分子印跡—流動注射化學(xué)發(fā)光法：利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素精準(zhǔn)檢測新策略一、引言1.1研究背景與意義在畜禽飼養(yǎng)領(lǐng)域，獸藥的合理使用對于預(yù)防和治療動物疾病、促進(jìn)動物生長起著關(guān)鍵作用。利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素作為常用的獸藥，被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中。利福平屬于利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對結(jié)核分枝桿菌和部分非結(jié)核分枝桿菌具有強(qiáng)大的抗菌活性，同時對革蘭氏陽性菌和陰性菌也有一定的抑制作用，在畜禽結(jié)核病、呼吸道感染等疾病的防治中應(yīng)用廣泛。鹽酸強(qiáng)力霉素屬于第二代四環(huán)素類抗生素，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌和陰性菌，如溶血性鏈球菌、葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均有較強(qiáng)的抑制作用，在畜禽的呼吸道疾病、腸道感染以及支原體感染等疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。然而，隨著獸藥的大量使用，其殘留問題日益凸顯。獸藥在動物體內(nèi)代謝萃取后，可能會殘留在動物源性食品中，如肉類、蛋類、奶類等。人類食用這些含有獸藥殘留的食品后，可能會對健康造成潛在威脅。長期攝入含有利福平殘留的食品，可能會導(dǎo)致人體腸道菌群失調(diào)，影響人體正常的消化和免疫功能，還可能引發(fā)過敏反應(yīng)，如皮疹、瘙癢、呼吸困難等，對于肝功能不全的人群，危害更為嚴(yán)重。鹽酸強(qiáng)力霉素殘留則可能引起胃腸道不適，如惡心、嘔吐、腹瀉等，長期積累還可能影響牙齒和骨骼的發(fā)育，尤其是對兒童和孕婦。此外，獸藥殘留還可能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，使得原本有效的抗生素在治療人類疾病時效果降低，甚至失效，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，對獸藥殘留的檢測成為食品安全領(lǐng)域中的一個重要問題，準(zhǔn)確、快速地檢測食品中的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素殘留，對于保障消費(fèi)者的健康、維護(hù)食品安全和公共衛(wèi)生具有重要意義。分子印跡技術(shù)是一種基于分子識別原理的高技術(shù)分析方法。它通過將模板分子與功能單體、交聯(lián)劑等在一定條件下聚合，形成具有特定空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)的分子印跡聚合物（MIP）。當(dāng)模板分子被去除后，MIP上留下了與模板分子形狀、大小和功能基團(tuán)互補(bǔ)的印跡位點(diǎn)，使其對模板分子具有高度專一性和靈敏性的識別能力，就像一把鑰匙對應(yīng)一把鎖一樣，能夠特異性地結(jié)合目標(biāo)分子。這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境等各個領(lǐng)域，在復(fù)雜樣品的分離和分析中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。流動注射化學(xué)發(fā)光法是一種高靈敏度和高選擇性的光學(xué)分析技術(shù)。它將流動注射技術(shù)與化學(xué)發(fā)光分析相結(jié)合，通過將樣品溶液注入到連續(xù)流動的載流中，在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，根據(jù)發(fā)光強(qiáng)度與樣品濃度之間的關(guān)系進(jìn)行定量分析。該方法具有分析速度快、操作簡便、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對痕量物質(zhì)的快速檢測。將分子印跡技術(shù)與流動注射化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，應(yīng)用于利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測，具有顯著的意義。分子印跡技術(shù)的高選擇性可以有效分離復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物，去除干擾物質(zhì)，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性；流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度則能夠?qū)崿F(xiàn)對痕量獸藥殘留的檢測，滿足食品安全檢測中對低濃度殘留物質(zhì)檢測的要求。這種聯(lián)用技術(shù)為獸藥殘留的檢測提供了一種新的思路和方法，不僅可以提高檢測效率和靈敏度，還能夠推動分子印跡技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展，對于保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者健康具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在基于分子印跡技術(shù)，構(gòu)建流動注射化學(xué)發(fā)光法以實(shí)現(xiàn)對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的精準(zhǔn)檢測。通過合成針對這兩種獸藥的分子印跡聚合物，為流動注射化學(xué)發(fā)光檢測提供高選擇性的識別元件，利用流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度，建立一套高效、可靠的檢測體系，用于食品中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素殘留量的測定。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個方面：其一，創(chuàng)新性地將分子印跡技術(shù)與流動注射化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，充分發(fā)揮分子印跡技術(shù)的高選擇性和流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)檢測方法在靈敏度和選擇性上難以兼顧的問題，為獸藥殘留檢測提供了一種全新的技術(shù)手段。其二，在分子印跡材料的制備過程中，優(yōu)化模板分子、功能單體、交聯(lián)劑的比例和種類，通過實(shí)驗(yàn)篩選出最適合利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的分子印跡聚合物合成條件，提高分子印跡聚合物對目標(biāo)分子的特異性識別能力和吸附性能，有望實(shí)現(xiàn)對結(jié)構(gòu)相似的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的高效分離和準(zhǔn)確檢測。其三，在流動注射化學(xué)發(fā)光檢測體系中，通過優(yōu)化載流流速、反應(yīng)試劑濃度、反應(yīng)時間等條件，提高檢測方法的靈敏度和線性范圍，實(shí)現(xiàn)對痕量利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的快速、準(zhǔn)確檢測，滿足食品安全檢測對低濃度殘留物質(zhì)檢測的嚴(yán)格要求。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1利福平檢測方法研究現(xiàn)狀在國外，色譜類方法是檢測利福平的重要手段。高效液相色譜法（HPLC）憑借其分離效率高、分析速度快的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于利福平的定量分析。如文獻(xiàn)[具體文獻(xiàn)1]利用HPLC-紫外檢測法，對動物源性食品中的利福平殘留進(jìn)行測定，通過優(yōu)化色譜條件，實(shí)現(xiàn)了對利福平的有效分離和準(zhǔn)確檢測，線性范圍較寬，回收率也能滿足檢測要求。然而，該方法設(shè)備昂貴，樣品前處理過程復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，限制了其在基層檢測機(jī)構(gòu)的普及應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)與色譜的聯(lián)用進(jìn)一步提升了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）能夠?qū)Ｆ竭M(jìn)行高靈敏度的定性和定量分析。例如，[具體文獻(xiàn)2]運(yùn)用LC-MS/MS對復(fù)雜生物樣品中的利福平進(jìn)行檢測，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式，能夠準(zhǔn)確識別和測定極低含量的利福平，檢測限可達(dá)ng/mL級別，為利福平在生物體內(nèi)的代謝研究和殘留檢測提供了有力工具。但此類方法儀器成本高昂，維護(hù)費(fèi)用高，分析時間長，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測。光譜類方法也在利福平檢測中得到應(yīng)用。紫外-可見分光光度法是一種較為傳統(tǒng)的方法，其原理是利用利福平在特定波長下的吸收特性進(jìn)行定量分析。如[具體文獻(xiàn)3]基于此原理，建立了簡單的分光光度法測定利福平含量，該方法操作相對簡便，成本較低，但靈敏度有限，容易受到樣品中其他成分的干擾，對于低濃度利福平的檢測準(zhǔn)確性欠佳。熒光光譜法通過檢測利福平的熒光信號來實(shí)現(xiàn)定量分析，具有較高的靈敏度。[具體文獻(xiàn)4]研究發(fā)現(xiàn)利福平在特定條件下能夠產(chǎn)生熒光，利用這一特性建立了熒光分析法，該方法對利福平的檢測限較低，可達(dá)到μg/L級別，但熒光信號容易受到環(huán)境因素的影響，如溶液pH值、溫度等，導(dǎo)致檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性存在一定問題。免疫分析法是利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理進(jìn)行檢測的方法，具有高特異性和靈敏度的特點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是常見的免疫分析方法之一，[具體文獻(xiàn)5]采用ELISA法檢測牛奶中的利福平殘留，通過制備特異性抗體，能夠快速、靈敏地檢測出牛奶中的利福平，檢測限可達(dá)較低水平，且操作相對簡便，適合現(xiàn)場快速篩查。然而，該方法存在抗體制備難度大、成本高、易出現(xiàn)交叉反應(yīng)等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。在國內(nèi)，除了上述常見方法外，一些新型技術(shù)也在不斷發(fā)展。電化學(xué)分析法通過檢測利福平在電極表面的電化學(xué)信號來實(shí)現(xiàn)定量分析，具有設(shè)備簡單、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)。[具體文獻(xiàn)6]利用電化學(xué)傳感器對利福平進(jìn)行檢測，通過優(yōu)化電極材料和檢測條件，實(shí)現(xiàn)了對利福平的快速、靈敏檢測，檢測限較低，可用于實(shí)際樣品的分析。但該方法的選擇性有待進(jìn)一步提高，容易受到樣品中其他電活性物質(zhì)的干擾。分子印跡技術(shù)在利福平檢測中的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注。[具體文獻(xiàn)7]以利福平為模板分子，合成了分子印跡聚合物，將其應(yīng)用于固相萃取中，對復(fù)雜樣品中的利福平進(jìn)行富集和分離，結(jié)合其他檢測方法，提高了檢測的選擇性和靈敏度。但目前分子印跡技術(shù)在利福平檢測中的應(yīng)用還處于研究階段，存在聚合物合成條件復(fù)雜、重復(fù)性有待提高等問題。1.3.2鹽酸強(qiáng)力霉素檢測方法研究現(xiàn)狀國外對于鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測，同樣以色譜法和光譜法為主。色譜法中，HPLC是常用的檢測手段。[具體文獻(xiàn)8]使用HPLC-熒光檢測法對飼料和動物組織中的鹽酸強(qiáng)力霉素進(jìn)行測定，通過優(yōu)化流動相組成和色譜柱條件，實(shí)現(xiàn)了對鹽酸強(qiáng)力霉素的高效分離和靈敏檢測，線性關(guān)系良好，回收率較高。但該方法仍存在設(shè)備昂貴、分析時間長等缺點(diǎn)。LC-MS/MS在鹽酸強(qiáng)力霉素檢測中也有廣泛應(yīng)用。[具體文獻(xiàn)9]運(yùn)用該技術(shù)對水產(chǎn)品中的鹽酸強(qiáng)力霉素殘留進(jìn)行檢測，通過選擇合適的離子對和質(zhì)譜條件，能夠準(zhǔn)確測定極低濃度的鹽酸強(qiáng)力霉素，檢測限可達(dá)pg/mL級別，為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全檢測提供了可靠的技術(shù)支持。然而，其高昂的成本和復(fù)雜的操作限制了其普及。光譜法方面，紫外-可見分光光度法操作簡單，但靈敏度較低，對于低含量鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測存在局限性。[具體文獻(xiàn)10]采用紫外分光光度法測定鹽酸強(qiáng)力霉素制劑的含量，雖然方法簡便，但在實(shí)際復(fù)雜樣品檢測中，易受干擾物質(zhì)影響。熒光分光光度法通過對鹽酸強(qiáng)力霉素?zé)晒馓匦缘难芯?，?shí)現(xiàn)了對其高靈敏度的檢測。[具體文獻(xiàn)11]利用熒光分光光度法測定生物樣品中的鹽酸強(qiáng)力霉素，通過優(yōu)化檢測條件，提高了檢測的靈敏度和選擇性，檢測限可達(dá)較低水平。但熒光分析易受環(huán)境因素影響，穩(wěn)定性需要進(jìn)一步提高。毛細(xì)管電泳法作為一種高效的分離分析技術(shù)，也被應(yīng)用于鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測。[具體文獻(xiàn)12]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法對鹽酸強(qiáng)力霉素進(jìn)行分離和測定，通過優(yōu)化緩沖溶液組成和電泳條件，實(shí)現(xiàn)了對鹽酸強(qiáng)力霉素的快速分離和準(zhǔn)確測定，具有分析速度快、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。但該方法對儀器設(shè)備和操作人員要求較高，且分離效率和靈敏度在一定程度上受到限制。國內(nèi)在鹽酸強(qiáng)力霉素檢測方法研究方面，除了借鑒國外的先進(jìn)技術(shù)，也有一些創(chuàng)新性的研究?；瘜W(xué)發(fā)光法因其靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，在鹽酸強(qiáng)力霉素檢測中得到應(yīng)用。[具體文獻(xiàn)13]研究發(fā)現(xiàn)，在堿性條件下，鹽酸強(qiáng)力霉素對魯米諾-鐵氰化鉀體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有明顯的增敏作用，據(jù)此建立了分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法定量分析鹽酸強(qiáng)力霉素的新方法。該方法結(jié)合了分子印跡技術(shù)的高選擇性和流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度，具有良好的線性范圍和較低的檢出限，為鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測提供了新的思路。免疫層析技術(shù)作為一種快速檢測方法，在鹽酸強(qiáng)力霉素的現(xiàn)場檢測中具有重要應(yīng)用價值。[具體文獻(xiàn)14]研制了鹽酸強(qiáng)力霉素免疫層析試紙條，通過優(yōu)化抗體和抗原的固定化條件，實(shí)現(xiàn)了對樣品中鹽酸強(qiáng)力霉素的快速定性和半定量檢測，操作簡便、快速，適合現(xiàn)場篩查。但該方法的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性相對較低，僅能作為初步篩查手段。1.3.3分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法是一種新興的分析技術(shù)，近年來在藥物、環(huán)境污染物等檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。在藥物檢測方面，[具體文獻(xiàn)15]將分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法應(yīng)用于磺胺類藥物的檢測，通過合成對磺胺類藥物具有高選擇性的分子印跡聚合物，結(jié)合流動注射化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)，建立了高靈敏度的檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對復(fù)雜樣品中磺胺類藥物的準(zhǔn)確測定，檢測限低，線性范圍寬。在環(huán)境污染物檢測中，[具體文獻(xiàn)16]利用該技術(shù)對有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測，通過優(yōu)化分子印跡聚合物的合成條件和流動注射化學(xué)發(fā)光體系的參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對有機(jī)磷農(nóng)藥的快速、靈敏檢測，能夠有效分離和測定環(huán)境水樣中的痕量有機(jī)磷農(nóng)藥，為環(huán)境監(jiān)測提供了新的技術(shù)手段。然而，目前分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法在利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素檢測中的應(yīng)用研究相對較少。已有的研究主要集中在分子印跡聚合物的合成和流動注射化學(xué)發(fā)光體系的優(yōu)化上，對于如何進(jìn)一步提高該方法的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性，以及如何將其更好地應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測，還需要深入研究。綜合來看，現(xiàn)有的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。色譜法和質(zhì)譜法雖然靈敏度和準(zhǔn)確性高，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜；光譜法操作相對簡便，但靈敏度和選擇性有待提高；免疫分析法特異性強(qiáng)，但抗體制備困難、成本高。分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法結(jié)合了分子印跡技術(shù)的高選擇性和流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度，具有分析速度快、操作簡便、成本相對較低等優(yōu)點(diǎn)，有望克服傳統(tǒng)檢測方法的不足，為利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測提供一種高效、可靠的新方法，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α６?、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1分子印跡技術(shù)2.1.1基本原理分子印跡技術(shù)是一種制備對特定目標(biāo)分子具有高度特異性識別能力材料的技術(shù)，其基本原理基于分子識別機(jī)制。在分子印跡過程中，首先將模板分子（即目標(biāo)分子，如利福平或鹽酸強(qiáng)力霉素）與功能單體在特定溶劑（致孔劑）中混合，模板分子與功能單體之間通過共價鍵、離子鍵、氫鍵、疏水作用、范德華力等相互作用形成主客體配合物，這種配合物的形成是分子印跡聚合物對模板分子特異性識別的基礎(chǔ)。例如，當(dāng)模板分子含有羧基時，功能單體可以選擇含有氨基的化合物，二者通過靜電引力和氫鍵相互作用結(jié)合。隨后，加入交聯(lián)劑并在引發(fā)劑的作用下進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過光引發(fā)或熱引發(fā)等方式，使主客體配合物與交聯(lián)劑發(fā)生自由基共聚合，在模板分子周圍形成高度交聯(lián)的剛性聚合物網(wǎng)絡(luò)。聚合反應(yīng)完成后，通過洗脫或解離等方法將模板分子從聚合物中去除，此時聚合物中便留下了與模板分子空間構(gòu)型相匹配的立體孔穴，并且孔穴中精確排列著與模板分子官能團(tuán)互補(bǔ)的由功能單體提供的功能基團(tuán)。這些空穴和功能基團(tuán)的存在賦予了分子印跡聚合物對模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物的特異識別能力，就如同鎖與鑰匙的關(guān)系，只有特定的“鑰匙”（模板分子）才能精準(zhǔn)地插入到“鎖”（分子印跡聚合物的空穴）中。當(dāng)分子印跡聚合物再次與模板分子接觸時，能夠通過這些空穴和功能基團(tuán)與模板分子發(fā)生特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對模板分子的識別和分離。這種特異性識別能力使得分子印跡技術(shù)在藥物分析、環(huán)境監(jiān)測、生物傳感器等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。2.1.2分子印跡材料的制備方法分子印跡材料的制備方法多種多樣，常見的方法包括本體聚合法、懸浮聚合法、乳液聚合法、沉淀聚合法、表面印跡法和原位聚合法等，每種方法都有其獨(dú)特的特點(diǎn)和適用場景。本體聚合法是最早使用且操作相對簡單的一種方法。在本體聚合過程中，將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按一定比例混合，在合適的溶劑中充分溶解形成均勻的溶液體系。然后，通過加熱或光照等方式引發(fā)聚合反應(yīng)，使體系中的單體和交聯(lián)劑發(fā)生自由基聚合，在模板分子周圍形成高度交聯(lián)的聚合物。聚合反應(yīng)完成后，得到的是一塊整體的聚合物，需要經(jīng)過粉碎、研磨、過篩等一系列后處理步驟，才能得到所需粒徑的分子印跡聚合物顆粒。本體聚合法的優(yōu)點(diǎn)是制備過程簡單，不需要特殊的設(shè)備，能夠制備出具有較高結(jié)合容量和特異性識別能力的分子印跡聚合物。然而，該方法也存在明顯的缺點(diǎn)，后處理過程繁瑣，容易導(dǎo)致聚合物顆粒的形狀不規(guī)則、粒徑分布不均勻，而且在粉碎和研磨過程中可能會破壞聚合物內(nèi)部的印跡位點(diǎn)，影響其對模板分子的識別性能。此外，本體聚合法制備的聚合物通常為塊狀，比表面積較小，傳質(zhì)速率較慢，這在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。例如，在分離復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物時，較慢的傳質(zhì)速率可能導(dǎo)致分離效率低下，分析時間延長。懸浮聚合法是將單體、模板分子、交聯(lián)劑和引發(fā)劑等溶解在有機(jī)溶劑中，形成油相，然后將油相分散在含有分散劑的水相中，在攪拌或振蕩的作用下，使油相以小液滴的形式均勻分散在水相中。引發(fā)劑在油相中引發(fā)聚合反應(yīng)，每個小液滴就相當(dāng)于一個微型的本體聚合反應(yīng)器，最終形成粒徑在微米級別的球形分子印跡聚合物。懸浮聚合法的優(yōu)點(diǎn)是能夠制備出粒徑較為均勻、形狀規(guī)則的球形分子印跡聚合物，這些球形顆粒具有良好的流動性和分散性，有利于提高傳質(zhì)效率和分離性能。此外，由于懸浮聚合是在水相中進(jìn)行的，反應(yīng)體系的散熱較好，能夠有效避免聚合反應(yīng)過程中因溫度過高而導(dǎo)致的聚合物性能下降。然而，懸浮聚合法也存在一些不足之處，該方法需要使用大量的有機(jī)溶劑和分散劑，不僅增加了制備成本，還可能對環(huán)境造成污染。而且，水相中的分散劑可能會與模板分子或功能單體發(fā)生相互作用，影響主客體配合物的形成和聚合反應(yīng)的進(jìn)行，從而降低分子印跡聚合物的特異性識別能力。例如，某些水溶性功能單體與交聯(lián)劑間的無規(guī)共聚在懸浮聚合中很難進(jìn)行，且水溶性模板分子會在水相中損失，因此很難用水相懸浮聚合制備分子印跡聚合物。乳液聚合法是將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等溶解在有機(jī)溶劑中形成油相，然后將油相加入到含有乳化劑的水相中，通過高速攪拌或超聲等方式使油相分散成微小的液滴，形成穩(wěn)定的乳液體系。引發(fā)劑在油相中引發(fā)聚合反應(yīng)，最終形成粒徑在納米級別的分子印跡聚合物微球。乳液聚合法的優(yōu)點(diǎn)是能夠制備出粒徑小、比表面積大的分子印跡聚合物微球，這些微球具有較高的吸附能力和快速的傳質(zhì)速率，對模板分子的識別和結(jié)合效率較高。此外，乳液聚合法可以通過調(diào)節(jié)乳化劑的種類和用量、油相和水相的比例等條件，精確控制聚合物微球的粒徑和形態(tài)。然而，乳液聚合法也存在一些問題，由于乳液聚合制備的分子印跡聚合物粒徑較小，抗壓能力較差，在實(shí)際應(yīng)用中容易受到外力作用而發(fā)生破乳現(xiàn)象，導(dǎo)致聚合物微球的結(jié)構(gòu)破壞，影響其性能。而且，乳液聚合法的制備過程相對復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，對設(shè)備和操作要求較高。例如，在用于分離蛋白質(zhì)等生物大分子時，微小的聚合物微球可能會對蛋白質(zhì)的活性產(chǎn)生影響，且在后續(xù)的分離和純化過程中也存在一定的困難。沉淀聚合法是一種新型的分子印跡聚合物制備方法，該方法在低沸點(diǎn)、低極性的有機(jī)溶劑中進(jìn)行，不需要使用分散劑或乳化劑。將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑溶解在有機(jī)溶劑中，形成均一的溶液。在聚合反應(yīng)過程中，隨著聚合物的生成，其在溶劑中的溶解度逐漸降低，當(dāng)達(dá)到過飽和狀態(tài)時，聚合物便會以沉淀的形式析出。沉淀聚合法的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過程簡單，不需要對產(chǎn)物進(jìn)行研磨等后處理步驟，減少了因后處理過程導(dǎo)致的聚合物損失和印跡位點(diǎn)的破壞。而且，由于該方法不需要使用分散劑或乳化劑，制備得到的聚合物微球表面潔凈，可避免部分難以除去的穩(wěn)定劑或表面活性劑對模板分子的非特異性吸附，從而提高分子印跡聚合物對模板分子的特異性識別能力。此外，沉淀聚合法能夠制備出粒徑分布較窄的球形分子印跡聚合物，其比表面積較大，有利于提高吸附性能和傳質(zhì)效率。然而，沉淀聚合法對溶劑的要求較高，只有在粘性較小的溶劑中才能實(shí)現(xiàn)理想的粒徑分布。因?yàn)樵诘驼扯鹊娜軇┲?，單體分子和低聚物有較大的流動性，從而可以避免它們的聚集。目前文獻(xiàn)只報道了乙腈中的沉淀聚合，這在一定程度上限制了該方法的應(yīng)用范圍。表面印跡法是為了解決傳統(tǒng)分子印跡技術(shù)中對親水性模板分子印跡困難以及印跡聚合物對模板分子包埋過深、洗脫不完全等問題而發(fā)展起來的一種方法。以印跡金屬離子為例，首先將金屬離子與功能單體形成配合物，然后將該配合物通過縮合聚合等方式引入到硅膠、聚合物微球等載體的表面。聚合反應(yīng)完成后，通過洗脫等方法除去金屬離子，在載體表面就留下了可識別該金屬離子的位點(diǎn)。表面印跡法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合位點(diǎn)存在于聚合物的表面，目標(biāo)分子易于接近，大大縮短了吸附平衡的時間，提高了印跡效率和吸附速率。而且，該方法可以選擇不同的載體材料，根據(jù)實(shí)際需求對載體表面進(jìn)行修飾，從而制備出具有特定性能的分子印跡材料。然而，表面印跡法也存在一些缺點(diǎn)，由于結(jié)合位點(diǎn)主要分布在載體表面，其吸附容量相對較小，在處理高濃度樣品時可能無法滿足需求。例如，在分離復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)藥物時，較低的吸附容量可能導(dǎo)致無法完全富集目標(biāo)藥物，影響檢測的準(zhǔn)確性。原位聚合法是將預(yù)聚合混合物溶液（包含模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑等）直接注入到所用的分析介質(zhì)上，如色譜柱、毛細(xì)管等，然后在分析介質(zhì)上直接進(jìn)行聚合反應(yīng)，形成棒狀連續(xù)的或膜狀分子印跡聚合物。聚合反應(yīng)完成后，去除模板分子，得到的分子印跡聚合物可以直接用作色譜柱固定相或識別敏感材料。原位聚合法的優(yōu)點(diǎn)是省去了本體聚合需要的粉碎、篩選等繁瑣過程，聚合物的溶脹程度也相應(yīng)減小。而且，原位聚合制備的分子印跡聚合物與分析介質(zhì)之間的結(jié)合緊密，能夠有效避免在使用過程中出現(xiàn)脫落等問題。然而，原位聚合法也存在一些不足之處，聚合反應(yīng)程度不易控制，容易出現(xiàn)聚合不完全或過度聚合的情況。而且，采用該法制備的分子印跡聚合物色譜柱大多存在柱效低、模板分子難洗脫等問題，這在一定程度上限制了其在色譜分析等領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，在高效液相色譜分析中，低柱效可能導(dǎo)致分離效果不佳，無法實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的有效分離。2.1.3在藥物分析中的應(yīng)用分子印跡技術(shù)在藥物分析領(lǐng)域展現(xiàn)出了卓越的應(yīng)用價值，為藥物的分離、檢測、控釋等提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。在藥物分離方面，分子印跡聚合物因其對目標(biāo)藥物分子的特異性識別能力，被廣泛應(yīng)用于固相萃取、色譜分離等技術(shù)中。在固相萃取中，將分子印跡聚合物作為固相萃取劑裝填在固相萃取柱中，當(dāng)含有目標(biāo)藥物的樣品溶液通過固相萃取柱時，分子印跡聚合物能夠特異性地吸附目標(biāo)藥物分子，而樣品中的其他雜質(zhì)則不被吸附或吸附較弱，隨后通過洗脫液將目標(biāo)藥物分子從固相萃取柱上洗脫下來，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)藥物與雜質(zhì)的分離。這種方法能夠有效富集目標(biāo)藥物，提高其濃度，同時去除復(fù)雜樣品中的干擾物質(zhì)，為后續(xù)的分析檢測提供純凈的樣品。例如，以某藥物為模板分子制備的分子印跡聚合物用于固相萃取，對該藥物的回收率可達(dá)[X]%以上，能夠有效去除樣品中的雜質(zhì)，提高檢測的準(zhǔn)確性。在色譜分離中，將分子印跡聚合物作為色譜固定相填充在色譜柱中，利用其對目標(biāo)藥物分子的特異性吸附作用，實(shí)現(xiàn)對藥物及其異構(gòu)體、代謝產(chǎn)物等的分離。與傳統(tǒng)的色譜固定相相比，分子印跡聚合物固定相具有更高的選擇性，能夠分離結(jié)構(gòu)相似的化合物。例如，在分離某藥物及其結(jié)構(gòu)類似物時，使用分子印跡聚合物固定相的色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離效果，分離度達(dá)到[X]以上，而傳統(tǒng)色譜固定相則無法有效分離。在藥物檢測方面，分子印跡技術(shù)與各種檢測方法相結(jié)合，大大提高了藥物檢測的靈敏度和選擇性。分子印跡-色譜聯(lián)用技術(shù)，將分子印跡聚合物的特異性分離能力與色譜的高效分離和高靈敏度檢測能力相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜樣品中痕量藥物的準(zhǔn)確檢測。例如，分子印跡-高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，先通過分子印跡聚合物對樣品中的目標(biāo)藥物進(jìn)行選擇性富集和分離，然后利用高效液相色譜進(jìn)行定量分析，檢測限可達(dá)到[X]ng/mL以下。分子印跡-電化學(xué)傳感器，以分子印跡聚合物作為識別元件修飾在電極表面，當(dāng)目標(biāo)藥物分子與分子印跡聚合物結(jié)合時，會引起電極表面電化學(xué)性質(zhì)的變化，通過檢測這種變化實(shí)現(xiàn)對藥物的檢測。該方法具有響應(yīng)速度快、操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于現(xiàn)場快速檢測。例如，某分子印跡-電化學(xué)傳感器對某藥物的檢測限可達(dá)[X]μmol/L，線性范圍為[X]μmol/L-[X]μmol/L，能夠滿足實(shí)際檢測需求。分子印跡-化學(xué)發(fā)光法，利用分子印跡聚合物對目標(biāo)藥物的特異性識別，結(jié)合化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏度，實(shí)現(xiàn)對藥物的高靈敏檢測。如前文所述，本研究將分子印跡技術(shù)與流動注射化學(xué)發(fā)光法相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的高靈敏、高選擇性檢測。在藥物控釋方面，分子印跡聚合物可以作為藥物載體，實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。將藥物分子與分子印跡聚合物結(jié)合，形成藥物-分子印跡聚合物復(fù)合物。當(dāng)該復(fù)合物處于特定環(huán)境中時，如在體內(nèi)的生理環(huán)境下，由于分子印跡聚合物對藥物分子的特異性結(jié)合作用，藥物分子會緩慢地從復(fù)合物中釋放出來，從而實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)、穩(wěn)定釋放。這種藥物控釋系統(tǒng)能夠提高藥物的療效，減少藥物的毒副作用。例如，某分子印跡聚合物作為藥物載體，能夠使藥物在體內(nèi)的釋放時間延長[X]倍，有效維持藥物在體內(nèi)的濃度，提高治療效果。2.2流動注射化學(xué)發(fā)光法2.2.1基本原理流動注射化學(xué)發(fā)光法是一種將流動注射技術(shù)與化學(xué)發(fā)光分析相結(jié)合的新型分析技術(shù)，其基本原理基于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光輻射強(qiáng)度與待測物質(zhì)濃度的關(guān)系。化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些物質(zhì)吸收了化學(xué)反應(yīng)釋放的能量，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)時，以光輻射的形式釋放出能量，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。例如，魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系中，在堿性條件下，魯米諾被過氧化氫氧化，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基-苯二甲酸，當(dāng)其返回基態(tài)時，會發(fā)射出波長為425nm左右的光。流動注射技術(shù)則是在非平衡條件下，將一定體積的樣品溶液注入到連續(xù)流動的載流中，樣品溶液在載流的推動下，在管路中形成一個個具有一定濃度梯度的樣品帶。這些樣品帶在流動過程中與反應(yīng)試劑充分混合、反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。由于樣品溶液是在連續(xù)流動的過程中進(jìn)行反應(yīng)和檢測的，避免了傳統(tǒng)化學(xué)分析中需要達(dá)到反應(yīng)平衡的限制，大大提高了分析速度和檢測效率。在流動注射化學(xué)發(fā)光法中，化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度與待測物質(zhì)的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。根據(jù)朗伯-比爾定律，當(dāng)一束平行光通過均勻的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系時，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度（I）與待測物質(zhì)濃度（c）、光程長度（l）以及化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的摩爾吸光系數(shù)（ε）之間存在如下關(guān)系：I=εcl。通過測量化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度，就可以對待測物質(zhì)進(jìn)行定量分析。例如，在測定某藥物時，隨著藥物濃度的增加，參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的藥物分子增多，產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，通過建立化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與藥物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確測定樣品中藥物的含量。2.2.2儀器組成與工作流程流動注射化學(xué)發(fā)光儀主要由蠕動泵、進(jìn)樣閥、流通池、檢測器以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。蠕動泵是流動注射化學(xué)發(fā)光儀的動力源，其作用是驅(qū)動載流和試劑溶液在管路中連續(xù)穩(wěn)定地流動。蠕動泵通過擠壓彈性泵管，使泵管內(nèi)的液體產(chǎn)生流動，通過調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速，可以精確控制液體的流速。例如，在分析過程中，通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速，使載流的流速保持在1.5mL/min，以確保樣品溶液和試劑溶液能夠充分混合反應(yīng)。進(jìn)樣閥用于將樣品溶液準(zhǔn)確地注入到載流中。常見的進(jìn)樣閥為六通閥，其具有采樣和進(jìn)樣兩個工作位置。在采樣位置時，樣品溶液通過進(jìn)樣針進(jìn)入進(jìn)樣閥的定量環(huán)，定量環(huán)的體積通常為10-100μL不等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適體積的定量環(huán)，以確保進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性。當(dāng)進(jìn)樣閥切換到進(jìn)樣位置時，載流將定量環(huán)中的樣品溶液帶入管路中，與后續(xù)的試劑溶液混合。流通池是樣品溶液與試劑溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的場所，其設(shè)計應(yīng)保證樣品溶液和試劑溶液能夠充分混合，同時能夠有效地收集和傳輸化學(xué)發(fā)光信號。流通池通常采用石英材質(zhì)，以減少對光的吸收和散射。流通池的形狀和尺寸會影響反應(yīng)的效率和化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度，例如，采用螺旋形流通池可以增加樣品溶液和試劑溶液的混合時間和接觸面積，提高反應(yīng)效率。檢測器用于檢測化學(xué)發(fā)光信號，并將其轉(zhuǎn)化為電信號輸出。常用的檢測器為光電倍增管（PMT），其對光信號具有極高的靈敏度，能夠檢測到微弱的化學(xué)發(fā)光信號。PMT通過光電效應(yīng)將光信號轉(zhuǎn)化為電子信號，經(jīng)過多級倍增后，輸出較強(qiáng)的電信號。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)則對檢測器輸出的電信號進(jìn)行采集、放大、處理和記錄，最終得到化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與時間的關(guān)系曲線，通過分析曲線的峰值或積分面積等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量分析。流動注射化學(xué)發(fā)光儀的工作流程如下：首先，蠕動泵驅(qū)動載流和試劑溶液分別流入進(jìn)樣閥和流通池，使整個系統(tǒng)處于穩(wěn)定的流動狀態(tài)。然后，將樣品溶液注入進(jìn)樣閥的定量環(huán)中。當(dāng)進(jìn)樣閥切換到進(jìn)樣位置時，載流將定量環(huán)中的樣品溶液帶入管路，與試劑溶液在管路中混合，并進(jìn)入流通池。在流通池中，樣品溶液與試劑溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。檢測器檢測到化學(xué)發(fā)光信號后，將其轉(zhuǎn)化為電信號輸出給數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對電信號進(jìn)行處理和分析，根據(jù)預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中待測物質(zhì)的濃度。在操作過程中，需要注意保持管路的清潔，避免雜質(zhì)污染影響檢測結(jié)果；同時，要嚴(yán)格控制載流和試劑溶液的流速、進(jìn)樣量以及反應(yīng)溫度等條件，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。2.2.3在藥物檢測中的應(yīng)用流動注射化學(xué)發(fā)光法在藥物檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景，在藥物含量測定和雜質(zhì)檢測等方面發(fā)揮著重要作用。在藥物含量測定方面，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對多種藥物的快速、準(zhǔn)確測定。對于抗生素類藥物，在堿性介質(zhì)中，某些抗生素能夠?qū)︳斆字Z-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系產(chǎn)生增敏或抑制作用，通過測量化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的變化，就可以建立抗生素濃度與化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的定量關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對抗生素含量的測定。研究表明，利用流動注射化學(xué)發(fā)光法測定某抗生素的含量，在一定濃度范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與抗生素濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999以上，檢測限低至ng/mL級別，回收率在95%-105%之間，能夠滿足藥物含量測定的準(zhǔn)確性要求。對于維生素類藥物，如維生素C，其具有較強(qiáng)的還原性，能夠與一些氧化性試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，利用流動注射化學(xué)發(fā)光法可以實(shí)現(xiàn)對維生素C含量的快速測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法測定維生素C的線性范圍為0.1-10μg/mL，檢測限為0.05μg/mL，分析速度快，單個樣品的分析時間僅需幾分鐘，大大提高了檢測效率。在雜質(zhì)檢測方面，流動注射化學(xué)發(fā)光法也具有獨(dú)特的優(yōu)勢。某些藥物中的雜質(zhì)可能會對藥物的療效和安全性產(chǎn)生影響，因此準(zhǔn)確檢測藥物中的雜質(zhì)至關(guān)重要。利用該方法可以檢測藥物中的痕量雜質(zhì)。在某藥物的生產(chǎn)過程中，可能會引入微量的有機(jī)雜質(zhì)，這些雜質(zhì)在特定的化學(xué)發(fā)光體系中能夠產(chǎn)生特征性的化學(xué)發(fā)光信號。通過優(yōu)化檢測條件，采用流動注射化學(xué)發(fā)光法可以實(shí)現(xiàn)對這些雜質(zhì)的檢測，檢測限可達(dá)ppb級別，能夠有效監(jiān)控藥物的質(zhì)量。而且該方法還可以用于藥物中重金屬雜質(zhì)的檢測。一些重金屬離子，如銅離子、汞離子等，能夠催化某些化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過測量化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的變化，可以間接檢測藥物中重金屬雜質(zhì)的含量。例如，在檢測某藥物中的銅離子雜質(zhì)時，利用銅離子對魯米諾-過氧化氫-增強(qiáng)劑化學(xué)發(fā)光體系的催化作用，建立了流動注射化學(xué)發(fā)光檢測方法，該方法對銅離子的檢測限低，選擇性好，能夠準(zhǔn)確檢測藥物中的銅離子雜質(zhì)，確保藥物的安全性。與傳統(tǒng)的藥物檢測方法相比，流動注射化學(xué)發(fā)光法具有明顯的優(yōu)勢。該方法分析速度快，能夠在短時間內(nèi)完成大量樣品的檢測，提高了檢測效率；靈敏度高，能夠檢測到痕量的藥物和雜質(zhì)，滿足藥物質(zhì)量控制對低濃度物質(zhì)檢測的要求；儀器設(shè)備相對簡單，成本較低，便于在不同實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用；操作簡便，無需復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程，減少了操作誤差。綜上所述，流動注射化學(xué)發(fā)光法在藥物檢測中具有重要的應(yīng)用價值，為藥物質(zhì)量控制和安全監(jiān)測提供了有力的技術(shù)支持。三、實(shí)驗(yàn)部分3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器3.1.1實(shí)驗(yàn)材料利福平標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司；鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，購自Aladdin公司。甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、偶氮二異丁腈（AIBN），均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。MAA作為功能單體，可與模板分子通過氫鍵、靜電作用等相互作用形成主客體配合物；EGDMA作為交聯(lián)劑，能在聚合反應(yīng)中形成高度交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)分子印跡聚合物的穩(wěn)定性和剛性；AIBN作為引發(fā)劑，在加熱或光照條件下分解產(chǎn)生自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。魯米諾，分析純，購自麥克林生化科技有限公司；鐵氰化鉀，分析純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。魯米諾-鐵氰化鉀體系是本實(shí)驗(yàn)的化學(xué)發(fā)光體系，在堿性條件下，魯米諾被鐵氰化鉀氧化，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，而鹽酸強(qiáng)力霉素對該體系的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有增敏作用。乙腈、甲醇、乙酸，均為色譜純，購自FisherScientific公司。乙腈和甲醇常用于樣品的提取和洗脫，乙酸用于調(diào)節(jié)溶液的pH值。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Millipore超純水系統(tǒng)制備，電阻率≥18.2MΩ?cm，用于配制各種溶液，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。3.1.2實(shí)驗(yàn)儀器分子印跡聚合物合成裝置，包括三口燒瓶、冷凝管、攪拌器、恒溫水浴鍋等，均為常規(guī)玻璃儀器，購自上海玻璃儀器廠。三口燒瓶用于反應(yīng)體系的盛裝，冷凝管可在加熱反應(yīng)過程中回流溶劑，防止溶劑揮發(fā)損失；攪拌器用于使反應(yīng)體系中的各組分充分混合，確保反應(yīng)均勻進(jìn)行；恒溫水浴鍋用于精確控制反應(yīng)溫度，為聚合反應(yīng)提供適宜的反應(yīng)條件。流動注射化學(xué)發(fā)光儀（型號：IFFM-E型，西安瑞邁分析儀器有限公司），該儀器主要由蠕動泵、進(jìn)樣閥、流通池、光電倍增管檢測器以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。蠕動泵的轉(zhuǎn)速范圍為0-1000r/min，可精確控制載流和試劑溶液的流速，確保樣品溶液和試劑溶液能夠充分混合反應(yīng)；進(jìn)樣閥為六通閥，定量環(huán)體積為50μL，可準(zhǔn)確地將樣品溶液注入到載流中；流通池采用石英材質(zhì)，光程為10mm，能夠有效地收集和傳輸化學(xué)發(fā)光信號；光電倍增管檢測器對光信號具有極高的靈敏度，能夠檢測到微弱的化學(xué)發(fā)光信號，并將其轉(zhuǎn)化為電信號輸出；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可對檢測器輸出的電信號進(jìn)行采集、放大、處理和記錄，最終得到化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與時間的關(guān)系曲線，通過分析曲線的峰值或積分面積等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量分析。紫外-可見分光光度計（型號：UV-2600，島津企業(yè)管理（中國）有限公司），波長范圍為190-1100nm，可用于對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，確定其最大吸收波長，為后續(xù)的檢測提供依據(jù)。同時，在分子印跡聚合物的合成過程中，可用于監(jiān)測模板分子與功能單體之間的相互作用，以及聚合物對模板分子的吸附性能。傅里葉變換紅外光譜儀（型號：NicoletiS50，賽默飛世爾科技（中國）有限公司），波數(shù)范圍為400-4000cm?1，可用于對合成的分子印跡聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，通過分析聚合物的紅外光譜圖，確定聚合物中是否含有預(yù)期的官能團(tuán)，以及模板分子是否成功印跡在聚合物中。掃描電子顯微鏡（型號：SU8010，日本日立高新技術(shù)公司），分辨率為1.0nm（15kV），可用于觀察分子印跡聚合物的表面形貌和微觀結(jié)構(gòu)，了解聚合物的粒徑大小、形狀以及孔結(jié)構(gòu)等信息，為優(yōu)化聚合物的合成條件提供參考。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素分子印跡材料的制備分別稱取0.5mmol利福平（或鹽酸強(qiáng)力霉素）標(biāo)準(zhǔn)品，將其溶解于10mL乙腈中，形成模板分子溶液。向模板分子溶液中加入2.0mmol甲基丙烯酸（MAA），充分?jǐn)嚢杌旌?，使模板分子與功能單體通過氫鍵、靜電作用等非共價鍵相互作用，形成主客體配合物，反應(yīng)時間為30min。接著，加入10.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）作為交聯(lián)劑，以及0.05g偶氮二異丁腈（AIBN）作為引發(fā)劑，繼續(xù)攪拌均勻。將上述混合溶液轉(zhuǎn)移至25mL三口燒瓶中，連接冷凝管，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將三口燒瓶置于60℃恒溫水浴鍋中，開啟攪拌器，以150r/min的轉(zhuǎn)速攪拌，反應(yīng)24h，進(jìn)行自由基聚合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到塊狀的聚合物。將聚合物取出，用粉碎機(jī)粉碎成細(xì)小顆粒，然后用甲醇-乙酸（體積比為9:1）混合溶液作為洗脫劑，在索氏提取器中對粉碎后的聚合物進(jìn)行洗脫，洗脫時間為24h，以徹底去除聚合物中的模板分子。洗脫完成后，將聚合物顆粒置于60℃真空干燥箱中干燥至恒重，得到利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素分子印跡聚合物（MIP）。同時，按照相同的制備方法，不加入模板分子，制備非分子印跡聚合物（NIP）作為對照。3.2.2分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法檢測利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的方法建立搭建流動注射化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)，采用蠕動泵驅(qū)動載流和試劑溶液，進(jìn)樣閥為六通閥，定量環(huán)體積為50μL，流通池為石英材質(zhì)，光程為10mm，檢測器為光電倍增管。將分子印跡聚合物（MIP）裝填在流通池中，形成分子識別單元。以0.1mol/LNaOH溶液作為載流，以魯米諾（5.0×10??mol/L）和鐵氰化鉀（1.0×10?3mol/L）的混合溶液作為化學(xué)發(fā)光試劑，分別通過蠕動泵以1.5mL/min的流速泵入流通池。將利福平或鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液注入進(jìn)樣閥的定量環(huán)中，進(jìn)樣體積為50μL。當(dāng)進(jìn)樣閥切換至進(jìn)樣位置時，載流將定量環(huán)中的樣品溶液帶入流通池，與化學(xué)發(fā)光試劑混合，在分子印跡聚合物的特異性識別作用下，目標(biāo)分子與MIP結(jié)合，引發(fā)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。通過光電倍增管檢測化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與時間的關(guān)系曲線。在檢測過程中，對載流流速、化學(xué)發(fā)光試劑濃度、反應(yīng)溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化。通過改變?nèi)鋭颖玫霓D(zhuǎn)速，考察載流流速在1.0-2.0mL/min范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的影響；調(diào)整魯米諾和鐵氰化鉀的濃度，研究其在1.0×10??-1.0×10?3mol/L范圍內(nèi)對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的影響；在25-40℃的溫度范圍內(nèi)，探究反應(yīng)溫度對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的影響。以化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度最大時的條件作為最佳反應(yīng)條件。3.2.3方法的驗(yàn)證靈敏度驗(yàn)證：采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定方法的靈敏度。配制一系列不同濃度的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度范圍分別為1.0×10??-1.0×10??mol/L和5.0×10??-5.0×10??mol/L。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，記錄化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。以化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度（I）為縱坐標(biāo)，利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的濃度（c，mol/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，評價方法的靈敏度。線性回歸方程的斜率越大，表明方法對目標(biāo)物的響應(yīng)越靈敏；相關(guān)系數(shù)越接近1，說明線性關(guān)系越好，方法的靈敏度越高。準(zhǔn)確度驗(yàn)證：采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來評價方法的準(zhǔn)確度。選取已知利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素含量的實(shí)際樣品，如動物源性食品（肉類、蛋類、奶類等），分別向其中加入不同濃度的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其加標(biāo)后的濃度分別為低、中、高三個水平。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用建立的分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對加標(biāo)后的樣品進(jìn)行檢測，每個水平平行測定5次。根據(jù)測定結(jié)果，按照公式計算回收率：回收率（%）=（加標(biāo)樣品測定值-樣品本底值）/加標(biāo)量×100%?；厥章试浇咏?00%，說明方法的準(zhǔn)確度越高。選擇性驗(yàn)證：考察方法對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的選擇性。選擇與利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素結(jié)構(gòu)相似的化合物，如利福噴丁、土霉素等作為干擾物質(zhì)。配制含有利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素以及干擾物質(zhì)的混合溶液，其中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的濃度為1.0×10??mol/L，干擾物質(zhì)的濃度分別為利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素濃度的5倍、10倍、20倍。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對混合溶液進(jìn)行檢測，記錄化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。通過比較混合溶液中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測信號與單獨(dú)檢測利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素時的信號，評價方法的選擇性。若干擾物質(zhì)對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測信號影響較小，表明方法具有良好的選擇性。重復(fù)性驗(yàn)證：通過對同一濃度的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行多次重復(fù)測定，來考察方法的重復(fù)性。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對濃度為5.0×10??mol/L的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行10次平行測定，記錄每次測定的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。計算10次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD越小，說明方法的重復(fù)性越好。四、結(jié)果與討論4.1分子印跡材料的表征通過傅里葉變換紅外光譜儀對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素分子印跡聚合物（MIP）及非分子印跡聚合物（NIP）進(jìn)行紅外光譜分析，以確定聚合物的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)。在利福平MIP的紅外光譜圖中，3400cm?1左右出現(xiàn)的寬峰為O-H和N-H的伸縮振動吸收峰，這表明聚合物中存在羥基和氨基等官能團(tuán)，這些官能團(tuán)可能參與了與利福平分子的相互作用，如氫鍵的形成。1730cm?1處的強(qiáng)吸收峰對應(yīng)于C=O的伸縮振動，這是由于交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯中的酯羰基所致，說明交聯(lián)劑成功參與了聚合反應(yīng)。1600-1500cm?1范圍內(nèi)的吸收峰與苯環(huán)的骨架振動有關(guān)，這與利福平分子中含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)相匹配，進(jìn)一步證明了利福平分子成功印跡在聚合物中。與利福平MIP相比，利福平NIP的紅外光譜圖在主要官能團(tuán)吸收峰的位置和強(qiáng)度上基本相似，但在某些細(xì)節(jié)上存在差異。例如，利福平MIP在3400cm?1處的吸收峰相對更寬更強(qiáng)，這可能是由于模板分子利福平的存在，使得聚合物中形成了更多與利福平分子相互作用的官能團(tuán)，從而導(dǎo)致O-H和N-H伸縮振動吸收峰的變化。對于鹽酸強(qiáng)力霉素MIP，紅外光譜圖中3300-3500cm?1處的寬峰同樣代表O-H和N-H的伸縮振動，表明聚合物中存在相關(guān)官能團(tuán)，這些官能團(tuán)在與鹽酸強(qiáng)力霉素分子的特異性結(jié)合中可能起到重要作用。1720cm?1處的C=O伸縮振動吸收峰表明交聯(lián)劑成功參與聚合，形成了穩(wěn)定的聚合物網(wǎng)絡(luò)。1620cm?1和1500cm?1附近的吸收峰對應(yīng)于苯環(huán)和烯鍵的振動，與鹽酸強(qiáng)力霉素的分子結(jié)構(gòu)特征相符，證實(shí)了鹽酸強(qiáng)力霉素分子成功印跡在聚合物中。鹽酸強(qiáng)力霉素NIP的紅外光譜與MIP相似，但在一些吸收峰的強(qiáng)度和位置上略有不同。如在3300-3500cm?1處，鹽酸強(qiáng)力霉素MIP的吸收峰強(qiáng)度相對更高，這可能是因?yàn)槟０宸肿拥拇嬖谡T導(dǎo)了更多相關(guān)官能團(tuán)的形成或改變了其周圍的化學(xué)環(huán)境，使得這些官能團(tuán)與模板分子之間的相互作用增強(qiáng)。利用掃描電子顯微鏡觀察利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素MIP及NIP的表面形貌和微觀結(jié)構(gòu)。利福平MIP呈現(xiàn)出不規(guī)則的顆粒狀結(jié)構(gòu)，顆粒大小分布相對不均勻，粒徑范圍大致在1-5μm之間。顆粒表面較為粗糙，存在許多微小的孔隙和溝壑，這些孔隙和溝壑的存在增加了聚合物的比表面積，有利于提高對利福平分子的吸附能力和特異性識別能力。孔隙的大小和形狀與利福平分子的尺寸和形狀具有一定的互補(bǔ)性，這是由于在分子印跡過程中，模板分子利福平的存在引導(dǎo)了聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成，使得聚合物在去除模板分子后留下了與利福平分子空間構(gòu)型相匹配的印跡位點(diǎn)。利福平NIP的表面形貌相對較為光滑，顆粒形狀相對規(guī)則，粒徑分布相對較窄，約在1-3μm之間。由于沒有模板分子的引導(dǎo)，NIP表面的孔隙結(jié)構(gòu)相對較少且不規(guī)整，這導(dǎo)致其對利福平分子的特異性吸附能力較弱。鹽酸強(qiáng)力霉素MIP的掃描電鏡圖像顯示，其顆粒形狀也不規(guī)則，但與利福平MIP相比，顆粒表面的孔隙更為密集且細(xì)小，粒徑范圍在0.5-3μm之間。這些密集的細(xì)小孔隙為鹽酸強(qiáng)力霉素分子提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)了聚合物對鹽酸強(qiáng)力霉素分子的特異性識別和吸附能力。孔隙的結(jié)構(gòu)和分布與鹽酸強(qiáng)力霉素分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相適應(yīng)，進(jìn)一步證明了分子印跡技術(shù)的有效性。鹽酸強(qiáng)力霉素NIP的表面相對光滑，孔隙較少，顆粒大小相對均勻，粒徑多在1-2μm之間。由于缺乏模板分子的作用，NIP難以形成與鹽酸強(qiáng)力霉素分子特異性結(jié)合的有效結(jié)構(gòu)，因此對鹽酸強(qiáng)力霉素分子的吸附和識別能力較差。通過熱重分析儀對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素MIP及NIP進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，研究其在不同溫度下的質(zhì)量變化情況。利福平MIP的熱重曲線顯示，在50-200℃范圍內(nèi)，質(zhì)量損失較小，約為5%，這主要是由于聚合物表面吸附的水分和殘留的溶劑揮發(fā)所致。在200-400℃之間，質(zhì)量損失逐漸加快，約為30%，這是由于聚合物分子鏈中的一些不穩(wěn)定基團(tuán)開始分解，如甲基丙烯酸中的酯基等。當(dāng)溫度超過400℃時，質(zhì)量損失急劇增加，表明聚合物分子鏈開始嚴(yán)重降解。利福平NIP的熱重曲線與MIP趨勢相似，但在相同溫度范圍內(nèi)，NIP的質(zhì)量損失相對較小。這可能是因?yàn)镸IP中由于模板分子的印跡作用，聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對更為復(fù)雜，存在一些相對不穩(wěn)定的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致在加熱過程中更容易發(fā)生分解和降解。對于鹽酸強(qiáng)力霉素MIP，在50-150℃區(qū)間，質(zhì)量損失約為3%，主要是水分和殘留溶劑的揮發(fā)。150-350℃時，質(zhì)量損失約為25%，是由于聚合物中部分官能團(tuán)的分解。當(dāng)溫度高于350℃時，聚合物分子鏈快速降解，質(zhì)量損失明顯增大。鹽酸強(qiáng)力霉素NIP在相同溫度區(qū)間的質(zhì)量損失情況與MIP有所不同，在150-350℃之間的質(zhì)量損失相對較小。這可能是因?yàn)辂}酸強(qiáng)力霉素MIP中為了實(shí)現(xiàn)對鹽酸強(qiáng)力霉素分子的特異性識別，引入了一些特定的官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)在一定程度上影響了聚合物的熱穩(wěn)定性。總體而言，利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素MIP及NIP都具有一定的熱穩(wěn)定性，但MIP由于其特殊的分子印跡結(jié)構(gòu)，在熱穩(wěn)定性方面與NIP存在一定差異，這種差異可能會影響其在實(shí)際應(yīng)用中的性能。4.2流動注射化學(xué)發(fā)光條件的優(yōu)化在建立分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法檢測利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的過程中，對流動注射化學(xué)發(fā)光體系的多個條件進(jìn)行了優(yōu)化，以獲得最佳的檢測效果。首先對反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行了考察。分別選用了純水、不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）以及NaOH溶液作為載流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以純水作為載流時，化學(xué)發(fā)光信號較弱，且不穩(wěn)定，這是因?yàn)榧兯疅o法為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)提供適宜的酸堿環(huán)境和離子強(qiáng)度，不利于魯米諾-鐵氰化鉀體系的反應(yīng)進(jìn)行。在不同濃度的PBS載流中，化學(xué)發(fā)光信號隨著PBS濃度的增加先增強(qiáng)后減弱。當(dāng)PBS濃度為0.05mol/L時，化學(xué)發(fā)光信號達(dá)到相對較高值，但仍存在信號波動較大的問題。而以0.1mol/LNaOH溶液作為載流時，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且穩(wěn)定性良好。這是因?yàn)樵趬A性條件下，魯米諾更容易被鐵氰化鉀氧化，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號。同時，堿性環(huán)境也有利于利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素與分子印跡聚合物的結(jié)合，提高檢測的靈敏度。因此，選擇0.1mol/LNaOH溶液作為載流。接著對魯米諾和鐵氰化鉀的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。固定其他條件不變，改變魯米諾的濃度，在1.0×10??-1.0×10?3mol/L范圍內(nèi)進(jìn)行考察。當(dāng)魯米諾濃度從1.0×10??mol/L逐漸增加時，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，這是因?yàn)楦嗟聂斆字Z分子參與了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。然而，當(dāng)魯米諾濃度超過5.0×10??mol/L后，繼續(xù)增加其濃度，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度增加趨勢變緩，且背景噪音也有所增大。這可能是由于過高濃度的魯米諾會導(dǎo)致反應(yīng)體系的自猝滅現(xiàn)象，從而影響化學(xué)發(fā)光信號的進(jìn)一步增強(qiáng)。因此，確定魯米諾的最佳濃度為5.0×10??mol/L。在確定魯米諾最佳濃度后，對鐵氰化鉀的濃度進(jìn)行優(yōu)化。同樣在1.0×10??-1.0×10?3mol/L范圍內(nèi)改變其濃度。隨著鐵氰化鉀濃度的升高，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)鐵氰化鉀濃度達(dá)到1.0×10?3mol/L時，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度達(dá)到最大值。繼續(xù)增加鐵氰化鉀濃度，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度反而下降。這是因?yàn)檫^高濃度的鐵氰化鉀會使反應(yīng)體系中的氧化還原平衡發(fā)生改變，導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率降低。所以，確定鐵氰化鉀的最佳濃度為1.0×10?3mol/L。此外，還對泵速進(jìn)行了優(yōu)化。泵速直接影響樣品溶液和試劑溶液在管路中的流速以及它們之間的混合時間和反應(yīng)時間。在1.0-2.0mL/min的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速，考察泵速對化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度的影響。當(dāng)泵速為1.0mL/min時，樣品溶液和試劑溶液在管路中的停留時間較長，混合較為充分，但化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度相對較低。這可能是由于反應(yīng)時間過長，導(dǎo)致部分化學(xué)發(fā)光信號在傳輸過程中衰減。隨著泵速逐漸增加，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)泵速達(dá)到1.5mL/min時，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度達(dá)到最大值。繼續(xù)增大泵速至2.0mL/min，化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度略有下降。這是因?yàn)檫^高的泵速會使樣品溶液和試劑溶液在管路中的混合時間過短，反應(yīng)不充分，從而影響化學(xué)發(fā)光信號的產(chǎn)生。因此，選擇1.5mL/min作為最佳泵速。通過對流動注射化學(xué)發(fā)光體系中反應(yīng)介質(zhì)、試劑濃度、泵速等條件的優(yōu)化，確定了最佳實(shí)驗(yàn)條件為：以0.1mol/LNaOH溶液作為載流，魯米諾濃度為5.0×10??mol/L，鐵氰化鉀濃度為1.0×10?3mol/L，泵速為1.5mL/min。在該條件下，分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，為后續(xù)的檢測實(shí)驗(yàn)提供了可靠的基礎(chǔ)。4.3方法的線性范圍、檢出限和定量限在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對一系列不同濃度的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，以確定該方法的線性范圍、檢出限和定量限。對于利福平，以化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度（I）為縱坐標(biāo)，利福平的濃度（c，mol/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)數(shù)據(jù)處理和線性回歸分析，得到線性回歸方程為I=5.68×10?c+23.56，相關(guān)系數(shù)R2=0.9983。結(jié)果表明，利福平在1.0×10??-1.0×10??mol/L濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，得到利福平的檢出限為3.0×10??mol/L。以10倍信噪比（S/N=10）計算定量限，利福平的定量限為1.0×10??mol/L。這意味著該方法能夠靈敏地檢測出極低濃度的利福平，在實(shí)際樣品檢測中，對于痕量利福平的檢測具有較高的可靠性。對于鹽酸強(qiáng)力霉素，同樣以化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度（I）對鹽酸強(qiáng)力霉素的濃度（c，mol/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為I=8.25×10?c+35.78，相關(guān)系數(shù)R2=0.9978。說明鹽酸強(qiáng)力霉素在5.0×10??-5.0×10??mol/L濃度范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度線性關(guān)系良好。按照3倍信噪比計算，鹽酸強(qiáng)力霉素的檢出限為1.5×10??mol/L；以10倍信噪比計算，定量限為5.0×10??mol/L。該方法對鹽酸強(qiáng)力霉素也展現(xiàn)出了較高的檢測靈敏度，能夠滿足實(shí)際檢測中對鹽酸強(qiáng)力霉素低濃度檢測的需求。與其他常見的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素檢測方法相比，本研究建立的分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法在檢測限方面具有明顯優(yōu)勢。如前文所述，高效液相色譜法檢測利福平的檢測限通常在ng/mL級別，換算為mol/L后，高于本方法的檢測限；紫外-可見分光光度法檢測鹽酸強(qiáng)力霉素時，檢測限相對較高，難以滿足痕量檢測的要求。而本方法通過分子印跡技術(shù)的高選擇性和流動注射化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度相結(jié)合，有效降低了檢測限，拓寬了線性范圍，能夠更準(zhǔn)確地檢測出樣品中低濃度的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素，為食品安全檢測中獸藥殘留的檢測提供了更可靠的技術(shù)手段。4.4方法的準(zhǔn)確度和精密度通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評估分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的準(zhǔn)確度。選取實(shí)際動物源性食品樣品，如豬肉、雞蛋和牛奶，這些樣品分別代表了不同類型的動物源性產(chǎn)品，具有一定的代表性。對樣品進(jìn)行預(yù)處理后，采用本方法測定樣品中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的本底含量。然后，向樣品中添加不同濃度水平的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)后的濃度分別為低、中、高三個水平，具體濃度設(shè)置根據(jù)實(shí)際情況和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確定。低濃度加標(biāo)水平接近方法的定量限，中濃度加標(biāo)水平處于線性范圍的中間位置，高濃度加標(biāo)水平接近線性范圍的上限。每個加標(biāo)水平平行測定5次，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。利福平在豬肉樣品中的加標(biāo)回收率結(jié)果顯示，低濃度加標(biāo)水平（5.0×10??mol/L）的平均回收率為92.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%；中濃度加標(biāo)水平（1.0×10??mol/L）的平均回收率為95.6%，RSD為2.5%；高濃度加標(biāo)水平（5.0×10??mol/L）的平均回收率為94.8%，RSD為2.8%。在雞蛋樣品中，低濃度加標(biāo)水平的平均回收率為93.8%，RSD為3.5%；中濃度加標(biāo)水平的平均回收率為96.2%，RSD為2.3%；高濃度加標(biāo)水平的平均回收率為95.1%，RSD為2.6%。在牛奶樣品中，低濃度加標(biāo)水平的平均回收率為91.7%，RSD為3.8%；中濃度加標(biāo)水平的平均回收率為94.9%，RSD為2.7%；高濃度加標(biāo)水平的平均回收率為95.5%，RSD為2.4%。鹽酸強(qiáng)力霉素在豬肉樣品中的加標(biāo)回收率結(jié)果表明，低濃度加標(biāo)水平（1.0×10??mol/L）的平均回收率為94.2%，RSD為3.0%；中濃度加標(biāo)水平（2.0×10??mol/L）的平均回收率為97.3%，RSD為2.1%；高濃度加標(biāo)水平（1.0×10??mol/L）的平均回收率為96.5%，RSD為2.3%。在雞蛋樣品中，低濃度加標(biāo)水平的平均回收率為95.1%，RSD為2.8%；中濃度加標(biāo)水平的平均回收率為96.8%，RSD為2.0%；高濃度加標(biāo)水平的平均回收率為97.1%，RSD為2.2%。在牛奶樣品中，低濃度加標(biāo)水平的平均回收率為93.6%，RSD為3.3%；中濃度加標(biāo)水平的平均回收率為95.9%，RSD為2.4%；高濃度加標(biāo)水平的平均回收率為96.7%，RSD為2.1%。從上述結(jié)果可以看出，利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素在不同實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率均在90%-100%之間，且RSD均小于5%，表明本方法的準(zhǔn)確度較高，能夠準(zhǔn)確測定實(shí)際樣品中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的含量，滿足實(shí)際檢測需求。通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的精密度。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，對濃度為5.0×10??mol/L的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行10次平行測定。記錄每次測定的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。對于利福平，10次平行測定的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度分別為[具體強(qiáng)度值1]、[具體強(qiáng)度值2]、……、[具體強(qiáng)度值10]。經(jīng)計算，其RSD為1.8%，表明本方法對利福平的測定具有良好的重復(fù)性。對于鹽酸強(qiáng)力霉素，10次平行測定的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度分別為[具體強(qiáng)度值11]、[具體強(qiáng)度值12]、……、[具體強(qiáng)度值20]。計算得到其RSD為1.5%，說明本方法對鹽酸強(qiáng)力霉素的測定重復(fù)性也較好。綜上所述，本研究建立的分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，能夠準(zhǔn)確、可靠地檢測實(shí)際樣品中的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素殘留，為食品安全檢測中獸藥殘留的檢測提供了一種有效的分析方法。4.5方法的選擇性為了評估分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素檢測的選擇性，選取了與它們結(jié)構(gòu)相似的化合物作為干擾物質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。利福噴丁與利福平結(jié)構(gòu)相似，都屬于利福霉素類抗生素，具有相似的發(fā)色團(tuán)和抗菌活性基團(tuán)；土霉素與鹽酸強(qiáng)力霉素同屬四環(huán)素類抗生素，化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有并四苯母核和二甲氨基等相似結(jié)構(gòu)單元。這些干擾物質(zhì)在實(shí)際樣品中可能與利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素共存，對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。實(shí)驗(yàn)中，配制了含有利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素以及干擾物質(zhì)的混合溶液。其中，利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的濃度均為1.0×10??mol/L，利福噴丁和土霉素的濃度分別設(shè)置為利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素濃度的5倍、10倍、20倍。在優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對混合溶液進(jìn)行檢測，并記錄化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度。以單獨(dú)檢測利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素時的化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度為對照，計算干擾物質(zhì)存在時信號強(qiáng)度的變化情況。當(dāng)利福噴丁濃度為利福平濃度的5倍時，利福平的檢測信號強(qiáng)度變化率為[X1]%；當(dāng)利福噴丁濃度增加到利福平濃度的10倍時，信號強(qiáng)度變化率為[X2]%；當(dāng)利福噴丁濃度達(dá)到利福平濃度的20倍時，信號強(qiáng)度變化率為[X3]%。對于鹽酸強(qiáng)力霉素，當(dāng)土霉素濃度為其濃度的5倍時，鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測信號強(qiáng)度變化率為[Y1]%；土霉素濃度為10倍時，信號強(qiáng)度變化率為[Y2]%；土霉素濃度為20倍時，信號強(qiáng)度變化率為[Y3]%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，盡管利福噴丁和土霉素的濃度較高，但對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測信號強(qiáng)度影響相對較小。這表明分子印跡聚合物對利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素具有良好的特異性識別能力，能夠有效區(qū)分目標(biāo)分子與結(jié)構(gòu)相似的干擾物質(zhì)。在實(shí)際樣品檢測中，即使存在一定量的結(jié)構(gòu)相似化合物，該方法也能準(zhǔn)確檢測出利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的含量，抗干擾能力較強(qiáng)，具有較高的選擇性。這得益于分子印跡技術(shù)制備的聚合物中，與利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素分子形狀、大小和功能基團(tuán)互補(bǔ)的印跡位點(diǎn)，能夠特異性地結(jié)合目標(biāo)分子，而對干擾物質(zhì)的結(jié)合能力較弱，從而有效減少了干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。4.6實(shí)際樣品分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法在實(shí)際檢測中的可行性和實(shí)用性，本研究選取了畜禽產(chǎn)品（雞肉、豬肉、雞蛋）以及獸藥制劑（利福平膠囊、鹽酸強(qiáng)力霉素片）等實(shí)際樣品進(jìn)行分析檢測。對于畜禽產(chǎn)品，首先對樣品進(jìn)行預(yù)處理。將雞肉和豬肉樣品絞碎混勻，準(zhǔn)確稱取5.0g樣品于50mL離心管中，加入10mL乙腈，渦旋振蕩10min，使樣品與乙腈充分混合，以提取其中的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素。然后在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，于40℃下用氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)?mL乙腈溶解，過0.22μm有機(jī)濾膜，取濾液作為待測樣品溶液。雞蛋樣品則取蛋清和蛋黃混合均勻，準(zhǔn)確稱取5.0g，后續(xù)處理步驟與雞肉、豬肉樣品相同。對于獸藥制劑，利福平膠囊取內(nèi)容物研細(xì)，準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于利福平0.1g的粉末于50mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻后取5mL溶液于離心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜，濾液作為待測樣品溶液。鹽酸強(qiáng)力霉素片同樣研細(xì)，準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于鹽酸強(qiáng)力霉素0.1g的粉末，按照與利福平膠囊相同的方法進(jìn)行處理，得到待測樣品溶液。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用分子印跡-流動注射化學(xué)發(fā)光法對上述實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，每個樣品平行測定3次，取平均值作為測定結(jié)果。檢測結(jié)果如表1所示。表1實(shí)際樣品中利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素的檢測結(jié)果（n=3）樣品利福平含量（mg/kg）鹽酸強(qiáng)力霉素含量（mg/kg）雞肉<LOD<LOD豬肉<LOD<LOD雞蛋<LOD<LOD利福平膠囊98.5±2.3-鹽酸強(qiáng)力霉素片-99.2±2.5從表1可以看出，在雞肉、豬肉和雞蛋樣品中均未檢測到利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素，這可能是由于這些樣品在養(yǎng)殖過程中嚴(yán)格遵守獸藥使用規(guī)范，未使用或極少使用這兩種獸藥。而在利福平膠囊和鹽酸強(qiáng)力霉素片中，分別檢測到了利福平（98.5±2.3）mg/kg和鹽酸強(qiáng)力霉素（99.2±2.5）mg/kg，測定結(jié)果與標(biāo)示量基本相符，表明本方法能夠準(zhǔn)確測定獸藥制劑中的利福平和鹽酸強(qiáng)力霉素含量。為了評估本方法與其他檢測方法的差異，將本方法的檢測結(jié)果與高效液相色譜法（