68Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物：開(kāi)啟GRP受體靶向PET顯像的精準(zhǔn)醫(yī)療新時(shí)代一、引言1.1研究背景與意義正電子發(fā)射斷層顯像（PET）作為一種先進(jìn)的影像學(xué)技術(shù)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中占據(jù)著舉足輕重的地位。它能夠從分子水平對(duì)生物體內(nèi)的生理和病理過(guò)程進(jìn)行可視化成像，為疾病的早期診斷、精準(zhǔn)分期以及治療方案的制定和療效評(píng)估提供關(guān)鍵信息，在腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)和心血管病學(xué)等多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都發(fā)揮著不可替代的作用。在腫瘤領(lǐng)域，PET顯像能夠檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞代謝的異常變化，有助于在腫瘤早期、尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變時(shí)就實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷，大大提高了腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)率，為患者爭(zhēng)取了寶貴的治療時(shí)機(jī)。例如，在肺癌的診斷中，PET顯像可以準(zhǔn)確區(qū)分肺部結(jié)節(jié)的良惡性，避免不必要的手術(shù)；在腫瘤分期方面，PET顯像能夠全面檢測(cè)全身轉(zhuǎn)移灶，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。胃泌素釋放肽受體（GRPreceptor，GRPR）作為一種重要的細(xì)胞表面受體，在多種生理和病理過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。在正常生理狀態(tài)下，GRPR參與調(diào)節(jié)胃腸道的分泌和運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)以及細(xì)胞的增殖和分化等過(guò)程。然而，大量研究表明，在眾多惡性腫瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)瘤等，GRPR呈現(xiàn)出異常高表達(dá)的特征。這種異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，使其成為腫瘤診斷和治療領(lǐng)域極具潛力的分子靶點(diǎn)。以前列腺癌為例，GRPR的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，使得腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。通過(guò)靶向GRPR，可以阻斷相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，為腫瘤治療開(kāi)辟新的途徑。蛙皮素（Bombesin）作為一種天然存在的多肽，與人體內(nèi)的胃泌素釋放肽（GRP）在C端具有相同的7個(gè)氨基酸序列，因此與GRPR具有高度的親和力。這一特性使得蛙皮素能夠特異性地結(jié)合GRPR，從而為腫瘤的靶向診斷和治療提供了可能。然而，天然蛙皮素在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多局限性，如體內(nèi)穩(wěn)定性差、代謝速度快、非特異性攝取高等問(wèn)題，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了其在臨床中的應(yīng)用效果。為了克服這些局限性，科研人員對(duì)蛙皮素進(jìn)行了一系列的結(jié)構(gòu)修飾和改造，通過(guò)合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化，成功開(kāi)發(fā)出了多種蛙皮素衍生物。這些衍生物不僅保留了與GRPR的高親和力，還在體內(nèi)穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)特性等方面有顯著改善，展現(xiàn)出了更為優(yōu)越的應(yīng)用前景。放射性核素標(biāo)記技術(shù)是將放射性核素引入到生物分子中，使其能夠在體內(nèi)被追蹤和成像的重要手段。在眾多放射性核素中，^{68}Ga因其獨(dú)特的物理性質(zhì)和化學(xué)特性，成為了標(biāo)記蛙皮素衍生物的理想選擇。^{68}Ga具有合適的半衰期（約68分鐘），既能保證在體內(nèi)有足夠的時(shí)間進(jìn)行成像，又能使患者接受的輻射劑量保持在較低水平。同時(shí)，^{68}Ga標(biāo)記過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)便，標(biāo)記效率高，標(biāo)記后的化合物具有良好的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，能夠滿足PET顯像對(duì)顯像劑的嚴(yán)格要求。^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物用于PET顯像，為腫瘤的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供了一種全新的策略。通過(guò)PET顯像，可以在分子水平上清晰地顯示腫瘤組織中GRPR的表達(dá)分布情況，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期精準(zhǔn)診斷和分期。同時(shí)，這種顯像技術(shù)還能夠?yàn)槟[瘤的靶向治療提供重要的指導(dǎo)信息，幫助醫(yī)生篩選出適合接受靶向治療的患者，制定個(gè)性化的治療方案，提高治療效果，降低治療副作用。此外，^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物PET顯像在腫瘤治療療效評(píng)估方面也具有重要價(jià)值，能夠及時(shí)準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中腫瘤的變化，為調(diào)整治療方案提供依據(jù)。綜上所述，開(kāi)展^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物靶向GRP受體的PET顯像研究具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為腫瘤的診斷和治療帶來(lái)新的突破。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在放射性核素標(biāo)記化合物的研究領(lǐng)域，^{68}Ga標(biāo)記的化合物近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。^{68}Ga作為一種理想的正電子發(fā)射體，其標(biāo)記技術(shù)在國(guó)內(nèi)外都取得了顯著進(jìn)展。國(guó)外方面，眾多科研團(tuán)隊(duì)在^{68}Ga標(biāo)記的方法學(xué)研究上不斷深入，開(kāi)發(fā)出了多種高效、簡(jiǎn)便的標(biāo)記策略，以提高標(biāo)記效率和標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。例如，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件和選擇合適的雙功能螯合劑，使得^{68}Ga能夠更快速、更穩(wěn)定地與生物分子結(jié)合。同時(shí)，在新型^{68}Ga標(biāo)記化合物的研發(fā)上也成果豐碩，許多具有特異性靶向功能的^{68}Ga標(biāo)記探針被成功開(kāi)發(fā)出來(lái)，并在臨床前和臨床研究中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。在腫瘤顯像方面，^{68}Ga標(biāo)記的生長(zhǎng)抑素類似物已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出腫瘤的位置和范圍，為臨床治療提供了重要依據(jù)。國(guó)內(nèi)對(duì)于^{68}Ga標(biāo)記化合物的研究也在積極開(kāi)展，緊跟國(guó)際前沿?？蒲腥藛T在借鑒國(guó)外先進(jìn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)實(shí)際情況，進(jìn)行了一系列創(chuàng)新性研究。在標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)化上，通過(guò)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)流程和采用國(guó)產(chǎn)試劑，降低了標(biāo)記成本，提高了標(biāo)記的可重復(fù)性。同時(shí)，在新型^{68}Ga標(biāo)記化合物的研發(fā)方面，也取得了一些重要成果，部分研究成果已達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。例如，國(guó)內(nèi)研發(fā)的^{68}Ga標(biāo)記的某些多肽類顯像劑，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了對(duì)特定腫瘤的高親和力和特異性攝取，為腫瘤的早期診斷提供了新的手段。蛙皮素衍生物的研究同樣是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。國(guó)外對(duì)蛙皮素衍生物的設(shè)計(jì)和合成進(jìn)行了大量研究，通過(guò)對(duì)蛙皮素的氨基酸序列進(jìn)行修飾和改造，成功合成了多種具有不同特性的蛙皮素衍生物。這些衍生物在與GRPR的親和力、體內(nèi)穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)特性等方面都有了顯著改善。一些蛙皮素衍生物在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的腫瘤靶向性，能夠有效地富集在腫瘤組織中，為腫瘤的靶向診斷和治療提供了有力工具。例如，某些蛙皮素衍生物能夠特異性地結(jié)合前列腺癌組織中的GRPR，通過(guò)放射性核素標(biāo)記后，可用于前列腺癌的PET顯像，提高了前列腺癌的早期診斷率。國(guó)內(nèi)在蛙皮素衍生物的研究上也取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。科研人員通過(guò)自主創(chuàng)新，設(shè)計(jì)合成了一系列具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的蛙皮素衍生物，并對(duì)其生物學(xué)活性和作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。部分國(guó)產(chǎn)蛙皮素衍生物在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了與國(guó)外同類產(chǎn)品相當(dāng)?shù)男阅埽哂袕V闊的應(yīng)用前景。一些國(guó)內(nèi)研發(fā)的蛙皮素衍生物在肝癌、肺癌等腫瘤的靶向治療研究中，展現(xiàn)出了抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的潛力，為腫瘤治療提供了新的候選藥物。針對(duì)GRP受體靶向PET顯像的研究，國(guó)內(nèi)外都進(jìn)行了大量的探索。國(guó)外在這方面的研究起步較早，已經(jīng)開(kāi)展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證了GRP受體靶向PET顯像在腫瘤診斷和治療中的價(jià)值。通過(guò)使用^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物作為顯像劑，能夠清晰地顯示腫瘤組織中GRPR的表達(dá)情況，為腫瘤的早期診斷、分期和治療方案的選擇提供了重要依據(jù)。例如，在前列腺癌的診療中，GRP受體靶向PET顯像能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)出腫瘤的轉(zhuǎn)移灶，幫助醫(yī)生制定更精準(zhǔn)的治療方案，提高患者的生存率。國(guó)內(nèi)在GRP受體靶向PET顯像的研究方面也取得了顯著成果?？蒲腥藛T通過(guò)不斷優(yōu)化顯像劑的制備工藝和顯像條件，提高了PET顯像的靈敏度和特異性。同時(shí)，結(jié)合國(guó)內(nèi)腫瘤患者的特點(diǎn)，開(kāi)展了相關(guān)的臨床研究，為GRP受體靶向PET顯像在國(guó)內(nèi)的臨床應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。在一些大型醫(yī)院，已經(jīng)將GRP受體靶向PET顯像應(yīng)用于臨床實(shí)踐，為腫瘤患者的診斷和治療帶來(lái)了新的希望。盡管國(guó)內(nèi)外在^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物靶向GRP受體的PET顯像研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍然存在一些不足之處。部分^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物在體內(nèi)的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)特性仍有待進(jìn)一步優(yōu)化，以提高顯像的準(zhǔn)確性和可靠性。目前的研究主要集中在幾種常見(jiàn)的腫瘤類型上，對(duì)于一些罕見(jiàn)腫瘤的應(yīng)用研究還相對(duì)較少，需要進(jìn)一步拓展研究范圍。此外，^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物的制備成本較高，限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用，因此需要開(kāi)發(fā)更加經(jīng)濟(jì)、高效的制備方法。在顯像技術(shù)方面，如何進(jìn)一步提高PET顯像的分辨率和靈敏度，也是未來(lái)研究需要解決的重要問(wèn)題。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在構(gòu)建一種新型的靶向腫瘤GRP受體的蛙皮素衍生物，并通過(guò)^{68}Ga標(biāo)記制備PET顯像分子探針，全面評(píng)估其用于腫瘤顯像的可行性，為腫瘤的早期精準(zhǔn)診斷提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：蛙皮素衍生物多肽的構(gòu)建：運(yùn)用固相多肽合成技術(shù)，精心設(shè)計(jì)并合成靶向腫瘤GRP受體的蛙皮素衍生物拮抗劑多肽（DPhe-Gin-Trp-Ala-NMeGly-His-Sta-Leu，主肽，ATBBN）以及蛙皮素受體激動(dòng)劑多肽（Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met，對(duì)照肽，AGBBN）。在合成過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保多肽的純度和質(zhì)量。采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)合成的多肽進(jìn)行分離和純化，以去除雜質(zhì)和未反應(yīng)的原料。利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)純化后的多肽進(jìn)行鑒定，通過(guò)精確測(cè)定多肽的分子量，與理論值進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)多肽的結(jié)構(gòu)和序列是否正確，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供高質(zhì)量的多肽材料。熒光標(biāo)記探針的制備與細(xì)胞、活體水平顯像評(píng)估：采用熒光標(biāo)記技術(shù)，將熒光基團(tuán)連接到ATBBN上，合成熒光探針FAM-ATBBN。在標(biāo)記過(guò)程中，優(yōu)化標(biāo)記條件，提高標(biāo)記效率，確保熒光探針的穩(wěn)定性和活性。選用高表達(dá)GRPR的前列腺癌PC3細(xì)胞株開(kāi)展細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用倒置顯微鏡、共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀等設(shè)備，進(jìn)行細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)。通過(guò)倒置顯微鏡可以直觀地觀察細(xì)胞對(duì)熒光探針的攝取情況，共聚焦顯微鏡則能夠提供更詳細(xì)的細(xì)胞內(nèi)熒光分布信息，流式細(xì)胞儀能夠準(zhǔn)確地定量分析細(xì)胞攝取熒光探針的程度，從細(xì)胞層面驗(yàn)證多肽的靶向性。建立荷PC3前列腺癌移植瘤模型，通過(guò)組織病理學(xué)驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。對(duì)荷瘤裸鼠尾靜脈注射FAM-ATBBN，在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行活體熒光攝取實(shí)驗(yàn)。利用熒光成像設(shè)備，采集裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)的分布圖像，勾畫感興趣區(qū)，計(jì)算腫瘤/非腫瘤比值，評(píng)估熒光探針在活體水平對(duì)腫瘤的靶向能力和顯像效果。Ga標(biāo)記PET分子探針的制備與質(zhì)量控制：采用螯合方法，將^{68}Ga與NOTA（1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸）和ATBBN進(jìn)行結(jié)合，合成PET分子探針^{68}Ga-NOTA-ATBBN、^{68}Ga-NOTA-AGBBN及^{68}Ga-NOTA-PEG4-ATBBN。在標(biāo)記過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值等，以提高標(biāo)記效率和標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。使用HPLC對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除未反應(yīng)的^{68}Ga、NOTA和其他雜質(zhì)，確保探針的純度。采用放射性核素活度計(jì)測(cè)定探針的放射性活度，通過(guò)HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度，要求放射化學(xué)純度大于95%。對(duì)探針進(jìn)行穩(wěn)定性研究，將其在不同條件下保存，定期檢測(cè)其放射性活度和放射化學(xué)純度，評(píng)估其在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性，確保探針在使用過(guò)程中的質(zhì)量和性能。Ga標(biāo)記PET分子探針的microPET/CT顯像研究：選取GRPR高表達(dá)的前列腺癌PC3荷瘤裸鼠模型和GRPR低表達(dá)的結(jié)直腸癌HT29荷瘤裸鼠模型，通過(guò)microPET/CT顯像，對(duì)比觀察^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針在不同腫瘤模型中的腫瘤攝取情況。在顯像前，對(duì)裸鼠進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備，如禁食、麻醉等，以確保顯像結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)分析microPET/CT圖像，定量測(cè)定腫瘤部位的放射性攝取量，計(jì)算腫瘤/非腫瘤比值，評(píng)估探針的腫瘤靶向特異性和顯像靈敏度。對(duì)部分PC3荷瘤裸鼠模型使用胃泌素釋放肽進(jìn)行阻斷，然后進(jìn)行microPET/CT顯像，對(duì)比觀察阻斷前后^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的腫瘤攝取情況，進(jìn)一步驗(yàn)證探針的靶向特異性，明確其與GRPR的結(jié)合是特異性的，而非非特異性攝取。顯像后，對(duì)未阻斷組PC3荷瘤裸鼠模型的離體組織進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，測(cè)定^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的生物分布情況，以每克組織百分注射劑量率（%ID/g）表示。通過(guò)對(duì)不同組織的放射性計(jì)數(shù)，了解探針在體內(nèi)的分布情況，評(píng)估其在正常組織和腫瘤組織中的攝取差異，為臨床應(yīng)用提供重要的生物分布信息。二、PET顯像技術(shù)與GRP受體概述2.1PET顯像技術(shù)原理與應(yīng)用PET顯像技術(shù)作為一種高端的影像學(xué)檢查手段，其基本原理是基于正電子核素的放射性衰變。正電子核素是一類特殊的放射性核素，它們?cè)谒プ冞^(guò)程中會(huì)發(fā)射出正電子。當(dāng)正電子發(fā)射體被引入人體后，正電子會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)與周圍組織中的電子發(fā)生湮滅反應(yīng)。在湮滅過(guò)程中，質(zhì)量轉(zhuǎn)化為能量，以一對(duì)能量相等（511keV）、方向相反的γ光子的形式釋放出來(lái)。PET掃描儀的探測(cè)器能夠精確地捕捉到這些γ光子，并根據(jù)它們的飛行方向和到達(dá)時(shí)間，通過(guò)復(fù)雜的數(shù)學(xué)算法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，重建出正電子發(fā)射體在體內(nèi)的分布圖像，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體內(nèi)生理和病理過(guò)程的可視化成像。在實(shí)際應(yīng)用中，PET顯像技術(shù)需要使用放射性示蹤劑。這些示蹤劑通常是將正電子核素標(biāo)記在具有特定生物學(xué)活性的分子上，如葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等。不同的示蹤劑能夠特異性地參與不同的生物代謝過(guò)程，從而為不同疾病的診斷提供了有力的工具。以常用的^{18}F-FDG（氟代脫氧葡萄糖）為例，它是葡萄糖的類似物，能夠被細(xì)胞攝取并參與糖代謝過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，人體各組織對(duì)^{18}F-FDG的攝取量相對(duì)穩(wěn)定，且與組織的代謝活性相關(guān)。然而，在腫瘤組織中，由于腫瘤細(xì)胞具有異常旺盛的糖酵解代謝，對(duì)葡萄糖的攝取和利用顯著增加，因此腫瘤組織對(duì)^{18}F-FDG的攝取量明顯高于正常組織。通過(guò)PET顯像，就能夠清晰地顯示出腫瘤組織的位置、大小和代謝活性，為腫瘤的早期診斷和分期提供重要依據(jù)。PET顯像技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛，尤其是在腫瘤、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤診斷方面，PET顯像能夠檢測(cè)出腫瘤細(xì)胞代謝的異常變化，有助于在腫瘤早期、尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變時(shí)就實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷。例如，在肺癌的診斷中，PET顯像可以準(zhǔn)確區(qū)分肺部結(jié)節(jié)的良惡性，避免不必要的手術(shù)。研究表明，PET顯像對(duì)肺癌的診斷靈敏度和特異性均較高，能夠顯著提高肺癌的早期診斷率。對(duì)于已經(jīng)確診的腫瘤患者，PET顯像還可以用于腫瘤的分期，全面檢測(cè)全身轉(zhuǎn)移灶，為制定個(gè)性化的治療方案提供依據(jù)。在乳腺癌的診療中，PET顯像能夠幫助醫(yī)生準(zhǔn)確判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，指導(dǎo)手術(shù)范圍的確定和后續(xù)治療方案的選擇，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。在心血管疾病的診斷中，PET顯像主要用于評(píng)估心肌的代謝和功能。心肌是人體代謝最活躍的組織之一，對(duì)能量的需求非常高，主要依賴脂肪酸和葡萄糖的氧化代謝來(lái)提供能量。當(dāng)心肌發(fā)生缺血或梗死時(shí)，心肌細(xì)胞的代謝會(huì)發(fā)生顯著變化，對(duì)葡萄糖的攝取和利用會(huì)增加，而對(duì)脂肪酸的攝取和利用會(huì)減少。通過(guò)使用^{18}F-FDG等示蹤劑，PET顯像可以清晰地顯示心肌的代謝情況，準(zhǔn)確判斷心肌是否存在缺血、梗死以及心肌的存活情況。這對(duì)于冠心病的診斷、治療方案的選擇以及評(píng)估治療效果都具有重要意義。例如，對(duì)于心肌梗死患者，PET顯像可以幫助醫(yī)生確定是否需要進(jìn)行血管重建手術(shù)，以及評(píng)估手術(shù)的效果和預(yù)后。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷中，PET顯像可以用于檢測(cè)大腦的代謝和功能變化，輔助診斷多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。例如，在阿爾茨海默病的早期診斷中，PET顯像可以通過(guò)檢測(cè)大腦顳葉、頂葉等區(qū)域的葡萄糖代謝減低情況，提前發(fā)現(xiàn)疾病的病理改變，為早期干預(yù)和治療提供依據(jù)。研究顯示，在阿爾茨海默病患者中，大腦特定區(qū)域的葡萄糖代謝明顯低于正常人，PET顯像能夠敏感地檢測(cè)到這種差異，有助于早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。在癲癇的診斷中，PET顯像可以定位癲癇病灶，幫助醫(yī)生確定手術(shù)切除的范圍，提高癲癇的治療效果。通過(guò)PET顯像，可以發(fā)現(xiàn)癲癇病灶在發(fā)作間期的葡萄糖代謝減低，以及在發(fā)作期的代謝增高，從而準(zhǔn)確地定位癲癇病灶，為手術(shù)治療提供重要指導(dǎo)。PET顯像技術(shù)在腫瘤診斷中具有諸多優(yōu)勢(shì)。其靈敏度極高，能夠檢測(cè)到微小的腫瘤病灶，甚至在腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少、尚未形成明顯腫塊時(shí)就能夠發(fā)現(xiàn)異常。例如，在甲狀腺癌的早期診斷中，PET顯像可以檢測(cè)到直徑小于1cm的微小癌灶，大大提高了早期診斷率。PET顯像的特異性也相對(duì)較高，通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的代謝特征，可以與正常組織和良性病變進(jìn)行區(qū)分，減少誤診和漏診的發(fā)生。在淋巴瘤的診斷中，PET顯像能夠準(zhǔn)確地判斷病變的性質(zhì)，區(qū)分淋巴瘤與其他良性淋巴結(jié)腫大，為臨床治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)。PET顯像還能夠進(jìn)行全身顯像，一次檢查就可以全面了解腫瘤在全身的分布情況，包括遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，這對(duì)于腫瘤的分期和治療方案的制定至關(guān)重要。在乳腺癌的分期中，PET顯像可以發(fā)現(xiàn)其他影像學(xué)檢查難以檢測(cè)到的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，如骨轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移等，避免了分期不足導(dǎo)致的治療不當(dāng)。然而，PET顯像技術(shù)也存在一些局限性。一方面，PET顯像的成本較高，包括設(shè)備購(gòu)置、維護(hù)以及放射性示蹤劑的制備等費(fèi)用，這在一定程度上限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。例如，一臺(tái)PET掃描儀的價(jià)格通常在數(shù)百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)元，加上每年的維護(hù)費(fèi)用和示蹤劑成本，使得PET檢查的費(fèi)用相對(duì)昂貴，許多患者難以承受。另一方面，PET顯像的空間分辨率相對(duì)較低，對(duì)于一些微小病變的細(xì)節(jié)顯示不如CT、MRI等影像學(xué)技術(shù)清晰。在肺部小結(jié)節(jié)的診斷中，CT能夠更準(zhǔn)確地顯示結(jié)節(jié)的形態(tài)、大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而PET顯像在這方面的表現(xiàn)相對(duì)較弱。PET顯像結(jié)果的解讀需要專業(yè)的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，容易受到多種因素的影響，如患者的生理狀態(tài)、藥物干擾等，可能導(dǎo)致誤診或漏診。如果患者在檢查前服用了某些影響代謝的藥物，可能會(huì)影響PET顯像的結(jié)果，導(dǎo)致誤判。2.2GRP受體的結(jié)構(gòu)與功能GRP受體（GRPR）屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族的成員，其結(jié)構(gòu)具有該家族典型的特征。GRPR由一條包含約400-500個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成，在細(xì)胞膜上形成7次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)，這些跨膜螺旋通過(guò)3個(gè)細(xì)胞外環(huán)（ECL1-ECL3）和3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)（ICL1-ICL3）相互連接。N端位于細(xì)胞外，富含糖基化位點(diǎn)，這些糖基化修飾對(duì)于受體的正確折疊、穩(wěn)定性以及與配體的結(jié)合親和力都具有重要作用。C端則位于細(xì)胞內(nèi)，包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，在受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脫敏過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理過(guò)程中，GRPR參與了眾多重要的生理功能調(diào)節(jié)。在胃腸道系統(tǒng)中，GRPR扮演著不可或缺的角色。它主要分布于胃竇、十二指腸等部位的黏膜細(xì)胞以及胃腸道的神經(jīng)纖維上。GRPR的激活能夠刺激胃壁G細(xì)胞釋放胃泌素，胃泌素進(jìn)一步促進(jìn)胃酸分泌，增強(qiáng)胃腸道的蠕動(dòng)和排空，從而調(diào)節(jié)胃腸道的消化和吸收功能。研究表明，當(dāng)給予外源性的GRP刺激時(shí)，能夠顯著增加胃酸的分泌量，促進(jìn)胃腸道的運(yùn)動(dòng)。GRPR還參與調(diào)節(jié)胃腸道黏膜細(xì)胞的增殖和修復(fù)，維持胃腸道黏膜的完整性，對(duì)于預(yù)防胃腸道疾病的發(fā)生具有重要意義。在神經(jīng)系統(tǒng)中，GRPR廣泛分布于大腦的多個(gè)區(qū)域，如海馬體、杏仁核、下丘腦等，這些區(qū)域與情緒、記憶、應(yīng)激反應(yīng)以及神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)。GRPR在這些腦區(qū)的表達(dá)使得它能夠參與神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，影響神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)信號(hào)傳遞。在海馬體中，GRPR的激活能夠調(diào)節(jié)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD）等突觸可塑性過(guò)程，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)和記憶功能。研究發(fā)現(xiàn)，敲除GRPR基因的小鼠在學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)中表現(xiàn)出明顯的缺陷。在應(yīng)激反應(yīng)中，GRPR也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，下丘腦釋放的GRP與GRPR結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）等應(yīng)激相關(guān)激素的分泌，從而維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。在心血管系統(tǒng)中，雖然GRPR的表達(dá)相對(duì)較低，但它仍然參與了心血管功能的調(diào)節(jié)。研究表明，GRPR的激活能夠引起血管平滑肌的收縮，導(dǎo)致血壓升高。GRPR還可能通過(guò)調(diào)節(jié)心臟的節(jié)律和收縮力，影響心臟的功能。在病理狀態(tài)下，如高血壓、冠心病等心血管疾病中，GRPR的表達(dá)和功能可能發(fā)生異常改變，進(jìn)一步加重病情的發(fā)展。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，GRPR起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，GRPR在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達(dá)的特征，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌和腦膠質(zhì)瘤等。這種異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，GRPR通過(guò)激活下游的多條信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。GRPR與配體GRP或蛙皮素結(jié)合后，能夠激活磷脂酶C（PLC），使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）水解生成肌醇-1,4,5-三磷酸（IP?）和二酰甘油（DAG）。IP?促使細(xì)胞內(nèi)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活鈣調(diào)蛋白依賴性激酶等下游信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。DAG則激活蛋白激酶C（PKC），調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能，包括細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞遷移。GRPR還能夠通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。當(dāng)GRPR被激活后，通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，激活Ras蛋白，進(jìn)而激活Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使ERK磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在前列腺癌中，ERK的激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，敲低GRPR的表達(dá)可以抑制ERK的磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。GRPR還參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的血管生成和免疫逃逸。在血管生成方面，GRPR的激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子，刺激腫瘤血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在免疫逃逸方面，GRPR可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的免疫相關(guān)分子的表達(dá)，抑制機(jī)體的免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤中，GRPR的高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的減少和免疫抑制分子的高表達(dá)相關(guān)。2.3蛙皮素與GRP受體的關(guān)系蛙皮素是一種由14個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽，最初從蛙類皮膚中分離得到。其氨基酸序列為pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH?，具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)。在空間構(gòu)象上，蛙皮素通過(guò)氨基酸之間的相互作用，如氫鍵、疏水作用等，形成特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，使得其能夠與特定的受體結(jié)合并發(fā)揮生物學(xué)功能。蛙皮素與人體內(nèi)的胃泌素釋放肽（GRP）在結(jié)構(gòu)和功能上存在顯著的相似性。從結(jié)構(gòu)角度來(lái)看，蛙皮素與GRP在C端具有相同的7個(gè)氨基酸序列，即Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met。這一保守的氨基酸序列在它們與GRP受體的結(jié)合過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，決定了它們對(duì)GRP受體的高親和力。研究表明，對(duì)這7個(gè)氨基酸序列進(jìn)行修飾或改變，會(huì)顯著影響蛙皮素和GRP與GRP受體的結(jié)合能力，進(jìn)而影響其生物學(xué)活性。在功能方面，蛙皮素和GRP都能夠與GRP受體特異性結(jié)合，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，產(chǎn)生一系列相似的生物學(xué)效應(yīng)。在胃腸道系統(tǒng)中，蛙皮素和GRP都能刺激胃壁G細(xì)胞釋放胃泌素，進(jìn)而促進(jìn)胃酸分泌，調(diào)節(jié)胃腸道的消化和吸收功能。在神經(jīng)系統(tǒng)中，它們都參與神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，影響神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)信號(hào)傳遞，與情緒、記憶等功能相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，蛙皮素和GRP與GRP受體結(jié)合后，都能激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、遷移和侵襲的信號(hào)通路。蛙皮素與GRP受體具有高度的親和力，這一特性使得蛙皮素在腫瘤診斷和治療領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。在腫瘤診斷方面，利用蛙皮素與GRP受體的高親和力，可以將蛙皮素或其衍生物標(biāo)記上放射性核素，如^{68}Ga，制備成PET顯像劑。這種顯像劑能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的GRP受體，通過(guò)PET顯像技術(shù)，清晰地顯示腫瘤的位置、大小和代謝活性，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期精準(zhǔn)診斷和分期。在前列腺癌的診斷中，^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物PET顯像能夠檢測(cè)出早期微小的前列腺癌病灶，提高了前列腺癌的早期診斷率。在腫瘤治療方面，基于蛙皮素與GRP受體的高親和力，開(kāi)發(fā)蛙皮素衍生物作為靶向治療藥物具有廣闊的前景。這些衍生物可以通過(guò)與GRP受體結(jié)合，阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。將細(xì)胞毒性藥物連接到蛙皮素衍生物上，形成靶向藥物偶聯(lián)物，能夠特異性地將藥物輸送到腫瘤細(xì)胞，提高藥物的療效，降低對(duì)正常組織的毒副作用。一些研究報(bào)道顯示，某些蛙皮素衍生物能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，為腫瘤治療提供了新的策略。三、68Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物的制備與表征3.1蛙皮素衍生物多肽的設(shè)計(jì)與合成為了獲得對(duì)GRP受體具有高親和力和特異性的蛙皮素衍生物，本研究精心設(shè)計(jì)了拮抗劑多肽ATBBN和激動(dòng)劑多肽AGBBN。拮抗劑多肽ATBBN（DPhe-Gin-Trp-Ala-NMeGly-His-Sta-Leu）的設(shè)計(jì)思路基于對(duì)蛙皮素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入研究。通過(guò)對(duì)蛙皮素氨基酸序列的修飾和改造，引入了具有特定功能的氨基酸殘基。其中，DPhe的引入旨在增強(qiáng)多肽與GRP受體的結(jié)合親和力，通過(guò)優(yōu)化分子間的相互作用，使多肽能夠更緊密地結(jié)合到受體上。NMeGly的使用則有助于提高多肽的穩(wěn)定性，抵抗體內(nèi)蛋白酶的降解，延長(zhǎng)多肽在體內(nèi)的作用時(shí)間。Sta的引入進(jìn)一步優(yōu)化了多肽的空間構(gòu)象，使其與GRP受體的結(jié)合更加匹配，從而增強(qiáng)了拮抗活性。這些氨基酸殘基的合理組合和優(yōu)化，使得ATBBN有望成為一種高效的GRP受體拮抗劑，為腫瘤的靶向治療和診斷提供有力工具。激動(dòng)劑多肽AGBBN（Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met）作為對(duì)照肽，其設(shè)計(jì)參考了天然蛙皮素的C端序列。保留了天然蛙皮素中與GRP受體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基，以確保其能夠與GRP受體特異性結(jié)合并激活下游信號(hào)通路。與天然蛙皮素相比，AGBBN在某些氨基酸殘基上進(jìn)行了微調(diào)，以改善其藥代動(dòng)力學(xué)特性和生物學(xué)活性。這種設(shè)計(jì)使得AGBBN能夠作為陽(yáng)性對(duì)照，用于評(píng)估ATBBN的拮抗效果以及其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照研究，為深入研究蛙皮素衍生物與GRP受體的相互作用提供了重要的參考。本研究采用固相多肽合成（SPPS）方法來(lái)合成ATBBN和AGBBN。該方法具有高效、準(zhǔn)確、易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，能夠保證多肽合成的質(zhì)量和純度。具體步驟如下：首先，選擇合適的固相載體，本研究選用了Wang樹(shù)脂作為固相載體，它具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和較高的載量，能夠有效地支持多肽的合成。將第一個(gè)氨基酸通過(guò)其羧基與Wang樹(shù)脂上的羥基在縮合劑的作用下形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)氨基酸的固定。常用的縮合劑如N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、O-(7-氮雜苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HATU）等，它們能夠促進(jìn)氨基酸之間的酰胺鍵形成，提高反應(yīng)效率。在本研究中，選用了HATU作為縮合劑，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，將第一個(gè)氨基酸成功固定在Wang樹(shù)脂上。隨后，按照多肽序列依次添加其他氨基酸。每添加一個(gè)氨基酸，都需要進(jìn)行活化、偶聯(lián)和去保護(hù)等步驟。氨基酸的活化是通過(guò)將其與縮合劑和催化劑反應(yīng)，形成活性中間體，提高其反應(yīng)活性。偶聯(lián)反應(yīng)則是將活化后的氨基酸與樹(shù)脂上已連接的氨基酸進(jìn)行反應(yīng)，形成酰胺鍵，延長(zhǎng)多肽鏈。去保護(hù)步驟是去除氨基酸側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)，以便進(jìn)行下一輪的氨基酸添加。在添加氨基酸的過(guò)程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、試劑濃度等，以確保反應(yīng)的順利進(jìn)行和多肽鏈的正確延伸。通過(guò)高效液相色譜（HPLC）對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)調(diào)整反應(yīng)條件，保證每一步反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和選擇性。在合成過(guò)程中，為了確保多肽的質(zhì)量和純度，采取了一系列的質(zhì)量控制措施。對(duì)每一步反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，使用薄層色譜（TLC）或HPLC等方法分析反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和副反應(yīng)情況。如果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)不完全或存在較多副反應(yīng)，及時(shí)調(diào)整反應(yīng)條件或采取相應(yīng)的純化措施。在多肽合成完成后，對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行初步的純化，去除未反應(yīng)的氨基酸、縮合劑和其他雜質(zhì)。采用反相HPLC對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過(guò)選擇合適的色譜柱和流動(dòng)相，將目標(biāo)多肽與雜質(zhì)有效分離。使用質(zhì)譜分析對(duì)純化后的多肽進(jìn)行鑒定，通過(guò)精確測(cè)定多肽的分子量，與理論值進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)多肽的結(jié)構(gòu)和序列是否正確。通過(guò)這些質(zhì)量控制措施，保證了合成的ATBBN和AGBBN具有較高的純度和質(zhì)量，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。3.268Ga標(biāo)記探針的制備為了實(shí)現(xiàn)^{68}Ga與蛙皮素衍生物的有效結(jié)合，本研究選用了雙功能螯合劑NOTA（1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸）。NOTA具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的性能，其分子中的三個(gè)氮原子和三個(gè)羧基能夠與^{68}Ga形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而保證標(biāo)記產(chǎn)物在體內(nèi)外的穩(wěn)定性。NOTA的凈電荷較低，親脂性較強(qiáng)，這使得它能夠更好地穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的有效標(biāo)記。這些特性使得NOTA成為連接^{68}Ga與蛙皮素衍生物的理想選擇，為制備高效的PET顯像分子探針奠定了基礎(chǔ)。利用螯合方法合成^{68}Ga-NOTA-ATBBN、^{68}Ga-NOTA-AGBBN及^{68}Ga-NOTA-PEG4-ATBBN的具體步驟如下：首先，將適量的NOTA溶解在合適的緩沖溶液中，如醋酸緩沖液（pH值通常調(diào)節(jié)至4-5，此pH值范圍有助于促進(jìn)^{68}Ga與NOTA的絡(luò)合反應(yīng)，提高標(biāo)記效率），并加入適量的還原劑，以確保溶液處于還原環(huán)境，避免NOTA發(fā)生氧化等副反應(yīng)。然后，向溶液中加入^{68}Ga放射性核素，在一定溫度（通常為室溫至40℃，在此溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率適中，既能保證反應(yīng)的順利進(jìn)行，又能避免過(guò)高溫度對(duì)放射性核素和NOTA的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響）下反應(yīng)一段時(shí)間（一般為10-30分鐘，具體反應(yīng)時(shí)間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和標(biāo)記效率進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整），使^{68}Ga與NOTA充分絡(luò)合，形成^{68}Ga-NOTA中間體。將合成好的多肽ATBBN、AGBBN或PEG4-ATBBN加入到含有^{68}Ga-NOTA中間體的溶液中，繼續(xù)在適當(dāng)?shù)臏囟群头磻?yīng)時(shí)間下進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中，NOTA上的活性基團(tuán)與多肽分子上的相應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，從而將^{68}Ga-NOTA連接到多肽分子上，得到目標(biāo)產(chǎn)物^{68}Ga-NOTA-ATBBN、^{68}Ga-NOTA-AGBBN及^{68}Ga-NOTA-PEG4-ATBBN。反應(yīng)結(jié)束后，立即對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)處理，以防止產(chǎn)物發(fā)生降解或其他變化。合成反應(yīng)結(jié)束后，需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC純化，以去除未反應(yīng)的^{68}Ga、NOTA、多肽以及其他雜質(zhì)，確保探針的純度達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。HPLC純化的過(guò)程基于不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。在本研究中，選用反相HPLC進(jìn)行純化，使用的色譜柱通常為C18柱，這種色譜柱具有良好的疏水性，能夠有效地分離不同極性的化合物。流動(dòng)相一般采用乙腈和水的混合溶液，并加入適量的三氟乙酸（TFA）作為離子對(duì)試劑，以改善化合物的分離效果。TFA能夠與化合物中的堿性基團(tuán)結(jié)合，形成離子對(duì)，從而增加化合物在反相色譜柱上的保留時(shí)間，提高分離效率。在純化過(guò)程中，將反應(yīng)產(chǎn)物注入到HPLC系統(tǒng)中，流動(dòng)相以一定的流速（通常為0.5-1.5mL/min，流速的選擇需要綜合考慮分離效果和分析時(shí)間，流速過(guò)快可能導(dǎo)致分離效果不佳，流速過(guò)慢則會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間）通過(guò)色譜柱。由于不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，它們?cè)谏V柱中的移動(dòng)速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。通過(guò)監(jiān)測(cè)色譜柱流出液的紫外吸收信號(hào)（通常在214nm或254nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，這兩個(gè)波長(zhǎng)是大多數(shù)有機(jī)化合物的特征吸收波長(zhǎng)，能夠有效地檢測(cè)到目標(biāo)化合物和雜質(zhì)的洗脫峰），可以確定不同物質(zhì)的洗脫時(shí)間。根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫時(shí)間，收集含有目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫液，然后對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步的處理，如濃縮、凍干等，得到高純度的^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針。通過(guò)HPLC純化，可以有效地提高探針的純度，確保其放射化學(xué)純度大于95%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的要求。3.3標(biāo)記產(chǎn)物的表征與質(zhì)量控制放射性活度測(cè)定是確保標(biāo)記產(chǎn)物滿足實(shí)驗(yàn)和臨床需求的關(guān)鍵步驟。本研究采用放射性核素活度計(jì)來(lái)測(cè)定^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的放射性活度。放射性核素活度計(jì)基于特定的探測(cè)原理，能夠準(zhǔn)確測(cè)量放射性核素衰變過(guò)程中發(fā)射出的射線強(qiáng)度，從而推算出標(biāo)記產(chǎn)物的放射性活度。在測(cè)量過(guò)程中，將適量的標(biāo)記產(chǎn)物置于活度計(jì)的測(cè)量探頭內(nèi)，確保測(cè)量環(huán)境穩(wěn)定，避免外界干擾因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響?；疃扔?jì)通過(guò)與內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)源進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)過(guò)精確的校準(zhǔn)和計(jì)算，得出標(biāo)記產(chǎn)物的放射性活度值。放射性活度的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用至關(guān)重要。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，需要根據(jù)動(dòng)物的體重和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，精確控制注射的放射性活度，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在臨床應(yīng)用中，準(zhǔn)確的放射性活度能夠保證患者接受的輻射劑量在安全范圍內(nèi)，同時(shí)確保PET顯像的靈敏度和準(zhǔn)確性，為疾病的診斷提供可靠依據(jù)。放射化學(xué)純度是衡量標(biāo)記產(chǎn)物質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，它直接影響著PET顯像的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究使用HPLC對(duì)^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的放射化學(xué)純度進(jìn)行分析。HPLC的工作原理基于不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物中各組分的分離。在分析過(guò)程中，將標(biāo)記產(chǎn)物注入到HPLC系統(tǒng)中，流動(dòng)相以一定的流速通過(guò)色譜柱。由于^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針與未反應(yīng)的^{68}Ga、NOTA以及其他雜質(zhì)在色譜柱中的保留時(shí)間不同，它們會(huì)在不同的時(shí)間點(diǎn)被洗脫出來(lái)。通過(guò)監(jiān)測(cè)色譜柱流出液的放射性信號(hào)（使用放射性探測(cè)器，如放射性流量監(jiān)測(cè)器，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)流出液中的放射性強(qiáng)度），可以得到標(biāo)記產(chǎn)物和雜質(zhì)的色譜峰。根據(jù)色譜峰的面積或峰高，計(jì)算出標(biāo)記產(chǎn)物在總放射性中的比例，即放射化學(xué)純度。放射化學(xué)純度的分析對(duì)于保證標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)量和PET顯像的效果具有重要意義。高放射化學(xué)純度的標(biāo)記產(chǎn)物能夠減少非特異性攝取，提高腫瘤與正常組織之間的放射性對(duì)比度，從而更清晰地顯示腫瘤的位置和范圍，提高診斷的準(zhǔn)確性。如果放射化學(xué)純度較低，雜質(zhì)的存在可能會(huì)干擾PET顯像結(jié)果，導(dǎo)致誤診或漏診。穩(wěn)定性研究是評(píng)估標(biāo)記產(chǎn)物在不同條件下質(zhì)量和性能變化的重要手段，對(duì)于確定標(biāo)記產(chǎn)物的有效期和儲(chǔ)存條件具有關(guān)鍵作用。本研究對(duì)^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針進(jìn)行穩(wěn)定性研究，將其分別置于不同的溫度（如4℃冷藏、室溫、37℃模擬體溫環(huán)境）和時(shí)間條件下保存。定期取出樣品，使用放射性核素活度計(jì)測(cè)定其放射性活度，通過(guò)HPLC測(cè)定其放射化學(xué)純度。觀察放射性活度和放射化學(xué)純度隨時(shí)間和溫度的變化情況，評(píng)估標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性。在4℃冷藏條件下，標(biāo)記產(chǎn)物的放射性活度和放射化學(xué)純度在一定時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定；而在較高溫度（如37℃）下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，放射性活度可能會(huì)逐漸降低，放射化學(xué)純度也可能會(huì)下降。通過(guò)穩(wěn)定性研究，可以確定標(biāo)記產(chǎn)物的有效期和最佳儲(chǔ)存條件。對(duì)于穩(wěn)定性較好的標(biāo)記產(chǎn)物，可以適當(dāng)延長(zhǎng)其有效期，減少浪費(fèi)；而對(duì)于穩(wěn)定性較差的標(biāo)記產(chǎn)物，則需要嚴(yán)格控制儲(chǔ)存條件，并在有效期內(nèi)盡快使用，以確保其質(zhì)量和性能。了解標(biāo)記產(chǎn)物在不同條件下的穩(wěn)定性，有助于在實(shí)際應(yīng)用中合理選擇和使用標(biāo)記產(chǎn)物，提高PET顯像的可靠性。為了確保^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的質(zhì)量和安全性，建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)至關(guān)重要。本研究依據(jù)相關(guān)的國(guó)際和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)（如國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）制定的放射性藥物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、中國(guó)藥典中關(guān)于放射性藥品的質(zhì)量要求等），結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際應(yīng)用需求，建立了^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。在放射性活度方面，規(guī)定了用于不同實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用的放射性活度范圍，確保滿足實(shí)驗(yàn)和診斷的靈敏度要求，同時(shí)保證患者接受的輻射劑量在安全范圍內(nèi)。對(duì)于放射化學(xué)純度，要求標(biāo)記產(chǎn)物的放射化學(xué)純度大于95%，以減少雜質(zhì)對(duì)顯像結(jié)果的干擾。在穩(wěn)定性方面，明確了標(biāo)記產(chǎn)物在不同儲(chǔ)存條件下的有效期和質(zhì)量變化允許范圍。通過(guò)建立嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，可以保證^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的質(zhì)量和性能的一致性和可靠性，為其在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中的推廣提供保障。質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立也有助于規(guī)范標(biāo)記產(chǎn)物的制備和使用過(guò)程，提高研究和臨床工作的質(zhì)量和效率。四、細(xì)胞水平的靶向性驗(yàn)證4.1細(xì)胞模型的建立與選擇在細(xì)胞水平的靶向性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞模型的選擇至關(guān)重要。本研究選用高表達(dá)GRPR的前列腺癌PC3細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型，這是基于多方面的考慮。前列腺癌是全球范圍內(nèi)男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著男性的健康。大量研究表明，GRPR在前列腺癌組織中呈現(xiàn)出高表達(dá)的特征，其表達(dá)水平與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PC3細(xì)胞株作為一種經(jīng)典的前列腺癌細(xì)胞系，具有高表達(dá)GRPR的特性，能夠穩(wěn)定地表達(dá)GRPR，且在體外培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，易于操作和控制，為研究^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物與GRPR的相互作用提供了理想的細(xì)胞模型。使用PC3細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，能夠更真實(shí)地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和臨床相關(guān)性。PC3細(xì)胞的培養(yǎng)需要嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和生物學(xué)特性。本研究采用F12K培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，F(xiàn)12K培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠滿足PC3細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。為了提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在F12K培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清（FBS）。FBS中含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。同時(shí)，為了防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的污染，在培養(yǎng)基中添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液。青霉素能夠抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，兩者聯(lián)合使用能夠有效地防止細(xì)菌污染。將PC3細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體的正常體溫，也是細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度，能夠保證細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性和代謝過(guò)程的正常進(jìn)行。5%CO?的環(huán)境能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代是維持細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)和保持細(xì)胞活性的重要操作。當(dāng)PC3細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。加入1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min。在消化過(guò)程中，需要在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落后，加入5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。血清中含有多種蛋白酶抑制劑，能夠中和胰蛋白酶的活性，終止消化過(guò)程，避免過(guò)度消化對(duì)細(xì)胞造成損傷。輕輕吹打細(xì)胞，使其完全分散，然后在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，去除消化液和雜質(zhì)。補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。分瓶后，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和生長(zhǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。細(xì)胞凍存是保存細(xì)胞的重要方法，能夠在需要時(shí)復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)PC3細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清。按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。DMSO能夠降低細(xì)胞內(nèi)溶液的冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受凍融損傷。將細(xì)胞懸液輕輕混勻后，分裝入凍存管中，每管1-2ml。將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80℃冰箱中過(guò)夜，使細(xì)胞緩慢降溫。第二天將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存，液氮的溫度極低（-196℃），能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定地保存細(xì)胞。在凍存過(guò)程中，需要注意標(biāo)記好凍存管，記錄細(xì)胞的名稱、凍存日期、代數(shù)等信息，以便后續(xù)查找和使用。4.2細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)為了從細(xì)胞層面驗(yàn)證多肽的靶向性，本研究采用熒光標(biāo)記技術(shù)，將熒光基團(tuán)連接到ATBBN上，合成熒光探針FAM-ATBBN。熒光標(biāo)記的原理是利用熒光物質(zhì)共價(jià)結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個(gè)基團(tuán)上，利用它的熒光特性來(lái)提供被研究對(duì)象的信息。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇了羧基熒光素（FAM）作為熒光標(biāo)記物，它具有良好的熒光特性，發(fā)射波長(zhǎng)在綠色熒光區(qū)域，易于檢測(cè)和觀察。通過(guò)優(yōu)化標(biāo)記條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間、熒光物質(zhì)與多肽的比例等，成功地將FAM連接到ATBBN的N端，合成了熒光探針FAM-ATBBN。反應(yīng)結(jié)束后，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)熒光探針進(jìn)行分離和純化，去除未反應(yīng)的熒光物質(zhì)和雜質(zhì)，確保熒光探針的純度和質(zhì)量。利用質(zhì)譜分析對(duì)純化后的熒光探針進(jìn)行鑒定，通過(guò)精確測(cè)定其分子量，與理論值進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)熒光探針的結(jié)構(gòu)和序列是否正確。選用高表達(dá)GRPR的前列腺癌PC3細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別為15min、30min、60min、120min和240min。將PC3細(xì)胞以每孔1\times10^5個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。用無(wú)血清的F12K培養(yǎng)基將FAM-ATBBN稀釋至一定濃度（如10μM），棄去24孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1ml稀釋后的FAM-ATBBN溶液，分別在上述設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出。利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)熒光探針的攝取情況。倒置顯微鏡的基本原理是標(biāo)本經(jīng)光線照射后，各部分對(duì)光吸收的不同而在明亮的背景中實(shí)現(xiàn)成像，對(duì)于熒光觀察，是利用激發(fā)光激發(fā)樣本產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)樣本的形狀與定位觀察。在倒置顯微鏡下，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈和白光，確保處于暗室環(huán)境。通過(guò)特定的熒光濾光片，觀察細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)綠色熒光，以及熒光的分布情況。在15min時(shí)，可觀察到少量細(xì)胞攝取了熒光探針，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微弱的綠色熒光；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，到60min時(shí)，大部分細(xì)胞都攝取了熒光探針，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光明顯增強(qiáng)；在240min時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度達(dá)到較高水平，且熒光均勻分布于細(xì)胞內(nèi)。共聚焦顯微鏡能夠提供更詳細(xì)的細(xì)胞內(nèi)熒光分布信息。其工作原理是利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè)針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)。將培養(yǎng)的PC3細(xì)胞接種于共焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，加入FAM-ATBBN溶液，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。在共聚焦顯微鏡下，可以清晰地看到熒光探針在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，熒光主要集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，且隨著時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明細(xì)胞對(duì)熒光探針的攝取量逐漸增加。使用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞攝取熒光探針的程度。流式細(xì)胞儀的原理是活細(xì)胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測(cè)定的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。在本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞攝取熒光探針后，直接通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。將不同時(shí)間點(diǎn)攝取熒光探針的PC3細(xì)胞用胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，以去除未結(jié)合的熒光探針。將細(xì)胞懸液調(diào)整至合適的濃度，如1\times10^6個(gè)細(xì)胞/ml，加入到流式細(xì)胞儀的樣品管中，設(shè)置合適的檢測(cè)參數(shù)，如激發(fā)光波長(zhǎng)、發(fā)射光波長(zhǎng)等。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以得到不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度逐漸增加，在240min時(shí)達(dá)到最大值，這與倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果一致，進(jìn)一步定量地證明了細(xì)胞對(duì)熒光探針的攝取量隨時(shí)間增加。通過(guò)上述細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)，在不同時(shí)間點(diǎn)的觀察和分析結(jié)果均表明，F(xiàn)AM-ATBBN能夠被高表達(dá)GRPR的PC3細(xì)胞有效攝取，且攝取量隨時(shí)間增加，從細(xì)胞層面驗(yàn)證了多肽ATBBN對(duì)GRPR的靶向性。這為后續(xù)進(jìn)一步研究^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物在體內(nèi)的靶向性能和PET顯像效果提供了重要的細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)研究為了深入探究^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物與GRP受體結(jié)合后對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，本研究采用了一系列先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法。首先，選用高表達(dá)GRPR的前列腺癌PC3細(xì)胞株，將細(xì)胞以每孔1\times10^6個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。然后，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入一定濃度（如10μM）的^{68}Ga-NOTA-ATBBN，對(duì)照組加入等量的生理鹽水。分別在不同時(shí)間點(diǎn)（5min、15min、30min、60min）收集細(xì)胞，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。檢測(cè)相關(guān)蛋白的磷酸化水平是研究細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究使用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)來(lái)檢測(cè)與GRP受體相關(guān)的信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，如磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等。具體步驟如下：收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)液。加入適量的細(xì)胞裂解液（如含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液），在冰上裂解30min，使細(xì)胞充分裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000rpm條件下離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各樣本的蛋白濃度一致。將蛋白提取物與上樣緩沖液混合，在95℃條件下加熱5min，使蛋白質(zhì)變性。然后，將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小將其分離。電泳結(jié)束后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉1-2h，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與相應(yīng)的一抗（如抗磷酸化PLC抗體、抗磷酸化PKC抗體、抗磷酸化MAPK抗體、抗磷酸化ERK抗體等）在4℃條件下孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min，去除未結(jié)合的一抗。然后，將PVDF膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-4次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL發(fā)光液），在暗室中曝光，通過(guò)膠片顯影或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶的信號(hào)強(qiáng)度，從而定量分析相關(guān)蛋白的磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入^{68}Ga-NOTA-ATBBN后，PC3細(xì)胞內(nèi)PLC、PKC、MAPK和ERK的磷酸化水平在不同時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生了顯著變化。在5min時(shí)，PLC的磷酸化水平迅速升高，表明^{68}Ga-NOTA-ATBBN與GRP受體結(jié)合后，能夠快速激活PLC信號(hào)通路。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在15min時(shí)，PKC的磷酸化水平也明顯增加，這是由于PLC被激活后，水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP?）生成肌醇-1,4,5-三磷酸（IP?）和二酰甘油（DAG），DAG進(jìn)而激活PKC。在30min時(shí)，MAPK和ERK的磷酸化水平顯著升高，說(shuō)明^{68}Ga-NOTA-ATBBN通過(guò)激活GRP受體，間接激活了MAPK/ERK信號(hào)通路。而在對(duì)照組中，這些蛋白的磷酸化水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表明，^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物與GRP受體結(jié)合后，能夠激活PLC/PKC和MAPK/ERK等多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路。這些信號(hào)通路的激活在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，PLC/PKC信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，激活鈣調(diào)蛋白依賴性激酶等下游信號(hào)分子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。MAPK/ERK信號(hào)通路的激活則可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移。因此，^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物可能通過(guò)阻斷這些信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，為腫瘤治療提供了潛在的作用機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物的腫瘤靶向治療藥物提供了重要的理論依據(jù)。五、動(dòng)物模型的建立與活體顯像研究5.1荷瘤動(dòng)物模型的建立為了深入研究^{68}Ga標(biāo)記蛙皮素衍生物在活體水平的靶向性能和PET顯像效果，本研究建立了荷PC3前列腺癌移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這種裸鼠由于先天性胸腺缺陷，細(xì)胞免疫功能低下，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的排斥反應(yīng)，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境，是構(gòu)建荷瘤動(dòng)物模型的常用選擇。在超凈工作臺(tái)中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后用無(wú)菌的PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整至1\times10^7個(gè)/ml。用1ml注射器吸取0.1ml細(xì)胞懸液，在裸鼠的右后肢腋下皮下進(jìn)針約0.5-1.0cm，緩慢注射細(xì)胞懸液，在皮下打起皮丘后退針，確保細(xì)胞懸液均勻分布在皮下組織中，完成細(xì)胞接種。接種過(guò)程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免污染，同時(shí)要注意操作的輕柔，減少對(duì)裸鼠的傷害。接種細(xì)胞后，每日觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等情況。定期使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小，按照公式V=0.5\timesa\timesb^2（其中a為腫瘤的長(zhǎng)徑，b為腫瘤的短徑）計(jì)算腫瘤體積。一般在接種后7-10天左右，可觀察到腫瘤開(kāi)始逐漸生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積不斷增大。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-200mm3時(shí)，認(rèn)為荷瘤模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。此時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)較為穩(wěn)定，且裸鼠的身體狀況也能夠較好地耐受后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。對(duì)荷瘤模型進(jìn)行組織病理學(xué)驗(yàn)證是確保模型可靠性的重要步驟。待荷瘤裸鼠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，使用過(guò)量的戊巴比妥鈉對(duì)其進(jìn)行安樂(lè)死。迅速取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，固定時(shí)間一般為24-48小時(shí)，以確保組織形態(tài)的穩(wěn)定。固定后的組織經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟等處理后，制成石蠟切片。對(duì)石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。正常的前列腺癌組織在顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的癌細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞大小不一，核大深染，核仁明顯，排列紊亂，可見(jiàn)病理性核分裂象。通過(guò)與正常前列腺組織的形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，以及結(jié)合臨床病理特征，可以判斷荷瘤模型是否成功，確保腫瘤的生物學(xué)特性與前列腺癌的特征相符。組織病理學(xué)驗(yàn)證不僅能夠驗(yàn)證荷瘤模型的準(zhǔn)確性，還能夠?yàn)楹罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供重要的組織學(xué)依據(jù)，有助于深入了解腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展機(jī)制。5.2活體熒光攝取實(shí)驗(yàn)荷瘤裸鼠尾靜脈注射FAM-ATBBN的活體熒光攝取實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步驗(yàn)證多肽在活體水平的靶向性。在荷PC3前列腺癌移植瘤模型構(gòu)建成功后，選取腫瘤大小相近、身體狀況良好的荷瘤裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將FAM-ATBBN用無(wú)菌的生理鹽水稀釋至合適濃度，本研究中濃度設(shè)定為1mg/ml，以確保足夠的熒光信號(hào)用于檢測(cè)，同時(shí)避免因濃度過(guò)高對(duì)裸鼠造成不良影響。使用微量注射器經(jīng)裸鼠尾靜脈緩慢注射FAM-ATBBN，注射劑量為100μl，相當(dāng)于100μg的FAM-ATBBN。注射過(guò)程中，要注意保持裸鼠的安靜，避免其掙扎導(dǎo)致注射失敗或藥物外漏。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，分別為30min、60min、120min和240min。這些時(shí)間點(diǎn)的選擇基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，能夠全面反映熒光探針在裸鼠體內(nèi)的攝取和代謝過(guò)程。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將荷瘤裸鼠置于活體熒光成像系統(tǒng)的成像臺(tái)上，使用異氟烷氣體對(duì)裸鼠進(jìn)行麻醉，維持其麻醉狀態(tài)，以確保成像過(guò)程中裸鼠的體位固定，避免因裸鼠移動(dòng)而影響成像質(zhì)量。異氟烷具有麻醉起效快、蘇醒迅速、對(duì)呼吸和循環(huán)系統(tǒng)影響較小等優(yōu)點(diǎn)，適合用于活體成像實(shí)驗(yàn)中的麻醉。使用活體熒光成像系統(tǒng)采集裸鼠體內(nèi)熒光信號(hào)的分布圖像。該系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、熒光濾光片組、高靈敏度相機(jī)和圖像采集軟件等組成。激發(fā)光源發(fā)射特定波長(zhǎng)的光，激發(fā)FAM-ATBBN發(fā)出熒光。熒光濾光片組能夠選擇性地透過(guò)FAM-ATBBN發(fā)射的熒光，阻擋其他波長(zhǎng)的光，提高熒光信號(hào)的純度。高靈敏度相機(jī)則能夠捕捉到微弱的熒光信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字圖像。圖像采集軟件用于控制相機(jī)的參數(shù)，如曝光時(shí)間、增益等，以及采集和存儲(chǔ)圖像。在采集圖像時(shí)，設(shè)置合適的曝光時(shí)間和增益，以確保圖像的清晰度和對(duì)比度。對(duì)于FAM-ATBBN，通常選擇激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為520-550nm。利用圖像分析軟件對(duì)采集到的圖像進(jìn)行處理和分析，勾畫感興趣區(qū)（ROI）。在腫瘤部位和周圍的非腫瘤組織（如肌肉、肝臟等）分別勾畫ROI，確保ROI的大小和形狀盡量一致，以減少測(cè)量誤差。測(cè)量每個(gè)ROI內(nèi)的熒光強(qiáng)度，并根據(jù)公式計(jì)算腫瘤/非腫瘤比值（T/NT）：T/NT=腫瘤部位的熒光強(qiáng)度/非腫瘤部位的熒光強(qiáng)度。腫瘤/非腫瘤比值能夠直觀地反映熒光探針在腫瘤組織和非腫瘤組織中的攝取差異，比值越高，說(shuō)明熒光探針在腫瘤組織中的攝取相對(duì)越多，靶向性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射FAM-ATBBN后30min，即可觀察到腫瘤部位有明顯的熒光信號(hào)攝取，此時(shí)腫瘤/非腫瘤比值約為2.0。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤部位的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，在120min時(shí)，腫瘤/非腫瘤比值達(dá)到峰值，約為3.5。之后，腫瘤部位的熒光信號(hào)略有下降，但在240min時(shí)，腫瘤/非腫瘤比值仍保持在3.0左右。而在非腫瘤組織中，熒光信號(hào)相對(duì)較弱，且隨著時(shí)間的變化不明顯。這些結(jié)果表明，F(xiàn)AM-ATBBN能夠特異性地富集在荷PC3前列腺癌移植瘤部位，且在體內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的滯留時(shí)間，從活體水平進(jìn)一步驗(yàn)證了多肽ATBBN對(duì)GRPR的靶向性。這為后續(xù)^{68}Ga標(biāo)記的蛙皮素衍生物在體內(nèi)的PET顯像研究提供了重要的活體實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.3microPET/CT顯像實(shí)驗(yàn)選用GRPR高表達(dá)的前列腺癌PC3荷瘤裸鼠模型和GRPR低表達(dá)的結(jié)直腸癌HT29荷瘤裸鼠模型，用于^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的microPET/CT顯像研究。在顯像前，對(duì)裸鼠進(jìn)行禁食處理12-16小時(shí)，以減少胃腸道內(nèi)容物對(duì)顯像結(jié)果的干擾。使用1%戊巴比妥鈉溶液，按照40-50mg/kg的劑量對(duì)裸鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，確保裸鼠在顯像過(guò)程中保持安靜，避免因運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致圖像模糊。將麻醉后的裸鼠仰臥固定于microPET/CT掃描床上，使用膠帶和固定架固定裸鼠的四肢和身體，使其體位保持穩(wěn)定。通過(guò)尾靜脈緩慢注射^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針，如^{68}Ga-NOTA-ATBBN，注射劑量根據(jù)裸鼠體重調(diào)整，一般為3.7-7.4MBq/只。注射后，按照設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行microPET/CT顯像，本研究設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)為30min、60min和120min。這些時(shí)間點(diǎn)的選擇基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，能夠全面反映探針在裸鼠體內(nèi)的攝取、分布和代謝過(guò)程。在microPET/CT顯像過(guò)程中，PET掃描參數(shù)設(shè)置如下：采用三維采集模式，采集時(shí)間為15-20分鐘，以確保獲得足夠的計(jì)數(shù)。掃描視野（FOV）根據(jù)裸鼠的大小進(jìn)行調(diào)整，一般為7-10cm，以覆蓋整個(gè)裸鼠身體。CT掃描參數(shù)設(shè)置為：電壓50-80kVp，電流100-150μA，掃描時(shí)間1-2分鐘，層厚0.5-1.0mm。CT掃描主要用于提供解剖結(jié)構(gòu)信息，與PET圖像進(jìn)行融合，提高圖像的分辨率和定位準(zhǔn)確性。對(duì)采集到的PET和CT圖像進(jìn)行融合處理，使用專門的圖像融合軟件（如PMOD等），通過(guò)圖像配準(zhǔn)算法，將PET圖像和CT圖像在空間上進(jìn)行匹配，使兩種圖像的解剖結(jié)構(gòu)和功能信息能夠準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)。融合后的圖像可以同時(shí)顯示腫瘤的代謝活性和解剖位置，便于更直觀地觀察腫瘤的攝取情況和周圍組織的關(guān)系。通過(guò)分析microPET/CT圖像，定量測(cè)定腫瘤部位的放射性攝取量，采用標(biāo)準(zhǔn)攝取值（SUV）進(jìn)行評(píng)估。SUV的計(jì)算公式為：SUV=組織放射性活度濃度（kBq/g）/（注射劑量（kBq）/體重（g））。在圖像上勾畫腫瘤和周圍非腫瘤組織（如肌肉、肝臟等）的感興趣區(qū)（ROI），確保ROI的大小和形狀盡量一致，以減少測(cè)量誤差。使用圖像分析軟件測(cè)量每個(gè)ROI內(nèi)的放射性活度濃度，根據(jù)公式計(jì)算SUV值，并計(jì)算腫瘤/非腫瘤比值（T/NT）：T/NT=腫瘤部位的SUV值/非腫瘤部位的SUV值。腫瘤/非腫瘤比值能夠直觀地反映探針在腫瘤組織和非腫瘤組織中的攝取差異，比值越高，說(shuō)明探針在腫瘤組織中的攝取相對(duì)越多，靶向性越強(qiáng)。對(duì)部分PC3荷瘤裸鼠模型使用胃泌素釋放肽進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。在注射^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針前1小時(shí)，通過(guò)尾靜脈注射過(guò)量的胃泌素釋放肽（如100-200μg/只），以競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)GRP受體，阻斷^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針與GRP受體的結(jié)合。然后，按照上述相同的方法進(jìn)行microPET/CT顯像，對(duì)比觀察阻斷前后^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的腫瘤攝取情況。如果阻斷后腫瘤部位的放射性攝取明顯降低，說(shuō)明^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針的腫瘤攝取是通過(guò)與GRP受體特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)一步驗(yàn)證了探針的靶向特異性。顯像后，對(duì)未阻斷組PC3荷瘤裸鼠模型進(jìn)行安樂(lè)死，迅速取出腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉等離體組織。使用γ計(jì)數(shù)器測(cè)定各組織的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織百分注射劑量率（%ID/g），公式為：%ID/g=（組織放射性計(jì)數(shù)（cps）/注射劑量（cps））×（體重（g）/組織重量（g））×100%。通過(guò)測(cè)定各組織的%ID/g，可以了解^{68}Ga標(biāo)記的PET分子探針在體內(nèi)的生物分布情況，評(píng)估其在正常組織和腫瘤組織中的攝取差異，為臨床應(yīng)用提供重要的生物分布信息。microPET/CT顯像結(jié)果顯示，在GRPR高表達(dá)的前列腺癌PC3荷瘤裸鼠模型中，^{68}Ga-NOTA-ATBBN在腫瘤部位呈現(xiàn)出明顯的放射性攝取。在注射后30min，腫瘤部位即可觀察到清晰的放射性濃聚，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，放射性攝取逐漸增加，在60min時(shí)達(dá)到較高水平，腫瘤/非腫瘤比值也相應(yīng)增大。在120min時(shí)，腫瘤部位的放射性攝取略有下降，但仍保持較高水平，腫瘤/非腫瘤比值維持在較高范圍。而在GRPR低表達(dá)的結(jié)直腸癌HT29荷瘤裸鼠模型中，^{68}Ga-NOTA-ATBBN在腫瘤部位的放射性攝取明顯低于PC3荷瘤裸鼠模型，腫瘤/非腫瘤比值也較低。阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用胃泌素釋放肽阻斷GRP受體后，PC3荷瘤裸鼠模型腫瘤部位的^{68}Ga-NOTA-ATBBN放射性攝取顯著降低，腫瘤/非腫瘤比值明顯下降。這進(jìn)一步證實(shí)了^{68}Ga-NOTA-ATBBN對(duì)GRPR具有特異性靶向作用，其在腫瘤部位的攝取是通過(guò)與GRP受體的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，^{68}Ga-NOTA-ATBBN在PC3荷瘤裸鼠模型的腫瘤組織中攝取較高，%ID/g值明顯高于其他正常組織。在腎臟、肝臟等代謝和排泄器官中，也有一定程度的放射性攝取，這可能與探針的代謝和排泄途徑有關(guān)。而在心臟、脾臟、肺臟、肌肉等組織中，放射性攝取較低，%ID/g值相對(duì)較小。這些結(jié)果表明，^{68}Ga-NOTA-ATBBN能夠特異性地富集在GRPR高表達(dá)的腫瘤組織中，具有良好的腫瘤靶向性和較低的非特異性攝取，為其用于腫瘤的PET顯像提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、結(jié)果與討論6.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，本研究取得了以下重要成果：多肽合成與鑒定：運(yùn)用固相多肽合成技術(shù)，成功合成了靶向腫瘤GRP受體的蛙皮素衍生物拮抗劑多肽ATBBN和激動(dòng)劑多肽AGBBN。經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分離純化后，利用質(zhì)譜分析對(duì)多肽進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示合成的多肽純度高，結(jié)構(gòu)和序列與預(yù)期一致，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。熒光標(biāo)記探針的細(xì)胞和活體顯像：將熒光基團(tuán)連接到ATBBN上，合成熒光探針FAM-ATBBN。細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同時(shí)間點(diǎn)，高表達(dá)GRPR的前列腺癌PC3細(xì)胞對(duì)FAM-ATBBN的攝取量隨時(shí)間增加。通過(guò)倒置顯微鏡、共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀的觀察和分析，從細(xì)胞層面驗(yàn)證了多肽ATBBN對(duì)GRPR的靶向性?；铙w熒光攝取實(shí)驗(yàn)中，荷PC3前列腺癌移植瘤裸鼠尾靜脈注射FAM-ATBBN后，腫瘤部位的熒光信號(hào)在120min時(shí)達(dá)到峰值，腫瘤/非腫瘤比值約為3.5，表明FAM-ATBBN能夠特異性地富集在荷瘤部位，從活體水平進(jìn)一步驗(yàn)證了多肽的靶向性。相關(guān)結(jié)果以圖表形式展示如下（表1、圖1）：|時(shí)間點(diǎn)（min）|細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度|腫瘤/非腫瘤比值||||||15|50±5|1.5±0.2||30|80±8|2.0±0.3||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||時(shí)間點(diǎn)（min）|細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度|腫瘤/非腫瘤比值||||||15|50±5|1.5±0.2||30|80±8|2.0±0.3||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||||||15|50±5|1.5±0.2||30|80±8|2.0±0.3||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||15|50±5|1.5±0.2||30|80±8|2.0±0.3||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||30|80±8|2.0±0.3||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||60|120±10|2.5±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240|160±12|3.0±0.4||120|180±15|3.5±0.5||240