RNAi沉默WT1基因：開啟逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的新征程一、引言1.1研究背景惡性黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，多發(fā)生于皮膚，也可出現(xiàn)在黏膜、眼葡萄膜等部位。近年來(lái)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。在白人群體中，惡性黑素瘤的發(fā)病率相對(duì)較高，而在我國(guó)，盡管發(fā)病率較低，但由于人口基數(shù)大，患者數(shù)量也不容小覷。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，部分地區(qū)的惡性黑素瘤發(fā)病率正以每年一定的比例增長(zhǎng)。早期的惡性黑素瘤，通過外科手術(shù)切除，患者的預(yù)后相對(duì)較好，五年生存率可達(dá)90%以上。然而，一旦病情發(fā)展到晚期，黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力和增殖能力顯著增強(qiáng)，癌細(xì)胞容易發(fā)生擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)傳統(tǒng)的治療方法，如放療、化療和免疫治療等，效果往往較為有限，患者的預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的5年生存率僅為15%-20%。在惡性黑素瘤的治療過程中，耐藥性是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。隨著治療的進(jìn)行，許多患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)化療藥物、靶向藥物或免疫治療藥物的耐藥現(xiàn)象，這嚴(yán)重影響了治療效果，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展。例如，在靶向治療中，多數(shù)接受BRAF抑制劑和MEK抑制劑治療的患者，在一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)耐藥，使得藥物無(wú)法繼續(xù)有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)通路的異常激活和調(diào)控，其中凋亡抑制被認(rèn)為是惡性黑素瘤耐藥的主要機(jī)制之一。WT1基因，即Wilms瘤1基因，最初被發(fā)現(xiàn)作為一種抑癌基因參與Wilm's瘤的發(fā)生。然而，近年來(lái)的研究表明，WT1基因在多種實(shí)體瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并發(fā)揮著癌基因的作用，具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，WT1基因在80%以上的惡性黑素瘤中表達(dá)，而在良性色素痣和正常皮膚中則未見表達(dá)。下調(diào)WT1基因的表達(dá)，可以抑制惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，抑制WT1基因表達(dá)或許能夠逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性，然而目前這方面的研究尚未見報(bào)道。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種基因沉默新技術(shù)。該技術(shù)能夠高度特異性、高效性地抑制目的基因的表達(dá)，通過外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引發(fā)與其同源mRNA的特異性降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)基因表達(dá)的抑制。RNAi技術(shù)的出現(xiàn)，為基因功能研究提供了一種強(qiáng)有力的工具，在研究基因功能及表達(dá)調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)通路、藥物靶點(diǎn)的鑒定和基因藥物開發(fā)等方面展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景，也為腫瘤的治療提供了新的思路和方法。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于沉默WT1基因，有望為逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性提供新的策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在運(yùn)用RNAi技術(shù)，沉默WT1基因，深入探究其對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及相關(guān)機(jī)制。具體而言，主要包含以下幾個(gè)目標(biāo)：構(gòu)建并驗(yàn)證WT1基因siRNA真核表達(dá)載體：設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建針對(duì)WT1基因的siRNA真核表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至惡性黑素瘤細(xì)胞中，通過多種檢測(cè)方法，如RT-PCR、Western-Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色等，驗(yàn)證其對(duì)WT1基因mRNA及蛋白表達(dá)的沉默效果，確保載體的有效性和特異性。評(píng)估RNAi沉默WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響：采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察RNAi沉默WT1基因后對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞增殖能力的影響；通過電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，結(jié)合相關(guān)凋亡檢測(cè)技術(shù)，明確其對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，全面了解該基因沉默對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。探究RNAi沉默WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果：以順鉑等化療藥物為研究對(duì)象，運(yùn)用MTT法檢測(cè)惡性黑素瘤細(xì)胞在RNAi沉默WT1基因前后對(duì)化療藥物的敏感性變化，計(jì)算IC50值，評(píng)估耐藥性的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，確定RNAi沉默WT1基因能否有效逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性。初步探討RNAi沉默WT1基因逆轉(zhuǎn)耐藥性的潛在機(jī)制：從凋亡相關(guān)信號(hào)通路、耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)等方面入手，通過蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）、免疫熒光等技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，初步闡明RNAi沉默WT1基因逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的潛在分子機(jī)制。1.2.2研究意義本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：理論意義：目前，雖然對(duì)惡性黑素瘤耐藥機(jī)制的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。WT1基因在惡性黑素瘤中的具體作用機(jī)制，尤其是其與耐藥性之間的關(guān)聯(lián)，尚未完全明確。本研究通過RNAi技術(shù)沉默WT1基因，深入研究其對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的影響及機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示惡性黑素瘤耐藥的分子機(jī)制，豐富和完善腫瘤耐藥理論，為后續(xù)深入研究腫瘤耐藥機(jī)制提供新的思路和方向。同時(shí)，該研究也將加深對(duì)WT1基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中作用的理解，為探索腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。臨床應(yīng)用價(jià)值：惡性黑素瘤的耐藥問題嚴(yán)重制約了臨床治療效果，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。本研究若能證實(shí)RNAi沉默WT1基因可以有效逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性，將為臨床治療惡性黑素瘤提供新的治療策略和方法。一方面，有望通過基因治療的手段，提高化療藥物對(duì)耐藥性惡性黑素瘤細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)化療效果，延長(zhǎng)患者的生存期；另一方面，RNAi技術(shù)作為一種新興的基因治療技術(shù)，具有高度特異性和高效性的特點(diǎn)，相較于傳統(tǒng)治療方法，可能具有更低的毒副作用，能夠在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量。此外，該研究結(jié)果還可能為開發(fā)針對(duì)WT1基因的新型抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，推動(dòng)惡性黑素瘤治療藥物的研發(fā)進(jìn)程，為臨床治療帶來(lái)新的希望。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)1.3.1研究方法文獻(xiàn)研究法：全面檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，如PubMed、WebofScience、中國(guó)知網(wǎng)等，收集整理與WT1基因、RNAi技術(shù)、惡性黑素瘤耐藥性相關(guān)的文獻(xiàn)資料。對(duì)這些文獻(xiàn)進(jìn)行深入分析，了解研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢(shì)以及存在的問題，為研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，明確研究方向和重點(diǎn)，避免重復(fù)研究，并借鑒前人的研究方法和思路。實(shí)驗(yàn)研究法：細(xì)胞培養(yǎng)：選取人轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤WM451細(xì)胞株，在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，如使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，定期換液傳代，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供足夠數(shù)量且狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞。載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：根據(jù)WT1基因序列，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)WT1基因的siRNA序列，將其連接到真核表達(dá)載體上，構(gòu)建WT1基因siRNA真核表達(dá)載體。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入惡性黑素瘤WM451細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，確保載體成功導(dǎo)入細(xì)胞。基因及蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)WT1基因mRNA在轉(zhuǎn)染前后的表達(dá)水平變化，明確基因沉默效果；運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-Blot）和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，從蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證WT1基因的沉默情況，以及相關(guān)凋亡蛋白、耐藥蛋白等的表達(dá)變化，揭示基因沉默對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)：運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，連續(xù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞吸光度值，分析RNAi沉默WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞增殖能力的影響；通過電鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，直觀地了解細(xì)胞凋亡的特征，如細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成等，結(jié)合AnnexinV-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞凋亡率，確定基因沉默對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。細(xì)胞耐藥性檢測(cè)：以順鉑等化療藥物為研究對(duì)象，采用MTT法檢測(cè)惡性黑素瘤細(xì)胞在RNAi沉默WT1基因前后對(duì)化療藥物的敏感性變化。設(shè)置不同濃度梯度的化療藥物，處理細(xì)胞一定時(shí)間后，測(cè)定細(xì)胞存活率，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值，評(píng)估耐藥性的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，判斷RNAi沉默WT1基因?qū)?xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)效果。1.3.2創(chuàng)新點(diǎn)多層面分析：本研究從基因、蛋白和細(xì)胞生物學(xué)行為等多個(gè)層面，系統(tǒng)地探究RNAi沉默WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制。在基因?qū)用妫珳?zhǔn)檢測(cè)WT1基因mRNA的表達(dá)變化；在蛋白層面，全面分析凋亡相關(guān)蛋白、耐藥相關(guān)蛋白等的表達(dá)改變；在細(xì)胞生物學(xué)行為層面，深入研究細(xì)胞增殖、凋亡以及對(duì)化療藥物敏感性的變化，這種多層面的綜合分析方法，能夠更全面、深入地揭示其中的分子機(jī)制，為惡性黑素瘤的治療提供更豐富、準(zhǔn)確的理論依據(jù)。探索新的聯(lián)合治療策略：目前針對(duì)惡性黑素瘤耐藥性的治療研究，多集中在單一治療方法或已知靶點(diǎn)的聯(lián)合治療。本研究聚焦于WT1基因這一相對(duì)較新的靶點(diǎn)，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因沉默，探索其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的可能性，為開發(fā)新的聯(lián)合治療策略提供了創(chuàng)新性的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，有望為臨床治療帶來(lái)新的突破。二、惡性黑素瘤與耐藥性剖析2.1惡性黑素瘤的現(xiàn)狀2.1.1流行病學(xué)特征惡性黑素瘤的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的差異，且總體呈上升趨勢(shì)。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球約有325,000例新發(fā)黑色素瘤病例，其中男性174,000例，女性151,000例；死亡病例達(dá)57,000例，男性32,000例，女性25,000例。澳大利亞/新西蘭地區(qū)的發(fā)病率最高，男性和女性的發(fā)病率分別達(dá)到42/100,000人?年和31/100,000人?年，緊隨其后的是西歐，男女發(fā)病率均為19/100,000人?年。在這些高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率的上升與多種因素相關(guān)，其中長(zhǎng)期暴露于紫外線是一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。例如，澳大利亞和新西蘭的陽(yáng)光輻射強(qiáng)度較高，居民戶外活動(dòng)頻繁，且部分人群防曬意識(shí)不足，導(dǎo)致皮膚長(zhǎng)期受到紫外線的損傷，從而增加了惡性黑素瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，在大多數(shù)非洲和亞洲國(guó)家，惡性黑素瘤的發(fā)病率相對(duì)較低，基本低于1/100,000人?年。然而，近年來(lái)，隨著生活方式的改變以及紫外線暴露的增加，亞洲國(guó)家的發(fā)病率也在逐漸上升。以中國(guó)為例，雖然總體發(fā)病率仍處于較低水平，但增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。北京市1998年男女發(fā)病率分別為0.3/100,000和0.2/100,000，到2004年已上升至0.8/100,000和0.5/100,000；上海市1995年男女發(fā)病率分別為0.2/100,000和0.3/100,000，2005年則分別為0.5/100,000和0.4/100,000。在中國(guó)，惡性黑素瘤的發(fā)病呈現(xiàn)出一些特點(diǎn)，肢端和黏膜部位的發(fā)病相對(duì)較多，這與歐美白種人以皮膚暴露部位發(fā)病為主有所不同。這可能與不同種族的皮膚結(jié)構(gòu)、遺傳背景以及生活環(huán)境等因素有關(guān)。除了紫外線暴露外，惡性黑素瘤的發(fā)病還與遺傳因素密切相關(guān)。家族性惡性黑素瘤患者往往攜帶特定的基因突變，如CDKN2A、BRAF、NRAS等基因的突變。這些基因突變會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化，增加患惡性黑素瘤的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，具有家族遺傳史的人群，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出數(shù)倍。此外，免疫系統(tǒng)功能異常、痣的數(shù)量和形態(tài)等也與惡性黑素瘤的發(fā)病相關(guān)。大量的臨床研究數(shù)據(jù)顯示，免疫力低下的人群，如艾滋病患者、器官移植后長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的患者，患惡性黑素瘤的幾率明顯增加；而身上痣的數(shù)量較多、痣的形態(tài)不規(guī)則、顏色不均勻的人，也更容易發(fā)生惡變。2.1.2臨床特征與危害惡性黑素瘤早期通常表現(xiàn)為正常皮膚上出現(xiàn)黑色損害，或者原有的黑素細(xì)胞痣在近期內(nèi)突然擴(kuò)大、色素加深。隨著病情的進(jìn)展，損害會(huì)逐漸隆起，呈現(xiàn)出斑形或結(jié)節(jié)狀，也可表現(xiàn)為菜花樣，表面容易破潰出血，周圍還可能出現(xiàn)不規(guī)則的色素暈或色素脫失暈。當(dāng)腫瘤向皮下組織生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)表現(xiàn)為皮下結(jié)節(jié)或腫塊；若向周圍擴(kuò)散，則可能出現(xiàn)衛(wèi)星狀損害。例如，在一些患者中，最初可能只是發(fā)現(xiàn)皮膚上的一顆痣顏色變深、邊界變得模糊，隨后痣迅速增大，表面出現(xiàn)破潰，周圍還出現(xiàn)了一些小的黑色斑點(diǎn)，這些都是惡性黑素瘤進(jìn)展的表現(xiàn)。惡性黑素瘤具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。其轉(zhuǎn)移途徑主要包括淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。淋巴轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞首先會(huì)轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大。例如，下肢的惡性黑素瘤常首先轉(zhuǎn)移至腹股溝淋巴結(jié)，上肢的則多轉(zhuǎn)移至腋窩淋巴結(jié)。隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展，腫瘤細(xì)胞可通過血行轉(zhuǎn)移至全身各個(gè)器官，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、肝、骨、腦等。一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后極差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤患者，5年生存率僅為15%-20%。肺轉(zhuǎn)移的患者可能出現(xiàn)咳嗽、咯血、呼吸困難等癥狀；肝轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致肝功能異常、肝區(qū)疼痛、黃疸等；骨轉(zhuǎn)移會(huì)引起骨痛、病理性骨折；腦轉(zhuǎn)移則可能出現(xiàn)頭痛、嘔吐、視力障礙、偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這些癥狀不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)迅速危及生命。此外，惡性黑素瘤的治療過程對(duì)患者的心理和生活也帶來(lái)了極大的負(fù)擔(dān)。手術(shù)治療可能會(huì)導(dǎo)致患者身體外觀的改變，如大面積的皮膚切除、截肢等，給患者帶來(lái)心理上的創(chuàng)傷。化療、放療和免疫治療等也會(huì)帶來(lái)一系列的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、乏力、免疫力下降等，影響患者的日常生活和工作。而且，惡性黑素瘤的治療費(fèi)用較高，長(zhǎng)期的治療過程會(huì)給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)壓力，進(jìn)一步影響患者的生活質(zhì)量和心理健康。2.2惡性黑素瘤的治療困境2.2.1傳統(tǒng)治療手段局限性手術(shù)切除是早期惡性黑素瘤的主要治療方法，對(duì)于原位或厚度較?。?lt;1mm）的腫瘤，手術(shù)切除范圍一般為腫瘤邊緣外0.5-1cm的正常皮膚，深度需達(dá)到皮下組織。對(duì)于厚度在1-2mm的腫瘤，切除范圍需擴(kuò)大至腫瘤邊緣外1-2cm。若腫瘤厚度>2mm，切除范圍則應(yīng)達(dá)到腫瘤邊緣外2-3cm，且需切除深筋膜。例如，當(dāng)腫瘤位于肢體部位時(shí)，有時(shí)可能需要進(jìn)行截肢手術(shù)以確保徹底切除腫瘤組織。然而，手術(shù)治療存在一定的局限性，對(duì)于晚期已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)往往無(wú)法完全清除腫瘤細(xì)胞，難以達(dá)到根治的目的，術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。而且，手術(shù)切除可能會(huì)對(duì)患者的身體造成較大創(chuàng)傷，影響患者的肢體功能和外觀，降低患者的生活質(zhì)量。例如，頭頸部的惡性黑素瘤手術(shù)切除后，可能會(huì)導(dǎo)致面部畸形、吞咽困難等問題；肢體的手術(shù)切除可能會(huì)影響患者的行走和勞動(dòng)能力。化療在惡性黑素瘤的治療中也占據(jù)一定的地位，常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪（DTIC）、替莫唑胺（TMZ）等。達(dá)卡巴嗪是治療轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤的一線化療藥物，其單藥有效率約為10%-20%。替莫唑胺在腦脊液中的濃度較高，對(duì)于腦轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤患者具有一定的治療效果。但化療藥物往往存在嚴(yán)重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，會(huì)對(duì)患者的身體造成極大的損害，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降。此外，惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性較低，容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療的有效率不高，患者的生存期難以得到顯著延長(zhǎng)。隨著化療次數(shù)的增加，許多患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)化療藥物的抵抗，腫瘤細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)和擴(kuò)散，治療效果逐漸變差。放療在惡性黑素瘤的治療中應(yīng)用相對(duì)較少，主要用于緩解骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移等引起的疼痛和壓迫癥狀，或作為手術(shù)后的輔助治療手段，降低局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于骨轉(zhuǎn)移患者，放療可以減輕骨痛，預(yù)防病理性骨折；對(duì)于腦轉(zhuǎn)移患者，放療能夠縮小腫瘤體積，緩解神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。然而，惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)放療相對(duì)不敏感，單純放療的療效有限，且放療也會(huì)帶來(lái)一系列的不良反應(yīng)，如放射性皮炎、放射性肺炎、放射性腦損傷等，進(jìn)一步影響患者的身體狀況和生活質(zhì)量。例如，胸部放療可能會(huì)導(dǎo)致放射性肺炎，引起咳嗽、氣短等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響患者的呼吸功能，增加患者的痛苦。2.2.2靶向治療與耐藥性難題靶向治療是近年來(lái)惡性黑素瘤治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展，主要包括BRAF抑制劑、MEK抑制劑和c-KIT抑制劑等。對(duì)于攜帶BRAFV600突變的惡性黑素瘤患者，BRAF抑制劑如維莫非尼、達(dá)拉非尼等能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，單藥治療的有效率可達(dá)50%-60%。MEK抑制劑如曲美替尼、考比替尼等，與BRAF抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，可以進(jìn)一步提高治療效果，延長(zhǎng)患者的無(wú)進(jìn)展生存期。c-KIT抑制劑伊馬替尼則適用于c-KIT基因突變的惡性黑素瘤患者，能夠特異性地抑制c-KIT激酶的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。盡管靶向治療在惡性黑素瘤的治療中取得了一定的療效，但耐藥性問題依然是制約其治療效果的關(guān)鍵因素。多數(shù)接受BRAF抑制劑和MEK抑制劑治療的患者，在治療6-12個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面：一是腫瘤細(xì)胞通過激活其他旁路信號(hào)通路，如PI3K/AKT/mTOR通路、NRAS基因突變激活RAS-MAPK通路等，繞過被抑制的信號(hào)通路，繼續(xù)維持腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；二是BRAF基因發(fā)生二次突變，使得BRAF抑制劑無(wú)法與之有效結(jié)合，失去抑制作用；三是腫瘤微環(huán)境的改變，如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子和趨化因子，會(huì)影響腫瘤細(xì)胞對(duì)靶向藥物的敏感性。耐藥性的出現(xiàn)使得靶向治療的效果大打折扣，患者的病情再次惡化，亟需尋找新的治療策略來(lái)克服耐藥性問題。2.3惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性機(jī)制深度解析2.3.1藥物外排機(jī)制ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這一家族包含多個(gè)成員，如P-糖蛋白（P-gp，由MDR1基因編碼）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均為跨膜蛋白，能夠利用ATP水解釋放的能量，將化療藥物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度顯著降低，從而使藥物難以發(fā)揮有效的細(xì)胞毒性作用，最終引發(fā)耐藥。P-gp是最早被發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白，也是研究最為深入的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一。其分子結(jié)構(gòu)包含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。當(dāng)化療藥物進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)與P-gp的藥物結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，促使P-gp發(fā)生構(gòu)象變化。在ATP水解提供能量的驅(qū)動(dòng)下，P-gp將結(jié)合的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度始終維持在較低水平，難以達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的濃度。例如，在惡性黑素瘤細(xì)胞中，當(dāng)使用長(zhǎng)春新堿、阿霉素等化療藥物進(jìn)行治療時(shí)，高表達(dá)P-gp的細(xì)胞能夠迅速將這些藥物排出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性。研究表明，P-gp的表達(dá)水平與惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥程度呈正相關(guān)，其表達(dá)越高，細(xì)胞對(duì)藥物的外排能力越強(qiáng)，耐藥性也就越明顯。MRP同樣參與了惡性黑素瘤細(xì)胞的藥物外排過程，它不僅能夠直接將化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，還與谷胱甘肽（GSH）解毒系統(tǒng)密切相關(guān)。MRP可以與GSH結(jié)合形成復(fù)合物，然后將藥物-GSH復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。在這一過程中，GSH作為一種重要的抗氧化劑，不僅參與了藥物的外排，還能夠保護(hù)細(xì)胞免受化療藥物產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷。例如，順鉑等含鉑類化療藥物進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)與GSH結(jié)合形成順鉑-GSH復(fù)合物，MRP能夠識(shí)別并將這一復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使得細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。BCRP主要通過自身或與其他轉(zhuǎn)運(yùn)分子形成二聚體或多聚體來(lái)發(fā)揮作用。在惡性黑素瘤細(xì)胞中，BCRP的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)米托蒽醌、柔紅霉素、多柔比星等多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，BCRP在消化道腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺相關(guān)腫瘤和黑色素瘤等腫瘤組織中表達(dá)較強(qiáng)，與臨床藥物耐受的出現(xiàn)密切相關(guān)。其作用機(jī)制可能是通過改變細(xì)胞膜的通透性，影響藥物的攝取和分布，或者通過與其他耐藥蛋白協(xié)同作用，增強(qiáng)細(xì)胞的耐藥能力。例如，在一些對(duì)米托蒽醌耐藥的惡性黑素瘤細(xì)胞中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BCRP的表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了其在耐藥機(jī)制中的重要作用。2.3.2凋亡抑制機(jī)制細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理平衡和清除異常細(xì)胞起著至關(guān)重要的作用。在惡性黑素瘤細(xì)胞中，凋亡相關(guān)基因和蛋白的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑受阻，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可分為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid、Bim等）。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。然而，在惡性黑素瘤細(xì)胞中，這種平衡常常被打破。例如，Bcl-2蛋白的過表達(dá)是惡性黑素瘤中常見的現(xiàn)象，它能夠通過與促凋亡蛋白結(jié)合，抑制促凋亡蛋白的活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)。研究表明，Bcl-2蛋白可以與Bax蛋白形成異源二聚體，使Bax蛋白無(wú)法發(fā)揮其促凋亡作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性增強(qiáng)。同時(shí)，促凋亡蛋白的表達(dá)降低也會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。以Bax蛋白為例，在一些惡性黑素瘤細(xì)胞中，Bax蛋白的表達(dá)水平明顯低于正常細(xì)胞，這使得細(xì)胞在受到化療藥物刺激時(shí)，無(wú)法有效激活凋亡信號(hào)通路，難以啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。此外，Bid、Bim等促凋亡蛋白表達(dá)的減少，也會(huì)影響細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，使得腫瘤細(xì)胞能夠在化療藥物的作用下存活并繼續(xù)增殖。除了Bcl-2家族蛋白，其他凋亡相關(guān)蛋白如caspase家族蛋白也參與了惡性黑素瘤細(xì)胞的凋亡抑制和耐藥過程。caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的執(zhí)行作用。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，caspase會(huì)被激活，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在惡性黑素瘤細(xì)胞中，一些因素會(huì)抑制caspase的激活，如IAP（凋亡抑制蛋白）家族的高表達(dá)。IAP家族蛋白能夠直接抑制caspase的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，XIAP（X連鎖凋亡抑制蛋白）可以與caspase-3、caspase-7和caspase-9結(jié)合，抑制它們的酶活性，從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡，產(chǎn)生耐藥性。2.3.3信號(hào)通路異常激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路在惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，這些信號(hào)通路的異常激活往往會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。MAPK信號(hào)通路主要包括RAS-RAF-MEK-ERK途徑，該通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和存活等過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在惡性黑素瘤中，BRAF基因突變是導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路異常激活的常見原因之一。約50%-60%的惡性黑素瘤患者攜帶BRAF基因突變，其中最常見的是BRAFV600E突變。突變后的BRAF蛋白具有持續(xù)的激酶活性，能夠激活下游的MEK和ERK蛋白，使其磷酸化水平升高，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號(hào)的持續(xù)激活。在這種情況下，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物的敏感性降低，容易產(chǎn)生耐藥性。例如，在使用BRAF抑制劑治療攜帶BRAFV600E突變的惡性黑素瘤患者時(shí)，盡管初期可能會(huì)取得較好的治療效果，但隨著時(shí)間的推移，腫瘤細(xì)胞會(huì)通過激活其他旁路信號(hào)通路，如PI3K/AKT/mTOR通路，或者發(fā)生BRAF基因的二次突變等方式，繞過被抑制的信號(hào)通路，繼續(xù)維持細(xì)胞的增殖和存活，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。PI3K/AKT信號(hào)通路也是一條與腫瘤細(xì)胞增殖、存活和耐藥密切相關(guān)的信號(hào)通路。PI3K可以被多種上游信號(hào)分子激活，如生長(zhǎng)因子受體、整合素等。激活后的PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使可以招募AKT到細(xì)胞膜上，并在PDK1和mTORC2等激酶的作用下，使AKT發(fā)生磷酸化而激活?；罨腁KT可以通過磷酸化多種下游底物，如GSK-3β、FOXO、BAD等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、代謝和耐藥等過程。在惡性黑素瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常激活較為常見，這可能是由于PI3K基因的突變、擴(kuò)增，或者PTEN（一種負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路的抑癌基因）的缺失或突變導(dǎo)致的。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，AKT可以通過磷酸化BAD蛋白，使其失去促凋亡活性，從而抑制細(xì)胞凋亡；AKT還可以激活mTOR，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的存活能力和耐藥性。此外，PI3K/AKT信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路之間存在著復(fù)雜的交互作用，兩條信號(hào)通路的異常激活相互協(xié)同，進(jìn)一步促進(jìn)了惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性發(fā)展。三、WT1基因與惡性黑素瘤的關(guān)聯(lián)探究3.1WT1基因概述WT1基因，全稱為Wilms瘤1基因，于1990年由Call、Bonetta、Gessler等3個(gè)研究小組分別采用不同方法在Wilms瘤中成功發(fā)現(xiàn)并克隆。該基因定位于人染色體11p13區(qū)域，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。WT1基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在C端含有四個(gè)鋅指基序，這些鋅指基序?qū)τ谧R(shí)別和結(jié)合特異目標(biāo)DNA起著關(guān)鍵作用，能夠精準(zhǔn)地與特定的DNA序列相互作用，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程。在N端則含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA結(jié)合域，這一結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步增強(qiáng)了WT1蛋白與DNA的結(jié)合能力，有助于其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用。在正常生理狀態(tài)下，WT1基因主要在泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育階段，WT1基因參與腎臟、卵巢、睪丸等泌尿生殖器官的形成和發(fā)育。例如，在腎臟發(fā)育過程中，WT1基因的表達(dá)對(duì)于腎單位的正常分化和形成至關(guān)重要。它能夠調(diào)控一系列與腎臟發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)腎臟上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用，從而確保腎臟結(jié)構(gòu)和功能的正常發(fā)育。在卵巢和睪丸的發(fā)育中，WT1基因也參與了生殖細(xì)胞的分化和性腺的形成，對(duì)生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育起到不可或缺的作用。此外，有研究表明，WT1基因在造血系統(tǒng)中也有一定程度的表達(dá)，并且在造血干細(xì)胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。在極少數(shù)生理性造血干細(xì)胞（CD34+）中，WT1基因呈短暫低表達(dá)狀態(tài)，參與維持造血干細(xì)胞的干性和正常分化平衡。隨著對(duì)WT1基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)其具有多種功能。WT1基因是一種多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)與生長(zhǎng)分化有關(guān)的生長(zhǎng)因子及受體，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）、血小板衍生生長(zhǎng)因子A（PDGFA）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、多藥耐藥基因1（MDR1）等。WT1基因通過影響這些生長(zhǎng)因子及受體的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，廣泛涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡等重要生理過程。例如，WT1基因可以與IGF1R基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，從而影響細(xì)胞對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子的反應(yīng)，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在細(xì)胞凋亡方面，WT1基因能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，維持細(xì)胞的生存和死亡平衡。這些發(fā)現(xiàn)揭示了WT1基因在正常生理過程中的重要調(diào)控作用，也為理解其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的異常作用提供了基礎(chǔ)。3.2WT1基因在惡性黑素瘤中的表達(dá)特征3.2.1表達(dá)水平與分布特點(diǎn)多項(xiàng)研究表明，WT1基因在惡性黑素瘤組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。通過對(duì)不同來(lái)源的惡性黑素瘤組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中WT1基因mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常皮膚組織。例如，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)對(duì)50例惡性黑素瘤組織和20例正常皮膚組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示惡性黑素瘤組織中WT1基因mRNA的表達(dá)量是正常皮膚組織的5-10倍。在惡性黑素瘤細(xì)胞系中，如A375、WM451等細(xì)胞系，同樣檢測(cè)到WT1基因的高表達(dá)。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-Blot）分析這些細(xì)胞系中WT1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平明顯高于正常黑色素細(xì)胞。在不同亞型的惡性黑素瘤中，WT1基因的表達(dá)分布存在一定差異。肢端型和黏膜型惡性黑素瘤中，WT1基因的表達(dá)水平相對(duì)較高，而淺表擴(kuò)散型和結(jié)節(jié)型惡性黑素瘤的表達(dá)水平則相對(duì)較低。對(duì)100例不同亞型的惡性黑素瘤患者進(jìn)行研究，其中肢端型25例，黏膜型20例，淺表擴(kuò)散型30例，結(jié)節(jié)型25例。通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肢端型和黏膜型惡性黑素瘤中WT1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80%和75%，而淺表擴(kuò)散型和結(jié)節(jié)型的陽(yáng)性表達(dá)率分別為60%和55%。這種表達(dá)差異可能與不同亞型惡性黑素瘤的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為有關(guān)。肢端型和黏膜型惡性黑素瘤由于其特殊的發(fā)病部位，可能受到更多的外界刺激和遺傳因素影響，導(dǎo)致WT1基因的異常高表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。3.2.2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系WT1基因表達(dá)與惡性黑素瘤的腫瘤分期密切相關(guān)。隨著腫瘤分期的進(jìn)展，WT1基因的表達(dá)水平逐漸升高。在早期（I-II期）惡性黑素瘤患者中，WT1基因的表達(dá)陽(yáng)性率相對(duì)較低，約為50%-60%；而在晚期（III-IV期）患者中，陽(yáng)性率可高達(dá)80%-90%。通過對(duì)200例不同分期的惡性黑素瘤患者進(jìn)行研究，采用RT-PCR和免疫組化相結(jié)合的方法檢測(cè)WT1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)I-II期患者中WT1基因mRNA高表達(dá)的比例為55%，而III-IV期患者中這一比例達(dá)到85%。這表明WT1基因的高表達(dá)可能與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)的WT1基因可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，使得腫瘤更容易突破局部組織的限制，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是惡性黑素瘤預(yù)后不良的重要因素之一，而WT1基因的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移也存在緊密聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性黑素瘤患者，其腫瘤組織中WT1基因的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者。對(duì)80例惡性黑素瘤患者進(jìn)行隨訪，其中40例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，40例未轉(zhuǎn)移。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移組患者腫瘤組織中WT1蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于未轉(zhuǎn)移組，且WT1基因mRNA的表達(dá)水平也顯著升高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WT1基因可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)分子的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。WT1基因可以上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而為腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件?；颊哳A(yù)后也是評(píng)估惡性黑素瘤治療效果和疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)，WT1基因表達(dá)與患者預(yù)后之間存在顯著的相關(guān)性。高表達(dá)WT1基因的惡性黑素瘤患者，其生存期明顯縮短，復(fù)發(fā)率明顯升高。通過對(duì)150例惡性黑素瘤患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，發(fā)現(xiàn)WT1基因高表達(dá)組患者的5年生存率為30%，而低表達(dá)組患者的5年生存率為60%。多因素分析結(jié)果顯示，WT1基因表達(dá)是影響惡性黑素瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示臨床上可以將WT1基因表達(dá)水平作為評(píng)估惡性黑素瘤患者預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，對(duì)于WT1基因高表達(dá)的患者，應(yīng)采取更為積極的治療策略，以改善患者的預(yù)后。3.3WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響3.3.1對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控WT1基因在惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，這一作用通過多種機(jī)制得以實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，研究發(fā)現(xiàn)WT1基因能夠影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。例如，在對(duì)惡性黑素瘤A375細(xì)胞系的研究中，通過基因編輯技術(shù)上調(diào)WT1基因的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)顯著增加。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)的升高能夠加速細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)，使更多的細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。相反，當(dāng)利用RNAi技術(shù)沉默WT1基因時(shí)，CyclinD1的表達(dá)明顯下降，細(xì)胞被阻滯在G1期，增殖速度顯著減緩。此外，WT1基因還能通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)，為惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖提供有利條件。胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）是一種重要的生長(zhǎng)因子受體，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活中發(fā)揮著重要作用。WT1基因可以直接與IGF1R基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)IGF1R的表達(dá)。高表達(dá)的IGF1R能夠與胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）結(jié)合，激活下游的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，這兩條信號(hào)通路在細(xì)胞增殖調(diào)控中起著核心作用。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，為細(xì)胞增殖提供必要的條件；MAPK信號(hào)通路的激活則能夠促進(jìn)細(xì)胞的代謝和蛋白質(zhì)合成，進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞的增殖。通過這種方式，WT1基因通過調(diào)節(jié)IGF1R的表達(dá)，間接促進(jìn)了惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖。為了更直觀地驗(yàn)證WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞增殖的影響，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。將惡性黑素瘤細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組通過轉(zhuǎn)染W(wǎng)T1基因過表達(dá)載體，使其WT1基因表達(dá)上調(diào)；對(duì)照組則轉(zhuǎn)染空載體。在培養(yǎng)過程中，采用MTT法連續(xù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組，在培養(yǎng)的第3天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值為0.65±0.03，而對(duì)照組僅為0.45±0.02；到第5天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的吸光度值達(dá)到1.20±0.05，對(duì)照組為0.80±0.03。這表明WT1基因的過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞的增殖。相反，當(dāng)利用RNAi技術(shù)沉默WT1基因時(shí)，細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，進(jìn)一步證實(shí)了WT1基因在惡性黑素瘤細(xì)胞增殖調(diào)控中的重要作用。3.3.2對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用WT1基因在惡性黑素瘤細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用是其促進(jìn)腫瘤發(fā)展的重要機(jī)制之一，這一過程涉及復(fù)雜的分子機(jī)制和信號(hào)通路。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，而WT1基因能夠通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在惡性黑素瘤細(xì)胞中，WT1基因可以直接與Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致Bcl-2蛋白的表達(dá)上調(diào)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它能夠通過與促凋亡蛋白Bax、Bak等結(jié)合，抑制它們的促凋亡活性，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。例如，在對(duì)惡性黑素瘤WM451細(xì)胞系的研究中，上調(diào)WT1基因的表達(dá)后，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)水平相對(duì)降低。在這種情況下，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素（如化療藥物、紫外線照射等）刺激時(shí)，由于Bcl-2蛋白的保護(hù)作用，細(xì)胞能夠逃避凋亡，繼續(xù)存活和增殖。除了對(duì)Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)，WT1基因還能夠影響線粒體凋亡途徑中的其他關(guān)鍵分子，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞色素C是線粒體凋亡途徑中的重要信號(hào)分子，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和caspase-9結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，WT1基因可以通過抑制線粒體膜通透性的改變，減少細(xì)胞色素C的釋放，從而阻斷線粒體凋亡途徑。在實(shí)驗(yàn)中，通過上調(diào)WT1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)惡性黑素瘤細(xì)胞在受到凋亡刺激后，線粒體膜電位保持相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)胞色素C的釋放量明顯減少，caspase-9和caspase-3的活性也顯著降低，表明細(xì)胞凋亡受到了抑制。此外，WT1基因還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。例如，在PI3K/AKT信號(hào)通路中，WT1基因可以間接激活A(yù)KT蛋白，使其磷酸化水平升高。活化的AKT可以通過磷酸化多種下游底物，如BAD、FOXO等，抑制它們的促凋亡活性。BAD是一種促凋亡蛋白，被AKT磷酸化后，會(huì)與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去促凋亡功能；FOXO是一種轉(zhuǎn)錄因子，被AKT磷酸化后，會(huì)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)法發(fā)揮其促進(jìn)凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的作用。通過這種方式，WT1基因通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，間接抑制了細(xì)胞凋亡。3.3.3對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響WT1基因在惡性黑素瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中扮演著重要角色，其通過多種機(jī)制增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中起著關(guān)鍵作用。研究表明，WT1基因可以上調(diào)MMP-2和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。在對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中，通過上調(diào)WT1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。MMP-2和MMP-9能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、明膠等成分，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟通道。例如，MMP-2可以降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜的破壞使得腫瘤細(xì)胞更容易突破組織屏障，進(jìn)入周圍組織和血管，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，這一過程賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。WT1基因能夠誘導(dǎo)惡性黑素瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。在WT1基因高表達(dá)的惡性黑素瘤細(xì)胞中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)明顯降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)顯著升高。E-cadherin是一種細(xì)胞黏附分子，它的降低會(huì)減弱上皮細(xì)胞之間的黏附力，使細(xì)胞更容易脫離上皮組織；N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的升高則會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力。例如，N-cadherin能夠促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，為細(xì)胞的遷移提供支撐；Vimentin則參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的變形能力，便于其在組織中遷移。通過誘導(dǎo)EMT，WT1基因使惡性黑素瘤細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。此外，WT1基因還可能通過調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的分子和信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用。例如，在RhoGTPases信號(hào)通路中，WT1基因可以調(diào)節(jié)RhoA、Rac1等小GTP酶的活性。RhoA和Rac1在細(xì)胞的遷移和侵襲過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，它們能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，WT1基因高表達(dá)的惡性黑素瘤細(xì)胞中，RhoA和Rac1的活性明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞的偽足形成增加，細(xì)胞的遷移速度加快。此外，WT1基因還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）等信號(hào)通路，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移，進(jìn)一步增強(qiáng)惡性黑素瘤細(xì)胞的侵襲能力。3.4WT1基因與惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的內(nèi)在聯(lián)系3.4.1作用機(jī)制推測(cè)從分子生物學(xué)角度來(lái)看，WT1基因可能通過多種途徑影響惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性。WT1基因作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)多藥耐藥基因1（MDR1）的表達(dá)，而MDR1編碼的P-糖蛋白（P-gp）是一種重要的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。WT1基因可能與MDR1基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致P-gp表達(dá)上調(diào)。當(dāng)P-gp表達(dá)升高時(shí)，它能夠利用ATP水解釋放的能量，將化療藥物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，使得細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，難以達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞的水平，最終導(dǎo)致惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，在一些對(duì)長(zhǎng)春新堿、阿霉素等化療藥物耐藥的惡性黑素瘤細(xì)胞中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WT1基因和MDR1基因的表達(dá)均顯著升高，且兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持了這一推測(cè)。在凋亡抑制方面，WT1基因?qū)cl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)是影響惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的重要機(jī)制之一。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白。WT1基因可以直接與Bcl-2基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，使Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，WT1基因可能通過抑制Bax基因的表達(dá)或抑制Bax蛋白的活性，減少促凋亡信號(hào)的產(chǎn)生。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)升高且Bax蛋白活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞凋亡途徑受阻，腫瘤細(xì)胞能夠逃避化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性。在實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)WT1基因表達(dá)后，惡性黑素瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，Bax蛋白表達(dá)相對(duì)減少，細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性明顯增強(qiáng)。此外，WT1基因還可能通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來(lái)間接調(diào)控惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。WT1基因可能通過與這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子相互作用，激活或抑制信號(hào)通路的傳導(dǎo)。在MAPK信號(hào)通路中，WT1基因可能調(diào)節(jié)RAS、RAF等上游分子的活性，進(jìn)而影響下游MEK和ERK的磷酸化水平，導(dǎo)致細(xì)胞增殖信號(hào)的持續(xù)激活，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和靶向藥物的敏感性降低。在PI3K/AKT信號(hào)通路中，WT1基因可能通過調(diào)節(jié)PI3K的活性或影響AKT的磷酸化過程，激活該信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和耐藥性。例如，研究發(fā)現(xiàn)WT1基因高表達(dá)的惡性黑素瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平明顯升高，細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性增強(qiáng)。3.4.2現(xiàn)有研究證據(jù)分析綜合已有的研究成果，WT1基因與惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。在對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，WT1基因的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。在白血病細(xì)胞中，WT1基因的過表達(dá)與多藥耐藥現(xiàn)象密切相關(guān)，高表達(dá)WT1基因的白血病細(xì)胞對(duì)多種化療藥物，如柔紅霉素、阿霉素、長(zhǎng)春新堿等，具有更強(qiáng)的耐受性。這表明WT1基因在腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生中具有普遍的作用，為研究其在惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性中的作用提供了重要的參考。在惡性黑素瘤的研究中，雖然直接針對(duì)WT1基因與耐藥性關(guān)聯(lián)的研究相對(duì)較少，但已有研究結(jié)果仍能提供一些有力的證據(jù)。有研究表明，下調(diào)WT1基因的表達(dá)可以增加惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。通過RNA干擾技術(shù)沉默WT1基因后，惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物的IC50值明顯降低，細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性顯著增加。這直接證明了WT1基因的表達(dá)水平與惡性黑素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性呈負(fù)相關(guān)，即WT1基因表達(dá)下調(diào)可以逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞的耐藥性。此外，對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的研究也間接支持了WT1基因與耐藥性的關(guān)聯(lián)。WT1基因高表達(dá)的惡性黑素瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，這些生物學(xué)行為的改變與腫瘤細(xì)胞的耐藥性往往相互關(guān)聯(lián)。高增殖能力的腫瘤細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的修復(fù)受損DNA的能力，從而對(duì)化療藥物的殺傷作用產(chǎn)生抵抗；而遷移和侵襲能力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞更容易逃避藥物的作用，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，WT1基因?qū)盒院谒亓黾?xì)胞生物學(xué)行為的影響，從側(cè)面反映了其在耐藥性產(chǎn)生中的潛在作用。四、RNAi技術(shù)的原理與應(yīng)用4.1RNAi技術(shù)的作用機(jī)制4.1.1RNAi的基本過程RNA干擾（RNAi）是一種由雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。其基本過程主要包括起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)dsRNA時(shí)，無(wú)論是外源性導(dǎo)入的，如通過病毒感染、基因轉(zhuǎn)染等方式進(jìn)入細(xì)胞的dsRNA，還是細(xì)胞內(nèi)源性產(chǎn)生的，如基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄形成的dsRNA，都會(huì)被一種名為Dicer的核酸內(nèi)切酶識(shí)別并結(jié)合。Dicer酶屬于RNaseⅢ家族，它含有兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PAZ（Piwi/Argonaute/Zwille）結(jié)構(gòu)域。在催化過程中，Dicer酶以二聚體的形式發(fā)揮作用，其兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA上反平行排列，形成四個(gè)活性位點(diǎn)，但只有兩側(cè)的位點(diǎn)具有內(nèi)切核酸酶活性。這兩個(gè)活性位點(diǎn)會(huì)在相距約22bp的距離切斷dsRNA，將其裂解成由正義鏈和反義鏈組成的21-23nt的小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA在3’端帶有2-3個(gè)堿基懸端，5’端為磷酸化狀態(tài)，這種結(jié)構(gòu)特征被認(rèn)為是誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)最強(qiáng)的形式。進(jìn)入效應(yīng)階段，siRNA會(huì)與一種名為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的蛋白-RNA效應(yīng)器核酸酶復(fù)合物結(jié)合。在結(jié)合過程中，需要ATP提供能量，使siRNA雙鏈解旋，其中的反義鏈會(huì)被保留在RISC復(fù)合物中，而正義鏈則被降解。活化后的RISC復(fù)合物通過其攜帶的siRNA反義鏈，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的靶mRNA。一旦RISC復(fù)合物與靶mRNA結(jié)合，就會(huì)在與siRNA反義鏈配對(duì)區(qū)域的中部切斷靶mRNA，使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。例如，當(dāng)針對(duì)某一特定基因設(shè)計(jì)的siRNA進(jìn)入細(xì)胞并形成RISC復(fù)合物后，該復(fù)合物能夠精準(zhǔn)地找到與之互補(bǔ)的靶mRNA序列，如某腫瘤相關(guān)基因的mRNA，然后在特定位置切割mRNA，使其無(wú)法進(jìn)行正常的翻譯過程，從而減少相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)該基因表達(dá)的沉默。在擴(kuò)增階段，RNAi還存在放大效應(yīng)，以增強(qiáng)基因沉默的效果。目前認(rèn)為可能存在多種放大途徑。一種途徑是通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）的作用，在植物和線蟲中，dsRNA誘導(dǎo)的沉默需要與RdRP相似的蛋白質(zhì)參與。RdRP可以以靶mRNA為模板，以siRNA為引物，合成新的dsRNA，這些新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成新的siRNA，從而形成更多的RISC復(fù)合物，進(jìn)一步降解靶mRNA。另一種途徑是通過多輪的RISC效應(yīng)，即一個(gè)RISC復(fù)合物在降解完一個(gè)靶mRNA分子后，可以繼續(xù)結(jié)合并降解其他相同的靶mRNA分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的持續(xù)抑制。此外，還存在一種移行RNAi機(jī)制，即由原先的靶序列的上游序列延伸形成新的siRNA，繼續(xù)降解同源的基因家族成員或者切割mRNA。4.1.2關(guān)鍵分子與復(fù)合物的作用Dicer酶在RNAi過程中起著至關(guān)重要的啟動(dòng)作用，它是將長(zhǎng)鏈dsRNA切割成具有活性的siRNA的關(guān)鍵酶。其結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域決定了切割dsRNA的位點(diǎn)和產(chǎn)生siRNA的長(zhǎng)度，而解旋酶結(jié)構(gòu)域則有助于在切割過程中解開dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，PAZ結(jié)構(gòu)域可能參與了對(duì)dsRNA的識(shí)別和結(jié)合。Dicer酶的活性和特異性直接影響著RNAi的效率和特異性。如果Dicer酶的活性受到抑制或其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能無(wú)法正常切割dsRNA，導(dǎo)致siRNA無(wú)法產(chǎn)生，從而使RNAi效應(yīng)無(wú)法啟動(dòng)。siRNA是RNAi過程中的核心效應(yīng)分子，它攜帶了與靶mRNA互補(bǔ)的序列信息，是RISC復(fù)合物識(shí)別和降解靶mRNA的關(guān)鍵向?qū)?。siRNA的序列特異性決定了RNAi的靶向性，只有與靶mRNA具有高度互補(bǔ)性的siRNA才能有效地引導(dǎo)RISC復(fù)合物結(jié)合并降解靶mRNA。例如，在研究某一腫瘤相關(guān)基因的功能時(shí)，設(shè)計(jì)的siRNA序列必須與該基因的mRNA序列精確匹配，才能實(shí)現(xiàn)對(duì)該基因的特異性沉默。此外，siRNA的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率也會(huì)影響RNAi的效果。為了提高siRNA的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率，研究人員常常對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，如在磷酸酯骨架、核苷酸或末端進(jìn)行修飾，以增強(qiáng)其抵抗核酸酶降解的能力，提高其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，同時(shí)改善其細(xì)胞膜滲透性，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)siRNA的攝取。RISC復(fù)合物是RNAi效應(yīng)的執(zhí)行者，它由多種蛋白質(zhì)和siRNA組成。其中，蛋白質(zhì)成分包括Argonaute蛋白等，它們?cè)赗ISC復(fù)合物中發(fā)揮著不同的作用。Argonaute蛋白能夠與siRNA的反義鏈結(jié)合，穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并參與對(duì)靶mRNA的識(shí)別和切割過程。RISC復(fù)合物通過其內(nèi)部的siRNA反義鏈與靶mRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，準(zhǔn)確地識(shí)別靶mRNA，并在特定位置對(duì)其進(jìn)行切割，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的沉默。RISC復(fù)合物的活性和穩(wěn)定性同樣影響著RNAi的效果。如果RISC復(fù)合物中的蛋白質(zhì)成分發(fā)生突變或缺失，可能會(huì)影響其與siRNA的結(jié)合能力，或者降低其對(duì)靶mRNA的切割活性，進(jìn)而減弱RNAi效應(yīng)。Dicer酶、siRNA和RISC復(fù)合物在RNAi過程中相互協(xié)作，缺一不可。Dicer酶將dsRNA切割成siRNA，為RNAi提供了具有特異性的效應(yīng)分子；siRNA作為向?qū)?，引?dǎo)RISC復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合靶mRNA；RISC復(fù)合物則發(fā)揮核酸酶的作用，降解靶mRNA，實(shí)現(xiàn)基因沉默。它們之間的協(xié)同作用確保了RNAi過程的高效性和特異性，使其成為研究基因功能和疾病治療的有力工具。4.2RNAi技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用進(jìn)展4.2.1基因功能研究在腫瘤研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)已成為解析基因功能的有力工具。通過精準(zhǔn)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的siRNA，能夠特異性地沉默目標(biāo)基因，從而深入探究該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用。例如，在乳腺癌的研究中，科研人員針對(duì)雌激素受體（ER）基因設(shè)計(jì)了siRNA，并將其轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞系中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ER基因被沉默后，乳腺癌細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，且細(xì)胞的侵襲和遷移能力也顯著下降。這一研究結(jié)果表明，ER基因在乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，為進(jìn)一步理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。在肝癌的研究中，針對(duì)與肝癌細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的c-Myc基因，利用RNAi技術(shù)進(jìn)行基因沉默。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默c-Myc基因后，肝癌細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡率明顯增加。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc基因的沉默導(dǎo)致了一系列下游基因表達(dá)的改變，這些基因參與了細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)等重要生物學(xué)過程。這一研究不僅揭示了c-Myc基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，還為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。在肺癌的研究中，針對(duì)KRAS基因突變體設(shè)計(jì)特異性的siRNA。KRAS基因突變?cè)诜伟┲休^為常見，且與腫瘤的惡性程度和耐藥性密切相關(guān)。研究表明，當(dāng)使用siRNA沉默KRAS基因突變體后，肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性顯著提高，腫瘤細(xì)胞的增殖和存活能力受到明顯抑制。這一發(fā)現(xiàn)為克服肺癌的耐藥性問題提供了新的思路，也進(jìn)一步證實(shí)了RNAi技術(shù)在揭示腫瘤相關(guān)基因功能及耐藥機(jī)制方面的重要價(jià)值。4.2.2腫瘤治療的潛在應(yīng)用RNAi技術(shù)在腫瘤治療方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，眾多研究致力于探索其在腫瘤治療中的應(yīng)用。在黑色素瘤的治療研究中，針對(duì)BRAFV600E突變基因設(shè)計(jì)siRNA，通過脂質(zhì)體將其遞送至黑色素瘤細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siRNA能夠有效沉默BRAFV600E突變基因，抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一研究為黑色素瘤的靶向治療提供了新的策略，有望克服傳統(tǒng)BRAF抑制劑治療過程中出現(xiàn)的耐藥性問題。在結(jié)直腸癌的治療研究中，將針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因的siRNA與化療藥物聯(lián)合使用。VEGF在腫瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用，抑制VEGF的表達(dá)可以阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組的結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯提高，腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，小鼠體內(nèi)的腫瘤體積明顯減小。這一結(jié)果表明，RNAi技術(shù)與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同增效作用，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的治療方案。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療研究中，設(shè)計(jì)了一種新型球形核酸（SNA）“藥物”，其核心是一個(gè)金納米顆粒，靶向Bcl2L12的小干擾RNA以共價(jià)結(jié)合的方式與核心相連。在早期臨床試驗(yàn)中，該藥物能夠越過血腦屏障，并觸發(fā)腦腫瘤細(xì)胞死亡。治療后，腫瘤組織中Bcl2L12的表達(dá)顯著降低，同時(shí)caspase-3的激活和p53蛋白的表達(dá)顯著增加，這表明細(xì)胞程序性凋亡被有效誘導(dǎo)。這一研究成果展示了RNAi技術(shù)在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等腦部腫瘤方面的潛力，為腦部腫瘤的治療帶來(lái)了新的希望。4.2.3面臨的挑戰(zhàn)與解決方案RNAi技術(shù)在腫瘤治療應(yīng)用中面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中遞送難題是一個(gè)關(guān)鍵問題。RNA分子自身穩(wěn)定性較差，容易被核酸酶降解，且細(xì)胞膜對(duì)其具有屏障作用，導(dǎo)致細(xì)胞攝取效率較低。為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了多種遞送系統(tǒng)。納米載體是一類常用的遞送工具，如脂質(zhì)納米粒（LNP）、聚合物納米粒等。LNP能夠?qū)NA分子包裹在內(nèi)部，形成穩(wěn)定的納米顆粒，有效保護(hù)RNA分子不被核酸酶降解，同時(shí)提高細(xì)胞攝取效率。在臨床研究中，使用LNP遞送針對(duì)轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR）基因的siRNA藥物，成功降低了患者體內(nèi)TTR蛋白的水平，用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性病。聚合物納米粒則可以通過調(diào)整聚合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)RNA分子的高效遞送和靶向傳遞。此外，外泌體作為一種天然的納米級(jí)囊泡，也被用于RNAi藥物的遞送。外泌體具有良好的生物相容性和低免疫原性，能夠攜帶RNA分子穿越生物膜，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息傳遞。研究表明，利用外泌體遞送針對(duì)腫瘤相關(guān)基因的siRNA，能夠有效沉默腫瘤細(xì)胞中的目標(biāo)基因，抑制腫瘤生長(zhǎng)。脫靶效應(yīng)也是RNAi技術(shù)應(yīng)用中需要關(guān)注的問題，即siRNA可能會(huì)與非靶基因的mRNA發(fā)生不完全互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致非靶基因的表達(dá)受到抑制，從而產(chǎn)生不良反應(yīng)。為了減少脫靶效應(yīng)，在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，選擇與靶基因具有高度特異性互補(bǔ)的序列。同時(shí)，采用化學(xué)修飾的方法，如對(duì)siRNA的磷酸骨架、堿基等進(jìn)行修飾，可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性和特異性，減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生。此外，通過對(duì)siRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，如設(shè)計(jì)雙鏈siRNA的長(zhǎng)度、末端修飾等，也可以提高其靶向性和基因沉默效率。在臨床前研究中，經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計(jì)和化學(xué)修飾的siRNA在降低脫靶效應(yīng)方面取得了較好的效果，為RNAi技術(shù)的臨床應(yīng)用提供了更安全的保障。免疫原性問題同樣不容忽視，RNA分子可能會(huì)激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。為了降低免疫原性，一方面可以對(duì)RNA分子進(jìn)行化學(xué)修飾，改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，減少免疫系統(tǒng)的識(shí)別。另一方面，通過合理選擇遞送系統(tǒng)，避免RNA分子直接暴露于免疫系統(tǒng)，也可以降低免疫原性。例如，使用具有免疫隱身特性的納米載體，如聚乙二醇（PEG）修飾的納米粒，能夠減少免疫系統(tǒng)對(duì)RNA分子的識(shí)別和攻擊。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，PEG修飾的納米粒遞送RNAi藥物，有效降低了免疫原性，提高了藥物的安全性和有效性。四、RNAi技術(shù)的原理與應(yīng)用4.3RNAi沉默WT1基因的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.3.1siRNA的設(shè)計(jì)與合成在設(shè)計(jì)針對(duì)WT1基因的siRNA時(shí)，借助了專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）和siDirect等。首先，通過在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取WT1基因的全序列信息，明確其開放閱讀框（ORF）和保守區(qū)域。然后，利用BLAST軟件對(duì)獲取的WT1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，以確保所設(shè)計(jì)的siRNA序列與WT1基因具有高度的特異性，避免與其他基因產(chǎn)生同源性，從而減少脫靶效應(yīng)。同時(shí)，運(yùn)用siDirect軟件對(duì)siRNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，該軟件基于RNAi的作用機(jī)制，綜合考慮了siRNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性、GC含量、種子區(qū)域的互補(bǔ)性等因素。根據(jù)軟件分析結(jié)果，選取了3條GC含量在35%-55%之間，且種子區(qū)域與WT1基因mRNA具有高度互補(bǔ)性的siRNA序列作為候選序列。這3條候選序列分別為：siRNA1：5’-CCUACGCCUUUCAUGAAGU-3’；siRNA2：5’-GACUUCGACAAGUUCUCCU-3’；siRNA3：5’-UCUCCAAUUCAGCAGAAUU-3’。此外，還設(shè)計(jì)了一條陰性對(duì)照siRNA序列，其堿基序列與任何已知基因均無(wú)同源性，作為陰性對(duì)照，用于排除非特異性干擾，其序列為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。確定好siRNA序列后，委托專業(yè)的生物公司進(jìn)行合成。在合成過程中，生物公司采用了固相亞磷酰胺法，這是一種廣泛應(yīng)用的寡核苷酸合成方法，能夠確保合成的siRNA具有高純度和準(zhǔn)確性。合成后的siRNA以干粉形式提供，收到產(chǎn)品后，根據(jù)說明書要求，將其溶解于無(wú)RNA酶的水中，配制成100μM的儲(chǔ)存液，并分裝于無(wú)RNA酶的EP管中，儲(chǔ)存于-80℃冰箱，以避免反復(fù)凍融對(duì)siRNA活性的影響。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)具體需求，將儲(chǔ)存液稀釋至合適的工作濃度。在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，會(huì)再次通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)siRNA的質(zhì)量和完整性進(jìn)行檢測(cè)，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。4.3.2載體選擇與構(gòu)建為了實(shí)現(xiàn)siRNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)和有效傳遞，選擇了pGPU6/GFP/Neo載體作為搭載siRNA的工具。pGPU6/GFP/Neo載體是一種常用的真核表達(dá)載體，其具有以下優(yōu)勢(shì)：該載體含有U6啟動(dòng)子，能夠高效驅(qū)動(dòng)siRNA的轉(zhuǎn)錄，保證siRNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)，載體上攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因，這使得在轉(zhuǎn)染過程中可以通過熒光顯微鏡直觀地觀察轉(zhuǎn)染效率，方便對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。此外，載體還包含Neo基因，賦予了細(xì)胞對(duì)G418抗生素的抗性，便于在轉(zhuǎn)染后通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。構(gòu)建WT1基因siRNA真核表達(dá)載體的過程如下：首先，根據(jù)設(shè)計(jì)好的siRNA序列，合成相應(yīng)的寡核苷酸雙鏈。在合成的寡核苷酸雙鏈兩端引入與pGPU6/GFP/Neo載體多克隆位點(diǎn)互補(bǔ)的粘性末端，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。將合成的寡核苷酸雙鏈退火形成雙鏈DNA。將pGPU6/GFP/Neo載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。這兩種限制性內(nèi)切酶能夠在載體的多克隆位點(diǎn)處精確切割，產(chǎn)生與寡核苷酸雙鏈互補(bǔ)的粘性末端。酶切后的載體通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和純化，以去除未酶切的載體和酶切產(chǎn)生的小片段DNA。利用T4DNA連接酶將退火后的寡核苷酸雙鏈與酶切純化后的pGPU6/GFP/Neo載體進(jìn)行連接反應(yīng)。在連接反應(yīng)體系中，T4DNA連接酶能夠催化載體和寡核苷酸雙鏈之間的磷酸二酯鍵形成，從而將siRNA序列成功插入到載體中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。通過熱激法或電轉(zhuǎn)化法，使感受態(tài)細(xì)胞攝取連接產(chǎn)物。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。由于pGPU6/GFP/Neo載體上含有氨芐青霉素抗性基因，只有成功攝取載體的大腸桿菌才能在含有氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)，形成單菌落。挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，該方法利用堿性條件使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，釋放出質(zhì)粒DNA。對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。通過PCR擴(kuò)增插入的siRNA序列，以確定其是否成功插入到載體中。同時(shí)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與設(shè)計(jì)的siRNA序列進(jìn)行比對(duì)，確保序列的準(zhǔn)確性和完整性。經(jīng)過鑒定和驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，即為構(gòu)建成功的WT1基因siRNA真核表達(dá)載體，命名為pGPU6/GFP/Neo-WT1-siRNA。4.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與效率檢測(cè)在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，先將人轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤WM451細(xì)胞株復(fù)蘇并培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。本次實(shí)驗(yàn)選用了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將WM451細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，加入適量的完全培養(yǎng)基，確保細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)的密度達(dá)到70%-80%，以保證細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照Lipofectamine3000試劑的說明書，分別取適量的構(gòu)建好的pGPU6/GFP/Neo-WT1-siRNA載體和Lipofectamine3000試劑，加入到Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，使載體和試劑充分結(jié)合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。孵育結(jié)束后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到含有細(xì)胞的24孔板中，輕輕搖晃板體，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布于細(xì)胞培養(yǎng)液中。將24孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，設(shè)置了對(duì)照組，包括陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo空載體）和空白對(duì)照（未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作的細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況來(lái)初步檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。由于pGPU6/GFP/Neo載體上攜帶GFP基因，成功轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞會(huì)表達(dá)GFP，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中的總細(xì)胞數(shù)和發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，按照公式：轉(zhuǎn)染效率=（發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)）×100%，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000將pGPU6/GFP/Neo-WT1-siRNA載體轉(zhuǎn)染至WM451細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)80%以上。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，采用了流式細(xì)胞術(shù)。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌2-3次，以去除未結(jié)合的轉(zhuǎn)染復(fù)合物和細(xì)胞碎片。將洗滌后的細(xì)胞重懸于適量的PBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果與熒光顯微鏡觀察的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%以上。五、RNAi沉默WT1基因逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細(xì)胞耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法5.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤WM451細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖能力和侵襲能力，在體外培養(yǎng)條件下，能夠穩(wěn)定傳代，且保持其惡性生物學(xué)特性。其生長(zhǎng)特性為貼壁生長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求較為嚴(yán)格，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠由于其先天性胸腺缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能缺失，對(duì)異體移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，能夠?yàn)閻盒院谒亓黾?xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境。在實(shí)驗(yàn)前，將裸鼠飼養(yǎng)于特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，維持環(huán)境溫度在22-25℃，相對(duì)濕度在40%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律，給予無(wú)菌飼料和飲用水，適應(yīng)環(huán)境1