ATF3經(jīng)AP-1信號(hào)通路調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)氣道粘液高分泌的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義氣道黏液高分泌是臨床常見的呼吸道病理改變，是多種呼吸系統(tǒng)疾病的重要特征，如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘、慢性支氣管炎、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張等。其中，COPD作為一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，以持續(xù)進(jìn)行性氣流受限為特征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球COPD患者數(shù)量龐大，且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。慢性氣道黏液高分泌是COPD的重要病理生理特征之一，臨床上表現(xiàn)為慢性咳嗽、咳痰。有研究表明，近50%的COPD患者存在慢性氣道黏液高分泌，這會(huì)導(dǎo)致氣流受限、肺功能下降、呼吸道反復(fù)感染、COPD急性加重、住院和病死率增加。香煙煙霧（CS）是COPD發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。長期暴露于香煙煙霧中，其中的尼古丁、焦油、一氧化碳、多環(huán)芳烴等多種有害物質(zhì)會(huì)直接損傷氣道上皮細(xì)胞，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活炎癥細(xì)胞，釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥和黏液高分泌。研究顯示，吸煙人群患COPD的風(fēng)險(xiǎn)是非吸煙人群的數(shù)倍，且吸煙量與COPD的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。轉(zhuǎn)錄激活因子3（ATF3）作為一種參與細(xì)胞反應(yīng)過程的適應(yīng)性反應(yīng)基因，在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。既往研究表明，ATF3對(duì)炎癥反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)不同的靶基因來加強(qiáng)或抑制炎癥反應(yīng)，其具體作用取決于應(yīng)激條件的性質(zhì)和應(yīng)激信號(hào)影響的靶組織/細(xì)胞類型。然而，在氣道上皮細(xì)胞中，ATF3的表達(dá)在調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液分泌中的作用尚未明確。激活蛋白-1（AP-1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，由c-Jun和c-Fos等蛋白組成，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程。在氣道黏液高分泌的調(diào)控中，AP-1可能通過結(jié)合到黏蛋白基因（如MUC5AC）的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而增加氣道黏液的分泌。探討ATF3是否通過AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌，對(duì)于深入了解COPD等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。一方面，有助于揭示氣道黏液高分泌的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)；另一方面，可能為COPD等疾病的精準(zhǔn)治療提供新思路，改善患者的預(yù)后，減輕社會(huì)和家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀氣道黏液高分泌作為多種呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵病理特征，一直是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。在慢性阻塞性肺疾?。–OPD）中，氣道黏液高分泌不僅是疾病的重要標(biāo)志，還與病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，近50%的COPD患者存在慢性氣道黏液高分泌，這會(huì)導(dǎo)致氣流受限、肺功能下降、呼吸道反復(fù)感染、COPD急性加重、住院和病死率增加。在哮喘患者中，氣道黏液高分泌同樣常見，約20-40%的哮喘患者存在此癥狀，其導(dǎo)致的黏液栓可阻塞氣道，引發(fā)嚴(yán)重的呼吸困難，甚至危及生命。此外，慢性支氣管炎、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張等疾病也都伴有明顯的氣道黏液高分泌現(xiàn)象。香煙煙霧作為COPD發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，其致病機(jī)制的研究也取得了一定進(jìn)展。香煙煙霧中含有尼古丁、焦油、一氧化碳、多環(huán)芳烴等多種有害物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入人體后，會(huì)直接損傷氣道上皮細(xì)胞，破壞氣道的防御屏障。同時(shí)，它們還能引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等，促使這些細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥和黏液高分泌。有研究通過建立動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)長期暴露于香煙煙霧中的小鼠，氣道上皮細(xì)胞受損，杯狀細(xì)胞增生，黏液分泌顯著增加，同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤明顯，炎癥因子水平升高。轉(zhuǎn)錄激活因子3（ATF3）在多種生理和病理過程中的作用逐漸受到關(guān)注。在炎癥反應(yīng)方面，已有研究證實(shí)ATF3對(duì)炎癥具有雙向調(diào)節(jié)作用。在某些應(yīng)激條件下，ATF3可通過調(diào)節(jié)不同的靶基因來加強(qiáng)炎癥反應(yīng)；而在另一些情況下，它又能抑制炎癥反應(yīng)，其具體作用取決于應(yīng)激條件的性質(zhì)和應(yīng)激信號(hào)影響的靶組織/細(xì)胞類型。在肝臟損傷模型中，ATF3能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，減輕肝臟的炎癥損傷；而在神經(jīng)炎癥模型中，ATF3卻可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。然而，在氣道上皮細(xì)胞中，ATF3的表達(dá)在調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液分泌中的作用尚未明確，這為進(jìn)一步研究氣道黏液高分泌的機(jī)制留下了空白。激活蛋白-1（AP-1）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在氣道黏液高分泌的調(diào)控中，AP-1被認(rèn)為是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。已有研究表明，AP-1可以通過結(jié)合到黏蛋白基因（如MUC5AC）的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而增加氣道黏液的分泌。在哮喘和COPD的研究中，發(fā)現(xiàn)患者氣道上皮細(xì)胞中AP-1的活性明顯增強(qiáng)，同時(shí)MUC5AC的表達(dá)也顯著增加，提示AP-1在氣道黏液高分泌的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要作用。但是，AP-1在香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌過程中，與其他因子之間的相互作用關(guān)系，尤其是與ATF3之間的關(guān)聯(lián)，目前還缺乏深入的研究。綜上所述，雖然氣道黏液高分泌、香煙煙霧致病、ATF3和AP-1在相關(guān)領(lǐng)域都有了一定的研究成果，但對(duì)于ATF3是否通過AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌這一關(guān)鍵問題，目前尚未有明確的研究報(bào)道。深入探討這一問題，將有助于進(jìn)一步揭示氣道黏液高分泌的分子調(diào)控機(jī)制，為COPD等呼吸系統(tǒng)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在明確轉(zhuǎn)錄激活因子3（ATF3）是否通過激活蛋白-1（AP-1）調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌，為揭示慢性阻塞性肺疾病（COPD）等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，并為開發(fā)新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：香煙煙霧對(duì)氣道上皮細(xì)胞ATF3和MUC5AC表達(dá)的影響：以人體氣道上皮細(xì)胞HBE（正常氣道上皮細(xì)胞系）、NCI-H292細(xì)胞（人肺黏液表皮樣癌來源細(xì)胞系）和MTEC（小鼠原代氣道上皮細(xì)胞）為研究對(duì)象，采用不同濃度的香煙煙霧提取物（CSE）或直接暴露于香煙煙霧環(huán)境中處理細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）和免疫熒光（IF）等技術(shù)，檢測(cè)ATF3和MUC5AC在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，明確香煙煙霧暴露是否能誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5AC的表達(dá)。ATF3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用：構(gòu)建ATF3小干擾RNA（ATF3siRNA）和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞，使ATF3基因表達(dá)沉默或過表達(dá)。然后用香煙煙霧處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，通過Q-PCR、WesternBlot和IF檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)水平，分析ATF3缺失或過表達(dá)對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)的影響，確定ATF3是否參與調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)。ATF3通過AP-1調(diào)控MUC5AC表達(dá)的機(jī)制研究：利用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，驗(yàn)證ATF3與AP-1蛋白之間是否存在相互作用；運(yùn)用染色體免疫共沉淀（CHIP）法，檢測(cè)ATF3是否通過AP-1間接結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證AP-1在ATF3調(diào)控MUC5AC表達(dá)過程中的作用，明確ATF3通過AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)的具體分子機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ATF3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌的調(diào)控作用：構(gòu)建ATF3基因敲除小鼠（ATF3-/-mice），通過氣道滴注CSE或熏煙的方式建立COPD小鼠模型。同時(shí)設(shè)置野生型小鼠（WildTypemice，WTmice）作為對(duì)照。采用組織病理學(xué)分析，觀察小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況；運(yùn)用免疫組化和Q-PCR檢測(cè)小鼠氣道組織中MUC5AC的表達(dá)水平；通過檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的含量，評(píng)估氣道炎癥程度。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證在體內(nèi)環(huán)境下ATF3是否通過AP-1調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1氣道粘液高分泌概述氣道粘液高分泌是指氣道內(nèi)粘液過度分泌或清除障礙導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)，是多種呼吸系統(tǒng)疾病共有的重要病理特征，常見于慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、哮喘、慢性支氣管炎、囊性纖維化、支氣管擴(kuò)張等疾病。在正常生理狀態(tài)下，氣道粘液由氣道上皮的杯狀細(xì)胞和粘膜下腺體分泌，對(duì)維持氣道的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。它能夠濕潤吸入的空氣，防止氣道干燥，同時(shí)作為一道物理屏障，捕獲吸入的病原體、灰塵和其他有害物質(zhì)，通過纖毛的擺動(dòng)將其排出體外，從而保護(hù)氣道免受損傷。然而，當(dāng)氣道受到吸煙、感染、空氣污染、過敏原等多種因素刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的病理生理變化，導(dǎo)致氣道粘液高分泌。吸煙是導(dǎo)致氣道粘液高分泌的重要危險(xiǎn)因素之一，香煙煙霧中含有尼古丁、焦油、一氧化碳、多環(huán)芳烴等多種有害物質(zhì)，這些物質(zhì)可直接損傷氣道上皮細(xì)胞，破壞氣道的防御屏障，使氣道對(duì)病原體的易感性增加。同時(shí)，它們還能激活炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等，促使這些細(xì)胞釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，引發(fā)氣道炎癥反應(yīng)。炎癥介質(zhì)進(jìn)一步刺激杯狀細(xì)胞和粘膜下腺體增生、肥大，使其分泌粘液的能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致氣道粘液高分泌。氣道粘液高分泌會(huì)對(duì)呼吸功能產(chǎn)生諸多不良影響。大量分泌的粘液會(huì)積聚在氣道內(nèi)，導(dǎo)致氣道狹窄，增加氣流阻力，使患者出現(xiàn)呼吸困難的癥狀。同時(shí)，粘液還會(huì)阻礙氣道纖毛的正常擺動(dòng)，影響粘液的清除功能，使得病原體更容易在氣道內(nèi)定植和繁殖，引發(fā)反復(fù)的呼吸道感染。呼吸道感染又會(huì)進(jìn)一步加重氣道炎癥和粘液高分泌，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致病情不斷惡化。在COPD患者中，氣道粘液高分泌與肺功能的下降密切相關(guān)，是導(dǎo)致患者生活質(zhì)量降低、急性加重頻繁發(fā)作以及病死率增加的重要因素。在哮喘患者中，氣道粘液高分泌形成的粘液栓可阻塞小氣道，導(dǎo)致嚴(yán)重的通氣障礙，甚至引發(fā)哮喘持續(xù)狀態(tài)，危及患者生命。2.2香煙煙霧對(duì)氣道的影響香煙煙霧是一種復(fù)雜的混合物，含有多達(dá)4000余種化學(xué)物質(zhì)，其中氣相成分占總量的92%，主要包括一氧化碳、二氧化碳、氮氧化物、揮發(fā)性低分子烷烴和烯烴等；固相成分占總量的8%，為粒徑0.1-2μm的煙塵，冷凝后即為焦油，每支紙煙約產(chǎn)生20-35mg焦油。2017年10月27日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單初步整理參考，二手煙草煙霧被列為一類致癌物。香煙煙霧中的尼古丁是最主要的成癮成分，它能夠刺激神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致依賴性形成。同時(shí)，尼古丁還會(huì)加速心跳，增加血壓，對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。焦油作為香煙煙霧中的固體成分，含有多種有害化學(xué)物質(zhì)，如多環(huán)芳烴（PAHs）和亞硝胺等。這些物質(zhì)沉積在肺部，不僅會(huì)對(duì)肺部組織造成直接損傷，還可能導(dǎo)致肺病和癌癥的發(fā)生。一氧化碳是一種無色、無味的氣體，能夠與血紅蛋白結(jié)合，減少血液攜氧能力，增加心臟負(fù)擔(dān)，進(jìn)而增加心臟病和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，香煙煙霧中還含有多種重金屬，如鎘、鉛、砷等，這些重金屬可以損害肺部、心臟、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)；含有多種已知的致癌物質(zhì)，如苯并芘、亞硝胺和二惡英等，可引起多種癌癥，包括肺癌、口腔癌、食道癌和膀胱癌等；含有多種揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs），如甲醛、苯、甲苯等，這些化合物可以引起呼吸道刺激、頭痛、眼睛刺激等癥狀，長期接觸還可能增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)氣道暴露于香煙煙霧中時(shí)，這些有害物質(zhì)會(huì)對(duì)氣道產(chǎn)生多方面的影響。首先，它們會(huì)刺激氣道，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究表明，香煙煙霧中的成分能夠激活炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞等。這些炎癥細(xì)胞被激活后，會(huì)釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子會(huì)進(jìn)一步吸引更多的炎癥細(xì)胞聚集到氣道，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。在一項(xiàng)對(duì)吸煙人群的研究中發(fā)現(xiàn)，吸煙者氣道中的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯高于非吸煙者，且炎癥因子水平也顯著升高。其次，香煙煙霧會(huì)刺激氣道導(dǎo)致粘液高分泌。炎癥介質(zhì)的釋放會(huì)刺激氣道上皮的杯狀細(xì)胞和粘膜下腺體增生、肥大，使其分泌粘液的能力增強(qiáng)。同時(shí)，香煙煙霧中的有害物質(zhì)還可能直接影響粘液的成分和性質(zhì)，使其變得更加粘稠，難以排出。這不僅會(huì)導(dǎo)致氣道狹窄，增加氣流阻力，影響呼吸功能，還會(huì)為病原體的滋生提供良好的環(huán)境，增加呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)。有研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長期暴露于香煙煙霧中的小鼠，氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多，粘液分泌顯著增加，且呼吸道感染的發(fā)生率也明顯升高。此外，香煙煙霧還會(huì)損傷氣道上皮細(xì)胞。氣道上皮細(xì)胞是氣道的第一道防線，對(duì)維持氣道的正常功能至關(guān)重要。然而，香煙煙霧中的有害物質(zhì)能夠直接損傷氣道上皮細(xì)胞，破壞其結(jié)構(gòu)和功能。這會(huì)導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的屏障功能受損，使氣道更容易受到病原體的侵襲。同時(shí)，損傷的氣道上皮細(xì)胞還會(huì)釋放一些損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），進(jìn)一步激活炎癥反應(yīng)，加重氣道損傷。在體外實(shí)驗(yàn)中，將氣道上皮細(xì)胞暴露于香煙煙霧提取物中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率明顯降低，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，且細(xì)胞的屏障功能也受到了明顯的破壞。2.3ATF3的生物學(xué)特性與功能轉(zhuǎn)錄激活因子3（ATF3）屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包含一個(gè)N端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端的bZIP結(jié)構(gòu)域。bZIP結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與特定的DNA序列結(jié)合，形成同源或異源二聚體，從而識(shí)別并結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。ATF3基因位于人類染色體1q21.3上，全長約4.6kb，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其編碼的蛋白質(zhì)由181個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為20kDa。ATF3通常在細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激時(shí)被激活，如缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏以及病毒感染等。這些應(yīng)激信號(hào)通過一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致ATF3基因的轉(zhuǎn)錄激活和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。在未折疊蛋白反應(yīng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)激活I(lǐng)RE1α-XBP1通路，進(jìn)而誘導(dǎo)ATF3的表達(dá)。同時(shí)，p38MAPK信號(hào)通路也可在應(yīng)激條件下磷酸化ATF3，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS）會(huì)激活相關(guān)激酶，通過磷酸化等修飾作用，促使ATF3表達(dá)增加。ATF3在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是一種重要的應(yīng)激反應(yīng)蛋白。在細(xì)胞面臨各種不利環(huán)境時(shí)，它的表達(dá)迅速增加，幫助細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激條件，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在缺氧條件下，ATF3可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，促進(jìn)血管生成和細(xì)胞代謝的適應(yīng)性改變，以緩解缺氧對(duì)細(xì)胞的損傷。在缺氧的腫瘤微環(huán)境中，ATF3能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣。在炎癥反應(yīng)中，ATF3對(duì)炎癥具有雙向調(diào)節(jié)作用，其具體作用取決于應(yīng)激條件的性質(zhì)和應(yīng)激信號(hào)影響的靶組織/細(xì)胞類型。在巨噬細(xì)胞中，ATF3可抑制炎癥因子的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，防止過度炎癥對(duì)組織造成損傷。脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞時(shí)，ATF3能夠抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。然而，在某些情況下，ATF3也可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在神經(jīng)炎癥模型中，ATF3卻可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其具體機(jī)制可能與ATF3調(diào)節(jié)不同的靶基因有關(guān)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，ATF3參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，它可以抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞停滯在G1期或G2/M期，從而為細(xì)胞修復(fù)損傷或應(yīng)對(duì)應(yīng)激提供時(shí)間。這種細(xì)胞周期的阻滯作用有助于防止受損細(xì)胞的增殖，避免基因突變和腫瘤的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷時(shí)，ATF3表達(dá)上調(diào)，通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G1期，以便細(xì)胞有足夠的時(shí)間修復(fù)DNA損傷。ATF3在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著復(fù)雜的作用，其功能同樣取決于細(xì)胞類型和應(yīng)激刺激的性質(zhì)。在某些情況下，ATF3可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)細(xì)胞中，ATF3的過度表達(dá)可通過激活促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在其他細(xì)胞類型中，ATF3也可能具有抗凋亡作用，通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)。在腫瘤細(xì)胞中，ATF3的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生的早期，ATF3作為一種腫瘤抑制因子，可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，阻止腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展；而在腫瘤進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞可能利用ATF3來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和促進(jìn)腫瘤血管生成，此時(shí)ATF3又表現(xiàn)出促腫瘤的作用。在乳腺癌中，ATF3在腫瘤早期可抑制癌細(xì)胞的增殖，但在晚期腫瘤中，ATF3可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.4AP-1的結(jié)構(gòu)與功能激活蛋白-1（AP-1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，并非單一的蛋白質(zhì)，而是由Jun（c-Jun、JunB、JunD）、Fos（c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2）、ATF（激活轉(zhuǎn)錄因子，包括ATF-2、ATF-3/LRF1、ATF-4、ATF-5、ATF-6B、ATF-7、BATF、BATF-2、BATF-3、JDP2）或MAF（c-MAF、MafA、MafB、MafF、MafG、MafK和Nrl）等亞基組成的二聚體轉(zhuǎn)錄因子。這些亞基之間通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)以同源或異源二聚體的形式相互作用，形成穩(wěn)定的AP-1復(fù)合物。亮氨酸拉鏈?zhǔn)且环N蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其特點(diǎn)是在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，每隔7個(gè)氨基酸就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸殘基，這些亮氨酸殘基在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成α-螺旋，并且這些α-螺旋通過疏水相互作用相互纏繞，形成拉鏈狀的結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)之間能夠形成穩(wěn)定的二聚體。AP-1可以識(shí)別并結(jié)合到特定的DNA序列上，即AP-1結(jié)合位點(diǎn)（5’-TGACTCA-3’），進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。不同的AP-1二聚體對(duì)DNA結(jié)合位點(diǎn)的親和力和特異性存在差異，這決定了它們對(duì)不同靶基因的調(diào)控作用。c-Fos/c-Jun異源二聚體與AP-1結(jié)合位點(diǎn)的親和力較高，能夠有效地啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄；而其他一些二聚體組合可能對(duì)特定基因的調(diào)控具有不同的親和力和功能特性。AP-1的活性受到多種細(xì)胞外刺激的調(diào)節(jié)，這些刺激包括細(xì)胞因子、生長因子、壓力、細(xì)菌和病毒感染、氧化應(yīng)激、紫外線照射等。當(dāng)細(xì)胞受到這些刺激時(shí)，會(huì)激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致AP-1的活化。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在AP-1的激活中起著關(guān)鍵作用。生長因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，通過Ras蛋白激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使c-Jun的Ser63和Ser73位點(diǎn)磷酸化，增強(qiáng)AP-1與DNA的結(jié)合能力，從而促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。JNK通路也參與AP-1的激活，在應(yīng)激信號(hào)如紫外線（UV）、活性氧（ROS）等刺激下，JNK被激活并磷酸化c-Jun，進(jìn)而促進(jìn)AP-1的活化，以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)不同應(yīng)激條件的反應(yīng)。AP-1在細(xì)胞的多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，AP-1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而推動(dòng)細(xì)胞增殖。在腫瘤細(xì)胞中，c-Jun/c-Fos的過表達(dá)可通過激活CyclinD1等基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。在細(xì)胞分化過程中，AP-1參與調(diào)控細(xì)胞向特定方向分化的基因表達(dá)程序，影響細(xì)胞的命運(yùn)決定。在神經(jīng)細(xì)胞分化過程中，AP-1可以調(diào)節(jié)神經(jīng)特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟。在細(xì)胞凋亡過程中，AP-1的作用較為復(fù)雜，其功能取決于細(xì)胞類型和刺激因素。在某些情況下，AP-1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如在氧化應(yīng)激條件下，AP-1通過激活促凋亡基因BAX的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而在另一些情況下，AP-1可能具有抗凋亡作用，通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)。AP-1還參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。在免疫細(xì)胞中，AP-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等的表達(dá)，從而影響免疫細(xì)胞的活化、增殖、分化和遷移，以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。在T細(xì)胞活化過程中，AP-1可調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。在炎癥反應(yīng)中，AP-1能激活多種炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫病中，AP-1驅(qū)動(dòng)Th17細(xì)胞分化，促進(jìn)IL-17、IL-21等促炎因子的分泌，加重炎癥損傷。2.5ATF3與AP-1的關(guān)系A(chǔ)TF3與AP-1在結(jié)構(gòu)與功能上存在著密切的聯(lián)系，它們均屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。從蛋白結(jié)構(gòu)角度來看，ATF3和AP-1的亞基都含有bZIP結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域是它們能夠與特定DNA序列結(jié)合的關(guān)鍵。bZIP結(jié)構(gòu)域由一個(gè)富含堿性氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈區(qū)組成。亮氨酸拉鏈區(qū)中每隔7個(gè)氨基酸就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亮氨酸殘基，這些亮氨酸殘基在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成α-螺旋，并且這些α-螺旋通過疏水相互作用相互纏繞，形成拉鏈狀的結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)之間能夠形成穩(wěn)定的二聚體。ATF3通過其bZIP結(jié)構(gòu)域可以與自身形成同源二聚體，也可以與AP-1家族中的其他成員如c-Jun、c-Fos等形成異源二聚體。這種二聚體的形成增加了它們與DNA結(jié)合的特異性和親和力，從而更有效地調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，ATF3和AP-1存在著復(fù)雜的相互作用。ATF3可以結(jié)合到AP-1的結(jié)合位點(diǎn)（5’-TGACTCA-3’）上，與AP-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA，從而影響AP-1對(duì)靶基因的調(diào)控作用。在某些細(xì)胞應(yīng)激條件下，ATF3的表達(dá)上調(diào)，它可以與AP-1結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制AP-1對(duì)下游靶基因的激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，在氧化應(yīng)激條件下，ATF3能夠與AP-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。ATF3也可以與AP-1形成復(fù)合物，協(xié)同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在一些情況下，ATF3與AP-1的結(jié)合可以增強(qiáng)它們對(duì)靶基因的調(diào)控作用。在炎癥反應(yīng)中，ATF3和AP-1可以共同結(jié)合到炎癥相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。在脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞的模型中，ATF3和AP-1協(xié)同作用，上調(diào)白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。此外，ATF3和AP-1的表達(dá)和活性還受到多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的調(diào)控，這些信號(hào)通路的交叉對(duì)話進(jìn)一步影響了它們之間的相互作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路可以同時(shí)激活A(yù)TF3和AP-1。在生長因子刺激下，Ras蛋白激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，一方面使c-Jun的Ser63和Ser73位點(diǎn)磷酸化，增強(qiáng)AP-1與DNA的結(jié)合能力；另一方面，通過p38MAPK信號(hào)通路磷酸化ATF3，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。這種共同的信號(hào)調(diào)控機(jī)制使得ATF3和AP-1在細(xì)胞對(duì)不同刺激的反應(yīng)中能夠協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。三、ATF3參與香煙煙霧誘導(dǎo)氣道粘液高分泌的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：人體氣道上皮細(xì)胞HBE（正常氣道上皮細(xì)胞系）、NCI-H292細(xì)胞（人肺黏液表皮樣癌來源細(xì)胞系），購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。所有細(xì)胞均在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Solarbio公司，中國）的DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡的野生型C57BL/6小鼠和ATF3基因敲除小鼠（ATF3-/-mice），體重20-25g，購自南京模式動(dòng)物研究所。所有小鼠均飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的無特定病原體（SPF）環(huán)境中，自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)過程中遵循動(dòng)物倫理原則，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。香煙煙霧提取物（CSE）：參照文獻(xiàn)方法制備CSE。取市售某品牌香煙（每支含焦油量10mg、煙堿量1.0mg、一氧化碳量11mg），將香煙插入自制的吸煙裝置中，點(diǎn)燃后通過真空泵將煙霧緩慢吸入含有10mL無血清DMEM培養(yǎng)基的容器中，持續(xù)抽吸10min，使煙霧充分溶解于培養(yǎng)基中，得到CSE原液。將CSE原液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，保存于-80℃冰箱備用。使用時(shí)，將CSE原液用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。主要儀器設(shè)備：實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）用于檢測(cè)基因表達(dá)水平；蛋白質(zhì)印跡儀（Bio-Rad公司，美國）用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）用于免疫熒光檢測(cè)；高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）用于細(xì)胞和組織的離心分離；CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）用于細(xì)胞培養(yǎng)；核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop2000，ThermoFisherScientific公司，美國）用于核酸和蛋白濃度測(cè)定；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）用于核酸和蛋白電泳及結(jié)果分析；恒溫?fù)u床（NewBrunswickScientific公司，美國）用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar，上海睿鈺生物科技有限公司）用于細(xì)胞計(jì)數(shù)；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司，中國）用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌。主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）用于提取細(xì)胞和組織中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司，日本）用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)；兔抗人ATF3抗體、兔抗人MUC5AC抗體、兔抗人β-actin抗體（Abcam公司，英國）用于蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光檢測(cè)；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（JacksonImmunoResearchLaboratories公司，美國）用于蛋白質(zhì)印跡的二抗檢測(cè)；AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（Invitrogen公司，美國）用于免疫熒光的二抗檢測(cè)；DAPI染液（Solarbio公司，中國）用于細(xì)胞核染色；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國）用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染；ATF3小干擾RNA（ATF3siRNA）和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒（ThermoFisherScientific公司，美國）用于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；染色體免疫共沉淀（CHIP）試劑盒（Millipore公司，美國）用于檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國）用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫（AB-PAS）染色試劑盒（Solarbio公司，中國）用于組織病理學(xué)染色；ELISA試劑盒（R&DSystems公司，美國）用于檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的含量。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞培養(yǎng)：將HBE細(xì)胞和NCI-H292細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%-90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Solarbio公司，中國）消化傳代。小鼠原代氣道上皮細(xì)胞（MTEC）的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行。取C57BL/6小鼠，頸椎脫臼處死后，迅速取出氣管，用PBS沖洗干凈。將氣管剪成小段，放入含有0.1%II型膠原酶（Sigma-Aldrich公司，美國）的DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，37℃消化30-40min。用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞從氣管組織中分離出來，將細(xì)胞懸液通過40μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片。將濾液離心（1000rpm，5min），收集細(xì)胞沉淀，用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、10ng/mL表皮生長因子（EGF，PeproTech公司，美國）、500ng/mL氫化可的松（Sigma-Aldrich公司，美國）、10μg/mL胰島素（Sigma-Aldrich公司，美國）、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma-Aldrich公司，美國）、5ng/mL三碘甲狀腺原氨酸（T3，Sigma-Aldrich公司，美國）的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先包被有鼠尾膠原（Solarbio公司，中國）的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將對(duì)數(shù)生長期的HBE細(xì)胞和NCI-H292細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長至50%-60%匯合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將ATF3siRNA或ATF3過表達(dá)質(zhì)粒與Lipofectamine3000試劑分別稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）中，室溫孵育5min。然后將兩者混合，室溫孵育20min，形成RNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物或質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6h后，更換為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)基因表達(dá)：收集細(xì)胞或組織，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，要求OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中ATF3、MUC5AC和β-actin基因序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：收集細(xì)胞或組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（Solarbio公司，中國），冰上裂解30min。然后在4℃下，12000rpm離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司，中國）測(cè)定蛋白濃度。取30-50μg總蛋白，進(jìn)行10%-12%SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司，美國）上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入兔抗人ATF3抗體（1:1000）、兔抗人MUC5AC抗體（1:1000）或兔抗人β-actin抗體（1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液，pH7.4）洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL，ThermoFisherScientific公司，美國）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)水平。免疫熒光（IF）檢測(cè)蛋白表達(dá)和定位：將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，用PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100（Solarbio公司，中國）通透細(xì)胞10-15min，PBS洗滌3次，每次5min。用5%BSA封閉細(xì)胞1-2h，然后加入兔抗人ATF3抗體（1:200）或兔抗人MUC5AC抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min。然后加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:500），室溫避光孵育1-2h。再次用PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染液染色細(xì)胞核5-10min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑（Solarbio公司，中國）封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)和定位情況。免疫共沉淀（Co-IP）檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用：收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的IP裂解液（ThermoFisherScientific公司，美國），冰上裂解30min。4℃下，12000rpm離心15min，收集上清液。取適量上清液，加入兔抗人ATF3抗體或兔抗人AP-1抗體（c-Jun或c-Fos抗體，Abcam公司，英國），4℃孵育過夜。次日，加入ProteinA/G磁珠（ThermoFisherScientific公司，美國），室溫孵育2-4h，使抗體-抗原復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。用IP洗滌緩沖液（ThermoFisherScientific公司，美國）洗滌磁珠5次，每次5min。然后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5-10min，使蛋白質(zhì)從磁珠上洗脫下來。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后用WesternBlot檢測(cè)ATF3與AP-1蛋白之間是否存在相互作用。染色體免疫共沉淀（CHIP）檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA的相互作用：參照CHIP試劑盒說明書進(jìn)行操作。將細(xì)胞用1%甲醛室溫交聯(lián)10min，加入甘氨酸至終濃度為0.125M，室溫孵育5min終止交聯(lián)。用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，加入SDS裂解液裂解細(xì)胞。超聲破碎細(xì)胞，使染色質(zhì)斷裂成200-1000bp的片段。4℃下，12000rpm離心10min，收集上清液。取適量上清液，加入兔抗人ATF3抗體或兔抗人AP-1抗體，4℃孵育過夜。次日，加入ProteinA/G磁珠，室溫孵育2-4h，使抗體-抗原-DNA復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液依次洗滌磁珠，每次5min。然后加入洗脫緩沖液，室溫孵育15min，洗脫抗體-抗原-DNA復(fù)合物。加入蛋白酶K，65℃孵育4-6h，解交聯(lián)DNA與蛋白質(zhì)。用酚-***仿-異戊醇抽提DNA，乙醇沉淀DNA。將沉淀的DNA溶解于適量的ddH?O中，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域與ATF3或AP-1的結(jié)合情況。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合活性：根據(jù)MUC5AC啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-MUC5AC-AP-1），同時(shí)合成不含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的陰性對(duì)照質(zhì)粒（pGL3-MUC5AC-NC）。將HBE細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h。然后將pGL3-MUC5AC-AP-1或pGL3-MUC5AC-NC質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK（Promega公司，美國）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染ATF3過表達(dá)質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，分析AP-1在ATF3調(diào)控MUC5AC表達(dá)過程中的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將野生型C57BL/6小鼠和ATF3-/-mice隨機(jī)分為對(duì)照組、CSE氣道滴注組和熏煙組，每組10只。CSE氣道滴注組小鼠用10%CSE（50μL）通過氣管插管緩慢滴注到氣道內(nèi)，每周2次，共4周；熏煙組小鼠置于自制的熏煙裝置中，每天暴露于香煙煙霧中1h，共4周；對(duì)照組小鼠給予等量的PBS氣道滴注或置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉，進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），用于檢測(cè)炎癥因子含量。然后取出肺組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)分析；另一部分凍存于-80℃冰箱，用于提取RNA和蛋白質(zhì)，檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)水平。組織病理學(xué)分析：將固定好的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4μm。進(jìn)行HE染色，觀察氣道炎癥細(xì)胞浸潤情況；進(jìn)行AB-PAS染色，觀察氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus軟件對(duì)氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量和黏液分泌面積進(jìn)行定量分析。ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子含量：將收集的BALF在4℃下，3000rpm離心15min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)BALF中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的含量。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子的濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2香煙煙霧對(duì)氣道上皮細(xì)胞ATF3和MUC5AC表達(dá)的影響將對(duì)數(shù)生長期的人體氣道上皮細(xì)胞HBE、NCI-H292細(xì)胞和小鼠原代氣道上皮細(xì)胞（MTEC）分別接種于6孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在培養(yǎng)24h后生長至70%-80%匯合度。隨后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同條件的處理：對(duì)照組細(xì)胞給予正常的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別給予不同濃度（2.5%、5%、10%、20%）的香煙煙霧提取物（CSE）處理，或直接暴露于香煙煙霧環(huán)境中（設(shè)定煙霧濃度、暴露時(shí)間等參數(shù)，如煙霧濃度為XXmg/m3，暴露時(shí)間為30min、1h、2h等），分別在處理后0h、1h、3h、6h、12h、24h收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中ATF3和MUC5ACmRNA的表達(dá)水平。收集細(xì)胞后，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件如前文所述。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測(cè)細(xì)胞中ATF3和MUC5AC蛋白的表達(dá)水平。收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃下，12000rpm離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30-50μg總蛋白，進(jìn)行10%-12%SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入兔抗人ATF3抗體（1:1000）、兔抗人MUC5AC抗體（1:1000）或兔抗人β-actin抗體（1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)水平。通過免疫熒光（IF）檢測(cè)細(xì)胞中ATF3和MUC5AC蛋白的表達(dá)和定位。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，用PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min，PBS洗滌3次，每次5min。用5%BSA封閉細(xì)胞1-2h，然后加入兔抗人ATF3抗體（1:200）或兔抗人MUC5AC抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min。然后加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:500），室溫避光孵育1-2h。再次用PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染液染色細(xì)胞核5-10min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)和定位情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著CSE濃度的增加和暴露時(shí)間的延長，氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5ACmRNA和蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。在CSE濃度為10%、暴露時(shí)間為6h時(shí)，ATF3和MUC5AC的表達(dá)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)和濃度組（P<0.05）。在直接暴露于香煙煙霧環(huán)境中，暴露1h后，ATF3和MUC5AC的表達(dá)開始升高，2h時(shí)升高更為明顯（P<0.01）。免疫熒光結(jié)果也表明，ATF3和MUC5AC在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)量增加，且分布發(fā)生變化，更多地聚集在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。這表明香煙煙霧暴露能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5AC的表達(dá)上調(diào)，且這種上調(diào)具有時(shí)間和濃度依賴性。3.3ATF3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用將對(duì)數(shù)生長期的人體氣道上皮細(xì)胞HBE和NCI-H292細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長至50%-60%匯合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，將ATF3小干擾RNA（ATF3siRNA）或ATF3過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA或空載質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染4-6h后，更換為含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分為以下幾組：對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染且未用香煙煙霧處理）、陰性對(duì)照siRNA組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA后用香煙煙霧處理）、ATF3siRNA組（轉(zhuǎn)染ATF3siRNA后用香煙煙霧處理）、空載質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒后用香煙煙霧處理）、ATF3過表達(dá)質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染ATF3過表達(dá)質(zhì)粒后用香煙煙霧處理）。用10%CSE處理細(xì)胞6h，或按照前文設(shè)定的香煙煙霧暴露條件處理細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中MUC5ACmRNA的表達(dá)水平。收集細(xì)胞后，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件如前文所述。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）檢測(cè)細(xì)胞中MUC5AC蛋白的表達(dá)水平。收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min。4℃下，12000rpm離心15min，收集上清液，即為總蛋白提取物。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取30-50μg總蛋白，進(jìn)行10%-12%SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，然后加入兔抗人MUC5AC抗體（1:1000）或兔抗人β-actin抗體（1:5000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)水平。通過免疫熒光（IF）檢測(cè)細(xì)胞中MUC5AC蛋白的表達(dá)和定位。將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)24h。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，用PBS洗滌3次，每次5min。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min，PBS洗滌3次，每次5min。用5%BSA封閉細(xì)胞1-2h，然后加入兔抗人MUC5AC抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min。然后加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:500），室溫避光孵育1-2h。再次用PBS洗滌3次，每次5min。用DAPI染液染色細(xì)胞核5-10min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)和定位情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照siRNA組相比，ATF3siRNA組中，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5ACmRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.05）。這表明敲除ATF3基因能夠抑制香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)，說明ATF3在香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的過程中起到促進(jìn)作用。然而，ATF3過表達(dá)質(zhì)粒組與空載質(zhì)粒組相比，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。這一現(xiàn)象提示，ATF3可能并非直接調(diào)控MUC5AC的表達(dá)，其對(duì)MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用可能需要通過其他分子或信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。3.4ATF3調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的機(jī)制研究為深入探究ATF3調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的具體機(jī)制，采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)來驗(yàn)證ATF3與AP-1蛋白之間是否存在相互作用。收集經(jīng)10%CSE處理6h后的氣道上皮細(xì)胞HBE，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的IP裂解液，冰上裂解30min，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。4℃下，12000rpm離心15min，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。取適量上清液，加入兔抗人ATF3抗體，4℃孵育過夜，使抗體與ATF3蛋白特異性結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，室溫孵育2-4h，ProteinA/G磁珠能夠特異性地結(jié)合抗體，從而使抗體-ATF3蛋白復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。用IP洗滌緩沖液洗滌磁珠5次，每次5min，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。然后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5-10min，使蛋白質(zhì)從磁珠上洗脫下來。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后用WesternBlot檢測(cè)是否存在與AP-1蛋白亞基（如c-Jun或c-Fos）結(jié)合的ATF3蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在免疫共沉淀的產(chǎn)物中，能夠檢測(cè)到ATF3蛋白與c-Jun和c-Fos蛋白的結(jié)合條帶，表明ATF3與AP-1蛋白之間存在相互作用，ATF3可以與AP-1形成復(fù)合物。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究ATF3通過AP-1調(diào)控MUC5AC表達(dá)的機(jī)制提供了重要線索，說明ATF3對(duì)MUC5AC表達(dá)的調(diào)控可能是通過與AP-1相互作用來實(shí)現(xiàn)的。運(yùn)用染色體免疫共沉淀（CHIP）法，檢測(cè)ATF3是否通過AP-1間接結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域。將經(jīng)10%CSE處理6h后的氣道上皮細(xì)胞HBE用1%甲醛室溫交聯(lián)10min，使蛋白質(zhì)與DNA交聯(lián)在一起，固定它們之間的相互作用。加入甘氨酸至終濃度為0.125M，室溫孵育5min終止交聯(lián)。用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，加入SDS裂解液裂解細(xì)胞，使細(xì)胞破碎。超聲破碎細(xì)胞，將染色質(zhì)斷裂成200-1000bp的片段，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。4℃下，12000rpm離心10min，收集上清液。取適量上清液，加入兔抗人ATF3抗體或兔抗人AP-1抗體（c-Jun或c-Fos抗體），4℃孵育過夜，使抗體與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合。次日，加入ProteinA/G磁珠，室溫孵育2-4h，使抗體-抗原-DNA復(fù)合物結(jié)合到磁珠上。用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCl洗滌緩沖液和TE緩沖液依次洗滌磁珠，每次5min，去除未特異性結(jié)合的DNA和蛋白質(zhì)。然后加入洗脫緩沖液，室溫孵育15min，洗脫抗體-抗原-DNA復(fù)合物。加入蛋白酶K，65℃孵育4-6h，解交聯(lián)DNA與蛋白質(zhì)，使DNA釋放出來。用酚-***仿-異戊醇抽提DNA，乙醇沉淀DNA，得到純化的DNA。將沉淀的DNA溶解于適量的ddH?O中，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域與ATF3或AP-1的結(jié)合情況。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)香煙煙霧刺激的氣道上皮細(xì)胞中，ATF3和AP-1能夠結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域。當(dāng)敲低ATF3表達(dá)后，AP-1與MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合明顯減少，這進(jìn)一步證明了ATF3通過AP-1間接結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控MUC5AC的表達(dá)。為了更深入地驗(yàn)證AP-1在ATF3調(diào)控MUC5AC表達(dá)過程中的作用，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。根據(jù)MUC5AC啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)并合成含有AP-1結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL3-MUC5AC-AP-1），同時(shí)合成不含AP-1結(jié)合位點(diǎn)的陰性對(duì)照質(zhì)粒（pGL3-MUC5AC-NC）。將HBE細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞生長至合適的匯合度。然后將pGL3-MUC5AC-AP-1或pGL3-MUC5AC-NC質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染ATF3過表達(dá)質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pGL3-MUC5AC-AP-1質(zhì)粒和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，其熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，表明AP-1在ATF3調(diào)控MUC5AC表達(dá)過程中起到重要作用，ATF3通過與AP-1相互作用，結(jié)合到MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域，從而促進(jìn)MUC5AC的表達(dá)。四、基于動(dòng)物模型的體內(nèi)驗(yàn)證4.1構(gòu)建ATF3基因敲除小鼠的COPD模型為了在體內(nèi)驗(yàn)證ATF3對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌的調(diào)控作用，本研究構(gòu)建了ATF3基因敲除小鼠（ATF3-/-mice），并通過氣道滴注CSE或熏煙的方式建立COPD小鼠模型。ATF3基因敲除小鼠購自南京模式動(dòng)物研究所，野生型C57BL/6小鼠作為對(duì)照。小鼠到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，先在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的無特定病原體（SPF）環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。采用氣道滴注CSE的方法建立COPD小鼠模型時(shí)，將小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于操作臺(tái)上。用眼科鑷子輕輕撐開小鼠口腔，將一根鈍頭的微量移液器吸頭（外徑約1.0mm）經(jīng)口腔緩慢插入氣管，深度約0.5-0.8cm，確保吸頭進(jìn)入氣管內(nèi)。然后緩慢滴入10%CSE50μL，滴注過程中注意避免小鼠嗆咳。滴注完畢后，將小鼠直立輕輕旋轉(zhuǎn)10-15s，使CSE均勻分布于氣道內(nèi)。每周滴注2次，共4周。對(duì)照組小鼠給予等量的PBS氣道滴注。采用熏煙的方式建立COPD小鼠模型時(shí)，將小鼠置于自制的熏煙裝置中。該裝置為一個(gè)密閉的玻璃箱，體積約為50cm×30cm×30cm，內(nèi)置一個(gè)可放置香煙的支架和一個(gè)小型風(fēng)扇，用于使煙霧均勻分布。選用市售某品牌香煙（每支含焦油量10mg、煙堿量1.0mg、一氧化碳量11mg），每次點(diǎn)燃10支香煙，放入支架上，開啟風(fēng)扇，使煙霧充滿整個(gè)玻璃箱。將小鼠放入箱中，每天暴露于香煙煙霧中1h，共4周。對(duì)照組小鼠置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。在造模過程中，密切觀察小鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)量、呼吸頻率和節(jié)律等。造模結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，然后進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），用于檢測(cè)炎癥因子含量；取出肺組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)分析；另一部分凍存于-80℃冰箱，用于提取RNA和蛋白質(zhì)，檢測(cè)MUC5AC的表達(dá)水平。4.2模型小鼠氣道粘液高分泌相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)對(duì)構(gòu)建的ATF3基因敲除小鼠（ATF3-/-mice）和野生型C57BL/6小鼠（WTmice）的COPD模型，進(jìn)行氣道黏液高分泌相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠氣道炎癥細(xì)胞浸潤情況。將固定好的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4μm。脫蠟、水化后，用蘇木精染色細(xì)胞核5-10min，自來水沖洗后，用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)。然后用伊紅染色細(xì)胞質(zhì)1-2min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)高倍鏡視野下（×400）氣道周圍炎癥細(xì)胞數(shù)量，分析炎癥細(xì)胞浸潤程度。運(yùn)用阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫（AB-PAS）染色觀察氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況。切片脫蠟、水化后，用阿爾辛藍(lán)染液（pH2.5）染色30-60min，使酸性黏液物質(zhì)著藍(lán)色。然后用蒸餾水沖洗，過碘酸溶液氧化5-10min，再用蒸餾水沖洗。用Schiff試劑染色15-30min，使中性黏液物質(zhì)著紅色。流水沖洗后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus軟件對(duì)氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量和黏液分泌面積進(jìn)行定量分析，計(jì)算杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總數(shù)的百分比和黏液分泌面積占?xì)獾揽偯娣e的百分比。通過免疫組化檢測(cè)小鼠氣道組織中MUC5AC的表達(dá)水平。切片脫蠟、水化后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用PBS沖洗3次，每次5min。用0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)等方法。修復(fù)后自然冷卻，PBS沖洗3次，每次5min。用5%BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育1-2h。然后加入兔抗人MUC5AC抗體（1:200），4℃孵育過夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:500），室溫孵育1-2h。再次用PBS沖洗3次，每次5min。用DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽性反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)，用自來水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，采用Image-ProPlus軟件分析MUC5AC陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值，評(píng)估MUC5AC的表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Q-PCR）檢測(cè)小鼠氣道組織中MUC5ACmRNA的表達(dá)水平。取凍存的肺組織，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和條件如前文所述。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因。通過ELISA檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎癥因子的含量。將收集的BALF在4℃下，3000rpm離心15min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)BALF中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的含量。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算炎癥因子的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CSE氣道滴注或熏煙處理后的WTmice氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，氣道杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，黏液分泌面積增大，MUC5AC蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高，BALF中IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子含量也明顯增加。而在ATF3-/-mice中，與WTmice相比，氣道炎癥細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況以及MUC5AC表達(dá)水平均無明顯差異，但BALF中IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子含量顯著升高。這表明ATF3基因敲除后，雖然對(duì)氣道黏液高分泌的影響不明顯，但可能通過影響炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致氣道炎癥加重。4.3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)的對(duì)比分析體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)人體氣道上皮細(xì)胞HBE、NCI-H292細(xì)胞和小鼠原代氣道上皮細(xì)胞（MTEC）的研究發(fā)現(xiàn)，香煙煙霧能顯著地誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5AC的表達(dá)。當(dāng)用ATF3siRNA特異性地敲除ATF3這個(gè)基因后，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC的表達(dá)顯著下降，表明ATF3在香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的過程中起到促進(jìn)作用。免疫共沉淀（Co-IP）和染色體免疫共沉淀（CHIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ATF3通過AP-1信號(hào)通路作用于MUC5AC的啟動(dòng)子區(qū)域，從而間接調(diào)控香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道MUC5AC的表達(dá)。然而，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，CSE氣道滴注野生型小鼠（WildTypemice，WTmice）氣道MUC5AC的表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，而在ATF3基因敲除小鼠（ATF3-/-mice）中氣道MUC5AC的表達(dá)并未明顯下降，這與體外實(shí)驗(yàn)中敲除ATF3后MUC5AC表達(dá)顯著下降的結(jié)果不一致。分析這些差異的原因，可能是體內(nèi)環(huán)境比體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境更為復(fù)雜。在體內(nèi)，存在多種細(xì)胞類型和組織器官之間的相互作用，免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等也會(huì)參與其中。小鼠的整體生理狀態(tài)、代謝過程以及體內(nèi)的各種調(diào)節(jié)機(jī)制都可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在體內(nèi)，炎癥反應(yīng)可能不僅僅局限于氣道上皮細(xì)胞，還會(huì)涉及到其他免疫細(xì)胞和組織，這些因素可能干擾了ATF3對(duì)MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用。此外，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟町愐部赡軐?dǎo)致結(jié)果的不同。體外實(shí)驗(yàn)采用的是細(xì)胞系或原代細(xì)胞，能夠較為精確地控制實(shí)驗(yàn)條件，研究單一因素對(duì)細(xì)胞的影響；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用的是小鼠整體模型，雖然更接近生理真實(shí)情況，但難以完全排除其他因素的干擾。不同的實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)也可能存在一定的誤差，這也需要在結(jié)果分析中予以考慮。盡管存在這些差異，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中在ATF3-/-mice模型組中，氣管及血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤明顯增加，這表明ATF3基因敲除后，氣道炎癥加重，進(jìn)一步說明ATF3在氣道炎癥反應(yīng)中具有重要作用，與體外實(shí)驗(yàn)中ATF3對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響結(jié)果相互印證，進(jìn)一步驗(yàn)證了ATF3通過AP-1調(diào)控氣道黏液高分泌的機(jī)制在體內(nèi)外具有一定的一致性。五、研究結(jié)果討論5.1ATF3在香煙煙霧誘導(dǎo)氣道粘液高分泌中的作用分析本研究通過體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入探討了ATF3在香煙煙霧誘導(dǎo)氣道粘液高分泌中的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，采用人體氣道上皮細(xì)胞HBE、NCI-H292細(xì)胞和小鼠原代氣道上皮細(xì)胞（MTEC）作為研究對(duì)象，通過給予不同濃度的香煙煙霧提取物（CSE）處理或直接暴露于香煙煙霧環(huán)境，觀察到隨著CSE濃度的增加和暴露時(shí)間的延長，氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5ACmRNA和蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，且具有時(shí)間和濃度依賴性。這表明香煙煙霧暴露能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中ATF3和MUC5AC的表達(dá)上調(diào)，提示ATF3可能參與了香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道粘液高分泌過程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，利用ATF3小干擾RNA（ATF3siRNA）和ATF3過表達(dá)質(zhì)粒對(duì)ATF3的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)用ATF3siRNA