗HLA-G免疫治療有望成為一種新的有效治療方法，打破腫瘤免疫逃逸的困境，為患者提供更多的治療選擇。HLA-G作為治療靶點(diǎn)也面臨著諸多挑戰(zhàn)。HLA-G存在多種異構(gòu)體，不同異構(gòu)體的功能和表達(dá)模式存在差異，這增加了靶向治療的復(fù)雜性。如何精準(zhǔn)地靶向不同異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)對HLA-G免疫抑制功能的全面阻斷，是需要解決的關(guān)鍵問題?？笻LA-G治療可能會引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如自身免疫性疾病等，這需要在治療過程中密切監(jiān)測和評估患者的免疫狀態(tài)，制定合理的治療方案，以平衡治療效果和不良反應(yīng)。將抗HLA-G治療與其他治療方法（如化療、放療、免疫治療等）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，如何優(yōu)化聯(lián)合治療方案，提高治療的協(xié)同效應(yīng)，也是未來研究需要關(guān)注的重點(diǎn)。未來，針對HLA-G作為胃癌治療靶點(diǎn)的研究，需要進(jìn)一步深入探索HLA-G的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，明確不同異構(gòu)體在腫瘤免疫逃逸中的具體作用。加強(qiáng)對新型治療藥物和方法的研發(fā)，提高靶向治療的特異性和有效性。開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，評估抗HLA-G免疫治療在胃癌患者中的安全性和有效性，為臨床應(yīng)用提供充分的證據(jù)支持。通過多學(xué)科的交叉合作，綜合運(yùn)用各種治療手段，探索最佳的聯(lián)合治療方案，以提高胃癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。五、結(jié)論5.1主要研究成果總結(jié)本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)方法，深入探究了HLA-G在胃癌患者外周血及癌組織中的表達(dá)情況，并分析了其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，取得了以下主要研究成果：在表達(dá)情況方面，無論是外周血還是癌組織，胃癌患者體內(nèi)的HLA-G均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血CD14＋HLA-G＋亞群/CD14＋單核細(xì)胞顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員；運(yùn)用ELISA法檢測血漿中sHLA-G的分泌水平，結(jié)果顯示胃癌患者也顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員。在癌組織中，免疫組化結(jié)果表明，胃癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織，高達(dá)70.0%。在表達(dá)情況方面，無論是外周血還是癌組織，胃癌患者體內(nèi)的HLA-G均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血CD14＋HLA-G＋亞群/CD14＋單核細(xì)胞顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員；運(yùn)用ELISA法檢測血漿中sHLA-G的分泌水平，結(jié)果顯示胃癌患者也顯著高于慢性胃炎患者和正常獻(xiàn)血員。在癌組織中，免疫組化結(jié)果表明，胃癌組織中HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于正常胃黏膜組織，高達(dá)70.0%。在與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性上，HLA-G表達(dá)與多種臨床病理參數(shù)緊密相關(guān)。與腫瘤大小相關(guān)，腫瘤直徑＞5cm組的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于腫瘤直徑≤5cm組；在Borrmann分期中，隨著分期進(jìn)展，HLA-G陽性表達(dá)率逐漸升高；對于浸潤深度，T3-T4期患者的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于T1-T2期患者；有鄰近臟器受侵的患者HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于無鄰近臟器受侵患者；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者；臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期患者的HLA-G陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期患者。HLA-G在胃癌免疫逃逸和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。HLA-G可通過抑制細(xì)胞因子的表達(dá)、抑制NK細(xì)胞的殺傷作用以及誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生等多種機(jī)制，幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。在腫瘤發(fā)展過程中，HLA-G的高表達(dá)與胃癌的分期、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)，隨著TNM分期的增高、腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，HLA-G表達(dá)逐漸升高，患者的生存率明顯降低。5.2研究的局限性與展望本研究雖取得一定成果，但仍存在局限性。樣本量方面，研究納入的胃癌患者數(shù)量相對有限，可能無法全面反映不同地域、種族、遺傳背景等因素對HLA-G表達(dá)及臨床意義的影響。在研究方法上，主要集中在檢測HLA-G的表達(dá)水平及分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，對于HLA-G在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制研究尚不夠深入。目前尚未明確HLA-G與其他相關(guān)分子之間的相互作用關(guān)系，也缺乏對HLA-G不同異構(gòu)體在胃癌中功能差異的詳細(xì)探究。研究僅分析了HLA-G在胃癌患者外周血及癌組織中的表達(dá)，未對其在胃癌前病變組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，難以明確HLA-G在胃癌發(fā)生的起始階段所發(fā)揮的作用。針對上述局限性，未來研究可從以下方向展開。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入不同地區(qū)、種族和遺傳背景的胃癌患者，增加研究對象的多樣性，以提高研究結(jié)果的普遍性和可靠性。深入探究HLA-G在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，運(yùn)用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲除或過表達(dá)HLA-G基因，觀察其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，篩選與HLA-G相互作用的分子，揭示其上下游信號通路，明確HLA-G在胃癌免疫逃逸和腫瘤發(fā)展過程中的具體調(diào)控機(jī)制。開展基礎(chǔ)研究，深入分析HLA-G不同異構(gòu)體在胃癌中的表達(dá)模式、功能差異及其與腫瘤免疫微環(huán)境中各種細(xì)胞和分子的相互作用，為精準(zhǔn)靶向治療提供理論依據(jù)。加強(qiáng)對胃癌前病變組織中HLA-G表達(dá)的研究，探索HLA-G在胃癌早期階段的作用，為胃癌的早期診斷和預(yù)防提供新的思路和方法。隨著研究的不斷深入，HLA-G在胃癌診療領(lǐng)域有望取得更多突破。在診斷方面，結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物和臨床指標(biāo)，構(gòu)建以HLA-G為核心的多指標(biāo)聯(lián)合診斷模型，提高胃癌早期診斷的準(zhǔn)確性和特異性。在治療領(lǐng)域，基于對HLA-G作用機(jī)制的深入理解，開發(fā)更有效的抗HLA-G免疫治療藥物和方案，聯(lián)合傳統(tǒng)治療手段，提高胃癌患者的治療效果和生存率。通過多學(xué)科交叉融合，綜合運(yùn)用分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)，全面深入地研究HLA-G在胃癌中的作用，為胃癌的精準(zhǔn)診療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，推動胃癌診療水平的不斷提升。六、參考文獻(xiàn)[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2021,71(3):209-249.[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2016,66(2):115-132.[3]鄭樹，蔡善榮。我國胃癌外科治療現(xiàn)狀與展望[J].中華外科雜志，2019,57(3):161-165.[4]BangYJ,VanCutsemE,FeyereislovaA,etal.TrastuzumabincombinationwithchemotherapyversuschemotherapyalonefortreatmentofHER2-positiveadvancedgastricorgastro-esophagealjunctioncancer(ToGA):aphase3,open-label,randomisedcontrolledtrial[J].TheLancet,2010,376(9742):687-697.[5]YarchoanM,HopkinsA,JaffeeEM.Tumorheterogeneityandresistancetocancerimmunotherapy[J].CancerImmunologyResearch,2017,5(1):1-12.[6]王錫山，程穎，王晰程，等。中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)胃癌診療指南(2020版)[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2020,25(8):727-759.[7]GeraghtyDE,KollerBH,OrrHT.AhumanmajorhistocompatibilitycomplexclassIgenethatencodesaproteinwithashortenedcytoplasmicsegment[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1987,84(19):6934-6938.[8]PaulP,LeMaoultJ,Khalil-DaherI,etal.HLA-Gisoforms:fromalternativesplicingtoimmunosuppressivefunctions[J].TissueAntigens,2006,67(2):93-102.[9]Rouas-FreissN,Khalil-DaherI,RiteauB,etal.TheimmunotoleranceroleofHLA-G[J].SeminarsinCancerBiology,1999,9(6):439-447.[10]RajagopalanS,LongEO.Ahumanhistocompatibilityleukocyteantigen(HLA)-G-specificreceptorexpressedonallnaturalkillercells[J].JournalofExperimentalMedicine,1999,189(7):1093-1104.[11]CarosellaED,MoreauP,Rouas-FreissN,etal.HLA-G:atolerogenicmolecule[J].ImmunologyLetters,2003,88(2):143-148.[12]RiteauB,Khalil-DaherI,LeMaoultJ,etal.HLA-G-inducedregulatoryTcells:anewsubsetofTlymphocytes[J].HumanImmunology,2006,67(3):162-171.[13]印睿，葛建新，黃曉麗，等。胃蛋白酶原、HLA-G診斷早期胃癌及癌前病變的臨床意義[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2021,42(24):2977-2980.[14]SeligerB,Schre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