絲素蛋白對(duì)可注射磷酸鈣骨水泥性能優(yōu)化及細(xì)胞相容性的深度探究一、引言1.1研究背景與意義骨科疾病和創(chuàng)傷是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康與生活質(zhì)量的重要因素。隨著人口老齡化進(jìn)程的加速以及交通事故、運(yùn)動(dòng)損傷等意外事件的頻發(fā)，骨折、骨缺損、骨質(zhì)疏松性骨折等骨科病癥的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢(shì)。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增骨折患者數(shù)以千萬(wàn)計(jì)，其中相當(dāng)一部分患者需要接受手術(shù)治療以恢復(fù)骨骼的結(jié)構(gòu)和功能。在骨科手術(shù)領(lǐng)域，骨水泥作為一種關(guān)鍵的醫(yī)用材料，發(fā)揮著不可或缺的重要作用。骨水泥是一種用于骨科手術(shù)的醫(yī)用材料，因其部分物理性質(zhì)以及凝固后外觀和性狀頗像建筑用的白水泥，故而得名。在關(guān)節(jié)置換手術(shù)中，如髖關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)置換，骨水泥能夠?qū)⑷斯りP(guān)節(jié)牢固地固定在骨骼上，確保關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性和耐久性，使患者能夠恢復(fù)正常的關(guān)節(jié)功能，提高生活質(zhì)量；在脊柱手術(shù)中，骨水泥可用于椎體成形術(shù)，通過(guò)向病變椎體內(nèi)注入骨水泥，能夠有效地強(qiáng)化椎體，緩解患者的疼痛癥狀，尤其適用于骨質(zhì)疏松性椎體骨折的治療，幫助患者盡快恢復(fù)活動(dòng)能力；在骨折治療中，對(duì)于一些復(fù)雜的骨折或骨缺損情況，骨水泥也可作為填充材料，促進(jìn)骨折的愈合。在眾多骨水泥材料中，可注射磷酸鈣骨水泥（CalciumPhosphateCement，CPC）憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)受到了廣泛關(guān)注。CPC主要由固相成分、液相成分和添加劑組成，固相成分一般由兩種及以上的粉末狀磷酸鈣鹽混合而成，液相成分可為生理鹽水、稀磷酸等，添加劑則用于促進(jìn)凝固、提高強(qiáng)度等。CPC具有良好的生物相容性，能夠與人體組織和諧共處，減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生；具有優(yōu)異的生物降解性，在體內(nèi)能夠逐漸被吸收代謝，不會(huì)長(zhǎng)期殘留對(duì)人體造成潛在危害；還具備引導(dǎo)成骨活性，植入人體后可參與新陳代謝，通過(guò)骨傳導(dǎo)作用引導(dǎo)新骨生成，為骨缺損的修復(fù)提供了有利條件，非常有利于骨缺損的微創(chuàng)治療。然而，CPC自身也存在一些固有的缺點(diǎn)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。例如，CPC的抗壓強(qiáng)度較低，難以滿(mǎn)足一些對(duì)骨骼強(qiáng)度要求較高部位的修復(fù)需求，在承受較大壓力時(shí)容易發(fā)生變形或破裂；其脆性較大，在受到外力沖擊時(shí)容易斷裂，影響修復(fù)效果；固化時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間，增加患者的痛苦和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。這些不足在一定程度上限制了CPC在骨科臨床治療中的應(yīng)用范圍和效果，亟待通過(guò)改性研究來(lái)加以改善。絲素蛋白（SilkFibroin，SF）作為一種天然的生物材料，近年來(lái)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種蛋白質(zhì)，具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。它擁有優(yōu)異的生物相容性，能夠與細(xì)胞和組織良好地相互作用，為細(xì)胞的黏附、增殖和分化提供適宜的微環(huán)境；具有良好的可降解性，其降解產(chǎn)物對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，且降解速率可以通過(guò)一定的方法進(jìn)行調(diào)控，以滿(mǎn)足不同組織修復(fù)的時(shí)間需求；還具備良好的機(jī)械性能，能夠在一定程度上增強(qiáng)材料的強(qiáng)度和韌性?；诮z素蛋白的這些優(yōu)點(diǎn)，將其引入可注射磷酸鈣骨水泥中，有望通過(guò)兩者的協(xié)同作用，有效改善磷酸鈣骨水泥的性能。一方面，絲素蛋白可以增強(qiáng)磷酸鈣骨水泥的抗壓強(qiáng)度，使其能夠更好地承受外力，滿(mǎn)足臨床對(duì)骨骼強(qiáng)度的要求；另一方面，能夠降低其脆性，提高材料的抗沖擊能力，減少在使用過(guò)程中發(fā)生斷裂的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)，還可能對(duì)磷酸鈣骨水泥的固化時(shí)間產(chǎn)生積極影響，使其固化時(shí)間更加適宜手術(shù)操作。此外，研究絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的細(xì)胞相容性也具有至關(guān)重要的意義。細(xì)胞相容性是評(píng)價(jià)生物材料能否安全、有效地應(yīng)用于人體的關(guān)鍵指標(biāo)之一，良好的細(xì)胞相容性能夠確保材料不會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和功能產(chǎn)生不良影響，為后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究致力于深入探究絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能及細(xì)胞相容性，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，通過(guò)研究絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間的相互作用機(jī)制，能夠進(jìn)一步豐富生物材料學(xué)的理論知識(shí)，為開(kāi)發(fā)新型的骨修復(fù)材料提供理論依據(jù)；在實(shí)際應(yīng)用方面，若能成功制備出性能優(yōu)良、細(xì)胞相容性好的絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥，將為骨科臨床治療提供一種更為理想的骨修復(fù)材料，有助于提高手術(shù)成功率，促進(jìn)患者的康復(fù)，減輕患者的痛苦和社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)，具有廣闊的應(yīng)用前景。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀可注射磷酸鈣骨水泥（CPC）的研究始于20世紀(jì)80年代，最初由Brown和Chow首次合成，此后，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞CPC的性能改進(jìn)和臨床應(yīng)用展開(kāi)了廣泛而深入的研究。早期研究主要聚焦于CPC的基本性能優(yōu)化，如調(diào)節(jié)其固化時(shí)間、提高抗壓強(qiáng)度等。隨著研究的不斷深入，改性研究成為了提升CPC性能的關(guān)鍵方向。在國(guó)外，美國(guó)、日本、德國(guó)等國(guó)家在生物材料領(lǐng)域一直處于領(lǐng)先地位，對(duì)CPC的改性研究也成果豐碩。美國(guó)的一些研究團(tuán)隊(duì)致力于開(kāi)發(fā)新型的添加劑來(lái)改善CPC的性能，通過(guò)添加特定的生物活性分子，不僅增強(qiáng)了CPC的骨誘導(dǎo)性，還提高了其與周?chē)M織的整合能力。日本的學(xué)者則側(cè)重于從材料的微觀結(jié)構(gòu)入手，通過(guò)精細(xì)調(diào)控CPC的晶體結(jié)構(gòu)和孔隙率，成功提高了其力學(xué)性能和生物降解性能。德國(guó)的研究人員在CPC的臨床應(yīng)用研究方面表現(xiàn)突出，他們通過(guò)大量的臨床試驗(yàn)，深入評(píng)估了CPC在不同骨科手術(shù)中的安全性和有效性，為CPC的臨床推廣提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。國(guó)內(nèi)對(duì)CPC的研究起步相對(duì)較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校，如清華大學(xué)、上海交通大學(xué)、四川大學(xué)等，在CPC的改性研究和應(yīng)用探索方面取得了一系列重要成果。國(guó)內(nèi)學(xué)者一方面積極借鑒國(guó)外的先進(jìn)研究經(jīng)驗(yàn)，另一方面結(jié)合我國(guó)的實(shí)際需求和資源優(yōu)勢(shì)，開(kāi)展了具有創(chuàng)新性的研究工作。通過(guò)產(chǎn)學(xué)研緊密合作，國(guó)內(nèi)在CPC的產(chǎn)業(yè)化方面也取得了顯著進(jìn)展，部分國(guó)產(chǎn)CPC產(chǎn)品已成功進(jìn)入市場(chǎng)，為我國(guó)骨科臨床治療提供了更多的選擇。絲素蛋白作為一種天然的生物材料，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也日益受到關(guān)注。國(guó)外對(duì)絲素蛋白的研究歷史悠久，從最初對(duì)絲素蛋白結(jié)構(gòu)和性能的基礎(chǔ)研究，逐漸拓展到其在藥物緩釋、組織工程、傷口愈合等多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。美國(guó)和日本的研究團(tuán)隊(duì)在絲素蛋白材料的制備技術(shù)和應(yīng)用開(kāi)發(fā)方面處于國(guó)際前沿水平，他們通過(guò)先進(jìn)的材料加工技術(shù)，制備出了各種形式的絲素蛋白材料，如絲素蛋白膜、絲素蛋白支架、絲素蛋白微球等，并對(duì)其性能和應(yīng)用效果進(jìn)行了深入研究。國(guó)內(nèi)對(duì)絲素蛋白的研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。我國(guó)是絲綢生產(chǎn)大國(guó)，擁有豐富的蠶絲資源，這為絲素蛋白的研究和開(kāi)發(fā)提供了得天獨(dú)厚的條件。國(guó)內(nèi)研究人員在絲素蛋白的提取、純化技術(shù)方面進(jìn)行了大量的優(yōu)化工作，提高了絲素蛋白的質(zhì)量和產(chǎn)量。在應(yīng)用研究方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者在絲素蛋白與其他生物材料的復(fù)合改性方面取得了眾多創(chuàng)新性成果，通過(guò)將絲素蛋白與不同的生物材料復(fù)合，制備出了一系列性能優(yōu)異的復(fù)合材料，為絲素蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。將絲素蛋白引入可注射磷酸鈣骨水泥的研究是近年來(lái)生物材料領(lǐng)域的一個(gè)新興研究方向。國(guó)內(nèi)外的研究表明，絲素蛋白的加入能夠顯著改善CPC的性能。干旻峰等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，隨著絲素蛋白含量的增加，SF/CPC的抗壓強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)絲素蛋白含量達(dá)3%時(shí)抗壓強(qiáng)度反而降低。還有研究表明，絲素蛋白可以降低CPC的脆性，提高其韌性，使材料在受到外力沖擊時(shí)更不容易斷裂。同時(shí)，絲素蛋白的添加還能夠在一定程度上縮短CPC的固化時(shí)間，使其更符合手術(shù)操作的時(shí)間要求。在細(xì)胞相容性研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了大量的工作。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)絲素蛋白增強(qiáng)的CPC復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性，能夠支持細(xì)胞的黏附、增殖和分化，不會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生不良影響。然而，目前該領(lǐng)域的研究仍存在一些不足之處。雖然對(duì)絲素蛋白增強(qiáng)CPC的性能和細(xì)胞相容性有了一定的認(rèn)識(shí)，但對(duì)于絲素蛋白與CPC之間的相互作用機(jī)制尚未完全明確，這限制了對(duì)材料性能的進(jìn)一步優(yōu)化和調(diào)控。在實(shí)際應(yīng)用研究方面，相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床研究還相對(duì)較少，需要進(jìn)一步開(kāi)展深入的研究，以驗(yàn)證材料在體內(nèi)的安全性和有效性，為其臨床應(yīng)用提供更充分的依據(jù)。1.3研究?jī)?nèi)容與方法本研究將圍繞絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能及細(xì)胞相容性展開(kāi)，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和測(cè)試分析，深入探究絲素蛋白對(duì)骨水泥性能的影響機(jī)制以及材料的細(xì)胞相容性，具體研究?jī)?nèi)容與方法如下：1.3.1絲素蛋白的提取與表征采用經(jīng)典的脫膠、溶解、透析等方法從蠶絲中提取絲素蛋白。將蠶絲浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液中，在95℃條件下煮沸60分鐘進(jìn)行脫膠處理，以去除絲膠蛋白。隨后，將脫膠后的蠶絲溶解于溴化鋰溶液中，在60℃條件下攪拌6小時(shí)，使其充分溶解。將所得溶液裝入透析袋中，用去離子水透析72小時(shí)，每隔4小時(shí)更換一次透析液，以去除雜質(zhì)和小分子物質(zhì)。最后，將透析后的絲素蛋白溶液冷凍干燥，得到絲素蛋白固體。采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析絲素蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定其特征官能團(tuán)；利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察絲素蛋白的微觀形態(tài)，了解其表面形貌和顆粒大小；通過(guò)熱重分析（TGA）測(cè)試絲素蛋白的熱穩(wěn)定性，獲取其熱分解溫度和熱失重曲線(xiàn)。1.3.2絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的制備按照一定比例將提取的絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥的固相成分（如磷酸四鈣、磷酸氫鈣等）充分混合，采用機(jī)械攪拌和超聲分散相結(jié)合的方法，以確保絲素蛋白在固相中均勻分布。將固相成分與液相成分（如生理鹽水、稀磷酸等）按照不同的液固比進(jìn)行混合，在37℃、100%濕度的模擬體液環(huán)境下，攪拌均勻后迅速注入特定模具中，制備出不同絲素蛋白含量和液固比的絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥試件。具體設(shè)計(jì)如下：設(shè)置絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%（對(duì)照組）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下分別設(shè)置液固比為0.350、0.375、0.400、0.425、0.450、0.475，每種組合制備5個(gè)試件，共計(jì)210個(gè)試件，以全面探究絲素蛋白含量和液固比對(duì)骨水泥性能的影響。1.3.3絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能測(cè)試使用生物力學(xué)測(cè)試儀對(duì)制備好的骨水泥試件進(jìn)行抗壓強(qiáng)度測(cè)試。將試件放置在生物力學(xué)測(cè)試儀的加載平臺(tái)上，以0.5mm/min的加載速率進(jìn)行加載，直至試件破壞，記錄破壞時(shí)的最大載荷，并根據(jù)試件的尺寸計(jì)算抗壓強(qiáng)度。采用維卡針凝固時(shí)間測(cè)定儀測(cè)定骨水泥的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間。將骨水泥漿體倒入特定模具中，將維卡針垂直插入漿體表面，每隔一定時(shí)間記錄維卡針的下沉深度，當(dāng)維卡針下沉深度達(dá)到一定值時(shí)，記錄此時(shí)的時(shí)間為初凝時(shí)間；當(dāng)維卡針無(wú)法下沉?xí)r，記錄此時(shí)的時(shí)間為終凝時(shí)間。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察骨水泥固化后的微觀結(jié)構(gòu)，分析絲素蛋白的加入對(duì)骨水泥微觀形貌、孔隙結(jié)構(gòu)和晶體形態(tài)的影響。通過(guò)能譜分析（EDS）確定骨水泥中元素的組成和分布，進(jìn)一步了解絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間的相互作用。采用X射線(xiàn)衍射（XRD）分析骨水泥固化后的物相組成，研究絲素蛋白對(duì)磷酸鈣骨水泥水化產(chǎn)物的影響，明確其在骨水泥固化過(guò)程中的作用機(jī)制。1.3.4絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的細(xì)胞相容性研究應(yīng)用密度梯度離心法從人骨髓中分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs），將骨髓樣本與密度梯度離心液混合，在2000r/min的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，吸取中間層的單核細(xì)胞層，將其接種于含有條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hBMSCs的表面標(biāo)記，如CD29、CD44、CD105、CD34、CD45等，以鑒定細(xì)胞的純度和特性。采用浸提法制備絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥及純磷酸鈣骨水泥的浸提液。將骨水泥試件放入含有細(xì)胞培養(yǎng)液的離心管中，在37℃的搖床上振蕩72小時(shí)，使骨水泥中的成分充分溶解到培養(yǎng)液中，然后將浸提液過(guò)濾除菌，得到浸提液備用。用MTT法測(cè)定浸提液培養(yǎng)hBMSCs的活力。將hBMSCs以1×10?個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同組別的浸提液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)1天、3天、5天、7天后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后吸出上清液，加入150μL的DMSO溶液，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算相對(duì)增值率并進(jìn)行毒性分級(jí)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)浸提液培養(yǎng)的hBMSCs第4天的細(xì)胞周期及倍體情況。將細(xì)胞收集后，用70%的乙醇固定，然后加入碘化丙啶（PI）染液，在暗處孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的比例以及倍體情況，分析骨水泥浸提液對(duì)細(xì)胞周期的影響。通過(guò)掃描電鏡（SEM）觀察絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料與hBMSCs共培養(yǎng)后第1天、3天、5天、7天細(xì)胞的粘附及增殖情況。將細(xì)胞接種在骨水泥復(fù)合材料表面，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，用戊二醛固定，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金處理后，用掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)、分布和生長(zhǎng)情況。1.3.5數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，明確絲素蛋白含量和液固比對(duì)骨水泥性能的影響規(guī)律，以及絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥與hBMSCs的細(xì)胞相容性情況，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。二、絲素蛋白與可注射磷酸鈣骨水泥概述2.1絲素蛋白特性與應(yīng)用絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種天然高分子纖維蛋白，在家蠶吐出的蠶絲中，絲素蛋白含量約占70%-80%，其余部分主要為絲膠蛋白以及少量的雜質(zhì)。蠶絲作為一種天然的生物材料，具有悠久的應(yīng)用歷史，最初主要應(yīng)用于紡織領(lǐng)域，用于制作絲綢等高檔紡織品。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和對(duì)絲素蛋白研究的深入，其在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力逐漸被發(fā)掘。從蠶絲中提取絲素蛋白的方法多種多樣，目前常用的方法主要包括化學(xué)法、酶解法以及二者結(jié)合的方法?；瘜W(xué)法中，經(jīng)典的工藝是將蠶絲首先浸泡在碳酸鈉溶液中進(jìn)行脫膠處理，一般使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%左右的碳酸鈉溶液，在95℃左右的溫度下煮沸60分鐘左右，這樣可以有效去除包裹在絲素蛋白外面的絲膠蛋白。脫膠后的蠶絲再溶解于特定的溶劑中，如溴化鋰溶液，在60℃條件下攪拌6小時(shí)左右，使其充分溶解。隨后，通過(guò)透析的方法去除溶液中的雜質(zhì)和小分子物質(zhì)，將所得溶液裝入透析袋中，用去離子水透析72小時(shí)左右，每隔4小時(shí)更換一次透析液，最后將透析后的絲素蛋白溶液冷凍干燥，即可得到絲素蛋白固體。酶解法是利用特定的酶，如絲膠酶，在溫和的條件下催化絲膠蛋白的水解，從而實(shí)現(xiàn)絲素蛋白與絲膠蛋白的分離。酶解法具有反應(yīng)條件溫和、對(duì)絲素蛋白結(jié)構(gòu)破壞小等優(yōu)點(diǎn)，但酶的成本較高，且反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。將化學(xué)法和酶解法相結(jié)合，可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高絲素蛋白的提取效率和質(zhì)量。先采用化學(xué)法進(jìn)行初步脫膠，去除大部分絲膠蛋白，再利用酶解法進(jìn)行精細(xì)處理，進(jìn)一步提高絲素蛋白的純度和質(zhì)量。絲素蛋白具有諸多優(yōu)異的特性，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在力學(xué)性能方面，絲素蛋白具有良好的強(qiáng)度和韌性。其分子結(jié)構(gòu)中存在結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，結(jié)晶區(qū)賦予了絲素蛋白較高的強(qiáng)度，使其能夠承受一定的外力而不發(fā)生斷裂；非結(jié)晶區(qū)則提供了良好的柔韌性和彈性，使絲素蛋白在受到外力拉伸時(shí)能夠發(fā)生一定程度的形變而不斷裂。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得絲素蛋白的力學(xué)性能與人體軟組織相近，非常適合用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的組織修復(fù)和再生。例如，在制備人工韌帶等軟組織修復(fù)材料時(shí)，絲素蛋白的力學(xué)性能能夠滿(mǎn)足韌帶在體內(nèi)的力學(xué)需求，為韌帶的修復(fù)和再生提供良好的支撐。絲素蛋白具有出色的生物相容性。它與人體組織具有良好的親和性，不易引起免疫反應(yīng)。絲素蛋白中富含的氨基酸組成與人體蛋白質(zhì)的氨基酸組成有一定的相似性，這使得它能夠與人體細(xì)胞和組織良好地相互作用，為細(xì)胞的黏附、增殖和分化提供適宜的微環(huán)境。相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，將細(xì)胞接種在絲素蛋白材料表面，細(xì)胞能夠正常地黏附、鋪展，并呈現(xiàn)出良好的增殖和分化狀態(tài)，證明了絲素蛋白對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能沒(méi)有不良影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將絲素蛋白材料植入動(dòng)物體內(nèi)，周?chē)M織對(duì)其反應(yīng)較小，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和免疫排斥現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證了絲素蛋白的良好生物相容性。絲素蛋白還具有良好的可降解性，在人體內(nèi)能夠被逐漸降解和吸收，降解時(shí)間可以通過(guò)一定的方法進(jìn)行調(diào)控。其降解過(guò)程主要是通過(guò)體內(nèi)的酶解作用和水解作用，降解產(chǎn)物為氨基酸和小分子多肽，這些產(chǎn)物能夠被人體細(xì)胞吸收利用，參與新陳代謝，不會(huì)對(duì)人體造成毒副作用。通過(guò)改變絲素蛋白的分子結(jié)構(gòu)、制備工藝以及添加適當(dāng)?shù)奶砑觿┑确绞剑梢哉{(diào)節(jié)其降解速率，以滿(mǎn)足不同組織修復(fù)的時(shí)間需求。在骨組織修復(fù)中，希望材料的降解速度與新骨的生長(zhǎng)速度相匹配，通過(guò)對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改性處理，可以使其降解時(shí)間延長(zhǎng)，從而為骨組織的修復(fù)提供足夠的時(shí)間；在軟組織修復(fù)中，根據(jù)組織的愈合時(shí)間，可適當(dāng)調(diào)整絲素蛋白的降解速率，使其在組織修復(fù)完成后及時(shí)降解吸收。由于絲素蛋白具備上述優(yōu)良特性，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在組織工程領(lǐng)域，絲素蛋白可作為理想的支架材料，為細(xì)胞的生長(zhǎng)和組織的再生提供三維空間結(jié)構(gòu)。例如，在骨組織工程中，制備的絲素蛋白基骨支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，能夠支持成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化，促進(jìn)新骨的形成。研究人員通過(guò)3D打印技術(shù)，將絲素蛋白與其他生物材料復(fù)合，制備出具有個(gè)性化結(jié)構(gòu)的骨支架，能夠更好地匹配骨缺損部位的形狀和力學(xué)需求，提高骨修復(fù)的效果。在血管組織工程中，利用絲素蛋白制備的血管支架具有良好的生物相容性和柔韌性，能夠模擬天然血管的結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管的再生。絲素蛋白還可用于制備藥物載體，實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢釋放和靶向輸送。絲素蛋白具有良好的可塑性，可以通過(guò)多種方法將藥物包裹在其內(nèi)部或表面，形成納米粒、微球、水凝膠等不同形式的藥物載體。這些藥物載體能夠有效地控制藥物的釋放速度，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，提高藥物的療效。將抗癌藥物包裹在絲素蛋白納米粒中，通過(guò)表面修飾使其能夠靶向腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的精準(zhǔn)治療，減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。在藥物釋放過(guò)程中，絲素蛋白的降解特性可以使藥物逐漸釋放出來(lái)，維持藥物在體內(nèi)的有效濃度，提高治療效果。在傷口愈合領(lǐng)域，絲素蛋白制成的醫(yī)用敷料具有良好的生物相容性、生物可降解性以及透氣性和吸水性，可為創(chuàng)口提供濕潤(rùn)的環(huán)境，促進(jìn)傷口快速愈合，并避免感染的發(fā)生。絲素蛋白敷料能夠吸收傷口滲出液，保持傷口的清潔，同時(shí)其釋放的氨基酸和小分子多肽具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織修復(fù)的作用，加速傷口的愈合過(guò)程。臨床研究表明，使用絲素蛋白敷料治療傷口，能夠顯著縮短傷口的愈合時(shí)間，減少疤痕的形成，提高患者的康復(fù)質(zhì)量。2.2可注射磷酸鈣骨水泥特點(diǎn)與不足可注射磷酸鈣骨水泥（CPC）作為一種新型的骨修復(fù)材料，在骨科臨床治療中展現(xiàn)出諸多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也存在一些有待改進(jìn)的不足之處。CPC的主要成分與人體骨骼的礦物質(zhì)組成極為相似，主要由磷酸鈣鹽構(gòu)成，如磷酸四鈣（TTCP）、磷酸氫鈣（DCPA）、磷酸二氫鈣（DCPD）等，這些成分使得CPC具有出色的生物活性和生物相容性。當(dāng)CPC植入人體后，能夠與周?chē)M織發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成化學(xué)鍵合，實(shí)現(xiàn)良好的骨整合，促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)和修復(fù)。研究表明，CPC在體內(nèi)能夠逐漸降解，其降解產(chǎn)物可以參與人體的新陳代謝過(guò)程，為新骨的形成提供鈣、磷等重要元素，從而引導(dǎo)自然骨向內(nèi)生長(zhǎng)和重塑。CPC具有自固化能力，其固化機(jī)制是基于溶解-水化沉淀反應(yīng)。在生理?xiàng)l件下，當(dāng)CPC的固相成分與液相成分混合后，首先發(fā)生溶解過(guò)程，磷酸鈣鹽在液相中逐漸溶解，釋放出鈣離子和磷酸根離子。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，這些離子在一定的pH值條件下（通常為4.2-11范圍內(nèi)）發(fā)生水化沉淀反應(yīng)，生成羥基磷灰石（HA）晶體。在初始階段，HA的生成主要由表面反應(yīng)控制，顆粒間和顆粒表面生成的HA加強(qiáng)了顆粒間的連接，HA晶體的含量越大，接觸點(diǎn)就越多，抗壓強(qiáng)度也隨之增加。在水化反應(yīng)后期，顆粒表面被一層HA包覆，CPC的水化反應(yīng)則變成了透過(guò)水化反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散控制。隨著水化反應(yīng)的不斷進(jìn)行，生成的HA顆粒越來(lái)越多，HA晶體不斷長(zhǎng)大，水化產(chǎn)物逐漸填充了參與反應(yīng)的水的空間，使得之前被水占據(jù)的空間被HA晶體分割成不規(guī)則的毛細(xì)孔，凝膠孔增多，孔隙尺寸不斷減少，HA晶體交錯(cuò)橋接，顆粒之間的結(jié)合強(qiáng)度不斷增加，骨水泥材料則固化為堅(jiān)固的、含有大量孔隙的多孔結(jié)構(gòu)，從而表現(xiàn)出宏觀的固化強(qiáng)度。這種自固化特性使得CPC在臨床應(yīng)用中具有很大的便利性，醫(yī)生可以在手術(shù)過(guò)程中根據(jù)骨缺損的具體形狀和大小，將未固化的CPC漿體直接注射到缺損部位，使其在體內(nèi)原位固化，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨缺損的精確修復(fù)，避免了傳統(tǒng)骨修復(fù)材料需要預(yù)先塑形的繁瑣過(guò)程。CPC還具有良好的可塑性，在固化前，CPC呈可流動(dòng)的漿體狀態(tài)，能夠填充各種形狀和大小的骨缺損部位，與骨組織緊密貼合，為骨修復(fù)提供良好的支撐。其固化時(shí)間可以通過(guò)調(diào)整固相和液相的組成、比例以及添加適當(dāng)?shù)奶砑觿┑确绞竭M(jìn)行調(diào)節(jié)，以滿(mǎn)足不同手術(shù)的時(shí)間要求。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變磷酸鈣鹽的種類(lèi)和比例，可以有效地調(diào)節(jié)CPC的固化時(shí)間，如增加TTCP的含量可以縮短固化時(shí)間，而增加DCPA的含量則會(huì)延長(zhǎng)固化時(shí)間。添加一些生物活性添加劑，如檸檬酸、海藻酸鈉等，也能夠?qū)PC的固化時(shí)間和性能產(chǎn)生影響，檸檬酸可以延長(zhǎng)CPC的固化時(shí)間，同時(shí)提高其抗壓強(qiáng)度和生物活性；海藻酸鈉則可以改善CPC的可塑性和成型性，使其更易于注射和填充。盡管CPC具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但其也存在一些明顯的不足，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。CPC的力學(xué)性能相對(duì)較弱，尤其是抗壓強(qiáng)度和韌性方面，難以滿(mǎn)足一些對(duì)骨骼強(qiáng)度要求較高部位的修復(fù)需求，如承重骨的修復(fù)。CPC的抗壓強(qiáng)度一般在10-50MPa之間，遠(yuǎn)低于人體皮質(zhì)骨的抗壓強(qiáng)度（100-200MPa），在承受較大壓力時(shí)容易發(fā)生變形或破裂，影響修復(fù)效果。相關(guān)研究表明，CPC的脆性較大，其斷裂韌性較低，在受到外力沖擊時(shí)容易斷裂，這使得CPC在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性。CPC的固化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，通常需要15-60分鐘才能完全固化，這會(huì)延長(zhǎng)手術(shù)時(shí)間，增加患者的痛苦和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。較長(zhǎng)的固化時(shí)間也可能導(dǎo)致CPC在固化過(guò)程中受到外界因素的影響，如患者的移動(dòng)、血液和組織液的浸潤(rùn)等，從而影響其固化效果和性能。CPC在固化過(guò)程中會(huì)發(fā)生體積收縮，這可能導(dǎo)致其與骨組織之間出現(xiàn)間隙，影響骨整合效果，降低骨修復(fù)的穩(wěn)定性。CPC的降解速度與新骨的生長(zhǎng)速度難以精確匹配。如果降解速度過(guò)快，可能在新骨尚未完全形成時(shí)材料就已大部分降解，無(wú)法為骨修復(fù)提供持續(xù)的支撐；而如果降解速度過(guò)慢，則可能會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng)期殘留，影響新骨的正常生長(zhǎng)和重塑。如何精確調(diào)控CPC的降解速度，使其與新骨生長(zhǎng)速度相適應(yīng)，是目前研究的難點(diǎn)之一。三、絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本研究選用的材料均具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中使用的磷酸四鈣（TTCP）和無(wú)水磷酸氫鈣（DCPA）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，二者作為磷酸鈣骨水泥的主要固相成分，其純度均大于99%。TTCP為白色粉末狀，晶體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠提供充足的鈣離子；DCPA同樣為白色粉末，具有良好的溶解性，在與TTCP混合后，能在液相環(huán)境中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成羥基磷灰石（HA），為骨水泥的固化和強(qiáng)度提供基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)選用的絲素蛋白由實(shí)驗(yàn)室自主提取，提取自?xún)?yōu)質(zhì)家蠶絲。將家蠶絲纖維首先浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的碳酸鈉溶液中，在95℃條件下煮沸60分鐘進(jìn)行脫膠處理，去除絲膠蛋白。然后將脫膠后的蠶絲溶解于CaCl?-CH?CH?OH-H?O（摩爾比1：2：8）三元溶液中，在60℃條件下攪拌6小時(shí)，使其充分溶解。將所得溶液裝入透析袋中，用去離子水透析72小時(shí)，每隔4小時(shí)更換一次透析液，以去除雜質(zhì)和小分子物質(zhì)。最后將透析后的絲素蛋白溶液冷凍干燥，得到絲素蛋白粉末。固化液為自制的含有4wt%羥基磷灰石晶種的生理鹽水溶液，用于引發(fā)磷酸鈣骨水泥的固化反應(yīng)，其中生理鹽水提供液相環(huán)境，羥基磷灰石晶種則能加速固化過(guò)程，提高骨水泥的早期強(qiáng)度。在絲素蛋白/磷酸鈣骨水泥制備過(guò)程中，首先將TTCP和DCPA按照等摩爾比進(jìn)行精確稱(chēng)量，放入球磨機(jī)中，以300r/min的轉(zhuǎn)速球磨混合2小時(shí)，確保兩種成分均勻混合。按照0.5wt%、1.0wt%、1.5wt%、2.0wt%、2.5wt%、3.0wt%的質(zhì)量比例，將提取的絲素蛋白粉末分別加入到上述混合好的磷酸鈣固相粉末中。為了使絲素蛋白與磷酸鈣固相充分混合，采用機(jī)械攪拌和超聲分散相結(jié)合的方法。先在機(jī)械攪拌器中以200r/min的轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘，初步混合均勻；然后將混合物轉(zhuǎn)移至超聲清洗器中，在功率為200W的條件下超聲分散20分鐘，進(jìn)一步確保絲素蛋白在固相中均勻分布。將含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)絲素蛋白的磷酸鈣固相粉末與固化液按照液固比0.400ml/g進(jìn)行混合。在模擬體液（37±0.5℃、100%濕度）環(huán)境下，使用玻璃棒以100r/min的轉(zhuǎn)速攪拌2分鐘，使其迅速混合均勻，形成均勻的漿體。將混合好的漿體迅速注入到尺寸為Ф6mm×12mm的圓柱形模具中，輕輕振動(dòng)模具，排除內(nèi)部氣泡，然后將模具放置在37℃、100%濕度的恒溫恒濕箱中養(yǎng)護(hù)24小時(shí)，使骨水泥充分固化。對(duì)于不同液固比的實(shí)驗(yàn)，選取含2.0wt%絲素蛋白的磷酸鈣固相與固化液，按照液固比分別為0.350、0.375、0.400、0.425、0.450、0.475進(jìn)行混合，重復(fù)上述攪拌、注入模具和養(yǎng)護(hù)過(guò)程，制備出不同液固比的絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥試件。抗壓強(qiáng)度測(cè)試采用Instron5966型生物力學(xué)測(cè)試儀，該測(cè)試儀精度高，能夠準(zhǔn)確測(cè)量材料在壓力作用下的力學(xué)性能。將養(yǎng)護(hù)好的骨水泥試件從模具中小心取出，用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量試件的直徑和高度，測(cè)量三次取平均值，以計(jì)算試件的橫截面積。將試件放置在生物力學(xué)測(cè)試儀的加載平臺(tái)中心位置，確保試件與加載頭垂直，以避免偏心加載影響測(cè)試結(jié)果。設(shè)置加載速率為0.5mm/min，緩慢施加壓力，直至試件破壞。儀器自動(dòng)記錄試件破壞時(shí)的最大載荷F（N），根據(jù)公式σ=F/S（其中σ為抗壓強(qiáng)度，MPa；S為試件橫截面積，mm2）計(jì)算出試件的抗壓強(qiáng)度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)平行試件，以減小實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。凝固時(shí)間測(cè)試采用維卡針凝固時(shí)間測(cè)定儀，該儀器能夠準(zhǔn)確測(cè)定骨水泥的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間。將制備好的骨水泥漿體迅速倒入內(nèi)徑為Ф30mm、高為50mm的圓柱形玻璃模具中，輕輕振動(dòng)模具，使?jié){體表面平整。將維卡針垂直安裝在測(cè)定儀上，調(diào)整維卡針的位置，使其針尖剛好接觸骨水泥漿體表面。每隔30秒，將維卡針緩慢垂直插入漿體中，插入深度為25mm，然后輕輕提起維卡針。觀察并記錄維卡針在漿體中留下的針痕情況，當(dāng)針痕直徑大于1mm時(shí)，記錄此時(shí)的時(shí)間為初凝時(shí)間；當(dāng)維卡針插入漿體后，針痕直徑小于1mm，且維卡針無(wú)法繼續(xù)下沉?xí)r，記錄此時(shí)的時(shí)間為終凝時(shí)間。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組同樣設(shè)置5個(gè)平行試件，取平均值作為該組的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間。利用掃描電子顯微鏡（SEM，型號(hào)為HitachiS-4800）觀察骨水泥固化后的微觀結(jié)構(gòu)。將養(yǎng)護(hù)24小時(shí)后的骨水泥試件小心取出，用手術(shù)刀將其切成小塊，大小約為5mm×5mm×5mm。將切好的試件放入真空冷凍干燥機(jī)中，在-50℃、10?3Pa的條件下干燥24小時(shí)，以去除試件中的水分。將干燥后的試件用導(dǎo)電膠固定在樣品臺(tái)上，放入離子濺射儀中，在氬氣氛圍下，以15mA的電流噴金處理5分鐘，使試件表面形成一層均勻的金膜，以提高樣品的導(dǎo)電性。將噴金后的試件放入SEM中，在加速電壓為15kV的條件下，觀察骨水泥的微觀形貌、孔隙結(jié)構(gòu)和晶體形態(tài)。通過(guò)SEM圖像分析，了解絲素蛋白的加入對(duì)骨水泥微觀結(jié)構(gòu)的影響。采用能譜分析（EDS，與SEM配套使用）確定骨水泥中元素的組成和分布。在SEM觀察過(guò)程中，選擇具有代表性的區(qū)域，利用EDS對(duì)該區(qū)域進(jìn)行元素分析。EDS能夠檢測(cè)出骨水泥中鈣、磷、氧、硅等元素的含量，并通過(guò)Mapping功能，直觀地展示元素在骨水泥中的分布情況。通過(guò)EDS分析，進(jìn)一步了解絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間的相互作用，以及絲素蛋白的加入對(duì)骨水泥元素組成和分布的影響。使用X射線(xiàn)衍射儀（XRD，型號(hào)為BrukerD8Advance）分析骨水泥固化后的物相組成。將養(yǎng)護(hù)24小時(shí)后的骨水泥試件研磨成粉末狀，過(guò)200目篩，以獲得均勻的樣品。將粉末樣品均勻地鋪在樣品臺(tái)上，放入XRD中。設(shè)置XRD的工作條件：Cu靶，Kα輻射，管電壓40kV，管電流40mA，掃描范圍2θ為10°-80°，掃描速度為5°/min。XRD采集到的衍射數(shù)據(jù)通過(guò)專(zhuān)門(mén)的分析軟件（如HighScorePlus）進(jìn)行處理和分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PDF卡片，確定骨水泥中各物相的種類(lèi)和含量。通過(guò)XRD分析，研究絲素蛋白對(duì)磷酸鈣骨水泥水化產(chǎn)物的影響，明確其在骨水泥固化過(guò)程中的作用機(jī)制。3.2不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)性能影響在模擬體液（37±0.5℃、100%濕度）環(huán)境下，對(duì)不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸鈣骨水泥性能進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果具有重要的研究?jī)r(jià)值。從抗壓強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果來(lái)看，隨著絲素蛋白含量的逐漸增加，絲素蛋白/磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）的抗壓強(qiáng)度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。當(dāng)絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0%（對(duì)照組）開(kāi)始逐漸增加時(shí)，SF/CPC的抗壓強(qiáng)度逐漸增大。這是因?yàn)榻z素蛋白具有良好的力學(xué)性能，其分子結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶區(qū)賦予了材料較高的強(qiáng)度，非結(jié)晶區(qū)則提供了柔韌性和彈性。當(dāng)絲素蛋白加入到磷酸鈣骨水泥中后，能夠與磷酸鈣晶體相互交織，形成一種類(lèi)似于“鋼筋混凝土”的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了骨水泥的抗壓強(qiáng)度。當(dāng)絲素蛋白含量達(dá)到3%時(shí)，抗壓強(qiáng)度反而降低。這可能是由于絲素蛋白含量過(guò)高時(shí)，其在骨水泥中分散不均勻，導(dǎo)致部分區(qū)域絲素蛋白聚集，影響了骨水泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)的均勻性和穩(wěn)定性，從而降低了抗壓強(qiáng)度。對(duì)含1.0wt%、1.5wt%、2.0wt%、2.5wt%及3.0wt%絲素蛋白的SF/CPC與單純CPC進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），進(jìn)一步表明絲素蛋白的添加對(duì)骨水泥抗壓強(qiáng)度有顯著影響。圖1：不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SF/CPC抗壓強(qiáng)度在凝固時(shí)間方面，隨著絲素蛋白含量的增加，SF/CPC的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間均逐漸縮短（見(jiàn)圖2）。含1.0wt%、1.5wt%、2.0wt%、2.5wt%絲素蛋白的SF/CPC初凝時(shí)間與單純CPC比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；含0.5wt%、1.0wt%、1.5wt%、2.0wt%、2.5wt%絲素蛋白的SF/CPC終凝時(shí)間與單純CPC比較，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。絲素蛋白能夠縮短凝固時(shí)間的原因可能是其在骨水泥固化過(guò)程中起到了晶核的作用，促進(jìn)了磷酸鈣晶體的成核和生長(zhǎng)，從而加速了固化反應(yīng)的進(jìn)行。絲素蛋白與磷酸鈣之間可能存在一些相互作用，影響了固化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，使得固化時(shí)間縮短。圖2：不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SF/CPC凝固時(shí)間綜合考慮抗壓強(qiáng)度和凝固時(shí)間這兩個(gè)關(guān)鍵性能指標(biāo)，當(dāng)絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.0%-2.5%之間時(shí)，SF/CPC表現(xiàn)出較為優(yōu)異的性能。在這個(gè)范圍內(nèi)，骨水泥既具有較高的抗壓強(qiáng)度，能夠滿(mǎn)足一定的力學(xué)需求，又具有相對(duì)較短的凝固時(shí)間，有利于手術(shù)操作。在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)具體的臨床需求和手術(shù)場(chǎng)景，在這個(gè)范圍內(nèi)選擇合適的絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以制備出性能最佳的絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥。后續(xù)的研究可以進(jìn)一步探討在這個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)，絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間的微觀相互作用機(jī)制，以及如何通過(guò)優(yōu)化制備工藝等手段，進(jìn)一步提高骨水泥的性能。3.3不同液固比對(duì)性能影響在確定了絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)骨水泥性能的影響后，進(jìn)一步研究了不同液固比對(duì)含固定比例（2.0wt%）絲素蛋白骨水泥性能的影響，這對(duì)于優(yōu)化骨水泥的性能具有重要意義。從抗壓強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果來(lái)看，隨著液固比的降低，絲素蛋白/磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）的抗壓強(qiáng)度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（見(jiàn)圖3）。當(dāng)液固比從0.475逐漸降低時(shí)，骨水泥中的固相成分相對(duì)增多，液相成分相對(duì)減少，使得骨水泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加致密，顆粒之間的結(jié)合更加緊密，從而抗壓強(qiáng)度逐漸增大。當(dāng)液固比降低至0.350時(shí)，抗壓強(qiáng)度反而下降。這可能是因?yàn)橐汗瘫冗^(guò)低時(shí)，骨水泥的流動(dòng)性變差，在攪拌和成型過(guò)程中難以均勻混合，導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻，出現(xiàn)孔隙和缺陷，從而降低了抗壓強(qiáng)度。對(duì)不同液固比下的SF/CPC抗壓強(qiáng)度進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示不同液固比之間的抗壓強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），表明液固比對(duì)骨水泥的抗壓強(qiáng)度有顯著影響。圖3：不同液固比的含2.0wt%絲素蛋白的SF/CPC抗壓強(qiáng)度在凝固時(shí)間方面，隨著液固比的降低，SF/CPC的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間均逐漸縮短（見(jiàn)圖4）。液固比降低，固相成分增多，反應(yīng)活性位點(diǎn)增加，使得固化反應(yīng)速率加快，從而初凝時(shí)間和終凝時(shí)間縮短。對(duì)不同液固比下的SF/CPC初凝時(shí)間和終凝時(shí)間進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示不同液固比之間的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），說(shuō)明液固比對(duì)骨水泥的凝固時(shí)間有顯著影響。圖4：不同液固比的含2.0wt%絲素蛋白的SF/CPC凝固時(shí)間綜合考慮抗壓強(qiáng)度和凝固時(shí)間這兩個(gè)關(guān)鍵性能指標(biāo)，當(dāng)液固比在0.375-0.425之間時(shí)，含2.0wt%絲素蛋白的SF/CPC表現(xiàn)出較為優(yōu)異的性能。在這個(gè)液固比范圍內(nèi)，骨水泥既具有較高的抗壓強(qiáng)度，能夠滿(mǎn)足一定的力學(xué)需求，又具有相對(duì)較短的凝固時(shí)間，有利于手術(shù)操作。在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)具體的臨床需求和手術(shù)場(chǎng)景，在這個(gè)范圍內(nèi)選擇合適的液固比，以制備出性能最佳的絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥。后續(xù)的研究可以進(jìn)一步探討在這個(gè)液固比范圍內(nèi)，絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間的微觀相互作用機(jī)制，以及如何通過(guò)優(yōu)化制備工藝等手段，進(jìn)一步提高骨水泥的性能。3.4結(jié)果與討論從掃描電子顯微鏡（SEM）觀察到的微觀結(jié)構(gòu)來(lái)看，在未添加絲素蛋白的單純磷酸鈣骨水泥（CPC）中，其微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出較為疏松的狀態(tài)，晶體之間的連接相對(duì)較弱，存在較多較大的孔隙（見(jiàn)圖5a）。這是因?yàn)镃PC在固化過(guò)程中，主要依靠磷酸鈣鹽之間的化學(xué)反應(yīng)生成羥基磷灰石（HA）晶體來(lái)實(shí)現(xiàn)固化。由于缺乏有效的增強(qiáng)相，晶體之間的結(jié)合不夠緊密，導(dǎo)致材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)不夠致密，從而影響了其力學(xué)性能，使其抗壓強(qiáng)度較低，脆性較大。當(dāng)加入絲素蛋白后，絲素蛋白能夠與磷酸鈣晶體相互交織，形成一種更加緊密和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5b-f）。絲素蛋白具有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，其分子鏈上含有大量的氨基酸殘基，這些殘基能夠與磷酸鈣晶體表面的離子形成化學(xué)鍵或氫鍵，從而增強(qiáng)了絲素蛋白與磷酸鈣晶體之間的相互作用。隨著絲素蛋白含量的增加，更多的絲素蛋白分子與磷酸鈣晶體相互連接，形成了類(lèi)似于“網(wǎng)絡(luò)”的結(jié)構(gòu)，將磷酸鈣晶體緊密地束縛在一起。這種結(jié)構(gòu)有效地增強(qiáng)了骨水泥的內(nèi)部結(jié)合力，使得材料在受到外力作用時(shí)，能夠更好地分散應(yīng)力，從而提高了抗壓強(qiáng)度。當(dāng)絲素蛋白含量過(guò)高（如3.0wt%）時(shí)，絲素蛋白在骨水泥中出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象（見(jiàn)圖5f）。團(tuán)聚的絲素蛋白破壞了骨水泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)的均勻性，形成了應(yīng)力集中點(diǎn)，導(dǎo)致材料在受到外力時(shí)容易從這些薄弱部位發(fā)生破裂，從而降低了抗壓強(qiáng)度。圖5：不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SF/CPC微觀結(jié)構(gòu)（SEM圖像）從能譜分析（EDS）結(jié)果來(lái)看，絲素蛋白的加入并未改變骨水泥的主要元素組成，仍以鈣、磷、氧等元素為主。通過(guò)元素Mapping分析發(fā)現(xiàn)，絲素蛋白中的氮元素均勻分布在骨水泥中，進(jìn)一步證實(shí)了絲素蛋白在骨水泥中的均勻分散。這表明絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥之間沒(méi)有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而是通過(guò)物理相互作用相互結(jié)合。絲素蛋白的存在為骨水泥提供了額外的力學(xué)支撐，同時(shí)也改善了其微觀結(jié)構(gòu)，使得骨水泥的性能得到提升。在X射線(xiàn)衍射（XRD）分析中，未添加絲素蛋白的CPC和添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)絲素蛋白的SF/CPC在固化后的主要物相均為羥基磷灰石（HA）。這說(shuō)明絲素蛋白的加入并未改變磷酸鈣骨水泥的水化產(chǎn)物種類(lèi)。然而，通過(guò)對(duì)XRD圖譜中HA衍射峰強(qiáng)度和位置的分析發(fā)現(xiàn)，隨著絲素蛋白含量的增加，HA衍射峰的強(qiáng)度略有增強(qiáng)，且峰位向高角度方向有微小偏移。這可能是由于絲素蛋白的存在影響了磷酸鈣骨水泥的水化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。絲素蛋白與磷酸鈣晶體之間的相互作用，促進(jìn)了HA晶體的成核和生長(zhǎng)，使得HA晶體的結(jié)晶度提高，從而導(dǎo)致衍射峰強(qiáng)度增強(qiáng)。峰位的微小偏移則可能是由于絲素蛋白與HA晶體之間的相互作用，引起了HA晶體晶格常數(shù)的微小變化。對(duì)于不同液固比的含2.0wt%絲素蛋白的SF/CPC，當(dāng)液固比降低時(shí)，骨水泥中固相成分相對(duì)增多，液相成分相對(duì)減少。在SEM圖像中可以觀察到，低液固比下的骨水泥微觀結(jié)構(gòu)更加致密，晶體之間的間隙減小，相互連接更加緊密（見(jiàn)圖6a-f）。這是因?yàn)樵谳^低液固比下，單位體積內(nèi)的磷酸鈣晶體數(shù)量增多，反應(yīng)活性位點(diǎn)增加，使得固化反應(yīng)更加充分。更多的HA晶體生成并相互交織，填充了骨水泥內(nèi)部的孔隙，從而提高了骨水泥的抗壓強(qiáng)度。當(dāng)液固比過(guò)低（如0.350）時(shí)，骨水泥的流動(dòng)性變差，在攪拌和成型過(guò)程中難以均勻混合，導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻，出現(xiàn)孔隙和缺陷（見(jiàn)圖6a）。這些孔隙和缺陷成為了材料的薄弱部位，在受到外力作用時(shí)容易引發(fā)裂紋的產(chǎn)生和擴(kuò)展，從而降低了抗壓強(qiáng)度。圖6：不同液固比的含2.0wt%絲素蛋白的SF/CPC微觀結(jié)構(gòu)（SEM圖像）XRD分析結(jié)果顯示，不同液固比下的SF/CPC水化產(chǎn)物均為HA，但隨著液固比的降低，HA衍射峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。這進(jìn)一步證明了低液固比下固化反應(yīng)更加充分，HA晶體的生成量增加，結(jié)晶度提高。液固比的變化還可能影響HA晶體的生長(zhǎng)取向和尺寸分布，從而對(duì)骨水泥的性能產(chǎn)生影響。綜上所述，絲素蛋白的加入通過(guò)物理相互作用與磷酸鈣晶體形成緊密的結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了骨水泥的抗壓強(qiáng)度，但過(guò)高含量的絲素蛋白會(huì)因團(tuán)聚而降低強(qiáng)度。液固比的變化主要通過(guò)影響骨水泥的微觀結(jié)構(gòu)和固化反應(yīng)程度來(lái)改變其性能，合適的液固比能夠使骨水泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加致密，提高抗壓強(qiáng)度。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能提供了重要的理論依據(jù)。四、絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的細(xì)胞相容性研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)選用的材料均具有良好的生物安全性和穩(wěn)定性，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。人骨髓標(biāo)本取自健康志愿者，在獲取標(biāo)本前，已獲得志愿者的知情同意，并嚴(yán)格按照相關(guān)倫理規(guī)范進(jìn)行操作。磷酸鈣骨水泥（CPC）由上海瑞邦公司提供，其主要成分為磷酸四鈣（TTCP）和無(wú)水磷酸氫鈣（DCPA），二者在固化液的作用下能夠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成羥基磷灰石（HA），從而實(shí)現(xiàn)骨水泥的固化。絲素蛋白（SF）由蘇州大學(xué)材料學(xué)院提供，其純度高，性能穩(wěn)定，是從優(yōu)質(zhì)家蠶絲中提取得到，經(jīng)過(guò)脫膠、溶解、透析等一系列工藝處理，去除了雜質(zhì)和小分子物質(zhì)，得到了高純度的絲素蛋白粉末。采用密度梯度離心法分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）。將獲取的人骨髓標(biāo)本與等量的PBS緩沖液混合均勻，然后緩慢加入到預(yù)先裝有Ficoll密度梯度離心液的離心管中，注意保持界面清晰。將離心管放入離心機(jī)中，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘。離心結(jié)束后，可見(jiàn)離心管中液體分為明顯的四層，從上到下依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、Ficoll分離液層和紅細(xì)胞層。用吸管小心吸取位于中間的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的Ficoll分離液和其他雜質(zhì)。將洗滌后的細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清（FBS）、1%青鏈霉素雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，然后將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每隔3天更換一次培養(yǎng)基，以去除代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代，將細(xì)胞以1:3的比例傳代至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hBMSCs的表面標(biāo)記。取第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSCs，用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分別加入到不同的流式管中，每個(gè)流式管中加入100μL細(xì)胞懸液。向每個(gè)流式管中分別加入適量的熒光標(biāo)記抗體，包括抗CD29-FITC、抗CD44-PE、抗CD105-APC、抗CD34-FITC、抗CD45-PE等，同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照管，加入相應(yīng)的同型對(duì)照抗體。將流式管輕輕混勻，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，向每個(gè)流式管中加入1mLPBS緩沖液，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。將洗滌后的細(xì)胞重懸于500μLPBS緩沖液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)，確定hBMSCs表面標(biāo)記的表達(dá)情況，以鑒定細(xì)胞的純度和特性。采用浸提法制備絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）及純磷酸鈣骨水泥（CPC）的浸提液。將制備好的SF/CPC和CPC試件分別放入無(wú)菌的離心管中，每個(gè)離心管中放入一個(gè)試件。向每個(gè)離心管中加入適量的α-MEM培養(yǎng)基，使試件完全浸沒(méi)在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基與試件的體積比為10:1（mL/g）。將離心管放置在37℃的恒溫?fù)u床上，以100r/min的轉(zhuǎn)速振蕩72小時(shí)，使骨水泥中的成分充分溶解到培養(yǎng)基中。振蕩結(jié)束后，將浸提液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除沉淀。將上清液通過(guò)0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，得到浸提液備用。用MTT法測(cè)定浸提液培養(yǎng)hBMSCs的活力。將第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSCs用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，然后將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。將96孔板放置在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24小時(shí)后，吸出96孔板中的原培養(yǎng)基，分別加入不同組別的浸提液，每孔加入100μL。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等量的新鮮α-MEM培養(yǎng)基。將96孔板繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天后進(jìn)行MTT檢測(cè)。在檢測(cè)前，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，吸出上清液，每孔加入150μL的DMSO溶液，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）：RGR=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》進(jìn)行毒性分級(jí)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)浸提液培養(yǎng)的hBMSCs第4天的細(xì)胞周期及倍體情況。取第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSCs，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液。將6孔板放置在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24小時(shí)后，吸出6孔板中的原培養(yǎng)基，分別加入不同組別的浸提液，每孔加入2mL。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等量的新鮮α-MEM培養(yǎng)基。將6孔板繼續(xù)放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的浸提液。將洗滌后的細(xì)胞重懸于1mLPBS緩沖液中，緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊振蕩，使細(xì)胞充分固定，將固定后的細(xì)胞放置在4℃冰箱中過(guò)夜。第二天，將固定后的細(xì)胞以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除乙醇，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。向細(xì)胞中加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色液，輕輕混勻，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的比例以及倍體情況，分析骨水泥浸提液對(duì)細(xì)胞周期的影響。通過(guò)掃描電鏡（SEM）觀察絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料與hBMSCs共培養(yǎng)后第1天、3天、5天、7天細(xì)胞的粘附及增殖情況。將制備好的SF/CPC復(fù)合材料切成大小約為5mm×5mm×5mm的小塊，用75%乙醇浸泡消毒30分鐘，然后用PBS緩沖液沖洗3-5次，去除殘留的乙醇。將消毒后的SF/CPC復(fù)合材料放入24孔板中，每孔放入一塊。將第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hBMSCs用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL，將細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入1mL細(xì)胞懸液。將24孔板放置在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第1天、3天、5天、7天時(shí)，取出24孔板，用PBS緩沖液輕輕沖洗材料表面3-5次，去除未粘附的細(xì)胞。向每孔中加入2.5%戊二醛固定液，固定2小時(shí)。固定結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗材料表面3-5次，然后依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度脫水15分鐘。將脫水后的材料進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥處理，然后用離子濺射儀在材料表面噴金處理，最后用掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)、分布和生長(zhǎng)情況。4.2細(xì)胞活力與毒性評(píng)價(jià)通過(guò)MTT法測(cè)定絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）及純磷酸鈣骨水泥（CPC）浸提液培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）的活力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的第1天，SF/CPC組和CPC組的細(xì)胞活力均較低，這是因?yàn)榧?xì)胞剛接種到浸提液中，需要一定的時(shí)間適應(yīng)新的環(huán)境。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組細(xì)胞活力均逐漸上升，說(shuō)明兩種骨水泥浸提液對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用。在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，SF/CPC組細(xì)胞活力略高于CPC組，且兩組細(xì)胞活力均維持在較高水平（見(jiàn)圖7）。對(duì)兩組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05），這表明絲素蛋白的添加并沒(méi)有顯著改變骨水泥浸提液對(duì)細(xì)胞活力的影響。圖7：SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)hBMSCs的細(xì)胞活力根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR），按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886.5-2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)》進(jìn)行毒性分級(jí)。計(jì)算結(jié)果顯示，第1天、3天、5天、7天SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)的hBMSCs的相對(duì)增殖率均大于100%，其毒性分級(jí)均為0或1級(jí)（見(jiàn)表1）。這表明兩種骨水泥浸提液對(duì)hBMSCs均無(wú)明顯的細(xì)胞毒性，細(xì)胞能夠在浸提液中正常生長(zhǎng)和增殖。絲素蛋白的加入并未增加骨水泥的細(xì)胞毒性，反而在一定程度上可能為細(xì)胞提供了更適宜的生長(zhǎng)微環(huán)境。表1：SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)hBMSCs的毒性分級(jí)培養(yǎng)時(shí)間（d）SF/CPC組RGR（%）毒性分級(jí)CPC組RGR（%）毒性分級(jí)1102.5±3.20101.8±2.903105.6±4.10104.3±3.705108.2±5.00106.8±4.507110.5±5.50109.0±5.20綜上所述，絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥浸提液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活力支持作用，且無(wú)明顯細(xì)胞毒性，為其進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供了重要的細(xì)胞相容性依據(jù)。4.3細(xì)胞周期與倍體分析利用流式細(xì)胞儀對(duì)絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）及純磷酸鈣骨水泥（CPC）浸提液培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）第4天的細(xì)胞周期及倍體情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果對(duì)于評(píng)估骨水泥對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響具有重要意義。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，兩組細(xì)胞均為二倍體細(xì)胞，未見(jiàn)異倍體細(xì)胞（見(jiàn)圖8）。這表明兩種骨水泥浸提液對(duì)hBMSCs的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響，細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性得以保持。在細(xì)胞周期分布方面，兩組Go/G1期、S期、G2/M期及細(xì)胞增殖指數(shù)（ProliferationIndex，PI）未見(jiàn)明顯差異（p>0.05）（見(jiàn)表2）。Go/G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA合成的階段，S期是DNA合成期，G2/M期是細(xì)胞準(zhǔn)備分裂的階段，PI則反映了細(xì)胞的增殖活性。兩組細(xì)胞在這些時(shí)期的比例沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明SF/CPC和CPC浸提液對(duì)hBMSCs的細(xì)胞周期進(jìn)程沒(méi)有明顯的阻滯或促進(jìn)作用，細(xì)胞能夠正常地進(jìn)行增殖和分化。圖8：SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)hBMSCs的細(xì)胞倍體分析表2：SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)hBMSCs的細(xì)胞周期分析組別Go/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）PI（%）SF/CPC組58.2±3.526.5±2.815.3±2.141.8±3.5CPC組57.8±3.327.1±3.015.1±2.042.2±3.3綜上所述，絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥浸提液對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期和倍體沒(méi)有明顯影響，細(xì)胞能夠保持正常的增殖和分化狀態(tài)，進(jìn)一步證明了該材料具有良好的細(xì)胞相容性。4.4細(xì)胞粘附與增殖觀察通過(guò)掃描電鏡（SEM）對(duì)絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）復(fù)合材料與hBMSCs共培養(yǎng)后第1天、3天、5天、7天細(xì)胞的粘附及增殖情況進(jìn)行觀察，結(jié)果能夠直觀地反映材料的細(xì)胞相容性。在共培養(yǎng)第1天，在SEM圖像中可以觀察到（見(jiàn)圖9a），少量hBMSCs開(kāi)始粘附在SF/CPC復(fù)合材料表面。此時(shí)，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，體積較小，細(xì)胞表面有一些微絨毛伸出，與材料表面相互接觸。這表明SF/CPC復(fù)合材料表面能夠?yàn)閔BMSCs提供一定的粘附位點(diǎn)，使細(xì)胞能夠在其表面附著。這些粘附位點(diǎn)可能是由于絲素蛋白的存在，絲素蛋白分子上的氨基酸殘基能夠與細(xì)胞表面的受體相互作用，形成化學(xué)鍵或氫鍵，從而促進(jìn)細(xì)胞的粘附。圖9：hBMSCs在SF/CPC復(fù)合材料上不同培養(yǎng)時(shí)間的粘附及增殖情況（SEM圖像）到第3天，細(xì)胞粘附數(shù)量明顯增多（見(jiàn)圖9b）。細(xì)胞開(kāi)始逐漸鋪展，形態(tài)變得不規(guī)則，伸出偽足與周?chē)?xì)胞及材料表面相互連接。此時(shí)，細(xì)胞的增殖活動(dòng)也逐漸增強(qiáng)，通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，SF/CPC復(fù)合材料為細(xì)胞提供了穩(wěn)定的支撐結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞能夠在其表面有序地生長(zhǎng)和增殖。絲素蛋白與磷酸鈣骨水泥形成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，具有良好的力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)，能夠承受細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖過(guò)程中產(chǎn)生的力學(xué)作用，同時(shí)其孔隙結(jié)構(gòu)也有利于細(xì)胞的遷移和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換。培養(yǎng)至第5天，細(xì)胞在材料表面進(jìn)一步增殖并融合成片狀（見(jiàn)圖9c）。細(xì)胞之間的連接更加緊密，形成了較為完整的細(xì)胞層。在這個(gè)階段，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)也逐漸增多，填充在細(xì)胞與材料之間以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙中。細(xì)胞外基質(zhì)中含有多種蛋白質(zhì)和多糖，這些成分不僅能夠增強(qiáng)細(xì)胞與材料之間的粘附力，還能夠?yàn)榧?xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。SF/CPC復(fù)合材料與細(xì)胞之間的相互作用更加復(fù)雜和穩(wěn)定，細(xì)胞在材料表面的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表明材料對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用。到第7天，材料表面被大量細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞呈現(xiàn)出旺盛的增殖狀態(tài)（見(jiàn)圖9d）。細(xì)胞形態(tài)多樣，有扁平狀、梭形等，這是細(xì)胞在增殖和分化過(guò)程中的正常形態(tài)變化。此時(shí)，細(xì)胞的代謝活動(dòng)也非?；钴S，需要大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。SF/CPC復(fù)合材料的多孔結(jié)構(gòu)能夠有效地促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳輸，滿(mǎn)足細(xì)胞的代謝需求。細(xì)胞的增殖和分化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，SF/CPC復(fù)合材料能夠持續(xù)為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，支持細(xì)胞的長(zhǎng)期生長(zhǎng)和功能發(fā)揮。綜上所述，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，hBMSCs在SF/CPC復(fù)合材料上能夠良好地粘附、生長(zhǎng)，并隨時(shí)間不斷增殖。這充分表明絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥具有良好的細(xì)胞相容性，能夠?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供適宜的微環(huán)境。這種良好的細(xì)胞相容性為該材料在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望在骨缺損修復(fù)等臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。4.5結(jié)果與討論從細(xì)胞活力與毒性評(píng)價(jià)結(jié)果來(lái)看，絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）浸提液培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）活力與純磷酸鈣骨水泥（CPC）浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力相當(dāng)，且均維持在較高水平。這表明絲素蛋白的加入并未對(duì)骨水泥浸提液的細(xì)胞活力支持作用產(chǎn)生負(fù)面影響。從分子層面分析，細(xì)胞活力的維持與細(xì)胞內(nèi)多種代謝酶的活性密切相關(guān)。MTT法檢測(cè)的原理是基于活細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體脫氫酶能夠?qū)TT還原為紫色的甲瓚結(jié)晶，而甲瓚結(jié)晶的生成量與細(xì)胞活力成正比。在本實(shí)驗(yàn)中，SF/CPC浸提液培養(yǎng)的hBMSCs能夠產(chǎn)生與CPC浸提液培養(yǎng)細(xì)胞相當(dāng)?shù)募篆懡Y(jié)晶量，說(shuō)明絲素蛋白增強(qiáng)骨水泥浸提液沒(méi)有抑制細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體脫氫酶的活性，細(xì)胞的能量代謝過(guò)程正常進(jìn)行。這可能是因?yàn)榻z素蛋白具有良好的生物相容性，其分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基等成分不會(huì)對(duì)細(xì)胞的代謝途徑產(chǎn)生干擾，能夠?yàn)榧?xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。根據(jù)細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）進(jìn)行的毒性分級(jí)結(jié)果顯示，SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)的hBMSCs毒性分級(jí)均為0或1級(jí)，表明兩種骨水泥浸提液對(duì)hBMSCs均無(wú)明顯細(xì)胞毒性。從細(xì)胞分子層面來(lái)看，細(xì)胞毒性的產(chǎn)生通常與材料浸提液中的有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷有關(guān)。這些有害物質(zhì)可能會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；也可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，干擾細(xì)胞的正常生理功能。在本研究中，SF/CPC浸提液中絲素蛋白的存在并沒(méi)有引入新的有害物質(zhì)，其與磷酸鈣骨水泥之間的相互作用也沒(méi)有產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)。相反，絲素蛋白可能通過(guò)其表面的活性基團(tuán)與細(xì)胞表面的受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。絲素蛋白分子中的某些氨基酸殘基可能與細(xì)胞表面的整合素等受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的增殖相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞周期與倍體分析中，SF/CPC及CPC浸提液培養(yǎng)的hBMSCs均為二倍體細(xì)胞，且細(xì)胞周期各時(shí)相比例及細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）未見(jiàn)明顯差異。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖和分化的基礎(chǔ)，受到細(xì)胞內(nèi)多種基因和信號(hào)通路的嚴(yán)格調(diào)控。從分子機(jī)制角度來(lái)看，細(xì)胞周期的調(diào)控主要涉及周期蛋白（Cyclin）、周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）以及相關(guān)的抑制因子等。在正常細(xì)胞中，Cyclin與CDK結(jié)合形成復(fù)合物，激活CDK的激酶活性，從而推動(dòng)細(xì)胞周期從一個(gè)時(shí)相進(jìn)入下一個(gè)時(shí)相。本實(shí)驗(yàn)中，SF/CPC浸提液沒(méi)有影響hBMSCs細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白的活性，使得細(xì)胞能夠按照正常的程序進(jìn)行增殖和分化。這進(jìn)一步證明了絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥對(duì)細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性和正常生理功能沒(méi)有產(chǎn)生不良影響。通過(guò)掃描電鏡（SEM）觀察hBMSCs在SF/CPC復(fù)合材料上的粘附及增殖情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在材料表面能夠良好地粘附和增殖。從細(xì)胞分子層面分析，細(xì)胞與材料表面的粘附是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及細(xì)胞表面的粘附分子與材料表面的配體之間的相互作用。hBMSCs表面表達(dá)多種粘附分子，如整合素等。絲素蛋白增強(qiáng)的骨水泥復(fù)合材料表面存在一些活性基團(tuán)，如羥基、羧基等，這些基團(tuán)能夠與細(xì)胞表面的整合素等粘附分子結(jié)合，形成化學(xué)鍵或氫鍵，從而促進(jìn)細(xì)胞的粘附。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，材料表面的微環(huán)境對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要的作用。SF/CPC復(fù)合材料具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，其孔隙結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)胞提供足夠的空間進(jìn)行增殖和遷移，同時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳輸，滿(mǎn)足細(xì)胞代謝的需求。材料的力學(xué)性能能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定的支撐，使得細(xì)胞在增殖過(guò)程中能夠保持正常的形態(tài)和功能。隨著細(xì)胞的增殖，細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)逐漸增多，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖維連接蛋白等成分能夠進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞與材料之間的粘附力，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能及細(xì)胞相容性，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在絲素蛋白的提取與表征方面，通過(guò)經(jīng)典的脫膠、溶解、透析等方法，成功從蠶絲中提取出了高純度的絲素蛋白，并利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、掃描電子顯微鏡（SEM）、熱重分析（TGA）等技術(shù)對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)和熱穩(wěn)定性進(jìn)行了全面表征，為后續(xù)的研究提供了優(yōu)質(zhì)的絲素蛋白原料。在絲素蛋白增強(qiáng)可注射磷酸鈣骨水泥的性能研究中，深入探討了不同絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和液固比對(duì)骨水泥性能的影響。研究結(jié)果表明，隨著絲素蛋白含量的增加，絲素蛋白/磷酸鈣骨水泥（SF/CPC）的抗壓強(qiáng)度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)絲素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.0%-2.5%之間時(shí)，SF/CPC表現(xiàn)出較為優(yōu)異的抗壓強(qiáng)度。這是因?yàn)榻z素蛋白分子中的結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)賦予了其良好的力學(xué)性能，適量的絲素蛋白能夠與磷酸鈣晶體相互交織，形成緊密的結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)骨水泥的抗壓強(qiáng)度；當(dāng)絲素蛋白含量過(guò)高時(shí)，會(huì)出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，破壞骨水泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)的均勻性，導(dǎo)致抗壓強(qiáng)度降低。凝固時(shí)間方面，隨著絲素蛋白含量的增加，SF/CPC的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間均逐漸縮短，這可能是由于絲素蛋白在骨水泥固化過(guò)程中起到了晶核的作用，促進(jìn)了磷酸鈣晶體的成核和生長(zhǎng)，加速了固化反應(yīng)的進(jìn)行。對(duì)于不同液固比的研究發(fā)現(xiàn)，隨著液固比的降低，SF/CPC的抗壓強(qiáng)度先上升后下降，當(dāng)液固比在0.375-0.425之間時(shí)，骨水泥具有較高的抗壓強(qiáng)度。這是因?yàn)橐汗瘫冉档?，固相成分增多，骨水泥?nèi)部結(jié)構(gòu)更加致密，顆粒之間的結(jié)合更加緊密，從而提高了抗壓強(qiáng)度；當(dāng)液固比過(guò)低時(shí)，骨水泥的流動(dòng)性變差，難以均勻混合，導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)不均勻，出現(xiàn)孔隙和缺陷，降低了抗壓強(qiáng)度。液固比降低時(shí)，SF/CPC的初凝時(shí)間和終凝時(shí)間均逐漸縮短，這是由于固相成分增多，反應(yīng)活性位點(diǎn)增加，使得固化反應(yīng)速率加快。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜分析（EDS）和X射線(xiàn)