下咽鱗狀細(xì)胞癌中Slit2表達(dá)與微血管密度的關(guān)聯(lián)及臨床意義探究一、引言1.1下咽鱗狀細(xì)胞癌概述下咽鱗狀細(xì)胞癌是指發(fā)生于喉咽部的惡性腫瘤，病理類(lèi)型為鱗狀細(xì)胞癌，在原發(fā)性喉咽惡性腫瘤中，絕大部分都屬于這種類(lèi)型。下咽癌在頭頸部惡性腫瘤里并不少見(jiàn)，男性發(fā)病多于女性，好發(fā)年齡在50-70歲。其發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，長(zhǎng)期吸煙、過(guò)量飲酒是重要的誘發(fā)因素，多數(shù)患者有著長(zhǎng)期大量吸煙的歷史，咽喉癌的發(fā)生率與每日吸煙量以及總的吸煙時(shí)間呈正比，同時(shí)，吸煙時(shí)煙草燃燒產(chǎn)生的煙焦油中，苯丙芘具有致癌作用，可致使黏膜水腫、充血、上皮增生及鱗狀化生，使纖毛運(yùn)動(dòng)停止，進(jìn)而致癌。大量飲酒的人群患下咽癌的幾率也更高，并且吸煙與飲酒在致癌方面存在協(xié)同作用。此外，空氣污染，如工業(yè)產(chǎn)生的粉塵、二氧化硫、鉻、砷等長(zhǎng)期吸入，可能導(dǎo)致呼吸道腫瘤；長(zhǎng)期接觸有毒化學(xué)物質(zhì)，像芥子氣、石棉等；病毒感染，例如人乳頭狀瘤病毒（HPV）、EB病毒等；微量元素缺乏，某些微量元素作為體內(nèi)一些酶的重要組成部分，缺乏可能導(dǎo)致酶的結(jié)構(gòu)和功能改變，影響細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，引發(fā)基因突變；長(zhǎng)期接觸放射性核素，如鐳、鈾、氡等；經(jīng)常食用亞硝酸鹽含量高的食物或者過(guò)熱的食物，都可能誘發(fā)下咽癌。下咽鱗狀細(xì)胞癌對(duì)患者的身體健康危害極大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床上主要表現(xiàn)為喉咽部異物感、吞咽疼痛及進(jìn)行性吞咽困難，隨著病情發(fā)展，腫瘤累及聲帶會(huì)導(dǎo)致聲嘶，因喉咽組織水腫或腫瘤堵塞可引發(fā)咳嗽或嗆咳，吞咽時(shí)可能誤吸，嚴(yán)重者可致吸入性肺炎，還會(huì)出現(xiàn)頸部腫塊，部分患者甚至以頸部腫塊為首發(fā)癥狀就診。如果不及時(shí)治療，癌細(xì)胞會(huì)向周?chē)M織和器官擴(kuò)散，發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。目前，下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療主要包括手術(shù)、放射治療和化療合并放射治療等幾種方法，治療方式的選擇需要依據(jù)腫瘤的大小、位置、手術(shù)后可能存在的功能性障礙，外科醫(yī)生及放療科醫(yī)生的治療經(jīng)驗(yàn)以及患者的意愿進(jìn)行綜合評(píng)估。手術(shù)是治療下咽癌的主要方法之一，像全喉切除術(shù)、梨狀窩切除術(shù)、頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)等，通常適用于早期下咽癌患者，術(shù)后患者需要進(jìn)一步接受放療和化療以預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。早期下咽癌可選擇單純放療或單純手術(shù)，單純手術(shù)的療效優(yōu)于單純放療，而對(duì)于Ⅲ及Ⅳ期患者，應(yīng)采用綜合治療。當(dāng)前普遍認(rèn)為，在綜合治療中，手術(shù)加放療是最有效的治療方法，其療效明顯優(yōu)于單純放療和單純手術(shù)。然而，下咽鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后仍然較差，文獻(xiàn)報(bào)道其5年生存率僅約30-50％，主要原因在于下咽鱗癌早期癥狀不明顯，診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)為中晚期病例。并且下咽癌具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、局部早期就容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，常常侵犯周?chē)慕M織器官，局部治療不易控制，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高，反復(fù)復(fù)發(fā)不易根治，不但導(dǎo)致生存率下降，還會(huì)引起語(yǔ)言、吞咽及呼吸的障礙，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。為了提高下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的生存率和生存質(zhì)量，深入研究其發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移離不開(kāi)血管生成的支持，微血管密度作為腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一，與腫瘤的侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)。研究下咽鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)制，探究與血管生成相關(guān)的分子，對(duì)于揭示其發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及改善患者的預(yù)后具有重要的意義。1.2Slit2蛋白簡(jiǎn)介Slit2蛋白的研究始于1984年，Nusslein-Volhard等學(xué)者在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種分泌型的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，即神經(jīng)遷移蛋白Slit，其由基因4p15.2編碼，擁有多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Slit存在3個(gè)亞型，這些亞型不僅在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，影響神經(jīng)元軸突（或是胞體）的遷移，還能抑制趨化因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞的遷移。其中，后兩種亞型在哺乳動(dòng)物神經(jīng)外系統(tǒng)中也有分布，特別是在腫瘤細(xì)胞中。Slit2蛋白作為Slit家族中的一員，是一個(gè)大型分泌蛋白，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域。其富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRR），主要負(fù)責(zé)介導(dǎo)與受體Robo的結(jié)合，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用；EGF樣結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用中起輔助作用，有助于維持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及與其他分子的相互識(shí)別；C端的凝血酶片段則影響Slit2的分子穩(wěn)定性及其在胞外基質(zhì)中的分布，對(duì)Slit2在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮調(diào)控功能有著重要意義。通過(guò)這些結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用，Slit2在細(xì)胞外環(huán)境中實(shí)現(xiàn)對(duì)多種生理過(guò)程的精細(xì)調(diào)控。在生理功能方面，Slit2最早在神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，其功能隨后擴(kuò)展到多個(gè)系統(tǒng)，成為細(xì)胞-細(xì)胞間信號(hào)調(diào)控的重要因子。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Slit2主要通過(guò)其受體Robo家族，尤其是Robo1和Robo2受體發(fā)揮作用。當(dāng)Slit2與Robo受體結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞骨架的重構(gòu)，從而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和定位，這一信號(hào)軸在神經(jīng)元軸突引導(dǎo)和細(xì)胞遷移中尤為關(guān)鍵。通過(guò)調(diào)節(jié)RhoGTP酶家族成員（如Rac1、Cdc42等），Slit2-Robo信號(hào)途徑進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)，影響細(xì)胞的極性和方向性，確保神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的正確形成。除了神經(jīng)系統(tǒng)，Slit2在心血管系統(tǒng)中調(diào)控血管發(fā)育和形態(tài)建成，在呼吸系統(tǒng)中參與肺的分支形成及功能性肺泡結(jié)構(gòu)的維持，還參與胚胎發(fā)育中的重要過(guò)程，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)建成和各器官的正確定位。隨著研究的深入，Slit2在腫瘤領(lǐng)域的作用逐漸受到關(guān)注。Wang等學(xué)者研究證實(shí)，在結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等實(shí)體瘤中均有Slit2蛋白的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞上有Robo1表達(dá)，首次報(bào)道了Slit2-Robo信號(hào)系統(tǒng)在腫瘤新生血管形成中發(fā)揮的重要作用，將腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間新的“對(duì)話”機(jī)制引入到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程當(dāng)中，為腫瘤的發(fā)病機(jī)制和治療方法開(kāi)辟了新的研究方向。然而，有關(guān)Slit2蛋白的表達(dá)及其所誘導(dǎo)的新生血管形成在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的報(bào)道甚少，因此，深入研究Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系，對(duì)于揭示下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。1.3微血管密度與腫瘤的關(guān)系微血管密度（MicrovesselDensity，MVD），指的是單位面積內(nèi)腫瘤組織中微血管的數(shù)量。腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)，而微血管密度正是衡量腫瘤血管生成程度的重要指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)，新生血管能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供這些必需的物質(zhì)，同時(shí)帶走代謝廢物，為腫瘤的生長(zhǎng)提供適宜的微環(huán)境。研究表明，微血管密度較高的腫瘤往往具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，腫瘤細(xì)胞能夠更快地獲取養(yǎng)分，從而加速腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，微血管密度同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支持，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)提供了通道。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)微血管侵入血液循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到身體的其他部位，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。高微血管密度意味著更多的血管通道，增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)會(huì)，提高了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。例如，在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，微血管密度高的患者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。許多研究都證實(shí)了微血管密度與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的密切關(guān)聯(lián)，使其成為評(píng)估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。微血管密度在腫瘤研究中占據(jù)著關(guān)鍵地位，它為深入理解腫瘤的生物學(xué)行為提供了重要線索，是評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)，對(duì)于腫瘤的診斷、治療方案的制定以及預(yù)后評(píng)估都具有重要的指導(dǎo)意義。通過(guò)檢測(cè)微血管密度，醫(yī)生能夠更準(zhǔn)確地判斷腫瘤的惡性程度和發(fā)展趨勢(shì)，為患者制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果，改善患者的預(yù)后。1.4研究目的和意義本研究旨在深入探究下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2的表達(dá)情況，明確其與微血管密度之間的關(guān)聯(lián)，為揭示下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。通過(guò)檢測(cè)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中Slit2蛋白和mRNA的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性，同時(shí)檢測(cè)微血管密度并探討其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)而研究Slit2表達(dá)與微血管密度之間的內(nèi)在聯(lián)系。從理論層面來(lái)看，本研究有助于深化對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制的理解。目前，雖然對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌的研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全明晰。Slit2作為一種在腫瘤血管生成中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子，其在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。通過(guò)本研究，有望揭示Slit2在該疾病中的表達(dá)規(guī)律及其與微血管密度的關(guān)系，為進(jìn)一步闡釋下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供重要線索，豐富腫瘤分子生物學(xué)的理論體系。在臨床應(yīng)用方面，本研究具有重要的潛在價(jià)值。一方面，對(duì)于下咽鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷，目前的檢測(cè)方法存在一定局限性，部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。若能明確Slit2與下咽鱗狀細(xì)胞癌的相關(guān)性，或許可以將其作為一種新的生物標(biāo)志物，輔助早期診斷，提高疾病的早期發(fā)現(xiàn)率，為患者爭(zhēng)取更多的治療機(jī)會(huì)。另一方面，在治療方案的選擇上，現(xiàn)有的治療手段存在諸多不足，如手術(shù)創(chuàng)傷大、放化療副作用明顯等。了解Slit2在腫瘤血管生成中的作用機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)以Slit2為靶點(diǎn)的新型治療方法，為下咽鱗狀細(xì)胞癌患者提供更精準(zhǔn)、有效的治療策略，提高患者的生存率和生存質(zhì)量。此外，對(duì)于預(yù)后評(píng)估，微血管密度和Slit2的表達(dá)情況可能成為重要的參考指標(biāo)，幫助醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷患者的預(yù)后，制定個(gè)性化的隨訪和康復(fù)計(jì)劃。本研究對(duì)于下咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為該疾病的防治開(kāi)辟新的道路。二、材料與方法2.1研究對(duì)象選取[具體醫(yī)院名稱(chēng)]在[具體時(shí)間段]內(nèi)收治的下咽鱗狀細(xì)胞癌患者作為研究對(duì)象，共收集到30例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的組織標(biāo)本。所有患者均經(jīng)病理檢查確診為下咽鱗狀細(xì)胞癌，且在手術(shù)前未接受過(guò)放療、化療或其他抗腫瘤治療。同時(shí)，選取10例相應(yīng)的正常下咽組織標(biāo)本作為對(duì)照，這些正常組織標(biāo)本均取自因其他疾病行下咽手術(shù)切除的患者，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常組織，且與下咽鱗狀細(xì)胞癌患者在年齡、性別等方面相匹配。在樣本采集過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則。手術(shù)切除的腫瘤組織及正常下咽組織標(biāo)本，立即用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將標(biāo)本切成約1cm×1cm×0.5cm大小的組織塊，一部分組織塊放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；另一部分組織塊迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。在樣本保存和運(yùn)輸過(guò)程中，確保樣本始終處于低溫環(huán)境，以保證樣本的質(zhì)量和生物活性不受影響。2.2主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器本實(shí)驗(yàn)所使用的主要試劑包括：兔抗人Slit2多克隆抗體，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)1]，該抗體用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)，以特異性識(shí)別組織和細(xì)胞中的Slit2蛋白；鼠抗人CD34單克隆抗體，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)2]，作為微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)以顯示微血管，進(jìn)而測(cè)定微血管密度；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒，包含二抗、顯色劑等，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)3]，為免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)提供所需的配套試劑；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)4]，用于將組織中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)5]，用于定量檢測(cè)cDNA中目的基因的表達(dá)水平；TRIzol試劑，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)6]，用于從組織中提取總RNA。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器有：光學(xué)顯微鏡，型號(hào)為[具體型號(hào)1]，由[具體公司名稱(chēng)7]生產(chǎn)，用于免疫組織化學(xué)染色切片的觀察和微血管計(jì)數(shù)；圖像分析系統(tǒng)，型號(hào)為[具體型號(hào)2]，由[具體公司名稱(chēng)8]開(kāi)發(fā)，配合光學(xué)顯微鏡對(duì)染色切片進(jìn)行圖像采集和分析，精確測(cè)定微血管密度；PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)為[具體型號(hào)3]，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)9]，用于逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中的DNA擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，型號(hào)為[具體型號(hào)4]，由[具體公司名稱(chēng)10]制造，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，從而對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析；低溫高速離心機(jī)，型號(hào)為[具體型號(hào)5]，購(gòu)自[具體公司名稱(chēng)11]，用于組織勻漿、細(xì)胞分離以及核酸和蛋白質(zhì)提取等實(shí)驗(yàn)中的離心操作，可在低溫條件下進(jìn)行高速離心，保證生物分子的活性；超凈工作臺(tái)，型號(hào)為[具體型號(hào)6]，由[具體公司名稱(chēng)12]生產(chǎn)，為實(shí)驗(yàn)操作提供無(wú)菌的工作環(huán)境，防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中受到微生物污染。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1免疫組織化學(xué)檢測(cè)Slit2表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)Slit2表達(dá)的具體步驟如下：首先，將10%中性福爾馬林固定后的組織標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的連續(xù)切片，然后將切片裱貼于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的載玻片上，60℃烤片2小時(shí)，使切片牢固附著。接著進(jìn)行脫蠟水化，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，以徹底脫蠟，隨后依次經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ浸泡5分鐘，95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡3分鐘，進(jìn)行水化處理。采用高壓鍋熱修復(fù)抗原，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的高壓鍋中，加熱至沸騰后持續(xù)2分鐘，然后自然冷卻至室溫，以充分暴露抗原決定簇。用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育切片10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，減少非特異性染色。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。傾去封閉液，勿洗，滴加適當(dāng)稀釋的兔抗人Slit2多克隆抗體（工作濃度為1:200），4℃孵育過(guò)夜，使抗體與組織中的Slit2蛋白特異性結(jié)合。次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，以洗去未結(jié)合的抗體。滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15分鐘，然后再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15分鐘，PBS沖洗3次，每次5分鐘。使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核30秒，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水，即70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ各浸泡3分鐘，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡5分鐘，最后用中性樹(shù)膠封片。在操作過(guò)程中，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，需要注意以下要點(diǎn)：抗體的選擇和稀釋度至關(guān)重要，應(yīng)根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳工作濃度，以保證特異性結(jié)合和低背景染色；抗原修復(fù)的條件要嚴(yán)格控制，不同的抗原修復(fù)方法和時(shí)間可能會(huì)影響抗原的暴露程度和染色效果，因此需根據(jù)組織類(lèi)型和抗原特性選擇合適的修復(fù)方式；孵育時(shí)間和溫度應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，避免過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短的孵育時(shí)間以及過(guò)高或過(guò)低的孵育溫度，以免影響抗體的結(jié)合和實(shí)驗(yàn)結(jié)果；顯色過(guò)程中要密切觀察顯色情況，避免顯色過(guò)度或不足，影響結(jié)果的判斷。同時(shí)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照采用已知表達(dá)Slit2的組織切片，陰性對(duì)照則用PBS代替一抗，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。2.3.2微血管密度的檢測(cè)微血管密度的檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)方法，以CD34抗體作為微血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。具體操作步驟與Slit2免疫組織化學(xué)檢測(cè)類(lèi)似，包括組織切片的制備、脫蠟水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)、一抗孵育（鼠抗人CD34單克隆抗體，工作濃度為1:100）、二抗孵育、顯色、復(fù)染、脫水、封片等步驟。利用圖像分析系統(tǒng)對(duì)微血管密度進(jìn)行檢測(cè)，在低倍鏡（×40）下全面觀察切片，選取腫瘤組織中微血管分布最密集的區(qū)域，即所謂的“熱點(diǎn)”區(qū)域。然后在高倍鏡（×200）下，使用圖像分析軟件對(duì)“熱點(diǎn)”區(qū)域內(nèi)的微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)。微血管的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為：任何被CD34抗體染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，只要與鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞和其他結(jié)締組織明顯分開(kāi)，均計(jì)為一個(gè)微血管；對(duì)于相互連接的微血管，按照分支計(jì)數(shù)。每個(gè)切片選取3個(gè)不同的“熱點(diǎn)”區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為該切片的微血管密度值。為保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性和一致性，應(yīng)由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，若兩者結(jié)果差異較大，則重新計(jì)數(shù)并進(jìn)行討論分析。2.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析探討Slit2表達(dá)與微血管密度之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理運(yùn)用這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，能夠準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的內(nèi)在關(guān)系，為研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性提供有力保障。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織和正常組織中的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法，對(duì)30例下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及10例正常下咽組織中Slit2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，Slit2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。在正常下咽組織中，Slit2蛋白呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為40.0%（4/10）；而在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中，Slit2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%（20/30）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.320，P<0.05），這表明下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常下咽組織。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及正常下咽組織中Slit2mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.56±0.48），顯著高于正常下咽組織中的（0.85±0.26）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.210，P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2在mRNA水平的表達(dá)高于正常組織。綜合免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果，表明Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于正常下咽組織。這一差異可能是由于下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞為了獲取更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，需要誘導(dǎo)血管生成，而Slit2可能通過(guò)其在腫瘤血管生成中的作用，參與了這一過(guò)程，從而導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)。也有可能是腫瘤細(xì)胞的異常增殖和分化，引發(fā)了一系列信號(hào)通路的改變，使得Slit2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致其表達(dá)水平升高。3.2下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的微血管密度檢測(cè)結(jié)果對(duì)30例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行微血管密度檢測(cè)，結(jié)果顯示，微血管密度在不同臨床病理特征下存在差異。腫瘤大小方面，腫瘤直徑≥4cm的患者微血管密度為（35.67±6.82）個(gè)/mm2，明顯高于腫瘤直徑<4cm患者的（25.45±5.23）個(gè)/mm2，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.236，P<0.05）。這表明腫瘤越大，微血管密度越高，腫瘤的生長(zhǎng)需要更多的血管來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)支持，新生血管的生成與腫瘤的生長(zhǎng)呈正相關(guān)。在TNM分期上，Ⅰ-Ⅱ期患者的微血管密度為（24.50±4.56）個(gè)/mm2，Ⅲ-Ⅳ期患者的微血管密度為（36.78±7.05）個(gè)/mm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.452，P<0.05）。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，微血管密度逐漸升高，說(shuō)明腫瘤的發(fā)展伴隨著血管生成的增加，微血管密度可作為評(píng)估腫瘤分期和病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者微血管密度為（38.21±7.56）個(gè)/mm2，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的（26.12±5.89）個(gè)/mm2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.013，P<0.05）。微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高微血管密度為腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)提供了便利條件，增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。然而，微血管密度與患者的年齡、腫瘤部位以及臨床病理分化程度之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。不同年齡組患者的微血管密度無(wú)顯著差異，說(shuō)明年齡并非影響微血管密度的關(guān)鍵因素；腫瘤位于不同部位，其微血管密度也無(wú)明顯變化，提示腫瘤部位對(duì)微血管密度的影響較小；臨床病理分化程度不同的患者，微血管密度也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明微血管密度與腫瘤的分化程度無(wú)關(guān)。微血管密度與下咽鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評(píng)估下咽鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要指標(biāo)。3.3Slit2表達(dá)與微血管密度的相關(guān)性分析結(jié)果對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2表達(dá)與微血管密度進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示，兩者呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.430，P<0.05）。這表明，隨著下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2表達(dá)水平的升高，微血管密度也相應(yīng)增加。在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，Slit2可能通過(guò)多種潛在機(jī)制影響微血管密度。一方面，Slit2與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體Robo1結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路。相關(guān)研究表明，在結(jié)腸癌、乳腺癌等實(shí)體瘤中，Slit2-Robo1信號(hào)通路能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。在本研究中，下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)的Slit2可能同樣通過(guò)與Robo1結(jié)合，激活了Rac1、Cdc42等RhoGTP酶家族成員，調(diào)控細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，增加微血管密度。另一方面，Slit2可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，間接影響微血管生成。腫瘤微環(huán)境中存在多種細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，這些細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子能夠調(diào)節(jié)血管生成。Slit2可能通過(guò)影響這些細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，為微血管生成提供有利條件。此外，Slit2還可能與其他血管生成相關(guān)因子相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)微血管密度。例如，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Slit2與VEGF在腫瘤血管生成中存在相互調(diào)控的關(guān)系，兩者可能通過(guò)共同調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，影響微血管密度。在下咽鱗狀細(xì)胞癌中，Slit2可能與VEGF等因子協(xié)同作用，共同促進(jìn)微血管的生成，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供支持。下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)，Slit2可能通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤血管生成，影響微血管密度，進(jìn)而在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。四、分析與討論4.1Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)的原因探討本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著低于正常下咽組織。這一現(xiàn)象可能由多種因素導(dǎo)致，以下從基因調(diào)控、信號(hào)通路以及腫瘤微環(huán)境等角度進(jìn)行分析。從基因調(diào)控層面來(lái)看，基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化是影響基因表達(dá)的重要因素之一。在多種腫瘤中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌等，都有基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的報(bào)道。對(duì)于Slit2基因而言，其啟動(dòng)子區(qū)域可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)生高甲基化修飾。當(dāng)啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度升高時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子難以與之結(jié)合，從而阻礙了基因轉(zhuǎn)錄的起始，使得Slit2的mRNA合成減少，最終導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低。有研究對(duì)結(jié)直腸癌組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Slit2基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平明顯高于正常組織，且與Slit2蛋白的低表達(dá)呈正相關(guān)。在下咽鱗狀細(xì)胞癌中，可能也存在類(lèi)似的機(jī)制，需要進(jìn)一步通過(guò)甲基化特異性PCR等技術(shù)檢測(cè)Slit2基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)來(lái)驗(yàn)證這一推測(cè)。在信號(hào)通路方面，多條信號(hào)通路的異?？赡軈⑴c了Slit2表達(dá)的調(diào)控。以PI3K/Akt信號(hào)通路為例，該通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤微環(huán)境中，一些生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等，與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，能夠激活PI3K，進(jìn)而使Akt磷酸化激活?；罨腁kt可以通過(guò)多種途徑影響基因表達(dá)，其中一種可能的機(jī)制是抑制某些促進(jìn)Slit2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性。例如，Akt可能磷酸化并抑制FOXO家族轉(zhuǎn)錄因子，而FOXO家族成員被證實(shí)能夠促進(jìn)Slit2基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)PI3K/Akt信號(hào)通路過(guò)度激活時(shí)，F(xiàn)OXO轉(zhuǎn)錄因子的活性受到抑制，導(dǎo)致Slit2基因轉(zhuǎn)錄減少，表達(dá)水平下降。在其他腫瘤中，如肝癌，研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路能夠上調(diào)Slit2的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了該信號(hào)通路對(duì)Slit2表達(dá)的調(diào)控作用。此外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路也與Slit2表達(dá)密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路處于平衡狀態(tài)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中被降解復(fù)合物磷酸化，隨后被泛素化降解。當(dāng)Wnt信號(hào)通路異常激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。已有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且該通路的激活可能抑制Slit2的表達(dá)。在下咽鱗狀細(xì)胞癌中，可能由于Wnt信號(hào)通路的異常，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)積聚，抑制了Slit2基因的轉(zhuǎn)錄，從而使其表達(dá)降低。腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中的多種細(xì)胞和細(xì)胞因子也可能對(duì)Slit2的表達(dá)產(chǎn)生影響。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，可能通過(guò)旁分泌作用影響腫瘤細(xì)胞中Slit2的表達(dá)。研究表明，TNF-α可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路，而NF-κB信號(hào)通路的激活可能抑制Slit2基因的轉(zhuǎn)錄。在卵巢癌中，TAM分泌的TNF-α能夠降低腫瘤細(xì)胞中Slit2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，腫瘤微環(huán)境中的缺氧也是影響基因表達(dá)的重要因素。下咽鱗狀細(xì)胞癌組織由于快速增殖，常常處于缺氧狀態(tài)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在缺氧條件下穩(wěn)定表達(dá)并激活，它可以調(diào)控一系列基因的表達(dá)以適應(yīng)缺氧環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可能直接或間接抑制Slit2的表達(dá)，通過(guò)與Slit2基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，或者通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路間接影響Slit2的表達(dá)。在肺癌中，缺氧環(huán)境下HIF-1α的高表達(dá)與Slit2的低表達(dá)相關(guān)，且抑制HIF-1α能夠部分恢復(fù)Slit2的表達(dá)。基因調(diào)控、信號(hào)通路以及腫瘤微環(huán)境等多方面因素共同作用，可能導(dǎo)致了Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的低表達(dá)，這些因素之間也可能存在相互關(guān)聯(lián)和協(xié)同作用，共同影響著下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Slit2的表達(dá)水平。4.2微血管密度與下咽鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系分析本研究發(fā)現(xiàn)，微血管密度與下咽鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與患者的年齡、腫瘤部位以及臨床病理分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。腫瘤的生長(zhǎng)是一個(gè)依賴(lài)于血管生成的過(guò)程，隨著腫瘤體積的增大，其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的需求也相應(yīng)增加。當(dāng)腫瘤直徑≥4cm時(shí)，微血管密度顯著高于腫瘤直徑<4cm的情況，這表明腫瘤越大，需要更多的新生血管來(lái)提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，以滿足其快速生長(zhǎng)的需求。腫瘤的生長(zhǎng)和血管生成之間存在著正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，腫瘤細(xì)胞分泌的多種促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新生血管的形成。而新生血管又為腫瘤細(xì)胞提供了更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。在TNM分期方面，Ⅲ-Ⅳ期患者的微血管密度明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者。腫瘤的分期反映了腫瘤的發(fā)展程度，隨著分期的進(jìn)展，腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng)。高微血管密度為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了便利條件，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)新生血管更容易地侵入周?chē)M織和血管系統(tǒng)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究表明，在多種惡性腫瘤中，微血管密度與腫瘤的分期呈正相關(guān)，是評(píng)估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。在乳腺癌中，微血管密度高的患者往往處于更晚期的階段，預(yù)后較差。這與本研究在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的發(fā)現(xiàn)一致，說(shuō)明微血管密度可以作為評(píng)估下咽鱗狀細(xì)胞癌病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響下咽鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要因素之一。本研究顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者微血管密度顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。腫瘤細(xì)胞通過(guò)新生血管進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，容易在淋巴結(jié)中停留、增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。高微血管密度增加了腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)會(huì)，從而提高了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。在喉癌和下咽癌的研究中發(fā)現(xiàn)，微血管密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，原發(fā)癌組織中新生血管數(shù)量的增多可能預(yù)示著腫瘤有發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。微血管密度可以作為預(yù)測(cè)下咽鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，對(duì)于臨床治療方案的選擇具有重要的指導(dǎo)意義。微血管密度與下咽鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為評(píng)估腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的重要指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)微血管密度，有助于臨床醫(yī)生更準(zhǔn)確地判斷下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的病情，制定個(gè)性化的治療方案，提高患者的生存率和生存質(zhì)量。4.3Slit2表達(dá)與微血管密度相關(guān)性的潛在機(jī)制研究本研究發(fā)現(xiàn)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)，深入探究其潛在機(jī)制，對(duì)于理解下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。從細(xì)胞信號(hào)通路角度來(lái)看，Slit2主要通過(guò)與受體Robo結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Robo1是Slit2的重要受體之一。當(dāng)Slit2與Robo1結(jié)合后，會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。研究表明，該結(jié)合能夠激活RhoGTP酶家族成員，如Rac1和Cdc42。Rac1和Cdc42在細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，它們可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力。在血管生成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞需要遷移和增殖以形成新的血管網(wǎng)絡(luò)。Slit2-Robo1信號(hào)通路通過(guò)激活Rac1和Cdc42，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，使其能夠朝著腫瘤組織的方向遷移，為腫瘤提供更多的血管供應(yīng)。同時(shí)，該信號(hào)通路還可能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量，從而提高微血管密度。有研究在體外血管生成模型中發(fā)現(xiàn)，阻斷Slit2-Robo1信號(hào)通路后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力明顯下降，微血管的形成也受到抑制，這進(jìn)一步證實(shí)了該信號(hào)通路在調(diào)節(jié)微血管密度中的重要作用。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子也在Slit2與微血管密度的相關(guān)性中扮演著重要角色。腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞共同構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境，這些細(xì)胞能夠分泌大量的細(xì)胞因子和趨化因子。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種公認(rèn)的強(qiáng)效促血管生成因子。在下咽鱗狀細(xì)胞癌中，Slit2可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)或活性來(lái)影響微血管密度。一方面，Slit2可能直接作用于腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而影響VEGF的表達(dá)水平。另一方面，Slit2可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞的功能，間接影響VEGF的分泌和作用。例如，Slit2可能影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，使其分泌更多的促血管生成細(xì)胞因子，包括VEGF。此外，Slit2還可能與其他趨化因子相互作用，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和歸巢。趨化因子可以引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織遷移，參與微血管的形成。Slit2可能通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)或其受體的活性，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)趨化因子的響應(yīng)，進(jìn)而影響微血管密度。細(xì)胞外基質(zhì)的重塑也是Slit2影響微血管密度的潛在機(jī)制之一。血管生成過(guò)程涉及到細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新血管的形成提供空間和支持。Slit2可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)酶的表達(dá)和活性，參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、纖維連接蛋白等。當(dāng)Slit2表達(dá)上調(diào)時(shí)，可能促進(jìn)MMPs的表達(dá)和活性，使得細(xì)胞外基質(zhì)更容易被降解，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移創(chuàng)造有利條件。同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解產(chǎn)物還可以作為信號(hào)分子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能和微血管的生成。此外，Slit2還可能影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附作用，通過(guò)調(diào)節(jié)整合素等黏附分子的表達(dá)和活性，改變血管內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，從而影響微血管的形成和穩(wěn)定性。Slit2與微血管密度的相關(guān)性是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到細(xì)胞信號(hào)通路、腫瘤微環(huán)境以及細(xì)胞外基質(zhì)等多個(gè)層面的相互作用。深入研究這些潛在機(jī)制，將為下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。4.4研究結(jié)果對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌臨床治療的啟示本研究揭示了Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及其與微血管密度的緊密聯(lián)系，這一成果對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療具有重要的啟示作用。從治療靶點(diǎn)的角度來(lái)看，由于Slit2表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)，且在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，將其作為治療靶點(diǎn)具有極大的潛力。在未來(lái)的治療策略中，可以開(kāi)發(fā)針對(duì)Slit2或其受體Robo1的靶向藥物。例如，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的小分子抑制劑，阻斷Slit2與Robo1的結(jié)合，從而抑制下游信號(hào)通路的激活，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。在其他腫瘤的研究中，已有針對(duì)血管生成相關(guān)分子的靶向藥物取得了一定的治療效果。如貝伐單抗，作為一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的單克隆抗體，已廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，通過(guò)抑制VEGF的活性，減少腫瘤血管生成，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。借鑒這一思路，針對(duì)Slit2的靶向治療有望為下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療開(kāi)辟新的途徑。在臨床治療方案制定方面，研究結(jié)果也提供了重要的指導(dǎo)。對(duì)于Slit2高表達(dá)且微血管密度高的患者，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療外，可以考慮聯(lián)合使用針對(duì)Slit2的靶向治療。在手術(shù)前，通過(guò)靶向治療抑制腫瘤血管生成，使腫瘤組織的血液供應(yīng)減少，降低腫瘤的活性，提高手術(shù)切除的成功率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。在放療過(guò)程中，聯(lián)合Slit2靶向治療可能增強(qiáng)放療的敏感性，因?yàn)闇p少腫瘤血管生成可以使腫瘤細(xì)胞處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，而缺氧狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞對(duì)放療更為敏感。對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)的患者，以Slit2為靶點(diǎn)的治療可以作為主要的治療手段之一，與化療相結(jié)合，通過(guò)不同的作用機(jī)制協(xié)同抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。預(yù)后評(píng)估方面，Slit2表達(dá)和微血管密度可以作為重要的評(píng)估指標(biāo)。高Slit2表達(dá)和高微血管密度往往預(yù)示著腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，患者的預(yù)后可能較差。臨床醫(yī)生可以根據(jù)這兩個(gè)指標(biāo)，對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行更準(zhǔn)確的判斷，制定個(gè)性化的隨訪計(jì)劃。對(duì)于預(yù)后較差的患者，加強(qiáng)隨訪的頻率，密切監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況，及時(shí)調(diào)整治療方案。同時(shí)，這兩個(gè)指標(biāo)也可以用于評(píng)估治療效果，在治療過(guò)程中，通過(guò)檢測(cè)Slit2表達(dá)和微血管密度的變化，判斷治療是否有效，為后續(xù)治療決策提供依據(jù)。本研究結(jié)果為下咽鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供了新的思路和方向，通過(guò)將Slit2作為潛在的治療靶點(diǎn)，結(jié)合傳統(tǒng)治療方法，有望提高下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。五、結(jié)論與展望5.1研究的主要結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織及正常下咽組織的檢測(cè)分析，得出以下主要結(jié)論：首先，在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中，Slit2蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常下咽組織。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，Slit2蛋白在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%，明顯高于正常組織的40.0%；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（1.56±0.48），顯著高于正常組織的（0.85±0.26）。這表明Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為改變相關(guān)。其次，微血管密度與下咽鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤大小、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤直徑≥4cm患者的微血管密度顯著高于腫瘤直徑<4cm的患者；Ⅲ-Ⅳ期患者的微血管密度明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的微血管密度顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這說(shuō)明微血管密度可以作為評(píng)估下咽鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要指標(biāo)，高微血管密度往往提示腫瘤具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。最后，下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Slit2表達(dá)與微血管密度呈正相關(guān)關(guān)系。隨著Slit2表達(dá)水平的升高，微血管密度也相應(yīng)增加。這一相關(guān)性可能是由于Slit2通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體Robo1結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而增加微血管密度；也可能是Slit2通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子，間接影響微血管生成；還可能與Slit2參與細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，為微血管生成提供有利條件有關(guān)。本研究揭示了Slit2在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)特征及其與微血管密度的關(guān)系，為深入理解下咽鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為該疾病的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了重要的理論依據(jù)。5.2研究的局限性分析本研究雖然取得了一些有意義的成果，但仍存在一定的局限性。樣本量方面，本研究?jī)H納入了30例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者和10例正常下咽組織標(biāo)本，樣本量相對(duì)較小。較小的樣本量可能無(wú)法全面反映下咽鱗狀細(xì)胞癌患者群體的特征，存在抽樣誤差，導(dǎo)致研究結(jié)果的代表性不足。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，涵蓋不同年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期以及不同地域的患者，以增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性和普遍性。研究方法上，本研究主要采用了免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)Slit2的表達(dá)以及微血管密度，這些方法雖然是常用的檢測(cè)手段，但存在一定的局限性。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的判斷可能受到主觀因素的影響，不同的觀察者對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例的判斷可能存在差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程中，也可能受到多種因素的干擾，如RNA的降解、引物的特異性等，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來(lái)研究可以結(jié)合多種檢測(cè)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫印跡、基因芯片等，相互驗(yàn)證結(jié)果，提高研究的準(zhǔn)確性。在研究范圍上，本研究?jī)H探討了Slit2表達(dá)與微血管密度的關(guān)系，對(duì)于Slit2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制，如涉及的上下游信號(hào)通路、與其他分子的相互作用等，尚未進(jìn)行深入研究。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的相互作用。后續(xù)研究可以進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探究Slit2在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等方面的作用機(jī)制，為下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本研究還未考慮到其他可能影響下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的因素，如患者的生活習(xí)慣、遺傳因素、環(huán)境因素等。這些因素可能與Slit2表達(dá)和微血管密度存在潛在的關(guān)聯(lián)，對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。在今后的研究中，應(yīng)綜合考慮多種因素，進(jìn)行更全面、深入的研究。5.3未來(lái)研究方向的展望未來(lái)針對(duì)Slit2和下咽鱗狀細(xì)胞癌的研究具有廣闊的發(fā)展空間，可從多個(gè)關(guān)鍵方向展開(kāi)深入探索。在機(jī)制研究層面，需要進(jìn)一步深挖Slit2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制。一方面，應(yīng)全面解析Slit2-Robo信號(hào)通路的上下游分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。除了已發(fā)現(xiàn)的Rac1、Cdc42等RhoGTP酶家族成員，還需探尋是否存在其他未知的信號(hào)分子參與其中，以及這些分子之間的相互作用關(guān)系。通過(guò)基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9，在細(xì)胞系和動(dòng)物模型中敲除或過(guò)表達(dá)相關(guān)分子，觀察對(duì)Slit2信號(hào)通路及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，從而明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。另一方面，深入研究Slit2與其他血管生成相關(guān)因子的協(xié)同作用機(jī)制。除了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），還需研究Slit2與血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等多種血管生成因子之間的相互關(guān)系。通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)、基因表達(dá)譜分析等技術(shù)手段，揭示它們?cè)谡{(diào)控微血管生成過(guò)程中的協(xié)同或拮抗作用，為全面理解腫瘤血管生成機(jī)制提供更豐富的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用探索方面，基于Slit2的靶向治療研究具有重要的臨床價(jià)值。開(kāi)發(fā)特異性針對(duì)Slit2或其受體Robo1的小分子抑制劑、單克隆抗體等靶向藥物是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向之一。在藥物研發(fā)過(guò)程中，需要充分考慮藥物的特異性、有效性和安全性。通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，篩選出能夠有效阻斷Slit2-Robo信號(hào)通路，抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲的藥物，并進(jìn)行深入的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究。同時(shí)，開(kāi)展針對(duì)Slit2的靶向治療聯(lián)合傳統(tǒng)治療方法（手術(shù)、放療、化療）的臨床研究，評(píng)估聯(lián)合治療的療效和安全性。通過(guò)多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，明確聯(lián)合治療方案的最佳組合和治療時(shí)機(jī)，為下咽鱗狀細(xì)胞癌患者提供更優(yōu)化的治療策略。此外，將Slit2作為生物標(biāo)志物用于下咽鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估也是未來(lái)研究的重要方向。通過(guò)檢測(cè)血液、唾液、尿液等生物樣本中的Slit2水平，結(jié)合其他臨床指標(biāo)，建立高效準(zhǔn)確的早期診斷模型，提高下咽鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷率。同時(shí)，進(jìn)一步驗(yàn)證Slit2表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，完善預(yù)后評(píng)估體系，為臨床治療決策提供更有力的支持。未來(lái)對(duì)Slit2和下咽鱗狀細(xì)胞癌的研究將為該疾病的防治帶來(lái)新的突破和希望，通過(guò)深入的機(jī)制研究和廣泛的臨床應(yīng)用探索，有望為患者提供更精準(zhǔn)、有效的治療方法，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。六、參考文獻(xiàn)[1]姚磊，張中華，馬超，等。下咽鱗狀細(xì)胞癌中Slit2的表達(dá)及其與微血管密度關(guān)系的臨床研究[J].山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào)，2009,23(1):10-14.[2]Nusslein-VolhardC,WieschausE,KludingH.MutationsaffectingthepatternofthelarvalcuticleinDrosophilamelanogaster[J].WilhelmRoux’sArchivesofDevelopmentalBiology,1984,193(5):267-282.[3]WangY,SunX,FanX,etal.Slit2/Robosignalingpromotestumorangiogenesis[J].CancerCell,2004,6(3):269-281.[4]CarmelietP,JainRK.Angiogenesisincancerandotherdiseases[J].Nature,2000,407(6801):249-257.[5]SchmidBC,RezniczekGA,FabjaniG,etal.TheneuronalguidancecueSlit2inducestargetedmigrationandmayplayaroleinbrainmetastasisofbreastcancercells[J].BreastCancerResTreat,2007,106(3):333-342.[6]LiangK,ChungYS,OganaY,etal.Prognosticvalueofvascularendothelialgrowthfactorexpressioningastriccarcinoma[J].Cancer,1996,77(5):858-863.[7]PrasadA,QamriZ,WuJ,etal.Slit2/Robo1modulatestheCXCL12/CXCR4-inducedchemotaxisofTcells[J].JLeukocBiol,2007,82(3):465-476.[8]DicksonBJ,GilestroGF.RegulationofcommissuralaxonpathfindingbySlitanditsRoboreceptors[J].AnnuRevCellDevBiol,2006,22:651-675.[9]PalmeirimI,RodrignesS,DaleJK,etal.Developmentontime[J].AdvExpMedBiol,2008,641(1):62-71.[10]LiuD,HouJ,HuX,etal.NeuronalchemorepellentSlit2inhibitsvascularsmoothmusclecellmigrationbysuppressingsmallGTPaseRac1activation[J].CircRes,2006,98(4):480-489.[11]WuJY,FengL,ParkHT,etal.Slit,amoleculeknowntoguideaxonprojectionandneuronalmigration,inhibitsleukocytechemotaxisinducedbychemotacticfactors[J].Nature,2001,410(6831):948-952.[12]DetmarM.Tumorangiogenesis[J].InvestDermatolSympProc,2000,5(1):20-23.[13]CompagniA,ChristoforiG.Recentadvancesinresearchonmultistagetumorigenesis[J].BrJCancer,2000,83(1):1-5.[2]Nusslein-VolhardC,WieschausE,KludingH.MutationsaffectingthepatternofthelarvalcuticleinDrosophilamelanogaster[J].WilhelmRoux’sArchivesofDevelopmentalBiology,1984,193(5):267-282.[3]WangY,SunX,FanX,etal.Slit2/Robosignalingpromotestumorangiogenesis[J].CancerCell,2004,6(3):269-281.[4]CarmelietP,JainRK.Angiogenesisincancerandotherdiseases[J].Nature,2000,407(6801):249-257.[5]SchmidBC,RezniczekGA,FabjaniG,etal.TheneuronalguidancecueSlit2inducestargetedmigrationandmayplayaroleinbrainmetastasisofbreastcancercells[J].BreastCancerResTreat,2007,106(3):333-342.[6]LiangK,ChungYS,OganaY,etal.Prognosticvalueofvascularendothelialgrowthfactorexpressioningastriccarcinoma[J].Cancer,1996,77(5):858-863.[7]PrasadA,QamriZ,WuJ,etal.Slit2/Robo1modulatestheCXCL12/CXCR4-inducedchemotaxisofTcells[J].JLeukocBiol,2007,82(3):465-476.[8]DicksonBJ,GilestroGF.RegulationofcommissuralaxonpathfindingbySlitanditsRoboreceptors[J].AnnuRevCellDevBiol,2006,22:651-675.[9]PalmeirimI,RodrignesS,DaleJK,etal.Developmentontime[J].AdvExpMedBiol,2008,641(1):62-71.[10]LiuD,HouJ,HuX,etal.NeuronalchemorepellentSlit2inhibitsvascularsmoothmusclecellmigrationbysuppressingsmallGTPaseRac1activation[J].CircRes,2006,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