課時基因工程的基本工具和基本操作程序（含DNA的粗提

?。┖鸢傅?4課時基因工程的基本工具和基本操作程序

（含DNA的粗提?。?/p>

1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展起來

課標(biāo)

的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.DNA的粗提取與鑒定。4.闡明基

要求

因工程的基本操作程序。

1.基因工程的基本工具2024?湖南?T5

2024.貴州.T212024?湖南-T212024?甘肅?T21

2024?全國甲?T38

2023?湖北-T42023?新課標(biāo)?T62023?廣東120

考情2.基因工程的基本操作

2023?海南?T20

分析程序

2023?山東?T252023?天津-T172022?廣東-T22

2022?北京-T21

2022?山東?T25

3.DNA的粗提取與鑒定2024.安徽-T142024?山東-T132022?山東-T13

考點(diǎn)一基因工程的基本工具

■整合必備知識

1.基因工程的概念

操作環(huán)境M

--------生物Mn體外

操作水平DNA分子水平

一

基主要技術(shù)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)

因

工

程操作結(jié)果賦予生物新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合

一

人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品

變異原理基因重組

［提醒］基因工程的理論基礎(chǔ)

①基因是控制生物性狀的遺

傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單位；

外源基因在受里2

體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基礎(chǔ)’②遺傳信息的傳遞都遵循中

心法則；

③生物界共用一套遺傳密碼

復(fù)重組DNA：

制戢體+目的基同

I①DNA的基本組成單位都是

：四種脫氧核甘酸

［基因拼接｝理論.I②DNA分子都遵循堿基互補(bǔ)

基礎(chǔ)：配對原則

：③雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)

;都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)

［教材隱性知識］源自選擇性必修3P68”科技探索之路”肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了

遺傳物質(zhì)是DNA,還證明了DNA可以在同種生物的不同個體之間轉(zhuǎn)移;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)

菌擬核DNA之外的質(zhì)粒有自我復(fù)制能力,并可以在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移；多種限制酶、DNA

連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件；基因組編

管技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。

2.重組DNA技術(shù)的基本工具

（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡稱“限制酶”）

主要來源.原核生物

種類

分離的限制酶有數(shù)王種

識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序列,

限特點(diǎn)

使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵

制（專一性j

酶斷開

,切割位置：識別序列的中心軸線兩側(cè)

黏性鬻上5（GAA；TTC3-J3AATTC

末叫A之間3'CTT［AAG5'CTTAAG

結(jié)果.切割）中而線

切割位置：識別序列的中心軸線處

SmaII

平一（在G與5ZCCC!GGG3ZCCCGGG

末端（

C之間3'GGG：CCC5GGGCCC

切割）f

中軸線

［提醒］①限制酶的識別序列一般由6個核昔酸組成，少數(shù)由4個、8個或其他數(shù)量的核甘酸

組成。

②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。

③在切割含目的基因的DNA分子時，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個末端。只

有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。

（2）DNA連接酶

作用將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制

酶切開的目

DNA除酸二酯鍵

連寵我大腸桿菌

接E.coliDNA

酶

類型連接酶“縫合”互補(bǔ)的黏性末端

整一T4噬菌體

T4DNA

國虹“縫合”互補(bǔ)的黏性末端

連接酶

和平末端

(3)載體

種類-質(zhì)粒(常用載體)：環(huán)狀雙鏈DNA分子

L噬菌體、動植物病毒等

有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)

攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)

載特點(diǎn)胞后,能在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制,或整

件

合到受體DNA上,隨受體DNA同步復(fù)制

常有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA

分子的篩選

解攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞

3.DNA的粗提取與鑒定

(1)基本原理

初步分離DNA

與蛋白質(zhì)

溶解DNA

鑒定DNA

(2)操作流程

（取材、研磨］

［在漏斗中墊上紗布，將研磨液過

.,濾到燒杯中，在4七冰箱中放置

去除濾液中口八1u/t上討wm"心、/㈤】

士用<幾分鐘后（或直接將研磨液倒入

心安--------塑料離心管中，離心5min）,再

.取上清液

r在上清液中加入等體積的、預(yù)冷

的體積分?jǐn)?shù)為螫的酒精溶液，

靜置2~3min,用玻璃棒沿一個

IDNA的析出“方向攪拌，卷起絲狀物，用濾紙

吸去上面的水分（或?qū)⑷芤旱谷?/p>

塑料離心管中，離心5min,棄上清

.液，將管底的沉淀物晾干）

一將絲狀物或沉淀物用2mol/L的

..........———NaCl溶液溶解，然后加入二苯

〔fDNA的鑒/EJ胺試劑，混勻后置于沸水中加

.熱5min,冷卻后觀察顏色變化

［提醒］①本實(shí)驗(yàn)不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動物成熟的紅細(xì)

胞無細(xì)胞核和其他細(xì)胞器（無DNA）?？蛇x用雞血細(xì)胞作為材料。

②加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不

能形成絲狀沉淀。

Z判斷正誤

（1）使用不同的限制酶也能產(chǎn)生相同的黏性末端（2024?貴州，13D）（V）

（2）羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料（2020?海南，10A）（X）

提示羊?qū)儆诓溉閯游?，其成熟紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核，不可作為提取DNA的材料。

（3）向雞血細(xì)胞液中加蒸偏水?dāng)嚢瑁梢姴ＡО羯嫌邪咨z狀物（X）

提示向雞血細(xì)胞液中加蒸俺水?dāng)嚢?，雞血細(xì)胞吸水漲破，DNA溶于蒸偏水，觀察不到白色

絲狀物。

（4）動、植物細(xì)胞DNA的提取必須在無菌條件下進(jìn)行（2022?湖北，4A）（X）

提示動、植物細(xì)胞DNA的提取不需要在無菌條件下進(jìn)行。

提升關(guān)鍵能力

分析限制酶的作用和選擇

將從蘇云金桿菌中獲取的麻基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分

子工具且經(jīng)歷多個操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRI和A%eI切割質(zhì)粒。如圖表示常

用的限制酶識別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請思考以下問題：

限制酶識別序列及切割位點(diǎn):

NheI：GCTAGC

MunI：&ATTG

XbaI：TCTAGA

IJ

EcoRI：GAATTC

I

SpeI：ACTAGT

MunIXbaISpeI

—GAATTC—

—CTTAAG—

⑴限制酶EcoRI和N/zeI切割產(chǎn)生的黏性末端分別是和

—GCTAGC—

—CGATCG—

O

(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請說明理由。

提示用限制酶MMWI和*eI切割目的基因。限制酶M加I和EcoRI切割后形成的黏性

末端相同，限制酶MeI和取eI切割后形成的黏性末端相同，實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRI

和NheI切割質(zhì)粒，應(yīng)選用MunI和SpeI切割目的基因。

歸納總結(jié)口口由I*Vt、正+叉

限制酶的1選擇

標(biāo)記基因Pstl

PstISmaIPstI

EcoRI

SmaI抗病EcoRI

基因

甲乙

(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇尸srI而不選擇SmaI0

⑵保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選

擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaI。若載體上有兩個及以上的標(biāo)記

基因，則可合理對其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個標(biāo)記基因更高的篩選成

功率，防止只有一個標(biāo)記基因時出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表

達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選)。

⑶善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時，一般需

要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對目的基因所在

序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目

的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體

啟動子的方向(或描述為“RNA聚合酶的移動方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o

法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇PstI和EcoRI兩種限制酶。

(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某

種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端。

■評價遷移應(yīng)用

考向一辨析基因工程的基本工具

1.（2023?新課標(biāo)，6）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目

的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)

載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。

一GXATTC—3'5'—&ATCC-3'

5'

3,—CTTAAG—5Z3Z—CCTAGG—5Z

tt

酶1酶2

—CCC’GGG—3'

5'5Z—AGATCT—3Z

3,—GGG^CCC—5"3"—TCTACjA—5Z

酶3酶4

下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）

A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接

B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接

C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接

D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.co/z-DNA連接酶連接

答案C

解析酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶

3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意;

質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證

目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若

用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)

載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。

2.（2024?連云港調(diào)研）質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因（如圖所示），通過標(biāo)

記基因可以推知外源基因（目的基因）是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。

外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長情況不同。如表是外源基因插入（插入點(diǎn)有

a、b、c）后細(xì)菌的生長情況。下列有關(guān)敘述正確的是（）

四環(huán)素抗性基因

項(xiàng)目細(xì)菌在含氨革青霉素的培養(yǎng)基上生長情況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長情況

?能生長不能生長

②能生長能生長

③不能生長能生長

A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)

B.①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a,②是c,③是b

C.質(zhì)粒被一種限制酶切開時，被水解的磷酸二酯鍵有2個

D.將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA聚合酶

答案C

解析質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，A錯誤；①②③三種重組后細(xì)菌的外

源基因插入點(diǎn)①是b,②是c,③是a,B錯誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時需用DNA連接酶,

D錯誤。

B歸納提升

與DNA有關(guān)的幾種酶的比較

〔生理屋的〔隹里曳倒他理望圜

111

段㈣lOi-分DNA子二酯磷鍵酸多個將D片N段A切成兩個或

DNA力DNA分磷酸將兩個DNA片段連

連接酶O子片段二酯鍵接為一個DNA分子

,以DNA單鏈為模板,

DNA力脫氧磷酸將單個脫氧核甘酸依

聚合酶核甘酸二酯鍵次連接到單鏈末端

DNA堿基對中將雙鏈DNA分子的

解旋酶

分子的氫鍵兩條鏈解開

DNADNA磷酸將DNA片段水解為

水解酶分子二酯鍵單個脫氧核普酸

考向二DNA的粗提取與鑒定

3.（2024?安徽，14）下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（）

A.實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸儲水，DNA提取的效率會降低

B.利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA

C.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物

D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應(yīng)，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)

答案D

解析研磨液中含有NaCl,有利于DNA的溶解，若換為蒸儲水，DNA提取的效率會降低，

A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，因此利用DNA和蛋白質(zhì)

在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA,B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl

濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進(jìn)行粗提取，C正確；在沸水浴

的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍(lán)色，因此二苯胺試劑可用于鑒定DNA,不能檢測溶液

中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，D錯誤。

4.(2024?山東，13)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法正確的是()

A.整個提取過程中可以不使用離心機(jī)

B.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中

C.鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變

D.僅設(shè)置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾

答案A

解析研磨液在4°C冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應(yīng)取上清液倒入燒杯中，B錯

誤；鑒定過程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，C錯誤；加入二苯胺試劑后沸

水浴處理的時間要在5分鐘以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯

的顯色反應(yīng)，僅設(shè)置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾，D錯誤。

考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序

■整合必備知識

1.目的基因的篩選與獲取

(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的

基因。

(2)篩選合適的目的基因

①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。

②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進(jìn)行篩選。

(3)目的基因的獲取

①人工合成目的基因。

②PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

a.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理,在體外提供參與DNA復(fù)制

的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核甘酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

b.PCR反應(yīng)的條件：一定的緩沖溶液、DNA模板、2種引物、4種脫氧核昔酸、耐高溫的

DNA聚合酶，以及能自動調(diào)控溫度的儀器。

c.PCR擴(kuò)增的過程

當(dāng)溫度超過出七時，雙鏈DNA解聚為

1變性)一

單鏈

當(dāng)溫度下降到50七左右時，兩種引物通

I復(fù)性卜

過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合

當(dāng)溫度上升到這七左右時，溶液中的4種

(延伸)-脫氧核甘酸在耐高溫的DNA聚合酶的作

用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的

DNA鏈

d.PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。

［歸納提升］(1)耐高溫的DNA聚合酶的作用：催化合成DNA子鏈。

⑵引物(2種)的作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核甘酸。

(3)緩沖液的作用：維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定。

(4)復(fù)性溫度過高，則引物難以與模板鏈結(jié)合，溫度過低則易使兩條母鏈配對結(jié)合，均無法獲

得PCR產(chǎn)物。

③通過構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因。

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建一基因工程的核心

(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代,同時，使目的基因能夠表

達(dá)和發(fā)揮作用。

(2)基因表達(dá)載體的組成及作用

目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因或具有調(diào)

控作用的因子

表達(dá)載體啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部

復(fù)制原點(diǎn)位;能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

終止子:起調(diào)控作用，使轉(zhuǎn)錄在所需要

的地方停下來

標(biāo)記基因:便于重組DNA分子的篩選

(3)構(gòu)建過程

質(zhì)粒外源DNA片段

同一種限制酶或目的基因

產(chǎn)生相同末端的

限制酶切割,

兩個切口，獲得

一個切口，DNA連接酶

目的基因

兩個黏性末端

基因表達(dá)載體

［提醒］啟動子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比

項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子

本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA

位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端

RNA聚合酶識別和翻譯的結(jié)束信號

使轉(zhuǎn)錄在所需要翻譯的起始信號

功能結(jié)合的部位，驅(qū)動基（正常情況下，不

的地方停下來（編碼氨基酸）

因轉(zhuǎn)錄出mRNA編碼氨基酸）

3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

生物種類植物動物微生物

常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射法Ca2+處理法

受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞

將含有目的基因的表Ca2+處理細(xì)胞一細(xì)

將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T—

達(dá)載體提純一取卵胞處于一種能吸收

DNA中一農(nóng)桿菌f導(dǎo)入植物

轉(zhuǎn)化過程（受精卵）一顯微注射周圍環(huán)境中DNA分

細(xì)胞一整合到受體細(xì)胞的染色

一受精卵發(fā)育一獲得子的生理狀態(tài)一基

體DNA上f表達(dá)

具有新性狀的動物因表達(dá)載體導(dǎo)入

［辨析］（1）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。此

處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。

（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入

分子水平的檢測個體生物學(xué)

水平的鑒定

,提升關(guān)鍵能力

分析基因工程的基本操作程序

接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低

乙型肝炎發(fā)病率。乙型肝炎病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工

程技術(shù)獲得的乙型肝炎病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉栴}：

（1）制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導(dǎo)入酵

母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是用于篩

選含有重組表達(dá)載體的細(xì)胞。為確保目的基因可以正常表達(dá)，其上下游序列需具有啟動子和

終止子。

（2）目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細(xì)胞中提取

染色體DNA（基因組DNA）并用PCR擴(kuò)增,電泳后觀察是否擴(kuò)增出目的基因。

（3）若要通過實(shí)驗(yàn)檢測目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請簡要寫出實(shí)驗(yàn)思路。叢

酵母細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，再用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交，檢測是否出現(xiàn)雜交帶。

■評價遷移應(yīng)用

考向三辨析基因工程的基本操作程序

5.（2023?湖北，4）用氨革青霉素抗性基因（小秋，、四環(huán)素抗性基因（嶷曲作為標(biāo)記基因構(gòu)建的

質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)

載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）

A.若用H加dill酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同

B.若用尸oal酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用印〃I酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否

D.若用印酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨茶青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成

菌落

答案D

解析若用H山dill酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，

A正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不

同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；取/?I的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若

用Sp/i1酶切,重組質(zhì)粒中含氟芋青霉素抗性基因（4可產(chǎn)），因此在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成

菌落，D錯誤。

B歸納提升

雙標(biāo)記基因與影印接種法篩選含重組質(zhì)粒的菌落

(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因

內(nèi)部，則會導(dǎo)致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)

素抗性基因失活。

⑵被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌有三種：含自身環(huán)化目的基因的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含自身環(huán)化質(zhì)粒

的細(xì)菌。

(3)篩選方法：將混合處理后的細(xì)菌先放在含氨芾青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組

質(zhì)粒的細(xì)菌和含自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用無菌的絨布影印到

含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4,則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的細(xì)

菌即為含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芾青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5

菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

6.(2024?河池模擬)研究人員將目的基因插入質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程如圖所示，再將該重

組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。由〃CZ基因編碼產(chǎn)生的半乳糖甘酶可分解x—gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，

使菌落呈藍(lán)色，否則菌落為白色。下列敘述錯誤的是()

A.將目的基因插入質(zhì)粒中時，需要用到的酶有X/ioI、NheI和DNA連接酶

B.需要用Ca2+處理大腸桿菌，使其處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)

C.按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，大腸桿菌可正常表達(dá)該目的基因

D.在含X—gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可出現(xiàn)藍(lán)色菌落

答案C

解析按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，由于目的基因的轉(zhuǎn)錄方向和啟動子的方向相

反，大腸桿菌不能正常表達(dá)該目的基因，C錯誤；重組質(zhì)粒含有LacZ基因，其編碼產(chǎn)生的隹

半乳糖甘酶可分解X—gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故在含X—gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的

大腸桿菌，可使菌落呈藍(lán)色，D正確。

---------------------------查落實(shí)固基礎(chǔ)---------------------------

1.下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（）

A.與洋蔥相比，豬血更適合作為DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)的材料

B.實(shí)驗(yàn)中如果將研磨液更換為蒸儲水，DNA提取的效率會降低

C.因DNA溶于酒精但蛋白質(zhì)不溶于酒精可分離DNA與蛋白質(zhì)

D.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，取沉淀進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

E.預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解

F.加入預(yù)冷酒精析出白色絲狀物的過程中用玻璃棒沿一個方向輕輕攪拌

G.兩次離心，第一次DNA主要存在于上清液中，第二次主要存在于沉淀物中

H.將提取的絲狀物溶解在2moi/LNaCl溶液中，將二苯胺試劑加入就能出現(xiàn)藍(lán)色

答案ACDH

解析豬血細(xì)胞無細(xì)胞核，不適合用于提取DNA,A錯誤；因DNA不溶于酒精但某些蛋白

質(zhì)溶于酒精，因而可分離DNA與蛋白質(zhì)，C錯誤；研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA

在上清液中，故取上清液進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，D錯誤；將絲狀物溶解在2moi/LNaCl溶液中，加入

二苯胺試劑，經(jīng)過沸水浴加熱5min才會出現(xiàn)藍(lán)色，H錯誤。

2.下列關(guān)于基因工程中工具酶的敘述，正確的是（）

A.限制性內(nèi)切核酸酶可以從某些原核生物中提取

B.限制性內(nèi)切核酸酶也可以識別和剪切RNA

C.不同限制性內(nèi)切核酸酶可能切割出相同的黏性末端

D.DNA連接酶連接的是兩條鏈堿基對之間的氫鍵

E.E.coliDNA連接酶只能將有互補(bǔ)黏性末端的兩個DNA片段連接起來

答案AC

解析限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核甘酸序列，不能識別剪切RNA,B錯誤;DNA

連接酶連接的是兩個DNA片段之間的磷酸二酯鍵，D錯誤；DNA連接酶既能連接具

有黏性末端的DNA片段，也能連接具有平末端的DNA片段，只是連接具有平末端的DNA

片段的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶，E錯誤。

3.下列關(guān)于基因工程中載體的敘述，錯誤的是（）

A.基因工程中所用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動植物病毒等

B.基因工程中用的載體大多數(shù)為天然質(zhì)粒

C.質(zhì)粒是常用的載體，有2個游離的磷酸基團(tuán)

D.必須具有自我復(fù)制能力

E.具有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)，以便目的基因的插入

F.載體質(zhì)粒中必須有抗生素抗性基因，便于重組DNA分子的篩選

答案BCF

解析在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改

造的，B錯誤；質(zhì)粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，無游離的磷酸基團(tuán)，C錯誤；載體質(zhì)粒中

必須有標(biāo)記基因，但不一定是抗生素抗性基因，F(xiàn)錯誤。

4.下列關(guān)于基因表達(dá)載體及其構(gòu)建過程的說法，正確的是（）

A.基因工程的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建

B.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是使目的基因在受體細(xì)胞中能穩(wěn)定存在且遺傳給下一代

C.一個基因表達(dá)載體一般包括目的基因、標(biāo)記基因、起始密碼子和終止密碼子等結(jié)構(gòu)

D.基因表達(dá)載體的構(gòu)建至少需要兩種工具酶

E.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程中會發(fā)生堿基互補(bǔ)配對

F.誘導(dǎo)物與誘導(dǎo)型啟動子結(jié)合可激活或抑制目的基因表達(dá)

G.基因表達(dá)載體中啟動子具有DNA聚合酶的結(jié)合部位，啟動復(fù)制過程

答案ABDEF

解析基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等部分，C錯誤；基因表達(dá)

載體中啟動子具有RNA聚合酶的結(jié)合部位，啟動轉(zhuǎn)錄過程，G錯誤。

5.下列關(guān)于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測和鑒定的敘述，正確的（）

A.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是利用土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，然后將重組Ti質(zhì)粒整合到受體植物細(xì)胞

的染色體DNA上

B.將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌中時，可以用鈣離子處理細(xì)菌

C.應(yīng)該將抗蟲基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T—DNA片段內(nèi)

D.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用體細(xì)胞作受體細(xì)胞，采用顯微注射技術(shù)進(jìn)行操作

E.可采用PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄和翻譯

F.某抗蟲基因轉(zhuǎn)基因是否成功，最簡便的方法是觀察該植物有沒有抗蟲性狀

答案BCF

解析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因插入農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中的T—DNA上，讓攜帶目的基因

的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細(xì)胞的染色

體DNA上，A錯誤；動物受精卵全能性最高，應(yīng)用顯微注射技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入受精卵來

獲得轉(zhuǎn)基因動物，D錯誤；可采用PCR檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄，采用抗原一抗體雜交技術(shù)檢

測目的基因是否翻譯，E錯誤。

課時精練

選擇題1?2題，每小題7分，3?6題，每小題8分，共46分。

一、選擇題

1.（2024?湖南，5）某同學(xué)將質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析

可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）

A.限制酶失活，更換新的限制酶

B.酶切條件不合適，調(diào)整反應(yīng)條件如溫度和酶的用量等

C.質(zhì)粒DNA突變導(dǎo)致酶識別位點(diǎn)缺失，更換正常質(zhì)粒DNA

D.酶切位點(diǎn)被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶

答案B

解析限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應(yīng)更換新的限制酶，A正確；在酶切條件

不合適時，可能會出現(xiàn)DNA完全沒有被酶切的情況，需要調(diào)整反應(yīng)條件如溫度、pH等，但

調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；質(zhì)粒DNA突變可能會導(dǎo)致限制酶識別位點(diǎn)缺失，進(jìn)而造

成限制酶無法進(jìn)行切割，此時應(yīng)更換為正常質(zhì)粒DNA,C正確；質(zhì)粒DNA上酶切位點(diǎn)被甲

基化修飾，會導(dǎo)致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進(jìn)行酶切，此時應(yīng)換用對DNA甲基化不

敏感的限制酶，D正確。

2.（2024?石家莊調(diào)研）圖1為某種質(zhì)粒簡圖，圖2表示某外源DNA上的目的基因，小箭頭所

指分別為限制酶EcoRI、BamHI、HindIII的酶切位點(diǎn)。下列有關(guān)敘述錯誤的是（）

EcoRIEcoRI

外源

.IIIII川川II川llllllll,

-ffDNA

BatnWIHindJH

圖2

A.在基因工程中若只用一種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割，則可選EcoRI

B.如果將一個外源DNA分子和一個質(zhì)粒分別用EcoRI酶切后，再用DNA連接酶連接,

形成一個含有目的基因的重組DNA,此重組DNA中EcoRI切割位點(diǎn)有1個

C.為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHI和“泳皿

兩種限制酶同時處理質(zhì)粒和目的基因

D.一個如圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)EcoRI切割后，含有2個游離的磷酸基團(tuán)

答案B

解析圖中目的基因兩側(cè)都有EcoRI酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒上也存在EcoRI酶切位點(diǎn)，若只用一

種限制酶完成對質(zhì)粒和外源DNA的切割，可選EcoRI,A正確；EcoRI切割外源DNA

分子和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，形成的含目的基因的重組DNA分子中，EcoRI酶切

割位點(diǎn)有2個，B錯誤；為了防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可

使用BamHI和HindIII兩種限制酶同時處理質(zhì)粒和目的基因，C正確；該質(zhì)粒分子經(jīng)EcoRI

切割后，產(chǎn)生兩個黏性末端，含有2個游離的磷酸基團(tuán)，D正確。

3.（2022?山東，13）關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯誤的是（）

A.過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解

B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀

C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色

D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)

答案B

解析離心研磨液是為了使細(xì)胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈

現(xiàn)藍(lán)色，C正確。

4.（2023?廣東，11）“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程：裂解一分離一沉淀一鑒定。

下列敘述錯誤的是（）

A.裂解：使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)

B.分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等

C.沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度

D.鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色

答案D

解析裂解是使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)，針對不同的實(shí)驗(yàn)材料，可選擇不同的方法破

壞細(xì)胞，如植物細(xì)胞可選擇研磨的方法，而動物細(xì)胞可選擇吸水漲破的方法，A正確；DNA

在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2moi/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將

混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒

精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA的純度，C正確；將DNA溶于NaCl溶液

中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘，待冷卻后，溶液能呈現(xiàn)藍(lán)色，D錯誤。

5.（2025?黃石模擬）如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因（GM4）和尾穗寬凝集素基因（ACA）

與載體（pBH21）結(jié)合，然后導(dǎo)入棉花細(xì)胞。下列操作不符合實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖牵ǎ?/p>

卡那霉素

Kp”IB,BIBsaBlXholKpnl基因

GNAM

廠pBI、121

\/（]

GNAIIMCA/

KpnlXho\KpnI啟動子

1Xho1

重組載體

A.用PCR技術(shù)可檢測GNA和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細(xì)胞中

B.將棉花細(xì)胞接種在含氨革青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

C.用限制酶BsaBI和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA—ACA融合基因

D.與只用KpnI相比，KpnI和XhoI處理融合基因和載體可保證基因轉(zhuǎn)錄方向正確

答案B

解析根據(jù)GNA-ACA融合基因的兩端序列設(shè)計合適的引物，可以利用PCR技術(shù)檢測GNA

和ACA基因是否導(dǎo)入棉花細(xì)胞的染色體DNA上，A正確；由于重組質(zhì)粒含有卡那霉素抗性

基因，故將棉花細(xì)胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，B