3.3.2基因工程操作的基本程序3.3.2基因工程操作的基本程序第1課時(shí)：PCR和電泳一、PCR的原理二、PCR的應(yīng)用三、電泳的原理和應(yīng)用PCR和電泳

漢水丑生作品（QQ:70939118）

PCR的全稱(chēng)是_________________，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。

細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的時(shí)候，解旋是靠__________完成的，合成DNA子鏈時(shí)要用到DNA聚合酶。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3’端延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要______，其作用是_________________________。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’GGAUCG5‘AUCGCG5‘RNA引物ⅠRNA引物ⅡTAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)解旋酶引物給DNA聚合酶提供3’端3′5′DNA聚合酶不能將單個(gè)的核苷酸鏈連接成鏈，因此子鏈合成需要引物（最初的已有鏈）。DNA聚合酶3′5′模板鏈DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端，即子鏈的延伸方向是5′→3′。PCR技術(shù)中，解開(kāi)雙鏈沒(méi)有用解旋酶，而是利用的DNA的熱變性和復(fù)性的原理。變性：在80-100℃的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈

PCR技術(shù)中使用的DNA聚合酶是能夠耐高溫的Taq酶（在70℃反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%）。

變性：當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度設(shè)定為95℃時(shí)，模板DNA的氫鍵被破壞，模板DNA變?yōu)閱捂?；?fù)性（退火）：當(dāng)PCR反應(yīng)體系的溫度降為55℃時(shí)候，堿基互補(bǔ)的DNA片段之間會(huì)自發(fā)形成氫鍵，恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)。此時(shí)會(huì)有一些引物片段與單鏈模板DNA結(jié)合，為T(mén)aq酶提供3’。

延伸：此后將PCR反應(yīng)體系的溫度升高為72℃，Taq酶沿著引物3’擴(kuò)增DNA。925575℃3`5`5`3`將模板DNA、4種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq酶、過(guò)量的2種引物、Mg2+加入緩沖溶液中。引物1引物2原料模板DNA目的基因Taq聚合酶925575℃變性3`5`5`3`925575℃退火思考、引物為何會(huì)結(jié)合在圖中所示位置？925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸925575℃變性925575℃退火925575℃延伸第1次擴(kuò)增長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)211第2次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)2233第3次擴(kuò)增短鏈-短鏈DNA______個(gè)中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)24277第4次擴(kuò)增短鏈-短鏈DNA______個(gè)中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)268151520022240226822(n-1)2n-2n137152n-12×2n-223`5`5`3`思考、如果兩種引物結(jié)合在模板DNA的一條鏈上，擴(kuò)增結(jié)果如何？ABCDEABCDEABCDEACBCDEAD引物丙引物乙引物甲ABCABCDEABCDEAC引物丙引物乙引物丙引物乙BCAABCBCA引物丙引物乙ABCDEABCDEACBCDEAD引物丙引物乙引物甲BCDEAC引物乙BCDEADBCDEAC引物乙引物甲引物甲引物乙引物乙引物甲BCEADDC

PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

如果目的基因的核苷酸序列未知，但知道目的基因兩端的部分_____________，就可以設(shè)計(jì)合適的______，利用PCR技術(shù)大量擴(kuò)增出目的基因。核苷酸序列引物PCR反應(yīng)需要在一定的______溶液中進(jìn)行，需提供：____________、_______________（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、________和_________________，同時(shí)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為_(kāi)_____、______和______。控制的溫度分別是______、______和______。緩沖DNA模板4種脫氧核苷酸兩種引物耐高溫的DNA聚合酶變性復(fù)性延伸95℃55℃72℃PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場(chǎng)所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(主要在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進(jìn)行結(jié)果合成整個(gè)DNA分子擴(kuò)增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開(kāi)始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成思考5、dATP與ATP在結(jié)構(gòu)上有什么區(qū)別？dATP為什么能用作DNA復(fù)制的底物？①引物的長(zhǎng)度通常為20-30bp。②引物自身不能含互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物在3‘端也不應(yīng)出現(xiàn)同源性，避免形成引物二聚體。③引物濃度不宜過(guò)高，否則會(huì)錯(cuò)配。引物：決定PCR特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵一、PCR的原理二、PCR的應(yīng)用三、電泳的原理和應(yīng)用PCR和電泳

漢水丑生作品（QQ:70939118）5′3′5′3′待添加的限制酶的識(shí)別序列5′5′5′5′5′3′3′5′3′3′5′3′5′3′5′3′5′3′思考、若目的基因兩側(cè)無(wú)合適的限制酶切割位點(diǎn)怎么辦？待添加的限制酶的識(shí)別序列5′3′3′5′3′3′53535353第一輪第二輪2021湖北卷16.某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對(duì)）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對(duì)）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是（

）A.增加模板DNA的量

B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間

D.提高復(fù)性的溫度3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′再依靠另兩種末端引物進(jìn)行PCR。不同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳分離3′3′5′5′3′5′3′5′5′5′5′3′5′3′5′3′3′5′5′5′3′3′思考、如何利用PCR得到融合基因？思考、如何利用PCR對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變？5353ATG535353AG5353T53A第一輪第二輪G535C353AG535353ATG5353355GTA353535G353C5353AT355G353C53C一、PCR的原理二、PCR的應(yīng)用三、電泳的原理和應(yīng)用PCR和電泳

漢水丑生作品（QQ:70939118）電泳是指_______________________________________________。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上_____________。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷______的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子___________________以及_______________，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。_____________電泳和____________________電泳是兩種常用的電泳方法。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它___________________以及_____________等因素。帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程正電或負(fù)電相反帶電性質(zhì)的差異分子本身的大小和形狀的不同瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠所帶凈電荷的多少分子的大小DNA瓊脂糖凝膠瓊脂糖的微結(jié)構(gòu)瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，從瓊脂中提取而來(lái)，在電泳緩沖液中加熱到沸點(diǎn)后溶解，冷卻后又凝固成均勻的膠體胨，具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。pH=8左右時(shí)，DNA分子帶負(fù)電。在堿性環(huán)境下，不同的DNA分子具有相同的電荷密度。DNA分子在凝膠中的遷移率與其所含堿基對(duì)數(shù)目的對(duì)數(shù)值成反比?？梢越朴糜诠浪惴肿拥拇笮　ｋ娪疽话阈枰狹arker（標(biāo)記），為一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段，在電泳中作為未知樣品大小的參照物。如D2000plusDNALadder含有9條雙鏈DNA分子，其分子量為100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000bp。電泳結(jié)果SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳可使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率只取決于它的分子大小。SDS的作用：

①SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成_____________；

②SDS能與各種蛋白質(zhì)（肽鏈）形成__